專利名稱：對her2具有結(jié)合親和力的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合人表皮生長受體因子2(以下稱為HER2)的新多肽。該多肽與葡萄球菌A蛋白(SPA)的一個結(jié)構(gòu)域相關(guān)，其中該多肽的序列對應(yīng)于SPA結(jié)構(gòu)域的序列，具有至少一個取代突變。本發(fā)明也涉及這種HER2結(jié)合多肽作為一種藥物的應(yīng)用，更特別地涉及其在制備一種治療以過表達HER2為特征的癌癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
Affibody分子該分子與Z蛋白有關(guān)，來源于葡萄球菌A蛋白(SPA)的B結(jié)構(gòu)域(Nilsson B et al(1987)Protein Engineering 1，107-133)，是通過使用不同的相互作用靶分子從該類分子的隨機文庫中選擇出來的(參見WO95/19374；WO00/63243；Nord K et al(1995)Prot Eng 8601-608；Nord K et al(1997)Nature Biotechnology 15，772-777)。不同的靶分子被用來選擇Z蛋白的衍生物，例如Nord K et al所述(1997，如上)。該論文描述的實驗概述了針對給定靶選擇Z蛋白衍生物的普通技術(shù)原理，而不是為了獲得用于特殊的治療和生物技術(shù)用途的具有足夠高親和力的分子這一明確的目的。
HER2及其在癌癥疾病中的作用HER2原癌基因編碼一個185kD的細胞表面受體蛋白，被稱為HER2蛋白或受體(Hynes NE et al(1994)Biochim Biophys Acta1198165-184)。該基因有時也被稱為neu、HER2/neu或c-erbB-2。neu最早在被乙基亞硝基尿處理過的大鼠中發(fā)現(xiàn)，并且表現(xiàn)出該基因的突變類型(Shih C et al(1981)Nature 290261-264)。這種neu的突變類型能夠產(chǎn)生一種具有組成型活性形式的受體，并且形成一種能夠在低拷貝數(shù)下轉(zhuǎn)化細胞的強力癌基因(Hynes NE et al，如上)。
正常細胞在其質(zhì)膜上以組織特異形式表達少量的HER2蛋白。目前還沒有已知的HER2配體被闡明，但是HER2可以和在與配體形成復(fù)合體的HER1(表皮生長因子受體，EGFR)、HER3和HER4形成異源二聚體。這種異源二聚體的形成導(dǎo)致激活的HER2受體將生長信號從胞外傳到核，從而控制正常細胞的生長和分裂(Sundaresan S et al(1999)Curr Oncol Rep 116-22)。
在腫瘤細胞中，DNA復(fù)制系統(tǒng)的錯誤可導(dǎo)致在一條染色體上的一個基因出現(xiàn)多個拷貝，這種現(xiàn)象也稱為基因擴增(geneamplification)。HER2基因的擴增導(dǎo)致這種基因轉(zhuǎn)錄的增加。這提高了HER2的mRNA的水平，并伴隨著HER2蛋白合成的增加，導(dǎo)致HER2蛋白在這些腫瘤細胞表面過表達。這種過表達可以導(dǎo)致HER2蛋白質(zhì)水平比臨近的正常細胞高10-100倍。這進而導(dǎo)致細胞分裂增加并伴隨更高速的細胞生長。HER2基因擴增也暗示正常細胞向癌癥表型的轉(zhuǎn)化(Hynes NE et al，如上；Sundaresan S et al如上)。
HER2蛋白的過表達被認(rèn)為能導(dǎo)致HER2同源二聚體的形成，進而導(dǎo)致形成組成型活性受體(Sliwkowski MX et al(1999)Semin Oncol26(4 Suppl 12)60-70)。在這種情況下，在不存在配體時，生長促進信號不停的傳送到細胞中。結(jié)果，多種胞間信號傳導(dǎo)途徑被激活，導(dǎo)致無法控制的細胞生長，并且在某些情況下導(dǎo)致致癌性轉(zhuǎn)化(HynesNE et al，如上)。因此，由生長因子受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制對于抑制細胞復(fù)制和腫瘤生長而言是重要的靶。
乳腺癌是美國婦女中最普遍的惡性腫瘤，在2001年就有192200個新病例出現(xiàn)(Greenlee R et al(2001)CA Cancer J Clin 5115-36)。在大約25％的乳腺癌患者中，由于HER2基因擴增導(dǎo)致HER2基因的過表達(Slamon DJ et al(1989)Science 244707-712)。HER2蛋白的過表達與一些不利預(yù)后變數(shù)有關(guān)，包括雌激素受體陰性狀態(tài)、高S期比例(S phase fraction)、陽性淋巴結(jié)狀態(tài)(positive nodal status)、突變的p53及高核分級(high nuclear grade)(Sjogren S et al(1998)J Clin Oncol 16(2)462-469)。根據(jù)Slamon et al(如上)的報道，發(fā)現(xiàn)HER2基因的擴增與無疾病存活期的縮短和陽性淋巴結(jié)患者的總體存活期的縮短有很大的相關(guān)性。
基于以上原因，進一步研究HER2在乳腺癌發(fā)病機理和治療中的作用不盡是現(xiàn)在，以后也仍將是一個重要的目標(biāo)。與HER2相互作用的分子的鑒定也成為上述努力的一部分。
臨床前體外研究研究了抑制HER2活性是否會影響腫瘤細胞的生長。與用對照單克隆抗體治療相比，用一種鼠抗HER2單克隆抗體4D5治療過表達HER2蛋白的SK-BR-3型乳腺癌細胞確實能抑制腫瘤細胞增殖。將4D5施用給攜帶過表達HER2的人乳腺癌和卵巢癌的小鼠(異種移植)延長了它們的無腫瘤存活時間。類似的研究也證實了抗HER2單克隆抗體能夠抑制小鼠體內(nèi)人胃癌細胞異種移植物的生長(Pietras RJ et al(1994)Oncogene 91829-1838)。
在用抗體抑制大量存在于腫瘤細胞表面的HER2蛋白的方法中，近年來有一種治療方法開始商業(yè)應(yīng)用。因此，單克隆抗體4D5或trastuzumab為這一目的已經(jīng)被Hoffman-La Roche和Genentech以Herceptin的商品名市場化。
盡管用抗體治療特征在于過表達HER2蛋白的癌癥具有明顯的優(yōu)勢，但是一些因素也是潛在地能夠降低抗體的效能(參見例如ReillyRM et al(1995)Clin Pharmacokinet 28126-142)。這包括(1)限制抗體穿透大的實體瘤或者進入致命區(qū)域，如腦；(2)降低由于血管透性降低而導(dǎo)致的抗體在靶位點的外滲；(3)抗體的交叉反應(yīng)和抗體對正常組織的非特異性結(jié)合，降低了靶向效果；(4)異質(zhì)腫瘤的吸收產(chǎn)生未治療區(qū)；(5)注入的抗體代謝提高，降低了治療效果；及(6)HAMA和人抗人抗體的迅速形成，使治療性抗體失活。
此外，毒素效應(yīng)已經(jīng)成為發(fā)展針對癌癥的治療性抗體的主要障礙(Carter P(2001)Nat Rev Cancer 1118-129；Goldenberg DM(2002)J Nucl Med 43693-713；Reichert JM(2002)Curr Opin Mol Ther 4110-118)。與健康組織的交叉反應(yīng)可導(dǎo)致非綴合(裸露)抗體的實質(zhì)性副作用，這種副作用在抗體與毒素或放射性同位素綴合時可能會被加強。免疫介導(dǎo)的并發(fā)癥包括來源于肺部毒素效應(yīng)的呼吸困難，偶發(fā)性中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，及肝和腎功能降低。偶然情況下，可以觀察到無法預(yù)期的毒性并發(fā)癥，如與HER2靶向抗體trastuzumab(Herceptin)相關(guān)的心臟毒素效應(yīng)(Schneider JW et al(2002)SeminOncol 29(3 suppl 11)22-28)。用同位素綴合抗體進行放射性免疫治療也會導(dǎo)致骨髓抑制。
盡管目前應(yīng)用的抗癌抗體在臨床和商業(yè)上取得了成功，但有關(guān)這種治療策略的未來的許多重要問題還是存在的。因此，繼續(xù)致力于研究一種對HER2具有相當(dāng)?shù)挠H和力以及該分子在治療疾病中的應(yīng)用在本領(lǐng)域內(nèi)仍然具有很大的吸引力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種多肽，其特征在于該多肽與HER2特異性結(jié)合。
本發(fā)明一個相關(guān)目的是一種HER2結(jié)合多肽，該多肽具有極少或沒有非特異性結(jié)合。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種HER2結(jié)合多肽，該多肽能被容易地用作融合多肽的一個部分。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種HER2結(jié)合多肽，該多肽解決了現(xiàn)有抗體試劑中存在的一個或多個已知問題。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種HER2結(jié)合多肽，該多肽可用于治療用途。
本發(fā)明一個相關(guān)目的是尋找新的在臨床中治療、抑制和/或靶向特征在于過表達HER2蛋白的癌癥的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種分子，該分子可作為一種試劑用于檢測低濃度的HER2。
這些及其它目的被本發(fā)明權(quán)利要求書所請求保護的本發(fā)明的不同方面所滿足。因而，第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽具有對HER2的結(jié)合親和力，并與葡萄球菌A蛋白(SPA)的一個結(jié)構(gòu)域相關(guān)，即該多肽的序列對應(yīng)于SPA結(jié)構(gòu)域的序列，但具有1到約20個取代突變。
在本發(fā)明的多肽的實施方案中，其對HER2的親和力即相互作用的KD值至多為1×10-6M。在另一個實施方案中，多肽對HER2的親和力即相互作用的KD值至多為1×10-7M。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽特異性結(jié)合HER2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域ECD。
因此，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過取代誘變SPA的一個結(jié)構(gòu)域可能獲得一種高親和力HER2結(jié)合多肽，以及該多肽能與HER2相互作用。本發(fā)明的多肽可作為HER2抗體在不同應(yīng)用中的一種替代物。作為非限制性的實例，其可用于治療特征為HER2過表達的癌癥，通過結(jié)合細胞表面HER2用于抑制細胞信號傳導(dǎo)，用于癌癥的體內(nèi)和體外診斷，用于將制劑靶向特征為過表達HER2的細胞，用于檢測HER2的組織化學(xué)方法，用于分離方法以及其它應(yīng)用。本發(fā)明的多肽可以用于依賴于一種試劑與HER2的親和力的任何方法中。因此，在這些方法中該多肽可用作為一種檢測試劑、一種捕獲試劑或者分離試劑，而且還可直接用作為一種治療制劑或者將其它治療制劑靶向HER2蛋白的手段。體外使用本發(fā)明的多肽的方法可以不同方式進行，如微量滴定板、蛋白陣列、生物傳感器表面和組織切片等等。為了令本發(fā)明多肽適用于特異的用途，在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，可以對本發(fā)明的多肽進行修飾和/或添加。在下面詳細描述了這些修飾和添加，其可能包括在同一多肽鏈中包含的額外的氨基酸，或者標(biāo)記和/或治療制劑，其化學(xué)綴合或以其它方式結(jié)合本發(fā)明的多肽。另外，本發(fā)明還涵蓋了保留了結(jié)合HER2能力的該多肽的片段。
“HER2結(jié)合親和力”是指可以例如通過利用表面等離子共振(surface plasmon resonance)技術(shù)如Biocore裝置進行檢測的一種多肽特性。HER2結(jié)合親和力可以通過一個實驗進行檢測，其中將HER2固定在該裝置的感應(yīng)芯片上，然后將含有待測多肽的樣品通過該芯片?；蛘?，也可以將待檢測的多肽固定在該裝置的感應(yīng)芯片上，然后將含有HER2的樣品通過該芯片。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用所獲得的感應(yīng)圖像建立多肽的HER2結(jié)合親和力的至少一種定性測量方法。如果需要定量測量方法，例如為了建立相互作用間的某個KD值，也可以使用表面等離子共振方法。例如，結(jié)合值可以利用Biocore2000裝置(Biocore AB)進行測定。HER2固定于該裝置的感應(yīng)芯片上，而親和力待檢測的多肽樣品通過連續(xù)稀釋制備并以隨機順序進行注射。然后可從結(jié)果中計算KD值，例如利用該裝置制造者提供的軟件BIAevaluation 3.2中的1∶1朗繆爾結(jié)合模型(Langmuir binding model)。
如上所述，本發(fā)明的多肽序列與SPA結(jié)構(gòu)域的序列相關(guān)，即所述SPA結(jié)構(gòu)域的1到約20個氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基。然而，這些引入的取代突變不應(yīng)該影響該多肽的基本結(jié)構(gòu)。也就是說，本發(fā)明多肽的Cα骨架的所有折疊在本質(zhì)上與相關(guān)的SPA結(jié)構(gòu)域的相同，例如在相同順序的二級結(jié)構(gòu)具有相同的元件。因此，如果基本結(jié)構(gòu)特性是共有的，例如導(dǎo)致相似的CD光譜的那些特性，則該多肽就落入了具有與SPA結(jié)構(gòu)域相同折疊的定義中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它相關(guān)的參數(shù)。在突變時，本質(zhì)上保持SPA結(jié)構(gòu)域的基本結(jié)構(gòu)的要求限制了該結(jié)構(gòu)域可以進行取代的位置。例如，當(dāng)從Z蛋白的已知結(jié)構(gòu)開始，優(yōu)選位于Z蛋白表面的氨基酸殘基被取代，而埋在Z蛋白核心“三螺旋束(three-helix bundle)”內(nèi)部的氨基酸殘基則應(yīng)當(dāng)保持不變以保護該分子的結(jié)構(gòu)特性。相同的原因適用于其它SPA結(jié)構(gòu)域及其片段。
本發(fā)明還涵蓋了這樣的多肽，其中上述HER2結(jié)合多肽作為HER2結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在任一末端或兩端被加入了額外的氨基酸殘基。這些額外的氨基酸殘基可以在多肽結(jié)合HER2時起作用，但是也可同樣用于其它目的，涉及例如該多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測的一種或幾種。這些額外的氨基酸殘基可以包括一或多種為了化學(xué)偶聯(lián)目的而添加的氨基酸殘基。一個例子是在多肽鏈的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一個半胱氨酸殘基。這種額外的氨基酸殘基也可以包括用于多肽純化或檢測的一個“標(biāo)記”，如與特異于標(biāo)記的抗體相互作用的六組氨酰(His6)標(biāo)記，或“myc”標(biāo)記或“flag”標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道其它的替代方法。
上述“額外的氨基酸殘基”也可構(gòu)成具有預(yù)期功能的一個或多個多肽結(jié)構(gòu)域，如與第一個、HER2結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同的結(jié)合功能，或者其它結(jié)合功能，或是一種酶促功能，或是一種熒光功能，或是其組合。
因此，本發(fā)明涵蓋了與HER2具有親和力的多肽的多聚體。這一點是令人感興趣的，例如當(dāng)使用本發(fā)明的多肽治療癌癥或用于一種純化HER2的方法中以獲得與本發(fā)明多肽相比可能具有更強的HER2結(jié)合。此時，在所述多肽多聚體的提供，如二聚體、三聚體或四聚體都能產(chǎn)生所需的效果。所述多聚體可以由適當(dāng)數(shù)量的本發(fā)明的多肽組成。在這些多聚體中形成單體的本發(fā)明的這些多肽結(jié)構(gòu)域可以都具有相同的氨基酸序列，但同樣也可能具有不同的氨基酸序列。本發(fā)明的多聚體中相連接的多肽“單位”可能是通過用已知有機化學(xué)方法共價偶聯(lián)相連，或是在重組表達多肽的系統(tǒng)中表達為一或多個融合多肽，或以任意其它形式連接，如直接或通過接頭連接，例如通過氨基酸接頭連接。
此外，在“異源”融合多肽中，HER2結(jié)合多肽構(gòu)成了第一個結(jié)構(gòu)域或第一個部分，第二和其它部分具有除了結(jié)合HER2外的其它功能，這些可預(yù)期的結(jié)果也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該融合多肽的第二和其它部分可能包含對除了HER2外的其它靶分子具有親和力的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可能與SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)，但在1到大約20個位置具有取代突變。結(jié)果是融合多肽有至少一個HER2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和至少一個與所述其它靶分子具有親和力的結(jié)構(gòu)域，其中兩個結(jié)構(gòu)域都與SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)。這也使產(chǎn)生能用在許多生物技術(shù)應(yīng)用中的多特異性試劑成為可能，如作為治療制劑或作為捕獲、檢測或分離試劑。對于這種與SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)多肽的多特異性多聚體的制備，上述對于多種HER2結(jié)合“單位”的多聚體的描述仍然有效，所述多特異性多聚體中至少一個多肽具有對HER2的親和力。在其它選擇中，第二或其它部分可能包含一個不相關(guān)的、自然形成或重組的蛋白(或其一個保留了自然形成或重組蛋白的結(jié)合能力的片段)，其具有對靶的結(jié)合親和力。這種對人血清白蛋白具有親和力并可以作為本發(fā)明的HER2結(jié)合SPA結(jié)構(gòu)域衍生物的融合配偶體的結(jié)合蛋白的例子就是鏈球菌G蛋白(SPG)的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nygren P- et al(1988)MolRecogn 169-74)。一種HER2結(jié)合SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)多肽和SPG的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合多肽就落入了本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)本發(fā)明的多肽作為一種治療制劑或作為靶向制劑施用人體時，其與結(jié)合血清白蛋白的部分的融合將會被證明是有益的，因為與單獨的SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)的HER2結(jié)合部分的半衰期相比，在體內(nèi)這種融合蛋白的半衰期很可能被證明會延長(其原理已例如在WO91/01743中描述)。
其它產(chǎn)生融合多肽的可能性也被想到。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的與HER2結(jié)合SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)多肽將會與第二或其它部分共價偶聯(lián)，其除了靶結(jié)合還展示了其它功能或者沒有靶結(jié)合而有其它功能。一個例子就是一或多個HER2結(jié)合多肽和一種作為報道子或效應(yīng)部分的具有酶促活性的多肽的融合物?？梢耘cHER2結(jié)合多肽偶聯(lián)形成一種融合蛋白的報道酶的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且包括酶如β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、羧肽酶。本發(fā)明的融合多肽的第二和其它部分的其它選擇包括熒光多肽，如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶及其變體。
本發(fā)明融合多肽第二和其它部分的其它選擇包括用于治療性應(yīng)用的一或多種部分。在治療性應(yīng)用中，其它分子也可以通過其它方法共價或非共價偶聯(lián)到本發(fā)明的多肽上。非限制性例子包括用本發(fā)明多肽引導(dǎo)效應(yīng)酶(例如羧肽酶)而進行“ADEPT”(抗體介導(dǎo)的酶前藥治療，antibody-directed enzyme prodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞和其它組分的蛋白質(zhì)；細胞因子，如IL-2、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如組織因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物堿；包括毒性小分子，如auristatin類似物、阿霉素。同時，為了更方便摻入放射性核素用于診斷(如68Ga、76Br、111In、99Tc、124I、125I)或治療(如90Y、131I、211At)，可以考慮上述列舉的額外的氨基酸(特別是六組胺酸標(biāo)記和半胱氨酸)，其目的是將放射性同位素的螯合劑偶聯(lián)到多肽序列。
本發(fā)明涵蓋了這樣的多肽，其中上述HER2結(jié)合多肽具有一個標(biāo)記基團例如用于多肽檢測的目的，如至少一個熒光團、生物素或放射性同位素。
在描述整合了本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽的融合蛋白時，需要說明的是第一、第二和其它部分的命名是用于清晰的原因，以區(qū)別一方面的HER2結(jié)合部分和另一方面具有其它功能的部分。這些命名并不是指融合蛋白的多肽鏈中不同結(jié)構(gòu)域的實際順序。因此，例如所述第一部分可能并不局限于出現(xiàn)在融合蛋白的N末端、中間部分或C末端。
用SPA結(jié)構(gòu)域作為起點來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的一個例子是蛋白Z，該蛋白來源于葡萄球菌A蛋白的B結(jié)構(gòu)域。如在背景部分所指出的，該蛋白曾被用作腳手架結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生命名為Affibody的分子，其能夠結(jié)合多種靶。未被修飾過的Z蛋白的58個氨基酸序列被稱為Zwt，如SEQ ID NO1所示并顯示在圖1中。
在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，其與SPA的結(jié)構(gòu)域相關(guān)，因為該多肽的序列相應(yīng)于SPA結(jié)構(gòu)域的序列，具有4到約20個取代突變。其它實施方案可能具有1到約13個取代突變，或4到約13個取代突變。
在本發(fā)明多肽的一個更特異的實施方案中，其序列與相應(yīng)于SEQID NO1中所示的序列，有1到約20個取代突變，如4到約20、1到約13或4到約13個取代突變。
本發(fā)明的多肽在一些實施方案中相應(yīng)于SEQ ID NO1中所示的序列，其序列在13、14、28、32和35位的一或多個位置包括取代突變。另外，本發(fā)明的多肽序列還可以在9、10、11、17、18、24、25和27位的一或多個位置包括取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在13位的由苯丙氨酸到酪氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在14位的由酪氨酸到色氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在28位的由天冬酰胺到選自精氨酸或組氨酸的氨基酸殘基的一個取代突變，優(yōu)選為到精氨酸。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在32位的由谷氨酰胺到精氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在35位的由賴氨酸到酪氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在10位的由谷氨酰胺到精氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在11位的由天冬酰胺到蘇氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在17位的由亮氨酸到纈氨酸的一個取代突變。
本發(fā)明另一個實施方案的多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少在27位的由精氨酸到選自賴氨酸或絲氨酸的氨基酸殘基的一個取代突變。
本發(fā)明一個優(yōu)選的多肽相應(yīng)于SEQ ID NO1，其包括至少以下的突變F13Y、Y14W、N28R、Q32R和K35Y。
本發(fā)明不同實施方案多肽的特異序列的例子中每一個都包括一或多個上述特異性突變，如SEQ ID NO2-79所示并在圖1中闡述。這些多肽的HER2結(jié)合特性在本發(fā)明概述后的實施例中加以揭示。
作為使用沒有修飾的SPA結(jié)構(gòu)域的一種替代，SPA結(jié)構(gòu)域也會被誘變進而增加其在堿性條件下的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性包括用對于堿性條件較不敏感的氨基酸殘基定點取代在沒有修飾的序列中出現(xiàn)的任何天冬酰胺殘基。當(dāng)使用本發(fā)明的多肽作為親和層析中的親和配體時，這種對堿具有降低的敏感性的特性是有益的；由于在不同的反應(yīng)之間親和層析柱要經(jīng)受頻繁的強堿處理以進行就地清洗(CIP，cleaning in place)，因此耐受這種處理的能力能夠延長親和層析基質(zhì)的使用壽命。例如，利用蛋白Z作為起點，本發(fā)明的多肽不僅有賦予HER2結(jié)合的取代突變，還有選自N3、N6、N11、N21、N23、N28、N43和N52的至少一個天冬酰胺殘基被對堿處理較不敏感的氨基酸殘基所取代的修飾。這種多肽的非限制性例子具有下列突變(參考Zwt序列)N3A；N6D；N3A、N6D和N23T；N3A、N6D、N23T和N28A；N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T；N6A和N23T。因此，這些SPA結(jié)構(gòu)域以及其它為了穩(wěn)定性的原因而發(fā)生天冬酰胺突變的SPA結(jié)構(gòu)域都被進一步進行氨基酸殘基的取代突變以獲得本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽?；蛘?，本發(fā)明的、包含天冬酰胺殘基的HER2結(jié)合多肽也被進一步突變以取代這些殘基。顯然，后一種選擇只有在保留該分子的HER2結(jié)合能力的程度下才是可能的。
本發(fā)明也涵蓋了通過產(chǎn)生上述多肽的片段而衍生自上述任何多肽的多肽，所述片段保留了HER2親和力。片段多肽是那些保留了穩(wěn)定性并保留了結(jié)合HER2的特異性的。產(chǎn)生對免疫球蛋白G具有保留的結(jié)合特異性的野生型SPA結(jié)構(gòu)域的片段的可能性在Proc NatlAcad Sci USA 935688-5692(1996)中由Braisted AC和Wells JA et al示出。通過使用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計和噬菌體展示的方法，具有59個殘基的三螺旋束的結(jié)合結(jié)構(gòu)域降低到具有33個殘基的雙螺旋衍生物。這通過在不同的區(qū)域逐步選擇隨機突變，使穩(wěn)定性和結(jié)合親和力被反復(fù)(iteratively)改良而達到。根據(jù)與本發(fā)明第一方面的多肽相同的推理，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到一個與“親代”HER2多肽具有相同結(jié)合特性的“最小化”HER2結(jié)合多肽。因此，一個構(gòu)成了本發(fā)明上述方面的多肽的、保留了對HER2的結(jié)合親和力的片段的多肽是本發(fā)明的另一個方面。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含編碼本發(fā)明多肽的序列的核酸分子。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含前述方面的核酸分子的表達載體，以及其它能夠通過表達所述核酸分子而生產(chǎn)本發(fā)明多肽的其它核酸元件。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含前述方面的表達載體的宿主細胞。
本發(fā)明所述的上述后三個方面是生產(chǎn)本發(fā)明多肽的工具，基于要表達多肽的信息和目前重組表達蛋白質(zhì)的技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到這些工具并且將其應(yīng)用于實踐而不需要過多負(fù)擔(dān)。例如，表達未被修飾的蛋白Z的質(zhì)?？梢杂米髌鹗疾牧?參見例如Nilsson B etal(1987)，如前)。使用已知技術(shù)，所需的取代突變可以被引入這個質(zhì)粒中以獲得本發(fā)明的表達載體。
然而，本發(fā)明的多肽也可通過其它方式生產(chǎn)，包括化學(xué)合成或在不同的原核或真核宿主中表達，所述宿主包括植物和轉(zhuǎn)基因動物。當(dāng)使用化學(xué)多肽合成時，上述多肽中的任何天然產(chǎn)生的氨基酸殘基都可以被任何相應(yīng)的、非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基或其衍生物所取代，只要多肽的HER2結(jié)合能力基本不被損害。所述結(jié)合能力應(yīng)該至少被保留，用相應(yīng)的、非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基或其衍生物取代實際上可能改良多肽的HER2結(jié)合能力。并且，摻入非天然產(chǎn)生的氨基酸可以為HER2結(jié)合多肽提供其它分子偶聯(lián)的位點。非經(jīng)典氨基酸或合成的氨基酸類似物，包括但不限于普通氨基酸D-異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨基、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸；設(shè)計氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸及通常的氨基酸類似物。并且，所述氨基酸殘基可以D或L的形式存在。
本分明也涉及使用上述HER2結(jié)合多肽的不同方面，以及不同的治療、診斷、檢測方法，其中由于其結(jié)合特性而使用所述多肽。當(dāng)在以下描述用途和方法中涉及“HER2結(jié)合多肽”時，該術(shù)語不僅涵蓋HER2結(jié)合多肽本身，還包括基于上述多肽的所有分子，例如構(gòu)成多肽片段和/或在融合蛋白中將HER2結(jié)合多肽摻入成為一個部分和/或與標(biāo)記或治療制劑綴合和/或具有額外的氨基酸殘基作為標(biāo)記或用于其他目的的分子。如上述，這些融合蛋白、衍生物、片段等構(gòu)成了本發(fā)明的一個部分。
因此，在某個方面，本發(fā)明提供了本文所述的HER2結(jié)合多肽作為藥物的應(yīng)用。
在另一個方面，本發(fā)明提供了本文所述的HER2結(jié)合多肽在制備一種用于治療至少一種特征在于過表達HER2的癌癥的藥物中的應(yīng)用。特征在于過表達HER2的一種特定的癌癥是乳腺癌。如在背景部分提到的，所有乳腺癌患者中約25％的患者表現(xiàn)出過表達HER2(Slamon DJ et al，如前)。
并不局限于這個理論，本文所述的多肽可以作為治療制劑基于至少一種以下機制(i)加強化療(細胞毒性)，施用該多肽會與目前和將來的化療和激素治療協(xié)同作用。阻斷細胞表面的HER2蛋白已經(jīng)被證明能阻止在DNA破壞藥物影響后的DNA修復(fù)(Pietras RJ et al(1994)Oncogene 91829-1838)。(ii)對腫瘤細胞增殖的抑制(抑制細胞)。這個推理基于如下觀察，當(dāng)一個分子(抗體)附著于細胞表面的HER2蛋白上時，導(dǎo)致一些受體被胞吞，限制了進一步的細胞生長信號，從而發(fā)生了HER2蛋白的下調(diào)(Baselga J et al(1998)Cancer Res582825-2831；Sliwkowski MX et al，如前)。
本發(fā)明的一個相關(guān)方面是提供了一種治療至少一種特征為過表達HER2的癌癥的方法，該方法包括將治療有效量的組合物施用給需要這種治療的患者，該組合物包括本文所述的HER2結(jié)合多肽作為活性物質(zhì)。
本發(fā)明的多肽的HER2結(jié)合特性以及用該多肽生產(chǎn)融合蛋白和/或標(biāo)記的結(jié)合分子的穩(wěn)定性意味著該多肽也可以用于將其它活性物質(zhì)靶向腫瘤部位，這些腫瘤包括過表達HER2的細胞。因此，本發(fā)明的另一方面是提供了本文所述的HER2結(jié)合多肽與一種具有抗癌活性的物質(zhì)綴合的應(yīng)用，以將所述物質(zhì)運送到過表達HER2的細胞。所述綴合的物質(zhì)也可以具有引起患者內(nèi)源免疫系統(tǒng)應(yīng)答的功能。自然殺傷(NK)細胞或者其它免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子會被吸引到細胞表面的HER2和HER2結(jié)合多肽的復(fù)合物上，這通過一種具有能募集該效應(yīng)子的功能的融合部分實現(xiàn)。NK細胞或其它效應(yīng)子，檢測細胞出現(xiàn)異常后，附著到HER2結(jié)合融合蛋白上。最后，癌細胞被NK細胞消滅。(Sliwkowski MX et al，如前；Pegram MD et al(1997)Proc Am AssocCancer Res 38602，Abstract 4044)。
這種活性物質(zhì)可能是通過融合或通過化學(xué)鍵偶聯(lián)到HER2結(jié)合多肽上的蛋白質(zhì)，如選自用于“ADEPT”(antibody-directed enzymeprodrug therapy)應(yīng)用的效應(yīng)酶；用于募集免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞和其它組分的蛋白；細胞因子，如IL-2、IL-12、TNFα、IP10；促凝血因子，如組織因子、von Willebrand因子；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物堿?；蛘?，所述活性物質(zhì)也可能是細胞毒性藥物，如auristatin類似物或阿霉素或放射性同位素(如90Y、131I、211At)，這種同位素可與HER2結(jié)合多肽直接結(jié)合，或通過一種螯合劑，如熟知的螯合劑DOTA或DTPA而與HER2結(jié)合多肽結(jié)合。
在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供了一種在體內(nèi)將具有抗癌活性的物質(zhì)導(dǎo)向過表達HER2細胞的方法，包括施用給患者本文所述的所述活性物質(zhì)與HER2結(jié)合多肽的綴合物。這種綴合物在前文已被適當(dāng)描述。
本發(fā)明的另一方面是使用本文所述的HER2結(jié)合多肽檢測樣品中的HER2。例如，這種檢測可以用來診斷特征為過表達HER2的疾病情況。檢測HER2的存在可以在體內(nèi)也可以在體外進行。體內(nèi)診斷的優(yōu)選選擇是使用正電子放射X線斷層攝影術(shù)，PET。被檢測的樣品可以例如是生物學(xué)液體樣品或組織樣品?，F(xiàn)在的普遍方法是用針對HER2的抗體，這種方法可以適用于本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽，這種方法是組織化學(xué)方法檢測HER2的存在，用來鑒定新鮮、冷凍或福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品中HER2蛋白的過表達。為了檢測HER2，本發(fā)明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它結(jié)構(gòu)域是報告酶或熒光酶?；蛘?，其也可以是被一個或多個熒光制劑和/或放射性同位素標(biāo)記的，任選通過螯合劑標(biāo)記。合適的放射性同位素包括68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I。
本發(fā)明的另一個方面是本文所述的HER2結(jié)合多肽在檢測生物學(xué)液體樣品中HER2的方法中的應(yīng)用。這個方法包括以下步驟(i)提供被檢測患者的生物學(xué)液體樣品，(ii)將本文所述的HER2結(jié)合多肽在能使所述多肽與樣品中存在的任何HER2結(jié)合的條件下加入樣品中，(iii)除去非結(jié)合的多肽，及(iv)檢測結(jié)合的多肽。被檢測到的結(jié)合的多肽的量與樣品中存在的HER2量相關(guān)。在步驟(ii)中，HER2結(jié)合多肽可以以任何適宜的形式加入到樣品中，包括例如這樣的情況，當(dāng)HER2結(jié)合多肽被固定在一種固體支持物上，通過其使樣品接觸，以及這樣的設(shè)置，其中HER2結(jié)合多肽存在于溶液中。
其它與本發(fā)明相關(guān)的方面是一種用來檢測樣品中HER2的方法，包括如下步驟(i)提供一種懷疑含有HER2的組織樣品，例如一個冷凍切片或用福爾馬林包埋的組織切片，(ii)在適宜條件下加入本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽到所述樣品中，所述條件為益于所述多肽與樣品中存在的任何HER2結(jié)合，(iii)除去未結(jié)合的多肽，及(iv)檢測結(jié)合的多肽。檢測到的結(jié)合的多肽的量與樣品中存在的HER2的量相關(guān)。
本發(fā)明還提供了一個診斷組織樣品中HER2過表達的試劑盒，包括與報告酶(如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)融合的、本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽、檢測酶活性的試劑、和陽性和陰性對照組織切片。
本發(fā)明還提供了一個診斷組織樣品中HER2過表達的試劑盒，包括通過抗體檢測的與標(biāo)記(如flag標(biāo)記或myc標(biāo)記)融合的本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽、一個特異于標(biāo)記的一抗、特異于一抗并與報告酶綴合的二抗、檢測酶活性的試劑，和陽性和陰性對照組織切片。
診斷應(yīng)用的一個領(lǐng)域就是在體內(nèi)檢測癌細胞或其聚集物。本發(fā)明提供了一個進行這種診斷的試劑盒，該試劑盒包括標(biāo)記有一個螯合物的、本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽、一種診斷用放射性同位素(非限制性的例子是68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I)，以及用于分析摻入效率的試劑。
如上所述，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽將活性物質(zhì)靶向過表達HER2的細胞如某些類型的癌癥細胞的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一個用于此目的的試劑盒，該試劑盒包括用一個螯合物標(biāo)記的本發(fā)明的HER2結(jié)合多肽、一個治療性放射性同位素(非限制性的例子是(90Y、131I、211At)，以及用于分析摻入效率的試劑。


圖1顯示序列表的序列的對比。本發(fā)明的多肽ZHER2中被修飾的氨基酸位點在圖中已用黑體標(biāo)出(SEQ ID NO2-79)。
圖2顯示實施例1中產(chǎn)生的一個融合多肽的氨基酸序列示意圖。ZHER2代表具有選自SEQ ID NO2-3的序列的HER2結(jié)合結(jié)構(gòu)域，His6代表六組氨酰標(biāo)記。
圖3顯示純化的融合蛋白的凝膠電泳結(jié)果。泳道1His6-ZHER2 A(8.7kDa)；泳道2His6-ZHER2B(8.7kDa)；M分子量標(biāo)準(zhǔn)(LMW-SDSMarker Kit，Amersham Biosciences#17-0446-01)。
圖4顯示向感應(yīng)芯片表面注射10μM的His6-ZHER2A融合蛋白后所獲得的Biacore感應(yīng)圖(sensorgram)，所述表面上固定有AHER2，BHIV-1gp120和CBB。
圖5顯示向感應(yīng)芯片表面注射10μM的His6-ZHER2 B融合蛋白后所獲得的Biacore感應(yīng)圖(sensorgram)，所述表面上固定有AHER2，BHIV-1gp120和CBB。
圖6顯示向其上固定有HER2的感應(yīng)芯片表面注射A1μM；B2μM；C5μM；D10μM；E20μM；F40μM的His6-ZHER2 A融合蛋白后獲得的Biacore感應(yīng)圖。
圖7顯示向其上固定有HER2的感應(yīng)芯片表面注射A1μM；B2μM；C5μM；D10μM；E20μM；F40μM的His6-ZHER2 B融合蛋白后獲得的Biacore感應(yīng)圖。
圖8A顯示HER2-ECD流動池(flow-cell)表面注射選定濃度的His6-ZHER2 A后獲得的Biacore感應(yīng)圖，所述濃度為312.5nM(實心菱形)，156.3nM(實心圓形)，78.2nM(實心三角形)，39.1nM(空心正方形)，19.6nM(空心菱形)，和9.8nM(空心圓形)。
圖8B顯示HER2-ECD流動池表面注射選定濃度的His6-ZHER2B后獲得的Biacore感應(yīng)圖，所述濃度為625nM(實心方形)，312.5nM(實心菱形)，156.3nM(實心圓形)，78.2nM(實心三角形)，39.1nM(空心正方形)和19.6nM(空心菱形)。
圖9顯示His6-ZHER2A與SKBR-3細胞結(jié)合的特異性。在估計理論配體HER2受體比率為5∶1時，125I標(biāo)記的His6-ZHER2A結(jié)合SKBR-3細胞。所有數(shù)值為三次實驗的平均值，誤差棒(error bar)表示標(biāo)準(zhǔn)差。
圖10顯示向有胺偶聯(lián)HER2-ECD的感應(yīng)芯片流動池表面注射純化的His6-ZHER2A(空心正方形)和His6-(ZHER2A)2(實心正方形)后獲得的Biacore感應(yīng)圖。曲線上的y值已被標(biāo)準(zhǔn)化為0-100共振單位(Resonance Unit)。插入的SDS-PAGE凝膠(16％的Tris-甘氨酸同質(zhì)凝膠，還原條件)顯示表達的和IMAC純化的His6-ZHER2A(泳道1)和His6-(ZHER2A)2(泳道2)。泳道M為分子量為kDa的標(biāo)記蛋白。
圖11顯示注射125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2后1小時攜帶腫瘤的裸鼠中放射活性生物分布的比較。封閉用未標(biāo)記的(ZHER2A)2預(yù)注射小鼠的數(shù)據(jù)。非封閉沒有預(yù)注射的小鼠的數(shù)據(jù)。
圖12顯示注射125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2(Z4具體)或者125I-苯甲酸酯-ZTaq(Ztaq5∶4)后4小時攜帶腫瘤的裸鼠中放射活性生物分布的比較。
圖13顯示注射125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2后不同時間點放射性碘在攜帶腫瘤的裸鼠中的生物分布。數(shù)據(jù)由兩次生物分布實驗結(jié)果組成。注射后4小時的數(shù)據(jù)是兩次實驗結(jié)果的平均值。
圖14顯示注射125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2后8小時攜帶腫瘤的裸鼠中放射性碘的生物分布。
圖15顯示血液和腫瘤中放射活性濃度的比較。數(shù)據(jù)由兩次生物分布實驗結(jié)果組成，A實驗數(shù)據(jù)，B通過以兩相指數(shù)衰減模式(two-phase exponential decay model)進行非線性回歸而擬合的曲線。
圖16顯示放射性濃度的腫瘤和血液比率。數(shù)據(jù)由兩次生物分布實驗結(jié)果組成。
圖17是iv尾注射125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2綴合物后后6小時(左側(cè)小鼠)和8小時(右側(cè)小鼠)攜帶腫瘤的小鼠(SKOV-3)的全身γ照相圖。
圖18顯示注射125I-苯甲酸酯-ZHER2A后4小時攜帶腫瘤的裸鼠中放射性的生物分布。
圖19顯示注射125I-苯甲酸酯-ZHER2A后24小時攜帶腫瘤的裸鼠中放射性的生物分布。
圖20顯示注射125I-苯甲酸酯-ZHER2A后在不同時間點在攜帶腫瘤的裸鼠的腫瘤和血液中放射性碘的動力學(xué)。
圖21顯示注射125I-苯甲酸酯-ZHER2A后放射性的腫瘤和血液比率。
圖22是實施例6中產(chǎn)生的一個融合多肽的氨基酸序列的示意圖。ZHER2A代表具有SEQ ID NO2所示序列的HER2結(jié)合結(jié)構(gòu)域，ABD代表葡萄球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
圖23顯示注射125I-苯甲酸酯-ABD(ZHER2A)2后12小時(灰色)和24小時(白色)攜帶腫瘤的裸鼠中放射性的生物分布。
圖24顯示注射(A)125I-ABD(ZHER2A)2，(B)125I-(ZHER2A)2和(C) 125I-ZHER2A后在不同時間點攜帶腫瘤的裸鼠的腫瘤中放射性碘的動力學(xué)。
圖25顯示125I-苯甲酸酯-ZHER2A，125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2和99mTc-(ZHER2A)2的輸送劑量的比較。
圖26顯示注射將99mTc-(ZHER2A)2后8小時攜帶腫瘤的裸鼠中放射性的生物分布。
圖27顯示注射99mTc-(ZHER2A)2后8小時攜帶腫瘤的裸鼠的選定器官中放射性的比較。
圖28是顯示SKBR-3細胞在經(jīng)211At-(ZHER2A)2照射24小時后的生長圖。曲線A的黑色實心圓圈代表沒有被照射的細胞，曲線B的空心方形代表中等水平的211At-(ZHER2A)2照射的細胞，曲線D的實心灰色方形代表用高水平的211At-(ZHER2A)2照射的細胞。曲線C的實心灰色三角形代表用組合有500倍超量的非標(biāo)記His6-(ZHER2A)2的高水平的211At-(ZHER2)2照射的細胞。所有數(shù)值都是三次實驗的平均值，誤差值表示標(biāo)準(zhǔn)差。
圖29A和B顯示用于測定從第四和第五輪親和力成熟選擇中挑選出的克隆的結(jié)合活性的ABAS ELISA的結(jié)果。
圖30是實施例9和10中產(chǎn)生的融合多肽的氨基酸序列的示意圖。ZHER2代表本發(fā)明第一方面的HER2結(jié)合多肽，His6代表六組氨酰標(biāo)記。
圖31為當(dāng)以約50nM的濃度注射于HER2包被的表面時，從本發(fā)明的10個親和力成熟的HER2結(jié)合多肽獲得的感應(yīng)圖的總體圖。AZHER2205，BZHER2149；CZHER2202；DZHER2A；EZHER2222；FZHER2225；GZHER2209；HZHER2229；IZHER2207；JZHER2107；KZHER2101。注意，本研究中添加了ZHER2A，其是從第一代文庫中選擇分離的。
圖32顯示了具有特異性HER2結(jié)合活性的ZHER2變體的結(jié)合分析結(jié)果。如圖所示的是向含有HER2或HIV-1 gp120的感應(yīng)芯片表面注射(A)ZHER23053(B)ZHER20434(C)ZHER20024*所獲得的總體感應(yīng)圖。
下面通過非限制性實施例的描述對本發(fā)明進行進一步闡述。
實施例1HER2結(jié)合多肽的選擇與研究在本實驗中，本發(fā)明的多個HER2結(jié)合多肽是從一個含有許多不同的SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)多肽的文庫中選擇的，并在隨后進行了定性。文庫淘選(panning)和克隆選擇一個組合噬菌體展示文庫已由Nord K et al(1995，如前)基本制備。本研究所用的該文庫池(pool)中包含有8.7×108個Z蛋白變體(Affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32和35位具有隨機的氨基酸殘基。用生物素?；娜薍ER2胞外結(jié)構(gòu)域(HER2-ECD)作為靶(重組人HER2胞外結(jié)構(gòu)域，氨基酸238-2109，由Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，USA提供)在四輪淘選循環(huán)中選擇結(jié)合抗原的Affibody分子。經(jīng)過這四輪選擇循環(huán)，共挑出91個克隆用于噬菌體ELISA以分析其HER2結(jié)合活性。
用于HER2結(jié)合分析的噬菌體ELISA將經(jīng)四輪選擇獲得的克隆的噬菌體置于96孔板上生產(chǎn)，酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)用于篩選表達HER2結(jié)合Affibody分子的噬菌體。單菌落用于接種在深孔96孔板中的補充有2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的250μl TSB培養(yǎng)基(30.0克胰胨豆胨肉湯(Tryptic Soy Broth)(Merck)，加水至1升，高壓滅菌)，37℃在搖床上過夜生長。取5μl的過夜培養(yǎng)物加入到新平板中補充了0.1％的葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的500μl的TSB+YE培養(yǎng)基(30.0克胰胨豆胨肉湯(Merck)，5.0g酵母提取物，加水至1升，高壓滅菌)中。在37℃生長3小時后，向每個孔中加入0.5μl的5×1012pfu/ml(2.5×109pfu)輔助噬菌體M13K07(NewEngland Biolabs，#NO315S)和100μl的TSB+YE培養(yǎng)基，然后將平板于37℃不搖動溫育30分鐘。向每個孔中加入補充了IPTG、卡那霉素和氨芐青霉素的300μl的TSB+YE至終濃度為1mM的IPTG，25μg/ml的卡那霉素和100μg/ml的氨芐青霉素，平板在30℃在搖床上溫育過夜。將細胞以2500g離心15分鐘沉淀，含有表達Affibody分子的噬菌體的上清用于ELISA。將100μl的含4μg/ml的HER2的PBS(2.68mM KCl，137mM NaCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4，pH7.4)加到微量滴定板(Nunc #446612)，并于4℃溫育1個月。在室溫下用含2％脫脂奶粉的PBS(封閉緩沖液)對封閉孔1小時后，加入200μl含噬菌體的上清和50μl的10％封閉緩沖液。平板在室溫溫育2小時。將多克隆抗體(兔抗M13，Abcam#ab6188)用2％封閉緩沖液1∶1000稀釋，向每個孔中加入150μl。平板在室溫溫育1小時。綴合了堿性磷酸酶的山羊抗兔IgG抗體(Sigma #A-3687)用2％封閉緩沖液1∶10000稀釋，之后向每個孔中加入150μl并在室溫溫育1小時。用含有1M二乙醇胺，5mM MgCl2，pH9.8及水的1∶1混合物溶解Sigma-104底物(Sigma #104-105)配制顯影液(1片/5ml的1∶1混合物)。然后，向每個孔中加入180μl的顯影液。每次加入新的試劑之前，用PBS-T(PBS+0.1％Tween-20)洗孔兩次并用PBS洗一次。加入底物25分鐘后，在ELISA分光光度計(Basic Sunrise，Tecan)上讀取A405的值。
用高于0.5的A405的ELISA值為閾值標(biāo)準(zhǔn)，鑒定編碼HER2結(jié)合物(binder)的噬菌體。48個克隆的ELISA信號高于這個值，并與另外隨機挑選的5個無ELISA值的克隆進行DNA序列分析。
DNA序列分析利用ABI PRISM，BigDyeTMTerminator v2.0 Ready ReactionCycle測序試劑盒(Applied Biosystems)根據(jù)廠商的指導(dǎo)從上述方法中所分離的克隆的DNA進行測序。制備質(zhì)粒以及用寡核苷酸RIT-27(5′-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3’)和生物素?；腘OKA-2(5′-生物素-CGGAACCAGAGCCACCACCGG-3’)對編碼Affibody分子的DNA進行測序。在ABI PRISM3700 Genetic Analyser(AppliedBiosystems)上分析序列。在上述挑選的53個克隆中，發(fā)現(xiàn)有一些克隆編碼相同的氨基酸序列?？紤]到簡并，在ELISA結(jié)合分析中選擇的克隆表達的4種Affibody分子的序列如圖1所示(ZHER2A-D)，并在序列表中鑒定為SEQ ID NO2-5。
克隆和蛋白生產(chǎn)使用如圖2示意圖所示的編碼構(gòu)建體的表達載體，在大腸桿菌(E.coli)中表達ZHER2多肽。所述多肽從而生產(chǎn)為與N末端六組氨酰標(biāo)記的融合體。在固定的金屬離子親和層析(IMAC)柱上純化融合多肽His6-ZHER2A和His6-ZHER2B并在SDS-PAGE上進行分析。SDS-PAGE實驗的結(jié)果如圖3所示。
融合多肽的生物傳感器分析在Biacore2000系統(tǒng)(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上利用表面等離子共振分析上述部分生產(chǎn)的His標(biāo)記的ZHER2變體與HER2之間的相互作用。根據(jù)操作手冊，在不同的流動池上通過偶聯(lián)于CM-5芯片表面上羧化葡聚糖層的胺將人HER2，HIV-1 gp120(ProteinSciences Corporation，#2003-MN)和BB(源自鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合蛋白)固定，后兩者作為對照。人HER2、HIV-1 gp120和BB的固化分別產(chǎn)生了1900、6290和1000的共振單位(RU)。第四個流動池表面被激活和失活以作為注射時的空白對照。用HBS(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性劑P-20，pH7.4)將His6-ZHER2A和His6-ZHER2B蛋白稀釋到終濃度為10μM，并以固定流速30μl/分鐘和隨機順序注射，均一式兩份。純化的蛋白His6-ZHER2A和His6-ZHER2B與HER2相互作用的能力已被證實，分別在圖4和5中的感應(yīng)圖加以說明。
此外，也對His6-ZHER2A和His6-ZHER2B進行了動力學(xué)研究。使用了人HER2固化其上的、具有1900RU的CM-5芯片。在HBS中分別制備了His6-ZHER2A和His6-ZHER2B的一系列六個不同濃度(1μM-40μM)，并以流速30μl/分鐘和隨機順序注射，均一式兩份?？傋⑸鋾r間為50秒(締合)，隨后洗滌6分鐘(解離)。用20mM HCl處理10秒使表面再生。具有固定的HER2的池的測量應(yīng)答應(yīng)減去參照池(激活/失活表面)的測量應(yīng)答。利用BIAevaluation 3.0.2軟件(Biacore AB)的1∶1朗繆爾結(jié)合模型分析結(jié)合曲線(感應(yīng)圖)。如圖6(His6-ZHER2A)和圖7(His6-ZHER2B)所示結(jié)合曲線清楚示出，His6-ZHER2A和His6-ZHER2B同樣清楚地結(jié)合于HER2，該結(jié)果被締合和解離曲線所證實，該曲線顯示His6-ZHER2A的指示KD為10-100nM，而His6-ZHER2B的為200-400nM。此外，結(jié)合是選擇性的，因為所研究的HER2結(jié)合多肽不與BB和gp120對照抗原結(jié)合(圖4和圖5)。
在第二個動力學(xué)實驗中，His6-ZHER2A和His6-ZHER2B變體以不同濃度(0-5μM，His6-ZHER2A最低濃度為0.0098μM，His6-ZHER2B最低濃度為0.0196μM，HBS稀釋)和30μl/分鐘的流速被注射到HER2表面。在動力學(xué)分析之前，蛋白濃度通過氨基酸分析確定。解離平衡常數(shù)(KD)，締合速率常數(shù)(Ka)以及解離速率常數(shù)(Kd)用BIAevaluation3.0.2軟件(Biacore)在假設(shè)一對一結(jié)合的條件下進行計算。對于首先的兩個Biacore分析，樣品在25℃以隨機順序一式兩份，而且每次注射之后，通過注射10mM HCl使流動池再生。在評估結(jié)合曲線(圖8A-8B)時，可確定His6-ZHER2A的解離平衡常數(shù)(KD)約為50nM，而His6-ZHER2B的約為140nM。導(dǎo)致KD差異的原因極有可能是解離速率的顯著差異，可以通過比較圖4的圖表A和圖5的圖表A看出。對His6-ZHER2A，締合速率常數(shù)(Ka)約為1.8×105M-1s-1，解離速率常數(shù)(Kd)約為9.9×10-3s-1，而對His6-ZHER2B，由于快速的締合和解離動力學(xué)，很難估計其Ka和Kd。因此，選擇表現(xiàn)出較強靶結(jié)合的His6-ZHER2Aaffibody變體進行進一步的定性。
實施例2ZHER2A與表達HER2細胞的結(jié)合細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞系SKBR-3購買于ATCC(ATCC #HTB-30)，已知該細胞系每個細胞表達約2×106個HER2分子。細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，其添加了10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和PEST(100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，皆購自Biochrom KG(柏林，德國)。細胞在37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中培養(yǎng)，實驗開始前三天在3cm有蓋培養(yǎng)皿中接種。
放射性標(biāo)記標(biāo)記前體，N-琥珀酰亞胺基p-(三甲基-甲錫烷基)苯甲酸酯(N-succinimidyl p-(trimethyl-stannyl)benzoate，SPMB)根據(jù)Orlova etal，Nucl Med Biol 27827-835(2000)的方法進行制備，將5μg的SPMB加到含有5MBq125I的5％乙酸溶液中。加入40μg氯胺-T(Sigma，St.Louis，MO)的水溶液以啟動反應(yīng)。將反應(yīng)混合物振蕩5分鐘，加入焦亞硫酸鈉(Aldrich，Steinheim，德國)水溶液以終止反應(yīng)。將放射標(biāo)記前體加到含有40μg的His6-ZHER2A或His6-ZHER2B的0.07M，pH9.2的硼酸鹽緩沖液中。在室溫下連續(xù)振蕩45分鐘進行偶聯(lián)反應(yīng)。利用經(jīng)PBS平衡的NAPTM-5大小排阻柱(Amersham Biosciences)將標(biāo)記的ZHER2變體與低分子量產(chǎn)物分離。然后利用Biacore技術(shù)分析標(biāo)記的ZHER2變體以證實標(biāo)記過程不影響對HER2-ECD的結(jié)合親和力。兩種ZHER2變體都保持了親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。
細胞檢測每個培養(yǎng)皿約有100000個SKBR-3細胞，加入含有14ng標(biāo)記過的His6-ZHER2A或His6-ZHER2B的1ml補充的培養(yǎng)基。這個量相應(yīng)于配體∶受體的理論比率為5∶1。為了確定非特異性結(jié)合不是來自細胞，對三個無細胞的培養(yǎng)皿也采用相同方式處理。處理細胞所獲得的數(shù)值應(yīng)減去非細胞對照的數(shù)值。為了分析細胞結(jié)合特異性，三個培養(yǎng)皿不僅用標(biāo)記過的ZHER2變體處理，而且也用500倍過量的非標(biāo)記的ZHER2變體處理。在37℃溫育3小時后，去除放射性培養(yǎng)基并用冰凍的無血清培養(yǎng)基迅速洗滌培養(yǎng)皿三次。用0.5ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.25％/0.02％的PBS；Biochrom KG，柏林，德國)在37℃對細胞進行胰蛋白酶消化15分鐘。然后用1ml補充的培養(yǎng)基重懸細胞，0.5ml細胞懸液用于細胞計數(shù)，另外1ml則用自動γ計數(shù)器測量放射性。
如圖9所示，His6-ZHER2A表現(xiàn)出與SKBR-3細胞的特異性結(jié)合，已知每個細胞表達2×106個HER2受體(“非封閉”條)。通過加入過量非標(biāo)記的His6-ZHER2A(“封閉”條)可將放射標(biāo)記的His6-ZHER2A的結(jié)合完全封閉。然而，His6-ZHER2B與SKBR-3細胞的結(jié)合低于檢測限度(數(shù)據(jù)未顯示)，可能是因為該ZHER2變體較快的解離速率(如前所述)。
實施例3
HER2結(jié)合多肽二聚體的表達及特性分析DNA載體構(gòu)建和蛋白生產(chǎn)如上述選擇一種新的affibody配體，即His6-ZHER2A，其具有對HER2受體的親和力。通過將編碼ZHER2A多肽的基因片段亞克隆到His6-ZHER2A的表達載體中來構(gòu)建二聚體ZHER2變體。在DNA測序儀ABI Prism3700 Analyzer(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上通過DNA測序確證導(dǎo)入的ZHER2A片段?？寺∵^程中采用大腸桿菌(Escherichia coli)菌株RR1ΔM15(Rther，Nucleic Acids Res 105765-5772(1982))作為細菌宿主。所得載體在T7啟動子的控制下(Studier et al，Methods Enzymol 18560-89(1990))編碼一個二聚體ZHER2變體，(ZHER2A)2，與N末端六組氨酰(His6)標(biāo)記融合，其允許通過固化金屬離子親和層析(IMAC)進行純化。
二聚體ZHER2變體在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達為His6標(biāo)記融合蛋白，在變性條件下，在Talon金屬親和樹脂(8901-2，BDBiosciences，CA)柱上通過IMAC純化回收，如實施例1中對多肽單體所述。根據(jù)產(chǎn)品說明書(Applied Biosystems)，使用以PBS(10mM磷酸鹽，154mM NaCl，pH7.1)平衡的PD-10柱對純化的His6-(ZHER2A)2融合蛋白進行復(fù)性。利用適當(dāng)?shù)南庀禂?shù)(30440M-1cm-1)，用280nm處測量的吸光值計算蛋白濃度，同時也通過氨基酸分析(Aminosyraanalyscentralen，Uppsala，Sweden)證實。利用Novex系統(tǒng)(Novex，CA，USA)在16％的Tris-甘氨酸同質(zhì)凝膠中通過SDS-PAGE對純化的蛋白進一步分析。蛋白條帶用考馬氏亮藍染色觀察。通過SDS-PAGE分析，可以看出該蛋白的預(yù)期分子量的特異條帶(15.6kD)(圖10，插入的泳道2)。用280nm測量的吸光值可估計出細胞培養(yǎng)物的表達水平約為200mg/l。
生物傳感器分析利用Biacore2000系統(tǒng)(Biacore AB)進行實時生物特異相互作用分析(BIA)。根據(jù)產(chǎn)品說明書，將重組的HER2的胞外結(jié)構(gòu)域(HER2-BCD)稀釋于10mM NaAc，pH4.5中，然后通過胺偶聯(lián)固定于與CM5感應(yīng)芯片(研究級)(BR-1000-14，Biacore AB)上的一個流動池表面的羧化葡聚糖層上。另一個流動池表面被激活和失活，以作為參照表面。根據(jù)產(chǎn)品說明書(Amersham Biosciences)，用NAPTM-10柱通過凝膠過濾將緩沖液改變?yōu)镠BS(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性劑P-20，pH7.4)，之后將樣品過濾(0.45μm；Millipore，Billerica，MA)。結(jié)合分析在25℃進行，HBS為工作液。所有Biacore分析，樣品都以隨機順序運行，一式兩份，每次注射后用10mM HCl注射再生流動池。
在第一次實驗中，以流速5μl/分鐘將5μM的每種蛋白注射到HER2-ECD表面，以檢測ZHER2蛋白的單體和二聚體(實施例1中的His6-ZHER2A及His6-(ZHER2A)2)間與HER2-BCD結(jié)合的差異。從圖10可看出，His6-(ZHER2A)2具有較低的脫離速率(off-rate)，表明其相對His6-ZHER2A而言His6-(ZHER2A)2和HER2-BCD具有更強的結(jié)合。
在第二次實驗中，將His6-(ZHER2A)2進行動力學(xué)分析，其中以不同濃度(0-5μM，最低濃度為0.0049μM，HBS稀釋)和30μl/分鐘的流速被注射到HER2-ECD表面。在動力學(xué)分析之前，通過氨基酸分析測定了蛋白濃度。解離平衡常數(shù)(KD)，締合速率常數(shù)(Ka)以及解離速率常數(shù)(Kd)用BIAevaluation 3.2軟件(Biacore AB)在假設(shè)1∶1結(jié)合的條件下進行計算。對結(jié)合曲線進行評估，可確定解離平衡常數(shù)(KD)約為3nM，締合速率常數(shù)(Ka)約為2.5×105M-1s-1，及解離速率常數(shù)(Kd)約為7.6×10-4s-1。通過比較這些值與實施例1中所獲得的His6-ZHER2A單體動力學(xué)常數(shù)，證實二聚體His6-(ZHER2A)2具有更強的結(jié)合。這種改良的表觀較高的親和力是因為這些二聚體結(jié)構(gòu)的親和力作用，證實了更早的其它Affibody分子(Gunneriusson E et al，Protein Eng 12873-878(1999))。
實施例4(ZHER2A)2在攜帶SKOV-3異種移植物的裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向在本實施例的實驗中，用125I標(biāo)記實施例3的His6-標(biāo)記的二聚體(ZHER2A)2多肽，并將其注射到攜帶特征為HER2過表達的移植腫瘤的小鼠體內(nèi)。進行了多肽生物分布的研究，并對小鼠成像以研究標(biāo)記多肽的定位。一個對Taq DNA聚合酶有結(jié)合親和力的標(biāo)記的Z結(jié)構(gòu)域衍生物被用作對照，其對HER2沒有特異性(ZTaq；Gunneriusson E etal，如前所述，并被稱為ZTaq S1-1)。
材料與方法間接放射性碘化(ZHER2A)2在一個硅化微量離心管里加入2.3μl125I(相應(yīng)于10MBq)(Na[125I]，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。再加入10μl乙酸(0.1％溶于水)、5μl N-琥珀酰亞胺基p-三甲基-甲錫烷基-苯甲酸酯(1mg/ml，溶于5％乙酸的甲醇)(參考Koziorowski J et al，Appl RadiatIsot 49955-959(1998))和10μl氯胺-T(溶于水，4mg/ml)(CH3C6H4SO2N(Cl)Na·3H2O，Sigma，St Louis，MO，USA)。以相同的混合使反應(yīng)進行5分鐘。反應(yīng)以10μl焦亞硫酸鈉中止(8mg/ml，溶于水)(Na2S2O5，Sigma，St Louis，MO，USA)。40μl(ZHER2A)2二聚體(0.25mg/ml，溶于0.07M硼酸鹽緩沖液中，pH9.2(硼酸鈉，Na2B4H7·10H2O，Sigma，St Louis，MO，USA，及氫氯酸，HCl，Merck，Darmstadt，Germany))加入到反應(yīng)試管中。每個試管中加入40μl硼酸緩沖液以使pH增加到9。持續(xù)振蕩至反應(yīng)時間到45分鐘后，在根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明用PBS平衡的NAP-5大小排阻柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上分離反應(yīng)組分。反應(yīng)試管，空級分，高MW級分，低MW級分和柱子分別在60cm(125I)用手持γ探測器(Mini-instruments Ltd，Essex，UK)測量以計算標(biāo)記產(chǎn)量。高分子量級分于-20℃儲存于硅化微量離心管中至第二天使用。得到的產(chǎn)量為25-30％。
間接放射性碘化ZTaq[125I]-NaI儲存液與10μl的0.1％乙酸水溶液、5μl N-琥珀酰亞胺基p-三甲基-甲錫烷基-苯甲酸酯溶液(1mg/ml，溶于5％乙酸的甲醇)及10μl的氯胺-T水溶液(4mg/ml)混合。反應(yīng)混合物劇烈渦旋，室溫下振蕩溫育5分鐘。10μl焦亞硫酸鈉水溶液(8mg/ml)中止反應(yīng)。21μl溶解于PBS的ZTaq溶液(2.4mg/ml)加入到粗反應(yīng)混合物中。用硼酸緩沖液(0.1M，pH9.15)調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH值到約9。反應(yīng)混合物在室溫下振蕩溫育30分鐘并在用于PBS中的5％白蛋白(牛，級分V，Sigma，St.Louis，MO，USA)預(yù)平衡的NAP-5柱中分離高分子量級分(標(biāo)記的ZTaq)和低分子量級分，PBS作為洗脫液。得到的放射化學(xué)產(chǎn)量在75％和80％之間。特異的放射性是100kBq/μg。
動物的制備在C181/1條例許可下使用來源于M&B的雌性雜交繁殖的nu/nubalb小鼠(到達時10-12周齡)。在異種移植之前的一周里，利用標(biāo)準(zhǔn)飼料、墊料和環(huán)境使小鼠適應(yīng)瑞典Uppsala的Rudbeck實驗室的動物設(shè)施。小鼠自由采食和飲水。
第一次實驗前兩月，將5×106個SKOV-3人卵巢癌細胞(ATCC#HTB-77)皮下注射入33只小鼠的右后腿。這組命名為“A組(setA)”。
第二次實驗前三周，將107個SKOV-3細胞皮下注射入32只小鼠的兩只后腿。這組命名為“B組”。
對于成像研究，具有大腫瘤的兩只小鼠(見下文)取自A組，所有其它的取自B組。
實驗時，腫瘤已經(jīng)在所有小鼠中建立，但是相當(dāng)小并在大小和狀態(tài)上有差異(被包被的和侵潤性的，血管形成階段)。使用時，所有小鼠體重在22-27克。
生物分布實驗IA組的20只小鼠被隨機分為5組(I-V)，4只一組。A組中具有較大腫瘤的2只小鼠不作成像研究。分組、注射和處死時間見方案1。
小鼠在尾部iv注射了于50μl的PBS中的0.5μg的(ZHER2A)2，其間接標(biāo)記了125I(每只小鼠100kBq)。在注射標(biāo)記的(ZHER2A)245分鐘前，組II的小鼠(“封閉”組)sc預(yù)注射了于200μl的PBS中的0.05mg未標(biāo)記的(ZHER2A)2。通過沒有任何明顯的問題來判斷，所有注射都被很好的耐受。
方案1

在處死前5分鐘，小鼠都被ip注射致死劑量的Ketalar/Rompun溶液(20μl/g體重，Ketalar 10mg/ml(Pfizer，New York，USA)，Rompun1mg/ml(Bayer，Leverkusen，Germany))。使用1ml用稀釋過的肝素(5000IE/ml，Leo Pharma，Copenhagen，Denmark)沖洗過的注射器在處死時通過心臟穿刺采血。血液、尿樣、肌肉、骨骼、大腸和小腸、心臟、膀胱、肺、肝、脾、胰、腎、胃、唾液腺和甲狀腺、腦、腫瘤和尾的樣品都被切碎并收集到20ml的塑料瓶中。在B組的某些小鼠的含有多個腫瘤的情況中，每個腫瘤都收集在不同的瓶中。稱量器官和組織樣品的重量，用γ計數(shù)器測量它們的放射活性(含有3-inch NaI(Tl)檢測裝置的自動γ計數(shù)器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，F(xiàn)inland)。
生物分布實驗IIB組的24只小鼠被隨機分為6組，4只一組。B組的8只有較大腫瘤的小鼠用于成像分析。分組、注射和處死時間見方案2。
I組和IV-VI組的小鼠在尾部iv注射于50μl的PBS中的0.5μg的(ZHER2A)2，其間接標(biāo)記了125I(每只小鼠100kBq)。組II的小鼠被注射同樣量的放射性碘化的(ZHER2A)2，但是在尾部皮下注射。組III的小鼠(“陰性對照組”)在尾部iv注射于50μl的PBS中1.07μg的、間接標(biāo)記了125I的ZTaq(每只小鼠100kBq)。通過沒有任何明顯的問題來判斷，所有注射都被很好的耐受。
方案2

如上述生物分布實驗I進行處死和采樣。在第二次實驗中，畜體同樣被收集，其放射性含量也被測量。稱量器官和組織樣品的重量，用γ計數(shù)器測量它們的放射活性。
放射活性測定采用測量125I的標(biāo)準(zhǔn)方法。計算相對于背景水平的每分鐘計數(shù)進行評估。組織吸收值用％ID/g表示，每克組織注射劑量的百分?jǐn)?shù)按下式計算 其中iv注射時注射的放射活性＝對照注射器中的平均放射活性-使用的注射器中的放射活性-尾部的放射活性sc注射時注射的放射活性＝對照注射器中的平均放射活性-使用的注射器中的放射活性成像研究為了成像，小鼠被分為2組，每組5只，每組中需包括一只來自A組的具有一個大腫瘤的小鼠。B組的小鼠被隨機化。在成像前6h或8h之前，兩組小鼠都分別注射于90μl的PBS中的2.3μg(ZHER2A)2，其間接標(biāo)記了125I(每只小鼠2.9MBq)。通過沒有任何明顯的問題來判斷，所有注射都被很好的耐受。
小鼠整個身體成像是在注射(pi)放射綴合物后6和8小時后進行。小鼠被迫排尿，ip注射致死的Ketalar/Rompun麻醉并通過頸部錯位(cervical dislocation)處死。小鼠(每組5個)被置于一個e.CAMγ-相機內(nèi)(Siemens，Germany)，每個時間點取10分鐘的圖像。具有較大腫瘤的2只小鼠(每組一只)被選作用同樣相機進行特殊圖像研究，曝光20分鐘。在具有99％窗口大小的35keV能量窗口下用低能量、高分辨率瞄準(zhǔn)儀在256×256-bit矩陣中獲得圖像。使用NuclearDiagnostics(Kent，UK)的Hermes軟件來幫助分析圖像。
結(jié)果封閉實驗進行生物分布實驗I的封閉實驗是為了證明腫瘤吸收(ZHER2A)2是否是特異的和是否受受體調(diào)控。在放射性碘化的二聚體被主要iv注射前，0.05mg未標(biāo)記的(ZHER2A)2被sc注射入方案1中組II的小鼠中。比較了組I和組II中注射后一小時的放射活性的吸收。兩組小鼠中腫瘤與血液的比率是0.72(組I，平均)和0.25(組II，平均)(圖11)。然而，吸收的差異并不顯著(p＝0.16)。在除腫瘤外的所有器官中，在封閉與非封閉動物中放射活性的吸收是相同的。
非封閉小鼠中出現(xiàn)相當(dāng)?shù)偷哪[瘤與血液比率可以通過該實驗所選的早期時間點(1h pi)來解釋。
吸收特異性在生物分布實驗II中，組III的小鼠被注射的ZTaq的量相當(dāng)于其它組中小鼠被注射的(ZHER2A)2的量。ZTaq使用和(ZHER2A)2相同的間接方法標(biāo)記了放射性碘。ZTaq對于HER2受體是非特異的。比較了組I和組II注射后4小時的放射活性的吸收。這個實驗的結(jié)果表明(圖12)，非特異的ZTaq分子比特異(ZHER2A)2分子具有較低的腫瘤吸收。本實驗中腫瘤與血液的比率是1.34(組I，特異的(ZHER2A)2)和0.15(組III，非特異的ZTaq)。統(tǒng)計學(xué)分析表明這個差異是顯著的(p＝0.009)。在所有其它器官中，對兩種Z分子，放射活性的吸收水平是相同的。
與封閉實驗相比，本實驗觀測到了更高的(ZHER2A)2的腫瘤與血液比率。這很可能是由于實驗時間點較晚(4h pi)造成的。
生物分布生物分布實驗I和II中iv注射了標(biāo)記的(ZHER2A)2的小鼠組的結(jié)果與攜帶腫瘤小鼠的器官和組織中放射性碘生物分布分析相結(jié)合。結(jié)果示于圖13-16。
參考圖13和14，腫瘤中125I的濃度比大多數(shù)正常器官高，表明(ZHER2A)2多肽能夠靶向具有HER2的腫瘤細胞。正常器官和組織中放射活性濃度低于腫瘤中的，除了腎(所有時間點)、甲狀腺(所有時間點)和肝(早期時間點)。本實驗展示了放射性碘從血液和正常器官中快速清除。正常器官的清除大體上緊隨血液中的清除，甲狀腺除外，發(fā)現(xiàn)其中聚集放射性碘。甲狀腺對游離碘吸收的增加，即使在間接標(biāo)記的方法中也會出現(xiàn)，這是眾所周知的并在一定程度上通過“冷凍”或非放射性碘來避免(Larsen RH et al，Nucl Med Biol 25351-357(1998))。高濃度的放射性碘也在小鼠腎臟中發(fā)現(xiàn)，因為腎臟是這種小蛋白和代謝物的主要排泄途徑。
圖15A和B示出放射性碘濃度在血液和腫瘤中隨時間變化的進程。從pi 4小時開始，腫瘤的放射活性高于血液放射活性。用圖15A所提供的實驗數(shù)據(jù)可以通過來自于GraphPad Software(San Diego，USA)的GraphPad Prism v3.0計算血液和腫瘤中放射性碘的半衰期。使用含有兩相指數(shù)衰減的非線形回歸作為模型，所得圖示于圖15B。腫瘤中T1/2α(0.36小時)比血液中的短(0.76小時)，但T1/2β卻長(腫瘤中87.5小時，血液中4.3小時)，這與取得的結(jié)果有很好的一致性。為了比較，血液中標(biāo)記的二聚體的T1/2α用取自正常的、不攜帶腫瘤的小鼠所得的生物分布數(shù)據(jù)計算，該值為0.3小時(數(shù)據(jù)未示出)。
腫瘤與血液的放射性濃度比率在pi至少12小時期間隨時間增加(圖16)。該比率是圖像對比的很好估計因子，因為放射性成像的主要背景來自血液中的放射活性。當(dāng)考慮到腫瘤與血液的比率和腫瘤的放射性濃度，可以得出這樣的結(jié)論，pi6和8小時可能是最佳的圖像時間點。為獲得好對比度的圖像，腫瘤與非腫瘤的放射活性濃度比應(yīng)該不小于2。
γ圖像γ圖像的拍攝來自兩組中的5只小鼠(分別在注射后6和8小時)，每一只都被成像。在兩個時間點在所有小鼠中都可以鑒定出具有清晰結(jié)構(gòu)的腎臟。注射后6小時，在小鼠的圖像中腎臟以上可見一些額外的結(jié)構(gòu)(可能是肝臟)，也可看到來自于總體血池(generalized bloodpool)的一個提高的背景。一些動物在膀胱中有尿液，這也可直接看到。在小鼠注射后8小時的圖像上，可以鑒別在頸部有額外的結(jié)構(gòu)，在所有的可能性中都是甲狀腺。
在每一個圖像部分的5個動物中，可以看到一個大的入侵性腫瘤(來自第一批的SKOV-3注射)。明顯沒有其它腫瘤定位。被研究的兩只動物被選出，進行額外的成像，結(jié)果示于圖17中。
總結(jié)通過苯甲酸酯基團間接標(biāo)記有放射性碘(125I)的二聚體多肽(ZHER2A)2在攜帶SKOV-3(卵巢癌細胞系)腫瘤的小鼠中的生物分布示出與正常小鼠中綴合物的正常生物分布具有很好的一致性。實現(xiàn)了125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2形式注射入的放射性碘的腫瘤吸收。腫瘤吸收是受體介導(dǎo)的，并具有特異性，可以通過使用一種高濃度非標(biāo)記的(ZHER2A)2分子的預(yù)注射封閉實驗，和通過注射一種非特異的、標(biāo)記的Z變異體ZTaq來示出。對所得數(shù)據(jù)的分析表明在注射后4小時后腫瘤中的放射活性濃度高于血液中放射活性濃度，并且比注射后6小時后大多數(shù)正常器官和組織還高，除了腎臟和甲狀腺。攜帶SKOV-3異種移植腫瘤的小鼠的γ圖像在注射后6小時和8小時得到。得到了很好的分辨率。在兩個時間點，大的入侵性腫瘤能夠被清楚地鑒別。
實施例5His6-ZHER2A單聚體在攜帶SKOV-3異種移植物的裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向在本實施例的實驗中，實施例1和2的單體ZHER2A多肽是125I放射標(biāo)記的，并注射到攜帶特征為HER2過表達的移植腫瘤的小鼠中。該多肽生物分布的研究是用以研究其定位。
材料和方法間接放射性碘化ZHER2A為了用125I標(biāo)記，40μl的單體His6-ZHER2A經(jīng)過與實施例4中的二聚體多肽構(gòu)建體相同的處理。
動物制備在C66/4條例許可下使用來源于M&B的雜交繁殖的nu/nu balb小鼠(到達時10-12周齡)。在異種移植建立之前的一周里，利用標(biāo)準(zhǔn)飼料、墊料和環(huán)境使小鼠適應(yīng)瑞典Uppsala的Rudbeck實驗室的動物設(shè)施。小鼠自由采食和飲水。實驗前三周，將5×107個SKOV-3人卵巢癌細胞(ATCC #HTB-77)皮下注射入16只小鼠的右后腿。實驗時，腫瘤已經(jīng)在所有小鼠中建立，所有小鼠體重在22-27克。
放射活性測定按照實施例4所述測量125I及計算％ID/g。
生物分布實驗16只小鼠隨機分成4組(I-IV)，每組4只小鼠。分組、注射及處亡時間參見方案3。小鼠在尾部iv注射于50μl的PBS中的0.5μg、間接用125I標(biāo)記的ZHER2A。所有注射都忍受良好，沒有任何肉眼可觀察到的缺陷。
方案3

如實施例4第一個生物分布研究所述處死小鼠和取樣。稱量器官和組織樣品的重量，用γ計數(shù)器測量它們的放射活性(具有3-inch NaI(T1)檢測裝置的自動γ計數(shù)器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，F(xiàn)inland)。
結(jié)果分析了sc注射標(biāo)記的ZHER2A的幾組小鼠的結(jié)果以建立小鼠器官和組織中放射性碘的生物分布。結(jié)果示于圖18-20。參考圖18和19，腫瘤中125I的濃度比大多數(shù)正常器官在4和24小時高，表明ZHER2A多肽能夠靶向攜帶HER2的腫瘤細胞。發(fā)現(xiàn)在正常器官和組織中放射活性濃度低于腫瘤中的，除了腎臟(所有時間點)和甲狀腺(所有時間點)。本實驗還示出從血液和正常器官中放射性碘的快速清除。從正常器官中的清除主要在血液清除之后，但甲狀腺除外，在其中發(fā)現(xiàn)放射性碘聚集。在小鼠腎臟中也發(fā)現(xiàn)了高濃度的放射性碘。圖20示出血液中和腫瘤中放射性碘濃度隨時間的變化。從注射后4小時開始，腫瘤放射活性比血液放射活性高6倍。腫瘤與血液中放射活性濃度的比率(圖21)在注射后至少8小時內(nèi)隨時間增長，注射后8小時的比率是10比1。
總結(jié)通過苯甲酸酯基團間接標(biāo)記有放射性碘(125I)的單體多肽ZHER2A在攜帶SKOV-3(卵巢癌細胞系)腫瘤的小鼠中的生物分布與正常小鼠中綴合物的正常生物分布有很好的一致性。實現(xiàn)了腫瘤對以125I-苯甲酸酯-ZHER2A形式注射的放射性碘的吸收。對所得數(shù)據(jù)的分析表明在注射后4小時，腫瘤中的放射活性濃度高于血液中的放射活性濃度，與二聚體形式的(ZHER2A)2相比，其也比注射后4小時的大多數(shù)正常器官和組織高，但腎臟和甲狀腺除外。
實施例6ABD(ZHER2A)2在攜帶SKOV-3異種移植物的裸鼠中的生物分布及腫瘤靶向在本實施例的實驗中，通過遺傳工程將實施例3的二聚體(ZHER2A)2多肽在其N末端與鏈球菌G蛋白的“白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域”(ABD)融合，以形成命名為ABD(ZHER2A)2的多肽(圖22)。ABD以高親和力結(jié)合人和小鼠血清白蛋白(M Johansson et al，J Biol Chem2778114-8120(2002))。白蛋白是血液中一種血漿清除緩慢、含量豐富的蛋白質(zhì)。高親和性結(jié)合白蛋白意味著應(yīng)使結(jié)合物具有與白蛋白本身相似的緩慢動力學(xué)。理論上，在動物體內(nèi)延長一個腫瘤靶向配體的循環(huán)時間，就會增加運輸?shù)侥[瘤的劑量。為檢測這個觀點，用125I放射標(biāo)記ABD(ZHER2A)2多肽并將其注射到攜帶特征為HER2過表達的移植腫瘤的裸鼠體內(nèi)。通過研究該多肽的生物分布以研究其定位。
材料與方法DNA構(gòu)建與蛋白生產(chǎn)如實施例1和2所述，選擇一個名為His6-ZHER2A新的affibody配體，且其具有對HER2受體的親和力。一個通過將編碼ZHER2A多肽的基因片段亞克隆到His6-ZHER2A的表達載體上而構(gòu)建的二聚體ZHER2A變體如實施例3所述。這個二聚體ZHER2A變體的ABD融合蛋白則通過將編碼ABD多肽的基因片段亞克隆到His6-ZHER2A的表達載體上，用ABD多肽取代六組氨酸標(biāo)記而構(gòu)建。另外，通過延伸PCR將一個C末端半胱氨酸殘基加入該融合蛋白。導(dǎo)入的ABD片段在DNA測序儀ABI Prism3700 Analyser(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)通過DNA測序加以證實?？寺∵^程中采用大腸桿菌菌株RR1ΔM15(Rther，Nucleic Acids Res 105765-5772(1982))作為細菌宿主。所得載體在T7啟動子控制下(Studier et al，Meth Enzymol18560-89(1990))編碼ABD融合二聚體ZHER2變體ABD(ZHER2A)2，其融合了C末端半胱氨酸殘基，該殘基可允許位點特異性化學(xué)修飾(圖22)。二聚體ZHER2A變體在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達為與ABD的融合體，并在根據(jù)產(chǎn)品說明制備的白蛋白瓊脂糖親和柱上通過親和層析純化而回收(Amersham Biosciences)。使用適當(dāng)消光系數(shù)，用280nm的吸光值計算蛋白濃度。利用Novex系統(tǒng)(Novex，CA，USA)在16％的Tris-甘氨酸同質(zhì)凝膠中通過SDS-PAGE進一步分析純化的蛋白質(zhì)。蛋白條帶用考馬氏亮藍染色觀察。通過SDS-PAGE分析，可以看出該蛋白的預(yù)期分子量的特異條帶。間接放射性碘化ABD(ZHER2A)2為了用125I標(biāo)記，40μl的ABD(ZHER2A)2經(jīng)過與實施例4中的二聚體多肽構(gòu)建體相同的處理。
動物制備在C66/4條例許可下使用來源于M&B的雌性雜交繁殖的nu/nubalb小鼠(到達時10-12周齡)。在異種移植建立之前的一周里，利用標(biāo)準(zhǔn)飼料、墊料和環(huán)境使小鼠適應(yīng)瑞典Uppsala的Rudbeck實驗室的動物設(shè)施。小鼠自由采食和飲水。實驗前三周，將5×107個SKOV-3人卵巢癌細胞(ATCC #HTB-77)皮下注射入16只小鼠的右后腿。實驗時，腫瘤已經(jīng)在所有小鼠中建立，所有小鼠體重在22-27克。
放射活性測定按照實施例4所述測量125I及計算％ID/g。
生物分布實驗16只小鼠隨機分成4組(I-V)，每組4只小鼠。分組、注射及處死時間參見方案4。小鼠在尾部iv注射于50μl PBS中的0.5μg用125I間接標(biāo)記的ABD(ZHER2A)2。所有注射都忍受良好，沒有任何肉眼可觀察到的缺陷。
方案4

如實施例4的第一次生物分布研究所述處死小鼠和取樣。將器官和組織樣品稱重，并用γ計數(shù)器(具有一個3-inch的NaI(Tl)檢測器的自動γ計數(shù)器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，F(xiàn)inland)測量它們的放射活性。
結(jié)果結(jié)果如圖23-24所示。如圖23所示，在12小時(腫瘤2.4％ID/g)和24小時(腫瘤2.2％ID/g)時，125I在腫瘤中的濃度高于大多數(shù)正常器官的，表明ABD(ZHER2A)2多肽能靶向攜帶HER2的腫瘤細胞。發(fā)現(xiàn)在正常器官和組織中的放射活性濃度低于腫瘤中的，除了腎臟(所有時間點，在24小時為3.5％ID/g)、甲狀腺(所有時間點，在24小時為5.2％ID/g)和血液(所有時間點，在24小時為3.9％ID/g)。肺臟數(shù)值或多或少與腫瘤數(shù)值相等，這是因為肺臟的血液含量高。本實驗顯示血液中的放射性碘的清除非常緩慢。這點正如預(yù)期，因為ABD(ZHER2A)2的ABD部分高親和性地與血清白蛋白結(jié)合，而該蛋白在血液中非常豐富而且具有緩慢的動力學(xué)。從正常器官中清除要比從血液中清除快，除了甲狀腺，發(fā)現(xiàn)在此放射性碘聚集。高濃度的放射性碘也在小鼠腎臟中發(fā)現(xiàn)。圖24顯示了與實施例4和5的ZHER2A單體和二聚體結(jié)果比較，腫瘤中與ABD(ZHER2A)2相關(guān)的放射性碘濃度隨時間的變化情況。在注射后24小時，使用ABD(ZHER2A)2的腫瘤放射活性比單體或二聚體高出13倍，表明靶向部分在體內(nèi)存留時間的延長的確可以用于增加其在腫瘤中的劑量。這些數(shù)據(jù)也支持(ZHER2A)2部分能與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行功能性偶聯(lián)。
總結(jié)通過苯甲酸酯基團間接標(biāo)記有放射性碘(125I)的融合多肽ABD(ZHER2A)2在攜帶SKOV-3(卵巢癌細胞系)腫瘤的小鼠中的生物分布與所期望的白蛋白結(jié)合多肽的特性有很好的一致性。實現(xiàn)了腫瘤對以125I-ABD(ZHER2A)2形式注射的放射性碘的吸收，而且在腫瘤上的劑量比ZHER2A多肽的二聚體或單聚體形式要高。對所得數(shù)據(jù)的分析表明，在注射后12小時，腫瘤中的放射活性濃度高于大多數(shù)其它器官中的放射活性濃度，盡管在肺、腎、甲狀腺和血液中的放射活性仍然維持高濃度。
實施例7锝標(biāo)記的二聚體99mTc-(ZHER2A)2的生物分布在本實施例的實驗中，用診斷性成像核素99m-锝標(biāo)記實施例3的二聚體His6-(ZHER2A)2多肽，并將其注射到正常小鼠和攜帶有特征為HER2過表達的移植腫瘤的小鼠中。99m锝(99mTc)是一種具有較適于體內(nèi)診斷的理想特性的放射性核素。另外，由于其廉價易得，也使其成為臨床上醫(yī)學(xué)成像的一個好選擇。研究該多肽的生物分布以研究其定位。
材料與方法锝標(biāo)記His6-(ZHER2A)2將His6-(ZHER2A)2多肽按照產(chǎn)品說明書利用商業(yè)化的IsoLinkTM試劑盒(Mallinckrodt，Netherlands)進行標(biāo)記，該試劑盒能將99mTc核素導(dǎo)向His6-(ZHER2A)2蛋白上的六組氨酸標(biāo)記。IsoLinkTM試劑盒的試劑產(chǎn)生锝陽離子，[99mTc(CO)3(H2O)3]+，然后其可穩(wěn)定地與六組氨酸標(biāo)記配位，提供了特異性標(biāo)記His6-(ZHER2A)2多肽的His6標(biāo)記的手段。
簡而言之，從Uppsala University Hospital的發(fā)生器(generator)洗脫的0.5-0.6ml的99mTc儲存液與IsoLinkTM羰基標(biāo)記試劑在100℃水浴中溫育20分鐘。這樣獲得的锝陽離子即[99mTc(CO)3(H2O)3]+的40μl溶液與40μl的His6-(ZHER2A)2的PBS(1.2mg/ml)混合并在50℃溫育1小時。以5kD為截斷值在NAP-5大小排阻柱(Pharmacia，Uppsala)上分離純化產(chǎn)物。根據(jù)直接薄層層析(instant thin layerchromatography)，產(chǎn)物純化度為97％。
動物制備在C66/4條例許可下使用來源于M&B的雌性雜交繁殖的nu/nubalb小鼠(到達時為10-12周齡)。在異種移植建立之前的一周里，利用標(biāo)準(zhǔn)飼料、墊料和環(huán)境使小鼠適應(yīng)瑞典Uppsala的Rudbeck實驗室的動物設(shè)施。小鼠自由采食和飲水。實驗前三周，將5×107個SKOV-3人卵巢癌細胞(ATCC #HTB-77)皮下注射入4只小鼠的右后腿。實驗時，腫瘤已經(jīng)在所有小鼠中建立，所有小鼠體重在22-27克。
放射活性測定如實施例4對125I所述進行99mTc測量和％ID/g的計算。
生物分布實驗4只小鼠作為一組進行實驗。注射及處死時間如表5所示。小鼠在尾部iv注射于50μl PBS中的0.5μg、用99mTc標(biāo)記的His6-(ZHER2A)2(每只小鼠100kBq)。所有注射都忍受良好，沒有任何肉眼可觀察到的缺陷。
方案5

如實施例4的第一次生物分布研究所述處死小鼠和采樣。將器官和組織樣品稱重，并用γ計數(shù)器(具有一個3-inch的NaI(Tl)檢測器的自動γ計數(shù)器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，F(xiàn)inland)測量它們的放射活性。
結(jié)果綴合物99mTc-His6-(ZHER2A)2在體外具有高穩(wěn)定性(用PBS、血漿、半胱氨酸和過量的游離組氨酸攻擊)。99mTc-His6-(ZHER2A)2的體內(nèi)生物分布實驗結(jié)果如圖25-27。如圖25，使用99mTc-His6-(ZHER2A)2的總腫瘤劑量(3.3％ID/g，注射后8小時)比125I標(biāo)記的單體構(gòu)建體125I-苯甲酸酯-ZHER2A(1.1％ID/g，注射后8小時)或二聚體構(gòu)建體125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2(1.06％ID/g，注射后8小時)高三倍。已知99mTc與125I相比是一種更好的殘留試劑，暗示其運輸?shù)膭┝勘槐Ａ袅?，而碘劑量被代謝并從腫瘤細胞中釋放。根據(jù)圖26，腫瘤中注射后8小時的99mTc濃度要高于大多數(shù)正常器官的(腫瘤，3.3％ID/g)，顯示99mTc-His6-(ZHER2A)2多肽能夠靶向攜帶HER2的腫瘤細胞。發(fā)現(xiàn)在正常器官和組織中的放射活性濃度低于腫瘤中的，除了腎臟(8小時時27％ID/g，腫瘤劑量的36倍)和肝臟(8小時時11.4％ID/g，腫瘤劑量的3倍)(圖27)。由于99mTc-His6-(ZHER2A)2經(jīng)過腎臟清楚，高腎臟值是預(yù)料到的。在腎臟中的高水平示蹤劑并沒有引起毒性問題，因為作為診斷目的的總注射劑量非常低。甲狀腺中的放射活性值如預(yù)計(8小時時1％ID/g)根本不采用125I的值(實施例4)一樣高。從正常器官的清除主要在血液清除之后，除了腎臟，在此1小時時可以觀察到99mTc聚集產(chǎn)生的一個峰。然后水平開始減少，一個小時間(直至注射后2小時)會有一個快速清除期(rapid elimination phase)，接著是一個慢的清除期，而24小時后腎臟內(nèi)仍然存在70％ID/g的顯著劑量。
注射后8小時時锝綴合物的腫瘤與血液比率為4，而總腫瘤劑量為3.3％ID/g。這說明99m锝可用于體內(nèi)診斷用途。作為比較，在相同時間點，125I-苯甲酸酯-(ZHER2A)2和125I-苯甲酸酯-ZHER2A的腫瘤劑量約為1％，而腫瘤與血液比率則約為11。
總結(jié)99mTc標(biāo)記多肽即99mTc-His6-(ZHER2A)2在攜帶SKOV-3(卵巢癌細胞系)腫瘤的小鼠中的生物分布示出用于醫(yī)學(xué)成像目的的相對好的分布特性。實現(xiàn)了腫瘤對以99mTc-His6-(ZHER2A)2注射的锝的吸收，其在腫瘤中的劑量高于125I標(biāo)記的ZHER2A多肽的二聚體或單體。分析所獲數(shù)據(jù)表明注射后8小時在腫瘤中的放射活性濃度高于大多數(shù)其它器官和血液中的放射活性濃度，盡管肝臟和腎臟比腫瘤的吸收實質(zhì)上要高。
實施例8利用211At進行體外標(biāo)記及定性分析在本實施例的實驗中，使用與前述用125I標(biāo)記相同的化學(xué)方法，用治療性放射性核素211砹(211At)標(biāo)記實施例3的二聚體His6-(ZHER2 A)2多肽。放射性核素腫瘤靶向的一個目的是放射治療。這要求核素發(fā)射高能粒子，如α粒子和高能β粒子，其能根除靶細胞。放射性鹵素211At的α放射范圍正好為幾個細胞的直徑，意味著細胞根除可以高度精確地進行。本實驗進行了211At標(biāo)記多肽的體外細胞殺傷能力的研究。
材料與方法提前兩天，將100000個特征為HER2過表達的SKBR-3細胞接種于3cm培養(yǎng)皿中。利用Copenhagen University Hospital的Scanditronix MC32回旋加速器產(chǎn)生的211At標(biāo)記60μg的His6-(ZHER2A)2多肽，并在瑞典Uppsala University的Jrgen Carlsson實驗室加以純化。將約1∶1和5∶1摩爾比的211At-(ZHER2A)2分子/細胞受體加入到三個培養(yǎng)皿中。另外三個培養(yǎng)皿加入5∶1濃度的211At-(ZHER2A)2以及500倍過量的非標(biāo)記His6-(ZHER2A)2以封閉結(jié)合位點，并估計非特異性放射效應(yīng)。細胞與211At-(ZHER2A)2在37℃溫育24小時。溫育24小時后，所有細胞都經(jīng)過洗滌并補充新鮮的培養(yǎng)基。在約兩個月內(nèi)每周一次進行一次細胞生長監(jiān)控。
平行地，向一組用與上述細胞殺傷分析方法相同的方式制備的培養(yǎng)皿加入相同的211At-(ZHER2A)2溶液。在不同時間點收集這些細胞，并進行細胞計數(shù)和放射活性測定，以建立所有培養(yǎng)皿組的吸收曲線。該曲線用于計算細胞殺傷實驗中超過24小時時每個細胞的衰減(decay)值。
結(jié)果將來源于人類乳腺癌細胞系SKBR-3、過表達HER2的細胞用兩種不同劑量的211At-(ZHER2A)2照射24小時。在第一種劑量中，加入的211At-(ZHER2A)2分子與細胞上HER2靶受體的數(shù)量相等。在第二種劑量中，加入5倍過量的211At-標(biāo)記分子。溫育24小時后，在兩個月內(nèi)每周一次監(jiān)控細胞和計數(shù)，并確定存活部分。如圖28所示，應(yīng)答與提供的劑量相關(guān)。與加入沒有靶制劑的放射活性的對照相比，用等摩爾量211At-(ZHER2A)2處理的細胞并沒有表現(xiàn)出任何特異的生長延遲。由于非特異性的放射損傷導(dǎo)致一個短期的生長延遲，但是細胞并沒有停止生長。相反，當(dāng)加入5倍過量的211At-(ZHER2A)2時，對細胞生長的抑制是非常明顯的。到實驗?zāi)┢冢邮芨邉┝康慕M也沒有恢復(fù)，而低劑量組和對照組則提高了106。假設(shè)照射后存活細胞仍然保持與以前相同的生長速度，在5∶1組的所有細胞都被清除了。吸收曲線揭示了5∶1封閉組也受到了實質(zhì)性的細胞相關(guān)照射，可能是因為封閉不足造成的。每個細胞的衰亡數(shù)量(DPC)由積分吸收曲線加以估計。從生長曲線上，倍增時間計算為指數(shù)生長曲線的斜率，而存活分?jǐn)?shù)則通過從照射時間推斷延遲生長來計算。結(jié)果如表1所示。
表1

總結(jié)在體外211At-(ZHER2)2表現(xiàn)出與HER2過表達的SKBR-3細胞的特異性結(jié)合。誘導(dǎo)的細胞死亡與劑量積累十分相關(guān)。每個細胞少于100個衰減就足夠引起單個細胞的死亡并達到整個細胞的消亡。
實施例9其它HER2結(jié)合多肽的鑒定及定性分析為了提高從實施例1所述的選擇中所獲得的HER2結(jié)合Z變體的親和力，在構(gòu)建第二個文庫時采用了親和力成熟策略(Gunneriusson etal，Protein Eng 12873-878(1999)；Nord et al，Eur J Biochem 2684269-77(2001))，然后針對HER2進行再次選擇。第一代多肽變體ZHER2A，B，C和D的比對示出ZHER2A和ZHER2B之間除了第13、14、28、32和35位相同外，在第10位存在R和K的趨同，在11位存在Q和T的趨同。因此，第二代文庫含有5個固定位置13、14、28、32和35位，以及兩個部分固定的位置，第10位(cgc/aaa作為簡并密碼子)和第11位(caa/acc作為簡并密碼子)，而余下的位置9、17、18、24、25和27使用NNG/T簡并密碼子隨機化。轉(zhuǎn)化后，獲得一個含3×108個克隆的文庫。以逐漸降低濃度的生物素?；娜薍ER2胞外結(jié)構(gòu)域(HER2-ECD)為靶(重組人HER2胞外結(jié)構(gòu)域，氨基酸238-2109，由Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，USA提供)，將抗原結(jié)合分子進行五輪選擇。
在第4和第5輪選擇中，分別獲得80和260個菌落克隆，將這些克隆挑出以分析其HER2結(jié)合活性。
HER2結(jié)合的ABAS ELISA分析從第4和第5輪選擇中隨機選擇的克隆在96孔板(Nunc)上生產(chǎn)。一個稱為ABAS ELISA的ELISA篩選步驟用于鑒定高親和力的HER2結(jié)合Z變體。將單菌落接種于于深孔96孔板中的、補加了1mMIPTG和100μg/ml氨芐青霉素的1ml TSB-YE培養(yǎng)基(30.0g胰胨豆胨肉湯(Merck)和5.0g酵母提取物(Merck)，加水至終體積1升)中，并在37℃在搖床上過夜生長。在3000g離心10分鐘沉淀細胞。用300μlPBS-T重懸沉淀并于-80℃冷凍至少30分鐘。平板在溫水中解凍，然后在3500g離心20分鐘。取100μl上清加到微量滴定孔中(#9018Costar)，該孔已經(jīng)用具有6μg/ml人血清白蛋白(HSA)的15mMNa2CO3和35mM NaHCO3(pH9.6)于4℃過夜溫育，然后在室溫用2％脫脂奶粉的PBS-T封閉1小時。在向每孔加入100μl的1μg/ml的生物素酰化的HER2之前將板洗滌四次并溫育1.5小時。洗滌孔四次之后，向每孔加入100μl鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1∶5000)(#P0397Dako)并溫育1小時。將孔洗滌四次，在最后一次洗滌后向每孔加入100μl顯影液(ImmunoPure)TMB(#34021 Pierce)。20-30分鐘后，向每孔加入100μl終止液(2M H2SO4)。在ELISA讀數(shù)器(Tecan)上讀取450nm的吸光值。ABAS ELISA結(jié)果如圖29所示。圖29A和29B中X軸對應(yīng)于待測96孔板的孔號-因此，圖29A表示第一個96孔板的ELISA結(jié)果，而圖29B表示第二個板的結(jié)果。
DNA序列分析根據(jù)廠商指導(dǎo)，使用生物素?；墓押塑账酇FFI-72(5′-生物素-CGGAACCAGAGCCACCACCGG)，利用ABI PRISMdGTP，BigDyeTMTerminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems))對ABAS-ELISA所分析的編碼ZHER2變體的DNA進行測序。在ABI PRISM3100 Genetic Analyser(AppliedBiosystems)上分析序列。序列分析獲得130個獨特序列。通過吸光值至少比陰性對照的吸光值高兩倍而證實的、來自在ABAS ELISA實驗中表現(xiàn)結(jié)合能力的ZHER2變體的序列示于圖1，并在序列表中鑒別為SEQ ID NO6-76。這些HER2結(jié)合Z變體的命名方式如下。從ELISA實驗中的第一個平板分離的變體(圖29A)命名為ZHER21NN，這里的NN對應(yīng)于在其中分析特定多肽變體的第一個平板的孔號。從ELISA實驗中的第二個平板分離的變體(圖29B)命名為ZHER22NN，這里的NN對應(yīng)于在其中分析特定多肽變體的第而個平板的孔號。
克隆和蛋白生產(chǎn)使用編碼如圖30所示的構(gòu)建體的表達載體，在大腸桿菌細胞中表達選擇的HER2結(jié)合多肽。這些多肽生產(chǎn)為與N末端六組氨酰標(biāo)記的融合體。His6標(biāo)記多肽ZHER2101、ZHER2107、ZHER2149、ZHER2202、ZHER2205、ZHER2207、ZHER2209、ZHER2222、ZHER2225和ZHER2229以及ZHER2A用BioRobot 3000(Qiagen)和NI-NTA Superflow 96 BioRobot方法在變性條件下進行純化。純化的、His6標(biāo)記蛋白在PBS(2.68mM KCl，137mM NaCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4，pH7.4)中透析。樣品的蛋白濃度利用280nm處測量的吸光值和各種蛋白的理論消光系數(shù)進行計算。
His6標(biāo)記ZHER2變體的生物傳感器分析在Biacore2000系統(tǒng)(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上利用表面等離子共振分析上述生產(chǎn)的His標(biāo)記的ZHER2變體與HER2之間的相互作用。根據(jù)廠商指導(dǎo)，將人HER2和IgG(免疫球蛋白G)通過偶聯(lián)于CM-5芯片表面上的羧化葡聚糖層上的胺而固定于不同的流動池上。人HER2和IgG的固化分別產(chǎn)生4600和5100共振單位(RU)。對第三個流動池表面進行激活和失活以作為注射時的空白對照。用1×HBS-EP(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性劑P-20，pH7.4)將融合多肽ZHER2101、ZHER2107、ZHER2149、ZHER2202、ZHER2205、ZHER2207、ZHER2209、ZHER2222、ZHER2225及ZHER2229稀釋到終濃度為50μM，以固定的流速10μl/分鐘注射。總注射時間為2分鐘(締合)，隨后洗滌3分鐘(解離)。用25mM HCl注射兩次(30秒/注射)使表面再生。具有固定的HER2的池的測量反應(yīng)應(yīng)減去參照池(激活/失活表面)的測量反應(yīng)。這些純化蛋白與HER2相互作用的能力已被確定，并如圖31的感應(yīng)圖所述。
實施例10其它HER2結(jié)合多肽的鑒定及特性分析對實施例1所述的第三和第四輪選擇后所獲得的克隆進行全面的序列分析。根據(jù)廠商指導(dǎo)，使用ABI PRISMdGTP，BigDyeTMTerminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)和ABI PRISM3100 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)對DNA進行測序。生物素酰化的寡核苷酸AFFI-72(5′-生物素-CGGAACCAGAGCCACCACCGG)用作引物。序列分析發(fā)現(xiàn)有11個新的多肽序列，即在實施例1中所述研究中未發(fā)現(xiàn)的克隆。
使用編碼如圖30所示的構(gòu)建體的表達載體，在大腸桿菌細胞中表達這些Z變體。這些多肽從而生產(chǎn)為與N末端六組氨酰標(biāo)記的融合體。這些多肽使用BioRobot 3000(Qiagen)和NI-NTA Superflow 96BioRobot方法在變性條件下通過固化金屬離子親和層析(IMAC)進行純化。洗脫的蛋白用SDS-PAGE分析。根據(jù)產(chǎn)品說明書，用PD-10柱(Amersham Bioscience)將His6標(biāo)記蛋白的緩沖液交換成5mMNH4Ac。然后，將蛋白凍干并溶解于HBS-EP(5mM HEPES，150mMNaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性劑P-20，pH7.4)。樣品的蛋白濃度利用280nm處測量的吸光值和各種蛋白的理論消光系數(shù)進行計算。
His6標(biāo)記ZHER2變體的生物傳感器分析利用Biacore2000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)分析His6標(biāo)記ZHER2變體與HER2之間的結(jié)合活性。根據(jù)廠商指導(dǎo)，將人HER2和HIV-1 gp120(Protein Sciences Corporation，#2003-MN)通過偶聯(lián)于CM-5芯片表面上的羧化葡聚糖層上的胺而固定于不同的流動池上。人HER2和HIV-1 gp120的固化分別產(chǎn)生了2631和3138共振單位(RU)。對第三個流動池表面進行激活和失活以作為注射時的空白對照。用1×HBS-EP(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性劑P-20，pH7.4)將ZHER2變體稀釋到終濃度為1μM，以固定的流速10μl/分鐘注射。總注射時間為1分鐘(締合)，隨后洗滌3分鐘(解離)。用10mM HCl注射30秒使表面再生。具有固定的HER2的池的測量反應(yīng)應(yīng)減去參照池(激活/失活表面)的測量反應(yīng)。三種純化的蛋白ZHER23053、ZHER20434和ZHER20024*與HER2特異性結(jié)合，如圖32的感應(yīng)圖所示。這些ZHER2變體的序列見圖1，并在序列表中鑒別為SEQ ID NO77-79。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其對HER2具有結(jié)合親和力，且與葡萄球菌A蛋白(SPA)的一個結(jié)構(gòu)域相關(guān)，所述多肽的序列對應(yīng)于SPA結(jié)構(gòu)域的序列，但具有1至約20個取代突變。
2.權(quán)利要求1的多肽，其對HER2具有結(jié)合親和力，其中相互作用的KD值至多為1×10-6M。
3.權(quán)利要求2的多肽，其對HER2具有結(jié)合親和力，其中相互作用的KD值至多為1×10-7M。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的多肽，其序列對應(yīng)于如SEQ ID NO1中所示的SPA的Z蛋白的序列，但包含1至約20個取代突變。
5.權(quán)利要求4的多肽，其包含4至大約20個取代突變。
6.權(quán)利要求4或5的多肽，其包含在第13、14、28、32和35位中的一個或多個位置的取代突變。
7.權(quán)利要求6的多肽，其還包含在第9、10、11、17、18、24、25和27位中的一個或多個位置的取代突變。
8.權(quán)利要求4-7中任一項的多肽，其包含在第13位的從苯丙氨酸至酪氨酸的取代突變。
9.權(quán)利要求4-8中任一項的多肽，其包含在第14位的從酪氨酸至色氨酸的取代突變。
10.權(quán)利要求4-9中任一項的多肽，其包含在第28位的從天冬酰胺至選自精氨酸和組氨酸的氨基酸殘基的取代突變。
11.權(quán)利要求4-10中任一項的多肽，其包含在第28位的從天冬酰胺至精氨酸的取代突變。
12.權(quán)利要求4-11中任一項的多肽，其包含在第32位的從谷氨酰胺至精氨酸的取代突變。
13.權(quán)利要求4-12中任一項的多肽，其包含在第35位的從賴氨酸至酪氨酸的取代突變。
14.權(quán)利要求4-13中任一項的多肽，其包含在第10位的從谷氨酰胺至精氨酸的取代突變。
15.權(quán)利要求4-14中任一項的多肽，其包含在第11位的從天冬酰胺至蘇氨酸的取代突變。
16.權(quán)利要求4-15中任一項的多肽，其包含在第17位的從亮氨酸至纈氨酸的取代突變。
17.權(quán)利要求4-12中任一項的多肽，其包含在第27位的從精氨酸至選自賴氨酸和絲氨酸的氨基酸殘基的取代突變。
18.權(quán)利要求4-17中任一項的多肽，其氨基酸序列對應(yīng)于SEQ IDNO1的氨基酸序列，但至少包含以下突變F13Y、Y14W、N28R、Q32R和K35Y。
19.權(quán)利要求4-18中任一項的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO2-79中的任一序列所示。
20.權(quán)利要求19的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO2-3中的任一序列所示。
21.前述任一項權(quán)利要求的多肽，其中存在于與所述多肽相關(guān)的葡萄球菌A蛋白(SPA)的結(jié)構(gòu)域中的天冬酰胺殘基中的至少一個被另一個氨基酸殘基所取代。
22.權(quán)利要求21的多肽，其中所述葡萄球菌A蛋白(SPA)的結(jié)構(gòu)域的序列對應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的SPA的Z蛋白的序列，且該多肽包含在選自N3、N6、N11、N21、N23、N28、N43和N52中的至少一個位置的取代突變。
23.權(quán)利要求22的多肽，其包含以下突變中的至少一個N3A、N6A、N6D、N11S、N23T、N28A和N43E。
24.一種多肽，其構(gòu)成了前述任一權(quán)利要求的多肽的片段，所述片段保留了對HER2的結(jié)合親和力。
25.前述任一項權(quán)利要求的多肽，其在任一末端或兩端包含額外的氨基酸殘基。
26.權(quán)利要求25的多肽，其中所述額外的氨基酸殘基包含在該多肽的N-或C-末端的半胱氨酸殘基。
27.權(quán)利要求25-26中任一項的多肽，其中所述額外的氨基酸殘基包含一個標(biāo)記，該標(biāo)記優(yōu)選選自六組氨酰標(biāo)記、myc標(biāo)記和flag標(biāo)記。
28.權(quán)利要求25-26中任一項的多肽，其中所述額外的氨基酸殘基包含至少一個功能性多肽結(jié)構(gòu)域，所以該多肽是由一個第一部分和至少一個第二部分以及任選地其它一個或多個部分組成的融合蛋白，所述第一部分由權(quán)利要求1-24中任一項的多肽組成。
29.權(quán)利要求28的多肽，其中所述第二部分由一個或多個如權(quán)利要求1-24中任一項所述的多肽組成，使得該多肽成為如權(quán)利要求1-24中任一項所述的HER2結(jié)合多肽的多聚體，這些HER2結(jié)合多肽的序列可以相同或不同。
30.權(quán)利要求28的多肽，其中所述第二部分包含至少一個能結(jié)合除了HER2外的靶分子的多肽結(jié)構(gòu)域。
31.權(quán)利要求30的多肽，其中所述第二部分包含至少一個能結(jié)合人血清白蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域。
32.權(quán)利要求31的多肽，其中所述至少一個能結(jié)合人血清白蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域是鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
33.權(quán)利要求30的多肽，其中所述第二部分包含與葡萄球菌A蛋白(SPA)的一個結(jié)構(gòu)域相關(guān)的多肽，其中該多肽的序列對應(yīng)于SPA結(jié)構(gòu)域的序列，但具有1至約20個取代突變。
34.權(quán)利要求33的多肽，其中所述第二部分多肽的序列對應(yīng)于如SEQ ID NO1中所示的SPA的Z蛋白的序列，但具有1至約20個取代突變。
35.權(quán)利要求28的多肽，其中所述第二部分具有酶學(xué)功能。
36.權(quán)利要求28的多肽，其中所述第二部分具有熒光功能。
37.權(quán)利要求28的多肽，其中所述第二部分是噬菌體外殼蛋白或其片段。
38.前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其包含一標(biāo)記基團。
39.權(quán)利要求38的多肽，其中所述標(biāo)記基團選自熒光標(biāo)記、生物素和放射性標(biāo)記。
40.前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其被偶聯(lián)到具有抗過表達HER2的細胞的活性的物質(zhì)上。
41.權(quán)利要求40的多肽，其中所述具有抗過表達HER2的細胞的活性的物質(zhì)選自細胞毒性制劑、放射性制劑、用于ADEPT應(yīng)用的酶、細胞因子和促凝血因子。
42.一種核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-37中任一項的多肽的序列。
43.包含權(quán)利要求42的核酸分子的表達載體。
44.包含權(quán)利要求43的表達載體的宿主細胞。
45.權(quán)利要求1-41中任一項的多肽作為藥物的用途。
46.權(quán)利要求1-41中任一項的多肽在制備用于治療至少一種特征為HER2過表達的癌癥的藥物中的用途。
47.一種治療至少一種特征為HER2過表達的癌癥的方法，該方法包括給需要這種治療的患者施用治療有效量的組合物，該組合物包含權(quán)利要求1-41中任一項的多肽作為活性物質(zhì)。
48.與一具有抗癌活性的物質(zhì)綴合的權(quán)利要求1-41中任一項的多肽用于將所述物質(zhì)輸送至過表達HER2的細胞的用途。
49.一種在體內(nèi)將一具有抗癌活性的物質(zhì)靶向過表達HER2的細胞的方法，該方法包括給患者施用所述物質(zhì)與權(quán)利要求1-41中任一項的多肽的綴合物。
50.權(quán)利要求1-41中任一項的多肽用于檢測樣品中HER2的用途。
51.一種檢測樣品中HER2的方法，在該方法中使用權(quán)利要求1-41中任一項的多肽。
52.權(quán)利要求51的方法，該方法包括以下步驟(i)提供一種待檢測的樣品；(ii)在使得權(quán)利要求1-41中任一項的多肽能與任何存在于所述樣品中的HER2結(jié)合的條件下，將所述多肽加入到所述樣品；(iii)除去未結(jié)合的多肽；和(iv)檢測結(jié)合的多肽。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述樣品是一種生物學(xué)液體樣品，優(yōu)選是人血漿樣品。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述樣品是組織樣品，優(yōu)選是人組織樣品，更優(yōu)選是一種來自患有癌癥的人的活檢樣品。
55.用于診斷組織樣品中HER2過表達的試劑盒，該試劑盒包含與一種報道酶融合的權(quán)利要求1-41中任一項的多肽、用于檢測所述報道酶的活性的試劑、和陽性與陰性對照組織玻片。
56.用于HER2過表達的體內(nèi)診斷的試劑盒，該試劑盒包含以螯合劑標(biāo)記的權(quán)利要求1-41中任一項的多肽、診斷用放射性同位素、和用于對摻入效率進行分析的試劑。
57.用于實施權(quán)利要求49的方法的試劑盒，該試劑盒包含以螯合劑標(biāo)記的權(quán)利要求1-41中任一項的多肽、治療性放射性同位素、和用于對摻入效率進行分析的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽具有HER2親和結(jié)合力，并與葡萄球菌A蛋白(SPA)的一個結(jié)構(gòu)域相關(guān)，即該多肽的序列對應(yīng)于SPA結(jié)構(gòu)域序列，但具有1到大約20個取代突變。本發(fā)明還提供了編碼該多肽的核酸，以及表達該多肽的表達載體及宿主細胞。本發(fā)明還提供了該多肽作為一種藥物和一種靶向試劑引導(dǎo)與其綴合的物質(zhì)至過表達HER2的細胞的用途。本發(fā)明還提供了該多肽的使用方法及用于實施該方法的試劑盒，該方法及試劑盒都基于所述多肽與HER2的結(jié)合。
文檔編號A61P35/00GK1816563SQ200480019059
公開日2006年8月9日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者約根·卡爾松, 斯特凡·斯托爾, 托弗·埃里克松, 埃琳·貢內(nèi)里烏松, 弗雷德里克·尼爾松 申請人:阿菲博迪公司