專利名稱：取代的四氫－1h－吡唑并[3,4－c]吡啶、含有它們的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的化合物，特別是新的四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶、含有它們的組合物以及它們作為藥物的應(yīng)用。
更具體而言，本發(fā)明涉及具有抗癌活性的新的四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶，尤其是具有激酶抑制活性并特別是Tie2抑制活性的新的四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶。
迄今為止，只有少數(shù)四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物是已知的。
WO 02/012442公開了在5位被可任選被取代的氨基基團(tuán)所取代的四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物。這些化合物用于治療癌癥及其它與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病。
P.Krogsgaard-Larsen等在Eur.J.Med.Chemical-Chim.Ther.(1979)，14(2)，第157-164頁中公開了兩種在3位具有羥基基團(tuán)取代基的取代的四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶。
WO 96/12720公開了取代的四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物，它們在3位被選自下列的取代基所取代H、烷基、亞烷基、環(huán)烷基和亞甲基環(huán)烷基，在1-和6-位上具有不同的取代基。這些化合物均被描述為(i)IV型磷酸二酯酶(PDE-IV)和(ii)腫瘤壞死因子(TNF)的抑制劑，所以它們被認(rèn)為可以應(yīng)用于治療炎癥疾病。但是，其中未公開任何本發(fā)明的化合物。
經(jīng)過努力，過去已經(jīng)成功的獲得了有效的Tie2抑制劑(在這一方面，可以參見，例如WO 98/02434；WO 98/41525；WO 99/10325；WO 99/17770；WO 99/54286；WO 99/21859；WO 99/55335；WO 00/17202；WO 00/17203；WO 00/27822；WO 00/75139；WO 01/37835；WO 01/57008；WO 01/72751；WO 02/060382；WO 02/076396；WO 02/076463；WO 02/076954；WO02/076984；WO 02/076985；WO 02/080926；WO 03/004488)。然而，這些文獻(xiàn)都沒有公開如下所定義的具有對抗激酶、特別是Tie2的活性的4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶衍生物。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明的化合物具有下列式(I)及其互變異構(gòu)體 其中L選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH、COO、NHCO、NH、NHSO2、SO2NH、NHCONH、CH2NH和NHCH2；X選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH和COO；R1選自O(shè)H、H、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代，并且當(dāng)X為鍵時，R1也可以為鹵素；R2為H或者選自烷基、亞烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；所述取代基可獨(dú)立選自R3、O-R3、鹵素、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3和OSO2NH-R3，其中每一個R3均獨(dú)立選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基，并任選被下列基團(tuán)所取代鹵素、芳基、雜芳基、R4、OR4或N(R4)2，每一個R4可獨(dú)立選自H、C1-C4烷基和鹵代C1-C4烷基。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明的化合物更特別是具有下列式(II)的化合物及其互變異構(gòu)體 其中X選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH和COO；R1選自烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；
R2為H或選自烷基、亞烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；所述取代基可獨(dú)立選自R3、O-R3、鹵素、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3和OSO2NH-R3，其中每一個R3均獨(dú)立選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基，并可任選被下列基團(tuán)所取代鹵素、芳基、雜芳基、OR4或N(R4)2，其中每一個R4均獨(dú)立選自H和C1-C4烷基。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明的化合物更特別具有下列式(III)及其互變異構(gòu)體 其中X選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH和COO；R1選自烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；R2為H或選自烷基、亞烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；其中所述取代基可獨(dú)立選自R3、O-R3、鹵素、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3和OSO2NH-R3，其中每一個R3均獨(dú)立選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基，并可任選被下列基團(tuán)所取代鹵素、芳基、雜芳基、OR4或N(R4)2，其中每一個R4均獨(dú)立選自H和C1-C4烷基。
本發(fā)明的化合物最好為如下定義的化合物，其中R1為可任選被取代的雜芳基，其中優(yōu)選的雜芳基選自可任選被鹵素、R4或O-R4所取代的苯并咪唑基、吲哚基、吡咯基。
更具體而言，優(yōu)選的雜芳基選自可任選被鹵素、R4或O-R4所取代的苯并咪唑-2-基、吲哚-2-基、吡咯-2-基。
優(yōu)選如下定義的本發(fā)明的化合物R2選自下列基團(tuán)苯基、吡啶基、噻吩基、C1-C4烷基和C3-C7環(huán)烷基，并任選被取代。
X最好選自CO和SO2。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明的化合物最好選自其中R1為H的式(I)化合物。
優(yōu)選的化合物最好選自其中R1為取代的芳基的式(I)化合物。
根據(jù)第一種優(yōu)選實(shí)施方案，優(yōu)選的化合物最好選自其中R1-L為R1-NH-CO的式(I)化合物，并更優(yōu)選R1為H。
根據(jù)第二種優(yōu)選實(shí)施方案，更優(yōu)選選自如下定義的(i)式(I)化合物，或(ii)根據(jù)第一種優(yōu)選實(shí)施方案的優(yōu)選化合物，其中X為鍵，并且其中R2選自取代的芳基和取代的雜芳基。
根據(jù)第三種優(yōu)選的實(shí)施方案，更優(yōu)選的化合物選自根據(jù)第二種實(shí)施方案的本發(fā)明的化合物，其中R2選自被NHSO2-R3或NHCONH-R3所取代的芳基，和被NHSO2-R3或NHCONH-R3所取代的雜芳基。
根據(jù)第三種優(yōu)選實(shí)施方案的化合物最好選自被NHSO2-R3或NHCONH-R3所取代的芳基，和被NHSO2-R3或NHCONH-R3所取代的雜芳基，其中芳基為苯基，且雜芳基選自吡啶基和嘧啶基。
根據(jù)第四種實(shí)施方案，根據(jù)第三種優(yōu)選實(shí)施方案的化合物最好選自被NHSO2-R3或NHCONH-R3所取代的芳基，和被NHSO2-R3或NHCONH-R3所取代的雜芳基，其中R3選自取代的芳基和取代的雜芳基，其中R3最好被選自下列的取代基所取代鹵素、R4、OR4和N(R4)2，其中每一個R4均可獨(dú)立選自H、C1-C4烷基和鹵代C1-C4烷基。
根據(jù)第五種實(shí)施方案，基于第四種優(yōu)選實(shí)施方案的化合物最好選自
和 根據(jù)其第一方面，本發(fā)明的化合物可以以下列形式存在1)外消旋形式，或2)富集立體異構(gòu)體的形式，或3)富集對映體的形式；并且也可以任選成鹽。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及含有如上所定義的化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥用組合物。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及如上所定義的化合物作為調(diào)節(jié)激酶活性的藥物的用途。優(yōu)選的激酶最好選自Tie2和KDR。更優(yōu)選Tie2。
根據(jù)其第三方面，本發(fā)明涉及如上所定義的化合物用于制備藥物的用途，該藥物用于治療病癥，特別是癌癥。
本發(fā)明的化合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法獲得，特別是可以參考酸和胺之間的偶合技術(shù)方面的文獻(xiàn)，參見，例如J.March，Advanced organic chemistry，(J.Wiley & Sons，ed.)，第四版，1992。
本發(fā)明化合物可以作為抑制由激酶所催化的反應(yīng)的抑制劑。Tie2為本發(fā)明化合物特別用作抑制劑所抑制的一種激酶。這些化合物也可以作為其它激酶的抑制劑，如KDR。
選擇激酶的原因如下所述Tie2
Tie-2(TEK)為內(nèi)皮細(xì)胞特異的受體酪氨酸蛋白激酶家族成員。Tie2為具有酪氨酸蛋白激酶活性的第一受體，其激動劑(促血管生成素1或Ang1)(刺激受體自磷酸化和細(xì)胞信號[S.Davis等(1996)Cell 87，1161-1169])和拮抗劑(促血管生成素2或Ang2))[P.C Maisonpierre等(1997)Science 277，55-60]均為已知的。促血管生成素1可以與VEGF在新血管生成的最后階段協(xié)同起效[Asahara T.Circ.Res.(1998)233-240]。在動物中進(jìn)行的Tie2和Ang1表達(dá)的敲除實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因處理結(jié)果顯示血管生成缺陷[D.J.Dumont等(1994)Genes Dev.8，1897-1909和C.Suri(1996)Cell 87，1171-1180]。Ang1與其受體的結(jié)合導(dǎo)致Tie2激酶域的自動磷酸化，這對新血管生成以及對具有外皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的血管的募集和相互作用是必不可少的，這些現(xiàn)象促成了新形成血管的成熟和穩(wěn)定[P.C.Maisonpierre等(1997)Science 277，55-60]。Lin等(1997)，J.Clin.Invest.100，82072-2078和LinP.(1998)PNAS 95，8829-8834已經(jīng)揭示了腺病毒感染期間或乳房腫瘤和黑色素瘤xenograph模型的細(xì)胞外區(qū)注射Tie-2(Tek)期間腫瘤生長和血管生成的抑制。
Tie2抑制劑可以用于新血管生成不適當(dāng)發(fā)生的情況(也就是說，在糖尿病視網(wǎng)膜病、慢性炎癥、銀屑病、卡波氏肉瘤、慢性新血管生成導(dǎo)致的黃斑變性、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、嬰兒血管瘤(haemoangioma)和癌癥中)KDRKDR(蛋白激酶插入域受體)，也被稱為VEGF-R2(血管內(nèi)皮生長因子受體2)，只在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。該受體與血管生長因子結(jié)合，并通過其細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶區(qū)的激活作為轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的介質(zhì)。在外源性VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)存在下，VEGF-R2蛋白激酶活性的直接抑制使得血管生成現(xiàn)象減少成為可能(Strawn等，Cancer Research，1996，56卷，第3540-3545頁)。特別在使用VEGF-R2突變型時該過程得到了證明(Millauer等，CancerResearch，1996，56卷，第1615-1620頁)。VEGF-R2受體似乎在成人中沒有任何作用，除非涉及VEGF的血管生成活性。因此，VEGF-R2蛋白激酶活性的選擇性抑制劑只顯示輕微的毒性。
除了在動態(tài)血管生成過程中的這個重要作用外，近期的結(jié)果顯示化療和放療后VEGF的表達(dá)有助于腫瘤細(xì)胞的存活，強(qiáng)調(diào)了KDR抑制劑與其它成分的潛在的協(xié)同作用(Lee等，Cancer Research，2000，60卷，第5565-5570頁)。
實(shí)驗(yàn)部分方法ALC/MS分析在與HP 1100設(shè)備相連接的Micromass LCT型設(shè)備上進(jìn)行LC/MS分析。使用HP G1315A二級管陣列檢測器在200-600nm的波長范圍內(nèi)和Sedex 65光散射檢測器測定產(chǎn)物的量。在180-800的范圍內(nèi)獲得質(zhì)譜。用Micromass MassLynx軟件分析數(shù)據(jù)。用Hypersil BDS C18，3μm(50×4.6mm)柱進(jìn)行分離，用含有0.05％(v/v)三氟乙酸的5-90％的乙腈水溶液(含0.05％(v/v)TFA)進(jìn)行線性梯度洗脫，以1ml/min的流速洗脫3.5分鐘?？偟姆治鰰r間(包括柱重新平衡時間)為7分鐘。
方法BLC/MS純化采用Waters FractionsLynx系統(tǒng)通過LC/MS純化產(chǎn)物，該系統(tǒng)包括Waters 600型梯度泵、Waters 515型再生泵、Waters Reagent Manager稀釋泵、Waters 2700型自動進(jìn)樣器、兩個Rheodyne LabPro型閥、Waters996型二極管陣列檢測器、Waters ZMD型質(zhì)譜儀和Gilson 204型組分收集器。該系統(tǒng)通過Waters FractionLynx軟件控制?？蛇x擇兩種WatersSymmetry柱(C18，5μm、19×50mm，目錄參考號186000210)進(jìn)行分離，一個柱用含有0.07％(v/v)三氟乙酸的95/5(v/v)水/乙腈混合物進(jìn)行再生，而另一個柱用于分離。以10ml/min的流速，用含有0.07％(v/v)三氟乙酸的5-95％的乙腈水溶液(含0.07％(v/v)TFA)線性梯度洗脫上述柱。在分離柱的出口，通過LC Packing Accurate方法將千分之一的洗脫液分離，以0.5ml/min的流速用甲醇稀釋并送入檢測器，75％送入二極管陣列檢測器，剩余的25％送入質(zhì)譜儀。其它的洗脫液(999/1000)送入組分收集器，待FractionLynx軟件檢測不到目標(biāo)產(chǎn)物的量時將流動液丟棄。將目標(biāo)產(chǎn)物的分子式提供給FractionLynx軟件，當(dāng)檢測到的質(zhì)譜信號符合離子[M+H]+和/或[M+Na]+時該軟件就開始收集產(chǎn)物。在某些情況下，根據(jù)分析LC/MS的結(jié)果，當(dāng)檢測到符合[M+2H]++的高密度離子時，相應(yīng)的計(jì)算分子量的一半(MW/2)的值也被提供給FractionLynx軟件。在此情況下，當(dāng)檢測到離子[M+2H]++和/或[M+Na+H]++的質(zhì)譜信號時，收集也會啟動。
方法CEI分析通過在Finnigan SSQ 7000光譜儀上電子轟擊(70eV)得到質(zhì)譜。
方法DNMR分析在Bruker Avance 300光譜儀和Bruker Avance DRX 400光譜儀上得到NMR譜。
4-(疊氮基乙氧基羰基甲基)-4-羥基哌啶-1-甲酸叔丁酯
于-78℃，在惰性氣體中，將新制備的LDA溶液(在惰性氣體中于-78℃將50.19ml的1.6M BuLi己烷溶液滴加到11.29ml二異丙基胺的200ml無水THF溶液中制備)滴加到10.0g N-Boc-哌啶酮懸浮液和5.54ml重氮乙酸乙酯的300ml無水THF中。將混合物于-78℃攪拌4小時，然后于-78℃用14.35ml濃AcOH分解。將獲得的混合物置于室溫下過夜，然后減壓蒸發(fā)除去溶劑，至初始體積的1/10時，在二異丙基醚中稀釋，并用飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌4次。用MgSO4干燥有機(jī)相。過濾除去含水鹽，減壓濃縮無水濾液得到15.12g粘性黃色油狀物。LC/MSRT＝2.84；[M+1]+＝304.33。產(chǎn)物用于后面的步驟。
4-(疊氮基乙氧基羰基甲基)-3，6-二氫-2H-吡啶-1-甲酸叔丁酯
將78.0ml無水吡啶加到15.12g 4-(疊氮基乙氧基羰基甲基)-4-羥基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的250ml iPr2O溶液中。將混合物冷卻到-10℃，在劇烈攪拌下緩慢加入8.86ml的POCl3。然后將混合物冷卻至室溫并于室溫下攪拌12小時。用500ml的0.1M NaOH溶液分解反應(yīng)混合物，然后用EtOAc萃取3次。用飽和的氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相并用硫酸鎂干燥。過濾除去含水鹽，減壓濃縮無水濾液至初始體積的1/10。LC/MSRT＝4.57；[M+1]+＝296.31。所得產(chǎn)物可用于后面的步驟。
2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶基-3，6-二甲酸6-叔丁基3-乙基酯
于回流下，將上面步驟獲得的4-(疊氮基乙氧基羰基甲基)-3，6-二氫-2H-吡啶-1-甲酸叔丁酯的Py/EtOAc溶液滴加到150ml甲苯中。以與滴加速度相同的速度蒸餾Py/PhMe共沸物。滴加結(jié)束后1小時，將溶液冷卻至室溫，減壓蒸發(fā)除去溶劑，將所得粗品產(chǎn)物(15.05g)經(jīng)快速色譜(SiO2，CH2Cl2/MeOH 1％NH37M(MeOH)先40∶1然后30∶1再20∶1)純化。蒸發(fā)除去溶劑得到10.05g(3步共71％)的黑色固體。LC/MSRT＝3.88；[M+1]+＝296.27。
2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶基-6-甲酸叔丁酯)-3-甲酸
將1.57g的LiOH和38ml的水加到10.05g 2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶基-3，6-二甲酸6-叔丁基3-乙基酯的375ml甲醇溶液中。將所得混合物加熱回流過夜。將溶液冷卻至室溫，然后用50ml的1M HCl溶液酸化至pH＝2。然后用EtOAc萃取上述溶液4次。用飽和的氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相，然后用硫酸鈉干燥。過濾除去得到的鹽，減壓蒸發(fā)溶劑得到8.90g(98％)的白色固體。LC/MSRT＝3.21；[M+1]+＝268.23。
產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室制備3-(烷基氨基甲?；?、芳基氨基甲?；㈦s芳基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯
通用方法將DCC和HOBT.H2O的DMF溶液及2eq的胺(R、Ar或Het)-NH2加到1eq的2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶基-6-甲酸叔丁酯)-3-甲酸的DMF溶液中，將混合物于室溫下攪拌3小時。于35℃減壓蒸發(fā)過夜除去溶劑。所得粗品產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(SiO2，CH2Cl2/MeOH 1％NH37M(MeOH)先20∶1然后10∶1然后5∶1，依產(chǎn)物而定)純化。
所用胺R1-NH2如下表(表1)[注釋R1-NH2＝(R、Ar或Het)-NH2]
表1
3-(烷基氨基甲?；?、芳基氨基甲?；?、雜芳基氨基甲?；?-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-鎓三氟乙酸鹽
通用方法將16eq的TFA加到1eq的3-(烷基氨基甲?；⒎蓟被柞；?、雜芳基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯的1∶1THF/水溶液中，將溶液加熱回流2小時。減壓蒸發(fā)除去溶劑，將收集到的粘性油狀物真空干燥過夜。所得產(chǎn)物不經(jīng)純化直接用于后面步驟。
6-(烷基、芳基、雜芳基等)羰基-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-(烷基、芳基、庚基等)酰胺
通用方法將2.5M HOBt·H2O(2eq)的DMF溶液、0.833M HBTU的DMF(2eq)溶液、2.5M DIPEA(4eq)的DMF溶液和適當(dāng)濃度的R2COOHp(2eq)的DMF懸浮液或溶液按順序加到1eq的3-(烷基氨基甲?；?、芳基氨基甲?；?、雜芳基氨基甲?；?-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-鎓三氟乙酸鹽的DMF溶液中。將溶液于室溫下攪拌過夜，然后用100μl的100％AcOH酸化，過濾并經(jīng)制備LC/MS純化。
所用酸R2COOH列于下表(表2)
表2結(jié)果根據(jù)前面所述方法制備下列產(chǎn)物。
方法A為了簡化下面表3中產(chǎn)物的表達(dá)，方法A中所列示的吡唑并吡啶環(huán)采用字母H表示，與H相連接的胺R1-NH2用后面跟隨數(shù)字1-15的字母B表示，與表1中的產(chǎn)物相對應(yīng)，與H相連接的酸R2-COOH用后面跟隨數(shù)字1-70的字母A表示，與表2所列示的產(chǎn)物相對應(yīng)。
所以，A1-H-B1所代表的產(chǎn)物與下列結(jié)構(gòu)相對應(yīng)
表3實(shí)施例13-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸2-苯基乙胺
可以通過下列方法制備3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸2-苯基乙胺將10mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶懸浮于0.3ml的四氫呋喃中。加入7.8μl的2-苯基乙基異氰酸酯，將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌20小時，然后減壓濃縮。
將蒸發(fā)所得殘留物經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，合并含有3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸2-苯基乙胺的部分，并將其置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。所得萃取液經(jīng)減壓濃縮。從而得到1.2mg白色粉末狀的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸2-苯基乙胺，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子415.29；保留時間＝3.48分鐘。
實(shí)施例23-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-甲磺?；?4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶
可以通過下列方法制備3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-甲磺?；?4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶將10mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶懸浮于0.3ml的二氯甲烷中。加入15.8μl的三乙胺，然后加入4.5μl的甲磺酰氯。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌20小時，然后減壓濃縮。
將蒸發(fā)所得殘留物經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，合并含有3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-甲磺?；?4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶的部分，并將其置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將所得萃取液減壓濃縮。從而得到4.2mg白色粉末狀的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-甲磺?；?4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子346.30；保留時間＝3.08分鐘。1H NMR(300MHz，(CD3)2SO，δ以ppm計(jì))2.32(寬峰6H)；3.02(s3H)；3.03(mt2H)；3.52(寬峰t，J＝5Hz2H)；4.45(寬峰2H)；7.24(寬峰1H)；7.42(寬峰1H)；12.45(mf1H)；13.07(mf1H).
實(shí)施例3[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮
可以通過下列方法制備[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮將10mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶懸浮于0.3ml的DMF溶液中。加入6.9mg的煙酸，然后加入7.6mg的HOBT和8.7μl的二異丙基碳二亞胺。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌20小時，然后減壓濃縮。
將蒸發(fā)所得殘留物經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，合并含有[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮的部分，并將其置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將所得萃取液減壓濃縮。從而得到5.3mg白色粉末狀的[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子373.31；保留時間＝2.87分鐘1H NMR(400MHz，(CD3)2SO，于373K溫度下，δ以ppm計(jì))2.35(s6H)；2.90-3.10(mt2H)；3.76(mf2H)；4.76(寬峰s2H)；7.27(mf1H)；7.40(mf1H)；7.51(dd，J＝8和5Hz1H)；7.90(寬峰d，J＝8Hz1H)；8.70(mt2H)；11.80-12.20(未確認(rèn)的寬峰(broad unresolved peak)1H)；12.50-13.00(未確認(rèn)的寬峰1H).
實(shí)施例46-(3-氯芐基)-3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶
可以根據(jù)下列方法制備6-(3-氯芐基)-3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶將10mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶懸浮于0.3ml的甲醇中。加入12.7μl的3-氯苯甲醛，然后加入4.7mg的NaBH3CN。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌20小時，然后將其減壓濃縮。
將蒸發(fā)所得殘留物經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，合并含有6-(3-氯芐基)-3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶的部分，并將其置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將所得萃取液減壓濃縮。從而得到4mg白色粉末狀的6-(3-氯芐基)-3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子392.26；保留時間＝3.18分鐘。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO，于373K溫度下，δ以ppm計(jì))2.35和2.36(2s總計(jì)6H)；2.83(t，J＝5.5Hz2H)；2.90-3.00(mt2H)；3.62(寬峰s2H)；3.78(s2H)；7.25-7.50(mt6H)；11.91(mf1H)；12.30-12.60(未確認(rèn)的寬峰1H)。
實(shí)施例5[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮
通過下列方法可以制備[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮將15mg的3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽懸浮于0.5ml的DMF中。加入24.3mg的二異丙基乙胺，然后加入12.7mg的HOBT、11.9mg的二異丙基碳二亞胺和11.6mg的煙酸。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌20小時，然后將其減壓濃縮。
將蒸發(fā)所得殘留物經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，合并含有[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮的部分，并將其置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將所得萃取液減壓濃縮。從而得到7.7mg白色粉末狀的[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-3-吡啶基甲酮，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子345.22；保留時間＝1.95分鐘。
實(shí)施例66-(3-氯芐基)-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶
通過下列方法可以制備6-(3-氯芐基)-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶將15mg的3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽懸浮于0.5ml的甲醇中。加入26.5mg的3-氯苯甲醛，然后加入7.9mg的NaBH3CN。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌20小時，然后將其減壓濃縮。
將蒸發(fā)所得殘留物經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，合并含有6-(3-氯芐基)-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶的部分，并將其置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將所得萃取液減壓濃縮。從而得到6.9mg白色粉末狀的6-(3-氯芐基)-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子364.22；保留時間＝2.19分鐘。
實(shí)施例7酰胺類化合物的制備 通過下列方法可以制備酰胺類化合物
將19種酸(表4)稱重并分別置于19個不同的實(shí)驗(yàn)試管中。
表4使用的酸
將152mg的HOBT和142mg的二異丙基碳二亞胺溶于12ml的DMF中，將所得溶液分配于19個試管中，每個試管600μl。
在290mg的N，N-二異丙基乙胺存在下，將200mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶懸浮于4ml的DMF中，將所得懸浮液分配到上述19個試管中，每個試管200μl。
將上述19個反應(yīng)混合物于室溫下通過軌道震搖方法震搖20小時。
自上述每一個反應(yīng)混合物中取10μl樣品，用40μl的DMSO稀釋(Gilson Liquid Han dler Quad-Z215)。通過LC/MS(方法A)分析所得DMSO溶液中的每一個樣品。
然后將19個反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，將蒸發(fā)殘留物分別溶于500μl的DMSO中，將所得溶液經(jīng)LC/MS(方法B)純化。
經(jīng)LC/MS純化后，將含有目標(biāo)化合物的部分(任選合并)置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將萃取液收集到已稱皮重的玻璃管中，蒸發(fā)至干(SavantAES 2000或Genevac HT8離心蒸發(fā)儀)，稱重(Mettler Toledo AutomatedWorkstation LA200)并用DMSO稀釋至10mM(Gilson Liquid HandlerQuad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個溶液。
通過質(zhì)譜(方法A)測定其保留時間和分子峰的方法，分離并定性下列化合物(表5)。
表5所得酰胺類化合物
實(shí)施例8磺酰胺類化合物的制備
磺酰胺類化合物可以通過下列方法制備在150μl的三乙胺存在下，將190mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽懸浮于2ml的二氯甲烷中。將所得懸浮液分配到17個試管中，每個試管500μl。將17份磺酰氯(表6)稱重，分別加到上述17個試管中。
表6所用磺酰氯
將上述17個反應(yīng)混合物于室溫下通過軌道震搖方法震搖20小時。
自上述每一個反應(yīng)混合物中取10μl樣品，用40μl的DMSO稀釋(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得DMSO溶液中的每一個樣品。
然后將17個反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，在1滴5N鹽酸水溶液存在下將蒸發(fā)殘留物分別溶于1ml的DMSO中，將所得溶液經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，將含有目標(biāo)化合物的部分(任選合并)置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將萃取液收集到已稱皮重的玻璃管中，蒸發(fā)至干(Savant AES2000或Genevac HT8離心蒸發(fā)儀)，稱重(Mettler Toledo AutomatedWorkstation LA200)，并用DMSO稀釋至10mM(Gilson Liquid HandlerQuad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個溶液。
通過質(zhì)譜(方法A)測定其保留時間和分子峰的方法，分離并定性下列化合物(表7)。
表7所得磺酰氯類化合物
實(shí)施例9胺類化合物的制備
胺類化合物可以通過下列方法制備將180mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽懸浮于2.7ml的甲醇中，將所得懸浮液分配于16個試管中，每個試管150μl。
將16種醛(表8)稱重，分別加到上述16個試管中。
表8所用醛
然后將85mg的NaBH3CN的2.7ml的甲醇溶液也分配到上述16個試管中，每個試管150μl。將上述反應(yīng)混合物以軌道震搖的方式于室溫下震搖20小時。然后將100μl的甲醇加到上述16個試管中的每一個。
自上述每一個反應(yīng)混合物中取10μl樣品，用40μl的DMSO稀釋(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得DMSO溶液中的每一個樣品。
然后將16個反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，將蒸發(fā)殘留物分別溶于500μl的DMSO中，通過燒結(jié)玻璃過濾，將殘留溶液經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，將含有目標(biāo)化合物的部分(任選合并)置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將萃取液收集到已稱皮重的玻璃管中，蒸發(fā)至干(Savant AES 2000或Genevac HT8離心蒸發(fā)儀)，稱重(Mettler Toledo AutomatedWorkstation LA200)，并用DMSO稀釋至10mM(Gilson Liquid HandlerQuad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個溶液。
通過質(zhì)譜(方法A)測定其保留時間和分子峰的方法，分離并定性下列化合物(表9)。
表9所得胺類化合物
實(shí)施例10脲類化合物的制備
脲類化合物可以通過下列方法制備在190μl的三乙胺存在下，將120mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽懸浮于3.6ml的四氫呋喃中，將所得懸浮液分配到9個試管中，每個試管300μl。
將9種異氰酸酯(表10)稱重并分別加到上述9個試管中。
表10所用異氰酸酯化合物
將9個反應(yīng)混合物以軌道震搖的方式于室溫下震搖2小時，然后將其蒸發(fā)至干。
將蒸發(fā)殘留物分別溶于1ml的DMSO中，自上述每一份溶液中取10μl樣品，用40μl的DMSO稀釋(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個樣品的DMSO溶液。
將殘留溶液經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，將含有目標(biāo)化合物的部分(任選合并)蒸發(fā)至干(序號1、3、6、8和9)或者置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相；序號2、4、5和7)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將萃取液收集到已稱皮重的玻璃管中，蒸發(fā)至干(Savant AES 2000或Genevac HT8離心蒸發(fā)儀)，稱重(MettlerToledo Automated Workstation LA200)，并用DMSO稀釋至10mM(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個溶液。
通過質(zhì)譜(方法A)測定其保留時間和分子峰的方法，分離并定性下列化合物(表11)。
表11.所得脲類化合物
實(shí)施例113-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶
3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶可以根據(jù)下列方法制備將9ml的水和2.8ml的三氟乙酸加到670mg的3-(2-氨基-4，5-二甲基苯基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯的9ml THF溶液中。于80℃攪拌2小時后，將反應(yīng)介質(zhì)減壓濃縮。然后將其置于水中，形成的沉淀通過燒結(jié)玻璃過濾回收，用1N氫氧化鈉溶液洗滌并干燥。隨后用二氯甲烷萃取所得水相部分，有機(jī)相用硫酸鎂干燥并減壓濃縮。合并所得殘留物和沉淀，然后將其溶于含有幾滴DMF的甲醇。然后將該溶液置于MEGA BE-SCX相上。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將所得萃取液減壓濃縮。
得到46mg淺褐色粉末狀的3-(5，6-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶，其特征如下EIm/z＝267M+.屯基峰m/z＝238[M-NHCH2]+m/z＝209[M-C3H8N]+.1H NMR(300MHz，(CD3)2SO，δ以ppm計(jì))2.31和2.32(2s總共6H)；2.81(寬峰t，J＝5Hz2H)；2.92(寬峰t，J＝5Hz2H)；3.83(寬峰s2H)；7.22(寬峰s1H)；7.40(寬峰s1H)；12.28(mf1H)；12.73(mf1H)。
實(shí)施例123-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽 3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶可以根據(jù)下列方法制備將9ml的5N的鹽酸水溶液加到1.7g的3-(2-氨基-4，5-二甲基苯基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯的40ml乙醇中。于80℃攪拌60小時后，將反應(yīng)介質(zhì)冷卻至室溫。通過燒結(jié)玻璃過濾回收形成的沉淀，干燥。得到1.04g為淺褐色粉末狀的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽，其特征如下EIm/z＝267M+.基峰m/z＝238[M-CH2NH]+m/z＝209[M-C3H8N]+.
m/z＝36[HCl]+1H NMR(300MHz，含幾滴CD3COOD的(CD3)2SO，δ以ppm計(jì))2.40(s6H)；3.23(寬峰t，J＝5.5Hz2H)；3.45(t，J＝5.5Hz2H)；4.45(s2H)；7.54(s2H)。
3-(2-氨基-4，5-二甲基苯基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯可以根據(jù)下列方法制備于室溫下將8.5g的HBTU和2.9g的二異丙基乙胺加到3g的(2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯)-3-甲酸的50ml無水DMF溶液中。于室溫下攪拌20分鐘后，加入3.06g的4，5-二氨基-o-二甲苯。于室溫下攪拌60小時后，用含有20g氯化鈉的pH大于7的3L碳酸氫鈉水溶液稀釋反應(yīng)物。水相用1L乙酸乙酯萃取3次，然后用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)相并減壓濃縮。所得粗品殘留物溶于150ml二氯甲烷，通過燒結(jié)玻璃過濾除去不溶物。然后將濾液減壓濃縮并經(jīng)硅膠(20-45μm Amicon)色譜純化，用50-100％乙酸乙酯環(huán)己烷溶液梯度洗脫。合并含有目標(biāo)化合物的部分并減壓濃縮。如此得到4.37g為淺褐色粉末狀的3-(2-氨基苯基氨基甲酰基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯，其特征如下EIm/z＝385M+.基峰m/z＝329[M-C4H8]+.
m/z＝312[M-C4H9O]+m/z＝57[C4H9]+1H NMR(300MHz，(CD3)2SO，δ以ppm計(jì))1.46(s9H)；2.10和2.12(2s每一個為3H)；2.77(mt2H)；3.58(t，J＝5.5Hz2H)；4.53(s2H)；4.57(未確定峰2H)；6.60(s1H)；7.14(寬峰s1H)；9.10(mf1H)；13.08(mf1H)。
實(shí)施例133-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽 3-(1H-苯并咪唑-2基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽可以根據(jù)下列方法制備將2.2ml的5N鹽酸水溶液加到200mg的3-(2-氨基苯基氨基甲酰基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯的1ml乙醇溶液中。于80℃攪拌20小時后，將反應(yīng)物冷卻至室溫。通過燒結(jié)玻璃過濾除去不溶物，將濾液減壓濃縮。得到84mg為橙色粉末狀的3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子測定240.26；保留時間＝1.68分鐘。
3-(2-氨基苯基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯可以通過下列方法制備
于室溫下將425mg的HBTU和145mg的二異丙基乙胺加到150mg的(2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯)-3-甲酸的1ml無水DMF中。于室溫下攪拌20分鐘后，加入121mg鄰苯二胺。
于室溫下攪拌20小時后，將反應(yīng)物用100ml水和50ml乙酸乙酯稀釋。水相用50ml乙酸乙酯萃取3次，然后將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥并減壓濃縮。所得粗品殘留物經(jīng)HPLC(反相C18 Lichroprep 12μm)純化，用含有0.07％(v/v)三氟乙酸的5-95％的乙腈水(含0.07％(v/v)的三氟乙酸)線性梯度洗脫，流速為10ml/min。合并含有目標(biāo)化合物的部分并將其置于MEGA BE-SCX相。隨后用甲醇洗滌SCX相，并用2M氨水甲醇溶液萃取。然后將合并的萃取液減壓濃縮。如此得到200mg為橙色粉末狀的3-(2-氨基苯基氨基甲?；?-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-甲酸叔丁酯，其特征如下LC/MS(方法A)分子離子358.34；保留時間＝3.19分鐘。
實(shí)施例14磺酰胺類化合物的制備
磺酰胺類化合物可以通過下列方法制備將40mg的6-[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]吡啶-3-基胺混懸于2ml的二氯甲烷中，將所得溶液分配到4試管中，每一個試管500μl。
將4種磺酰氯(表12)稱重，分別加到上述4個試管中，然后加入15.6μl三乙胺。
表12所用磺酰氯
將上述4種反應(yīng)混合物以軌道震搖的方式于40℃震搖15小時。
自上述每一個反應(yīng)混合物中取5μl樣品，用100μl的DMSO稀釋(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個樣品的DMSO溶液。
然后將4種反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，將蒸發(fā)殘留物分別溶于500μl的DMSO中，所得溶液經(jīng)LC/MS(方法B)純化。經(jīng)LC/MS純化后，將含有目標(biāo)化合物的部分(任選合并)置于SCX相上(500mg的CUBCX1-HL相)。隨后用甲醇洗滌SCX相，然后用2M的氨水甲醇液萃取。將萃取液收集到已稱皮重的玻璃管中，蒸發(fā)至干(Savant AES 2000或Genevac HT8離心蒸發(fā)儀)，稱重(Mettler Toledo Automated Workstation LA200)，并用DMSO稀釋至10mM(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。通過LC/MS(方法A)分析所得每一個溶液。
通過質(zhì)譜(方法A)測定其保留時間和分子峰的方法，分離并定性下列化合物(表13)。
表13所得磺酰胺類化合物
實(shí)施例156-[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫-吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]吡啶-3-基胺
6-[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]吡啶-3-基胺可以通過下列方法制備將55mg10％的Pd/CaCO3加到545mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶60ml乙醇溶于中。于35℃、3巴氫氣壓下攪拌15小時，然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，通過硅藻土過濾并減壓濃縮。如此得到300mg為棕色粉末狀的6-[3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶-6-基]-吡啶-3-基胺，其特征如下EI m/z＝359M+.基峰m/z＝266(M-C5H5N2)+實(shí)施例163-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶
3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶可以通過下列方法制備將287mg的2-氯-5-硝基吡啶和500mg碳酸鉀加到500mg的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶鹽酸鹽的5ml二甲基甲酰胺溶液中。于室溫下攪拌20小時后，將反應(yīng)物加到50ml水中。通過燒結(jié)玻璃過濾回收形成的沉淀，用15ml水洗滌3次，然后減壓干燥。如此得到548mg為黃色粉末狀的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-6-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶，其特征如下EIm/z＝389M+.基峰m/z＝266(M-C5H3N2O2)+實(shí)施例176-{5-[3-(2-氟-5-三氟甲基苯基)脲基]吡啶-2-基}-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺 6-{5-[3-(2-氟-5-三氟甲基苯基)脲基]吡啶-2-基}-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺可以通過下列方法自6-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯制備
采用氨水溶液，通過酰胺化反應(yīng)，將6-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯的乙基酯轉(zhuǎn)化為甲酰胺，結(jié)果得到6-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺。
EIm/z＝358在酸性介質(zhì)(三氟乙酸的二氯甲烷液中)中，將6-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺的氨基基團(tuán)去保護(hù)，結(jié)果得到6-(5-氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺。
EIm/z＝258采用異氰酸2-氟-5-(三氟甲基)苯基酯，根據(jù)實(shí)施例1中所述方法，將脲官能團(tuán)引入6-(5-氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺，結(jié)果得到6-{5-[3-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-脲基]吡啶-2-基}-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺。
EIm/z＝463實(shí)施例186-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯 6-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯可以通過下列方法制備將5mg 10％的Pd/C和38mg的二碳酸二叔丁酯加到50mg的6-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯的6ml甲醇溶液中。于室溫、3巴氫氣下攪拌12小時，將反應(yīng)物通過硅藻土過濾并減壓濃縮。所得反應(yīng)粗化合物經(jīng)快速色譜(SiO2，CH2Cl2/MeOH的梯度為75/25-25/75)純化。如此得到20mg為白色粉末狀的6-(5-叔丁氧基羰基氨基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯，其特征如下EIm/z＝387M+.
m/z＝331(M-C4H8)+.基峰m/z＝286(m/z＝331-CO2H)+m/z＝194 C9H12N3O2+m/z＝57C4H9+實(shí)施例196-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯 6-(5-硝基吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯可以通過下列方法制備將522mg的2-氯-5-硝基吡啶加到1g的3-(5，6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶三氟乙酸鹽的10ml吡啶溶液中。于室溫下攪拌20小時后，將反應(yīng)物減壓濃縮。通過燒結(jié)玻璃過濾回收形成的沉淀，用15ml水洗滌三次并減壓干燥。所得反應(yīng)粗產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(SiO2，環(huán)己烷/EtOAc的梯度為75/25-25/75)純化。如此得到450mg為黃色粉末狀的6-(5-硝基-吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯，其特征如下EIm/z＝317M+.基峰m/z＝271(M-NO2)+.
m/z＝194(M-C5H3N2O2)+m/z＝148(m/z＝194-C2H6O)+
實(shí)施例204，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯三氟乙酸鹽 4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯三氟乙酸鹽可以通過下列方法制備將50ml水和12ml的三氟乙酸先后加到3g的2，4，5，7-四氫吡唑并[3，4-c]吡啶基-3，6-甲酸6-叔丁基3-乙基酯的50ml四氫呋喃溶液中。于回流下攪拌2小時后，將反應(yīng)物冷卻至室溫，加入飽和的碳酸鈉水溶液直到獲得堿性pH。所得水相用乙酸乙酯萃取3次。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)相并減壓濃縮。如此得到1.49g的4，5，6，7-四氫-2H-吡唑并[3，4-c]吡啶-3-甲酸乙酯三氟乙酸鹽，其特征如下EIm/z＝195M+.
m/z＝166(M-CH3N)+.基峰m/z＝138(M-C3H7N)+.
m/z＝120(m/z＝166-C2H6O)+.
m/z＝92(m/z＝120-CO)+.
化合物對Tie2和KDR激酶活性的抑制效果的測定按照下面所述的實(shí)驗(yàn)方案測試化合物對Tie2和KDR激酶的抑制活性1.Tie2采用自人胎盤中分離的cDNA為模板，通過PCR技術(shù)獲得與細(xì)胞域776-1124氨基酸相應(yīng)的人Tie2編碼序列。將該序列引入GST融合蛋白形式的桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacGT中。
在純化至約80％同源性的GST-Tie2存在下，通過Tie2對PLC磷酸化的分析測定上述分子的抑制效果。底物由PLC的SH2-SH3片段組成，后者能夠以GST融合蛋白的形式表達(dá)。
在pH為7.2的含有10mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT和10mM的甘油磷酸的20mM MOPS緩沖液中測定Tie2的激酶活性。向保持于冰上的96孔Flashplate板中，每孔加入含有100ng GST-Tie2酶的70μl激酶緩沖液。然后加入DMSO(最大濃度為10％)稀釋的10μl待測化合物。對于給定的濃度，每個測定以一式四份進(jìn)行。通過加入含有2μg的GST-PLC、冷2μM ATP和1μCi的33P[ATP]的20μl溶液開始上述反應(yīng)。于37℃溫育1小時后，通過加入1個體積單位(100μl)的200mM EDTA終止反應(yīng)。移除培養(yǎng)緩沖液后，用300μl的PBS沖洗孔三次。在Wallac MicroBeta 1450上測定放射性。
計(jì)算Tie2抑制的活性并以相對于沒有化合物存在時所測定的對照活性的百分抑制率表示。
2.KDR采用閃爍技術(shù)(96孔，NEN)，通過KDR酶在體外對底物磷酸化測定化合物的抑制作用。
將人KDR酶的細(xì)胞質(zhì)域以GST融合形式在桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac中克隆。使上述蛋白質(zhì)在SF21細(xì)胞中表達(dá)并純化至同源性約為60％。
在10mM MgCl2、100μM Na3VO4和1mM NaF存在下，在20mMMOPS、10mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT、2.5mM EGTA、10mMb-甘油磷酸中于pH＝7.2測定KDR激酶活性。于4℃將10μl的化合物加到含有100ng KDR酶的70μl的激酶緩沖液中。通過加入20μl含有2μg底物(以GST融合蛋白形式表達(dá)的PLCγ的SH2-SH3片段)、2μCi的γ33P[ATP]及2μM冷ATP的溶液開始反應(yīng)。于37℃溫育1小時后，通過加入1體積單位(100μl)的200mM EDTA終止反應(yīng)。移除培養(yǎng)緩沖液后，用300μl的PBS沖洗孔三次。采用Top Count NXT(Packard)放射性計(jì)數(shù)器測定每一個孔的放射性。
通過測定含有放射活性ATP以及只含有底物的四個不同孔的放射性確定基礎(chǔ)值。
測定含有所有上述成分(γ33P-[ATP]、KDR和PLC-γ底物)但不含有化合物的四個不同孔的總對照活性。
本發(fā)明化合物對KDR活性的抑制以沒有化合物存在時所測定的對照活性的百分抑制率表示。
化合物SU5614(Calbiochem)(1μM)包括在每一個板中作為抑制對照品。
結(jié)果
















權(quán)利要求
1.通式(I)化合物及其互變異構(gòu)體， 其特征在于L選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH、COO、NHCO、NH、NHSO2、SO2NH、NHCONH、CH2NH和NHCH2；X選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH和COO；R1選自O(shè)H、H、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代，并且當(dāng)X為鍵時，R1也可以為鹵素；R2為H或者選自烷基、亞烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；其中所述取代基可獨(dú)立選自R3、O-R3、鹵素、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3和OSO2NH-R3，其中每一個R3均獨(dú)立選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基，并任選被下列基團(tuán)所取代鹵素、芳基、雜芳基、R4、OR4或N(R4)2，每一個R4可獨(dú)立選自H、C1-C4烷基和鹵代C1-C4烷基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其具有下式(II)及其互變異構(gòu)體， 其特征為X選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH和COO；R1選自烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；R2為H或選自烷基、亞烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；其中所述取代基可獨(dú)立選自R3、O-R3、鹵素、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3和OSO2NH-R3，其中每一個R3均獨(dú)立選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基，并可任選被下列基團(tuán)所取代鹵素、芳基、雜芳基、OR4或N(R4)2，其中每一個R4均獨(dú)立選自H和C1-C4烷基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其具有下式(III)及其互變異構(gòu)體， 其特征為X選自鍵、CH2、CO、SO2、CONH和COO；R1選自烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；R2為H或選自烷基、亞烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基，并任選被取代；其中所述取代基可獨(dú)立選自R3、O-R3、鹵素、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3和OSO2NH-R3，其中每一個R3均獨(dú)立選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基，并可任選被下列基團(tuán)所取代鹵素、芳基、雜芳基、OR4或N(R4)2，其中每一個R4均獨(dú)立選自H和C1-C4烷基。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于R1為可任選被取代的雜芳基。
5.權(quán)利要求4的化合物，其特征在于R1選自可任選被鹵素、R4或O-R4所取代的苯并咪唑基、吲哚基、吡咯基。
6.權(quán)利要求5的化合物，其特征在于R1選自可任選被鹵素、R4或O-R4所取代的苯并咪唑-2-基、吲哚-2-基、吡咯-2-基。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的化合物，其特征在于R2選自可任選被取代的苯基、吡啶基、噻吩基、C1-C4烷基和C3-C7環(huán)烷基。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的化合物，其特征在于X選自CO和SO2。
9.權(quán)利要求1的化合物，其特征在于R1為H。
10.權(quán)利要求1的化合物，其特征在于R1為取代的芳基。
11.權(quán)利要求1的化合物，其特征在于R1-L為R1-NH-CO。
12.權(quán)利要求11的化合物，其特征在于R1為H。
13.權(quán)利要求1、11或12的化合物，其特征在于X為鍵且R2選自取代的芳基和取代的雜芳基。
14.權(quán)利要求13的化合物，其特征在于R2選自NHSO2-R3或NHCONH-R3取代的芳基，和NHSO2-R3或NHCONH-R3取代的雜芳基。
15.權(quán)利要求14的化合物，其特征在于芳基為苯基且雜芳基選自吡啶基和嘧啶基。
16.權(quán)利要求14的化合物，其特征在于R3選自取代的芳基和取代的雜芳基。
17.權(quán)利要求16的化合物，其特征在于R3被選自下列基團(tuán)的取代基所取代鹵素、R4、OR4和N(R4)2，其中每一個R4可獨(dú)立選自H、C1-C4烷基和鹵代C1-C4烷基。
18.權(quán)利要求17的化合物，其特征在于它選自 和
19.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物，其特征在于它是以下列形式存在的4)外消旋形式，或5)富集立體異構(gòu)體的形式，或6)富集對映體的形式；并且也可以任選為成鹽的形式存在。
20.藥用組合物，該藥用組合物含有前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
21.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的化合物作為激酶活性調(diào)節(jié)劑的用途。
22.權(quán)利要求21的化合物的用途，其中激酶選自Tie2和KDR。
23.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的化合物的用途，用于生產(chǎn)用于治療疾病的藥物。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述疾病為癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及取代的四氫－1H－吡唑并[3，4－c]吡啶、含有它們的組合物以及它們的用途。本發(fā)明尤其涉及新的取代的四氫－1H－吡唑并[3，4－C]吡啶，它們具有治療活性，可用于治療癌癥。
文檔編號A61P35/00GK1823066SQ200480019823
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者F·湯普森, P·馬耶, T·達(dá)米亞諾, M-P·謝里耶, F·克萊爾, F·阿萊, H·布沙爾德, L·戈齊－拉佐, B·博杜安, C·蘇阿耶, F·維維亞尼, M·塔巴爾特 申請人:安萬特醫(yī)藥股份有限公司