專利名稱：治療血友病的含Ⅷ因子和IXa因子的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療血友病的組合物。
具體地，本發(fā)明涉及含F(xiàn)IXa和FVIII的組合物在制備治療A型血友病或B型血友病受試者的組合物中的用途。
背景技術(shù)：
血液凝集過程涉及一系列稱為血液凝集蛋白的蛋白質(zhì)，它們以級(jí)聯(lián)式反應(yīng)起作用以引起血液凝塊的形成。
血液凝集的分子機(jī)制以及參與凝集過程的成分在數(shù)篇綜述性文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述(Furie，B.and Furie，B.C.，Cell 53(1988)505-518；Davie，E.W.et al.，Biochem.30(1991)10363-10379；Bergmeyer，H.U.(ed.)Methods of Enzymatic Analysis，Vol.V，chapter 3，3rd ed.，Academic Press，New York(1983))。
血友病是人類和其它哺乳動(dòng)物疾病，其中體內(nèi)的一個(gè)編碼血液凝集因子的基因含有突變而使編碼的蛋白在級(jí)聯(lián)過程中不能發(fā)揮正常的作用。
A型血友病是該紊亂最常見的類型，為X染色體連鎖的隱性出血紊亂，是由于凝集VIII因子活性的缺乏而引起。發(fā)病個(gè)體可發(fā)生關(guān)節(jié)和肌肉出血、易擦傷和傷口出血時(shí)間過長等各種表現(xiàn)型。該紊亂是由圖譜定位在Xq28的VIII因子基因中雜合突變(heterogeneousmutations)引起。盡管VIII因子突變具有雜合性(heterogeneity)，可通過對選定突變(尤其是反轉(zhuǎn))的直接檢測來進(jìn)行對攜帶者的檢測和出生前診斷，也可通過連鎖分析進(jìn)行間接檢測。利用來自人血漿的各種制備物或重組技術(shù)來進(jìn)行VIII因子的置換。在大多數(shù)情況下，置換治療是有效的，而有10-25％的治療個(gè)體產(chǎn)生中和抗體而影響療效。常規(guī)治療A型血友病的主要方法是灌輸VIII因子，其量是恢復(fù)VIII因子至治療水平所需的量。由于VIII因子的半衰期是11-16小時(shí)，因此有時(shí)需要每天灌輸兩次。
B型血友病作為遺傳疾病，其特征為編碼血液凝集蛋白-因子IX的基因發(fā)生突變。因子IX的綜述可參見High等(1995，″Factor IX″，于Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis，High andRoberts，eds.，Marcel Dekker，Inc.)。
在1936年，Patek和Stetson(J.Clin.Invest.15，531-542)報(bào)道血友病可通過VIII因子的置換來糾正。但是，大約15％的血友病病人產(chǎn)生針對VIII因子的抗體(Roberts，(1981)，N.Engl.J.Med.305，757)，這成為治療這些患者的主要障礙。
Barrowcliffe等(1983，J.La b.Clin.Med)報(bào)道了治療該類患者的一種形式-FEIBA(Baxter Healthcare Corporation，USA)。FEIBA是源自血漿的蛋白復(fù)合物，可與抑制劑一起用于治療A型血友病的病人，這不需要VIII因子而能使血液形成凝塊。
Barrowcliffe等(1981，Thromb.Res.21，181)發(fā)現(xiàn)FEIBA中含有的VIII因子的一種形式占抑制劑血漿中體外血液凝集促進(jìn)活性的30-50％。結(jié)果表明，VIII因子可能與IXa因子和磷脂形成復(fù)合體而存在，而這種形式可以部分保護(hù)其免受與抑制劑的相互作用。Barrowcliffe等(1981)還報(bào)道，增加純化的IXa因子和磷脂可保護(hù)VIII因子免受隨后的抗體失活作用，而且磷脂起主要保護(hù)作用。
本發(fā)明尋求提供改進(jìn)的治療血友病患者的組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于如下驚人的發(fā)現(xiàn)相對于不含有FIXa的組合物而言，F(xiàn)IXa使得在治療A型血友病或B型血友病的組合物中的FVIII濃度可減少。
因此，第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及FIXa和FVIII在制備治療受試者中的A型血友病或B型血友病的組合物中的用途，其中所述病人中不存在抗-FVIII抗體。
第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有FIXa的組合物和含有FVIII的組合物，它們同時(shí)，同時(shí)但獨(dú)立或按順序使用以治療受試者中的A型血友病或B型血友病，其中所述病人中不存在抗-FVIII抗體。
第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及FIXa在制備含有FVIII的治療A型血友病或B型血友病的組合物中的用途，其中FIXa的存在允許相對于不含有FIXa的組合物而言，減少組合物中FVIII的濃度。
第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有需要的受試者含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述受試者中不存在抗FVIII抗體。
第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有需要的受試者以含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述組合物中含有的FVIII的量低于不含有FIXa的組合物用于治療該受試者所要求的量。
第六個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種強(qiáng)化FVIII的方法，包括將因子FVIII和FIXa混合成組合物的步驟。
本發(fā)明的其它方面在權(quán)利要求書中和下面的描述和討論中闡述。這些方面在不同的章節(jié)標(biāo)題下闡述。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是每一章節(jié)標(biāo)題下的教導(dǎo)并不局限于該特定章節(jié)標(biāo)題。
優(yōu)選地，含有FIXa的組合物中進(jìn)一步包含磷脂。
優(yōu)選地，本發(fā)明組合物進(jìn)一步包含磷脂。
優(yōu)選地，所述組合物給予體內(nèi)不存在抗-FVIII抗體的受試者。
優(yōu)選地，F(xiàn)VIII和FIXa通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。
此外，已經(jīng)提出增加FIXa和磷脂可以減少FVIII的免疫原性，因而減少血友病病人中抗-FVIII抑制劑的產(chǎn)生和/或所述抑制劑發(fā)生作用的速度。該推測的基礎(chǔ)是分別在FVIII分子的C2結(jié)構(gòu)域和A2結(jié)構(gòu)域中的磷脂結(jié)合區(qū)和FIXa結(jié)合區(qū)是優(yōu)勢免疫區(qū)域，因而通過與相應(yīng)的配體結(jié)合覆蓋這些區(qū)域應(yīng)該減少這些表位的抗原反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供一種減少FVIII的免疫原性的方法，包括給病人提供FVIII與FIXa和磷脂的混合物，或同時(shí)提供FVIII、FIXa和磷脂。同樣，本發(fā)明提供FIXa和磷脂在制備治療血友病受試者的組合物中的應(yīng)用，其中該組合物用于減少所述受試者對FVIII的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明具有諸多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)通過下面的描述將變得明顯。
舉例來說，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是由于提供了商業(yè)上有用的組合物。
舉例來說，本發(fā)明的又一優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的治療A型血友病或B型血友病的組合物中要求更低量的VIII因子。因此，本發(fā)明的組合物可比現(xiàn)有的治療方式更經(jīng)濟(jì)。
進(jìn)一步舉例來說，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是由于提供了治療A型血友病或B型血友病的另外的治療方法。
進(jìn)一步舉例來說，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是由于提供了治療受試者中的A型血友病或B型血友病的另外的治療方法，其中所述病人中存在有抗-FVIII抗體。
此外，本發(fā)明在治療過程中，通過減少天然或重組FVIII的免疫原性而阻止和/或延遲血友病病人中抗-FVIII抗體的產(chǎn)生。我們認(rèn)為FIXa掩蓋了FVIII的抗原表位，使它在血液循環(huán)中的免疫原性降低。
附圖簡要說明

圖1顯示含高濃度FIXa(14nM)的FVIII濃縮物產(chǎn)生凝血酶的情況。A.FVIII濃縮物的劑量反應(yīng)。濃縮物HP(Mo-Ab)2稀釋成人工FVIII缺乏型血漿，濃度分別為1 、0.125(■)、0.03(▲)、0.005I U/ml(×)、正常血漿(◆)。B.不同F(xiàn)VIII濃縮物產(chǎn)生凝血酶的比較。在人工FVIII缺乏型血漿中添加1IU/ml的FVIII濃縮物。rFVIIIBDD(O)、rFVIIIFL1(■)、rFVIII FL2(▲)、HP(Mo-Ab)1(×)、HP(Mo-Ab)2(*)、HP(Ion--ex)(●)、IP(+)、正常血漿(◆)。
圖2顯示不同的FVIII缺乏型血漿中產(chǎn)生凝血酶的情況。所有缺乏型血漿均為＜0.01IU/ml。正常血漿(◆)，從輸注后4天的病人采集的兩個(gè)嚴(yán)重的血友病的血漿1(-*-)、2(--*--)、商業(yè)購買的血友病血漿(+)、人工耗竭型血漿(0)。
圖3顯示FIXa對凝血酶產(chǎn)生的影響。A.FIXa的濃度對凝血酶產(chǎn)生的影響。兩種不同濃度的FIXa用于激活凝血酶的產(chǎn)生。添加14nM(實(shí)線)或0.2nM(虛線)的FIXa濃縮物以起始凝集反應(yīng)。正常血漿(◆)、血友病血漿(*)。B.在低濃度FIXa時(shí)，F(xiàn)VIII濃縮物的劑量反應(yīng)。HP(Mo-Ab)2稀釋到病人1的血友病血漿中。在FIXa濃度為0.2nM激發(fā)凝血酶的產(chǎn)生。正常血漿(◆)、1(●)、0.125(■)、0.03IU/ml(▲)和血友病血漿(*)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述血友病血友病是一類遺傳性出血紊亂，由特定的凝血因子引起，分為A型血友病和B型血友病。
如本文所述，本發(fā)明涉及了A型血友病和B型血友病的治療。在高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及A型血友病的治療。
A型血友病關(guān)于A型血友病的常規(guī)教導(dǎo)可參見Semin ThrombHemost(2002)28(3)309-22；Mol Pathol(2002)55(2)，127-44；Baillieres Clin Haematol(1996)9(2)211-28；Hum Mutat(1995)5(1)1-22；以及Adv Hum Genet(1988)1727-59；0｀Brien D P，Tuddenham E G D，The structure and function of factor VIII.于”Haemostasis&thrombosis”，Ed Bloom A，F(xiàn)orbes C D，ThomasD P，Tuddenham E G D，ChurchillLivingstone，1993，333-348。
Victor A.McKusick等在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim上提供了關(guān)于A型血友病的背景知識(shí)。下面關(guān)于血友病的信息是從該來源選擇和摘抄的A型血友病是X連鎖的、隱性的出血紊亂，是由凝血VIII因子活性的缺陷引起的。發(fā)病個(gè)體可產(chǎn)生關(guān)節(jié)和肌肉出血、易擦傷和傷口出血時(shí)間過長等各種表現(xiàn)型。該疾病是由圖譜定位在Xq28的VIII因子基因中雜合突變引起。盡管VIII因子突變具有雜合性，攜帶者的檢測和出生前診斷可通過對選定突變(尤其是反轉(zhuǎn))的直接檢測來進(jìn)行，也可通過連鎖分析進(jìn)行間接檢測。利用來自人血漿的各種制備物或重組技術(shù)來進(jìn)行VIII因子的置換。在大多數(shù)情況下，置換治療是有效的，而有10-25％的治療個(gè)體產(chǎn)生中和抗體而影響療效。
發(fā)病個(gè)體產(chǎn)生關(guān)節(jié)和肌肉出血、易擦傷和傷口出血時(shí)間過長等各種表現(xiàn)型。A型血友病和B型血友病的臨床表現(xiàn)具有相似性，而只能通過分析VIII因子和IX因子的活性來區(qū)分。相反，von Willebrand病更經(jīng)常存在有黏膜與皮膚的或胃與腸的出血或者月經(jīng)過多。診斷中采用的檢查方法包括出血時(shí)間、血小板凝集及VIII因子和vonWillebrand因子分析。
A型血友病中出血嚴(yán)重性和頻率與剩余的VIII因子的量負(fù)相關(guān)(＜1％為嚴(yán)重；2-5％為中等嚴(yán)重；5-30％為輕微)。
A型血友病是由抗血友病球蛋白(VIII因子)遺傳缺陷引起。VIII因子的分子量為330 000，其在血漿中循環(huán)的濃度為100ng/ml，可與von Willebrand因子(VWF)非共價(jià)結(jié)合，后者起穩(wěn)定劑和載體蛋白的作用。其主要在肝中合成。VWF在血漿中循環(huán)的濃度為5-10μg/ml，單體的分子量為250 000，但在循環(huán)中的形式是分子量最多2千萬的一系列多聚體。VIII因子由在Xq28上的VIII因子基因所編碼，而影響出血時(shí)間和血小板瑞斯托菌素(ristocetin)凝集的νWF由染色體12上的一個(gè)基因編碼。
常規(guī)治療A型血友病的主要方法是灌輸VIII因子，其用量為恢復(fù)VIII因子的活性至治療水平的量。由于VIII因子的半衰期是11-16小時(shí)，因此有時(shí)需要每天灌輸兩次。
B型血友病關(guān)于B型血友病的常規(guī)教導(dǎo)可參見Mol Pathol(2002)55(2)，127-44；Baillieres Clin Haema tol.(1996)9(2)211-28；Adv Hum Genet(1988)1727-59以及Haemophilia(1998)4(4)350-7。
B型血友病的特征是IX因子的缺陷，該病在受傷和外科手術(shù)等之后產(chǎn)生出血延長，初次出血終止后重新出血和滯后出血。嚴(yán)重的B型血友病中，最常見的癥狀是自發(fā)的關(guān)節(jié)出血。
診斷的年齡和出血現(xiàn)象(episodes)的頻率與因子IX的凝集活性有關(guān)。嚴(yán)重的B型血友病病人通常在出生第一年被診斷出來。若不進(jìn)行治療，每月病人平均有2至5次自發(fā)性出血現(xiàn)象。中等嚴(yán)重的B型血友病的病人很少自發(fā)性出血，然而在相對輕微的外傷之后確實(shí)發(fā)生延長出血或滯后出血，通常在5-6歲前診斷出來。出血現(xiàn)象的頻率在每月一次至每年一次之間變化。輕微的B型血友病的病人也不發(fā)生自發(fā)性出血，然而，若不進(jìn)行治療，在進(jìn)行外科手術(shù)、拔牙和嚴(yán)重受傷的情況下會(huì)發(fā)生不正常出血。出血的頻率在每年一次至每十年一次之間變化。輕微的B型血友病的病人通常在歲數(shù)較大后才被診斷出來。在任何病人中，出血現(xiàn)象在兒童和青少年時(shí)可能比成年時(shí)更頻繁。
在IX因子凝集活性低的個(gè)體中確立了B型血友病的診斷。對IX因子基因(染色體座位為Xq27.1-q27.2)進(jìn)行的分子遺傳檢測在超過99％的B型血友病的病人中鑒定出引起疾病的突變。
IXa因子在此處，術(shù)語“IXa因子”包括任何功能性IXa蛋白或其片段，包括任何重組、雜交或修飾形式的IXa因子。
雜交或修飾形式的IXa因子包括包含IXa因子氨基酸序列的任何功能性IXa因子蛋白或其片段-例如，來源于哺乳動(dòng)物(例如人和動(dòng)物)的IXa因子氨基酸序列。
IXa因子(FIXa)是從其無活性的前體，即因子IX，通過XIa因子或組織因子/VIIa因子/磷脂復(fù)合體的蛋白裂解產(chǎn)生的。所述活化產(chǎn)生于對IX因子分子的兩個(gè)肽鍵進(jìn)行的切割，釋放出活化糖肽，其表觀分子量為10 000。IXa因子的重鏈(Mr＝28000)包含絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，而輕鏈(Mr＝17 000)含有膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
IXa因子對IX因子的活化可參見綜述文獻(xiàn)Trends CardiovascMed(2000)，10(5)，198-204。
IXa因子作為絲氨酸蛋白酶發(fā)揮功能，參與了酶原(zymogen)X因子的活化以形成酶Xa因子。
根據(jù)本發(fā)明，IXa因子也可是天然存在的IXa因子的修飾形式-例如，化學(xué)修飾形式。IXa因子可以是任何重組形式的IXa因子-例如突變形式的IXa因子。如果利用修飾形式的IXa因子，則該修飾形式通常相對于天然形式具有優(yōu)點(diǎn)。這些特性可以包括例如增加的穩(wěn)定性、增加的活性、易于制備或降低制備成本等。
IXa因子可通過各種已知的方法來制備。例如，IXa因子可通過用XIa因子活化由高純度的IX因子來制備。IXa因子可進(jìn)一步通過凝膠過濾，繼而免疫親合純化來純化。其純度通過SDS-PAGE分析來評價(jià)?；钚苑治隹赏ㄟ^Over(1984)Scandinavian Journal of HaematologySupplementum No.41，33，13-24中描述的一步凝集分析法來確定。
優(yōu)選地，利用的IXa因子是通過重組DNA技術(shù)來制備的。
重組FIXa(97/562)可由NIBSC(Potters Bar，UK)獲得。
優(yōu)選地，重組FIXa是基本上純化的-例如99％的純度。
FIXa試劑可用于檢查因子Xa產(chǎn)生系統(tǒng)中FVIII和組織因子的缺乏(Barrowcliffe et al.2002，Thromb.Haemost 87，442-9)。
在數(shù)據(jù)庫中可以獲得IXa因子的核苷酸和氨基酸序列。
VIII因子在此處，術(shù)語“VIII因子”包括任何功能性VIII因子蛋白分子，包括任何雜交或修飾的VIII因子。
雜交或修飾的VIII因子包括包含VIII因子氨基酸序列的任何功能性VIII因子蛋白分子或其片段，所述VIII因子氨基酸序列來源于哺乳動(dòng)物-例如人和動(dòng)物。
人的VIII因子是痕量的血漿糖蛋白，作為輔因子(cofactor)參與活化因子X和IXa。VIII因子的遺傳性缺陷引起X連鎖性出血紊亂A型血友病，可通過純化的VIII因子來成功地進(jìn)行治療。A型血友病的置換療法最初是用來源于血漿的VIII因子，后來用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中克隆和表達(dá)VIII因子cDNA而獲得的重組VIII因子(Wood etal.，1984，Nature 312330)。
VIII因子的結(jié)構(gòu)域排列為A1-A2-B-A3-C1-C2，合成時(shí)為具有2351個(gè)氨基酸的單鏈多肽，在易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中時(shí)被切除19個(gè)氨基酸長的信號(hào)肽。
VIII因子可以是還包含其它蛋白物質(zhì)如纖維蛋白原和纖連蛋白的血漿部分的形式。這種VIII因子制備物可容易的通過現(xiàn)有技術(shù)中的分離方法來制備(例如參見，″Human Blood Coagulation，Haemostasisand Thrombosis″，Ed.R.Biggs，2nd Edition(1976)，BlackwellScientific Publications，Chapter 11)。
可以利用VIII因子的凍干中間純度制備物，這在Newman etal.(1971)British Journal of Haematology 2l，1中有描述。
VIII因子可以通過加熱、溶劑、清潔劑或其它技術(shù)進(jìn)行處理以滅活病毒。
近年來，研究人員盡力由重組來源來制備VIII因子，以避免與血液產(chǎn)品相關(guān)的潛在污染。此外，VIII因子的重組來源幾乎可以無限制地提供凝集因子，因而避免了與用捐贈(zèng)的血漿作為來源材料有關(guān)的供應(yīng)限制。
因此，有利地，利用重組DNA技術(shù)制備的VIII因子。
人VIII因子cDNA可從合適的基因組來源(如產(chǎn)生該蛋白的天然器官即人肝)中，通過各種方法而分離得到，其包括從分離的mRNA模板制備cDNA，直接合成，或其組合，如US 4757006所述。
表達(dá)VIII因子的宿主-載體系統(tǒng)可以是原核生物的，但由于VIII因子的復(fù)雜性，優(yōu)選地表達(dá)體系為哺乳動(dòng)物的(至少對于具凝集活性的生物活性VIII因子而言)。這可通過用合適的VIII因子載體轉(zhuǎn)化真核生物(通常是哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物細(xì)胞)來實(shí)現(xiàn)。
VIII因子的表達(dá)系統(tǒng)描述于US6358703。VIII因子在重組和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中的表達(dá)在Blood Cells Mol Dis(2000)，28(2)234-48中進(jìn)行了綜述。
編碼VIII因子或其個(gè)別片段或修飾蛋白的cDNA可在正確的閱讀框中與合適的調(diào)節(jié)信號(hào)融合以產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，然后其可被擴(kuò)增，例如根據(jù)常規(guī)方法-如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，1989)中描述的方法在細(xì)菌(如大腸桿菌)質(zhì)粒載體中制備。擴(kuò)增的構(gòu)建體然后可從載體中切出并純化以備用。其中可通過各種已知的方法來進(jìn)行純化，例如通過一個(gè)或多個(gè)循環(huán)的HPLC。
使用的VIII因子也可選自表1所列的NIBSC參考制備物。rFVIIIBDD(99/694)是缺乏B-結(jié)構(gòu)域的重組FVIII(B-結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對于止血沒有任何影響)。全長的重組體可通過稍微不同的方法來制備(rFVIII FL 1&2，96/598，96/590)，F(xiàn)L1是通過將FVIII和vWF的cDNA插入到中國倉鼠卵巢細(xì)胞系中來制備(Lee，(1999)，ThrombHaemost，82516-524)。FL2是通過將FVIII cDNA插入到幼倉鼠腎細(xì)胞系來制備，上述FL1和FL2的制備方法采用類似的純化步驟和均需要白蛋白用于穩(wěn)定。高純度的純化單克隆抗體(HP(Mo-Ab)1&2，96/574，95/640)使用與柱子中sephrose珠共價(jià)連接的FVIII抗體，當(dāng)冷沉物通過柱子時(shí)，抗體吸附FVIII，F(xiàn)VIII通過洗脫緩沖液從柱上釋放出來，并對材料進(jìn)行進(jìn)一步純化(Lee CA.Coagulation factorreplacement therapy.InRecent Advances in Haematology(Hoffbrand AV and Brenner MK，eds)，No 6.EdinburghChurchillLivingstone.p73-88)。純化的高純度離子交換(HP(Ion-ex)，96/600)制備如下先經(jīng)過色譜純化冷沉物之后，以離子交換樹脂通過吸附以進(jìn)一步純化FVIII。中等純度(IP，96/574)是通過肝素和甘氨酸沉淀進(jìn)行純化的(Kasper Cota e Silva(2000)InFacts and Figures，No 6.MontrealWorld Federation of Hemophilia.2000；5-6)。對照WHO濃縮物標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行顯色反應(yīng)以測定效力。
VIII因子的核苷酸和氨基酸序列可在數(shù)據(jù)庫中獲得。
磷脂通常，磷脂的最佳來源是取自嚴(yán)重血友病患者的富含血小板的血漿形式的血小板自身的磷脂(Nilsson et al.(1957)Acta.Med.Scand.159，35-57(1957))。然而，將對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說并不是有實(shí)際意義的方法，其它磷脂來源必須使用。
帶負(fù)電荷的磷脂(例如磷脂酰絲氨酸)與不帶電荷的磷脂(例如磷脂酰膽堿)的混合物可以作為合適的試劑(Zwaal&Hemker(1982)Haemostasis 11，12-39)。
可以利用不同來源的磷脂抽提物，例如在Bell and Alton(1954)Nature 174，880-881；Hjort et al.(1955)J.Lab.Clin.Med.46，89-97及Barrowcliffe et al.(1982)Haemostasis 11，96-101中披露的牛、兔或人腦。
磷脂可以是基本上純化或合成的磷脂。
磷脂可由純化或合成的磷脂單獨(dú)一種組成，也可以由其與其它物質(zhì)例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂等的混合組成。
磷脂可以通過非極性溶劑從富含磷脂的人、動(dòng)物或植物組織中抽提。合適的組織來源可以包括牛、人、豬或兔的腦、胎盤、脊髓或血小板，而?；蛉四X是富含磷脂的特別好的來源。
任何非極性溶劑，只要能夠用于抽提組織并獲得所需水平的磷脂，均可用于該方法。合適的溶劑可以包括但不局限于，氯烷烴-例如氯仿和二氯甲烷，和石油醚。
不管選擇何種抽提溶劑和抽提方法，優(yōu)選地，獲得的磷脂是穩(wěn)定的產(chǎn)品并包含最少的氧化產(chǎn)物。這可通過將合適的抗氧化劑，尤其是丁基化羥基苯甲醚，加入到所采用的一種或多種溶劑中來最好地實(shí)現(xiàn)。
一旦通過例如混合純化或合成磷脂或從自然來源的物質(zhì)抽提得到磷脂后，可隨后通過本領(lǐng)域已知的乳化方法將其分散到水性溶液中。例如，磷脂可溶解于甲醇或乙醇，然后蒸發(fā)大部分或所有的溶劑，接著在劇烈攪拌下將所述固體加入到水中或生理鹽水中而形成磷脂乳液。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，磷脂(91/542)可從NIBSC，Potters Bar，UK獲得。
治療(treatment)在本發(fā)明中所述治療包括治愈、減輕和預(yù)防性治療中的一種或多種。優(yōu)選地，術(shù)語治療至少包括治愈治療和/或減輕治療。
所述治療可以與其它治療血友病的方式相結(jié)合。
療法(therapy)本發(fā)明的組合物可以用作治療試劑-即用于治療用途。
如同在這里的術(shù)語“治療”，術(shù)語“療法”包括治愈效果、減輕效果及預(yù)防效果。
療法可以在人或動(dòng)物上進(jìn)行。
療法可與其它對血友病的治療性治療相結(jié)合。
受試者在本發(fā)明中，“受試者(subject)”指任何可以發(fā)展出或已患有血友病的受試者-例如哺乳動(dòng)物，例如人和動(dòng)物。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的受試者是人。
受試者體內(nèi)可含有或不含有抗-FVIII抗體。
抗-FVIII抗體的存在可通過各種本領(lǐng)域已知的多種方法來確定-例如在Barrowcliffe et al.(1983)J Lab.Clin.Med.34-43中描述的那些方法。
通常，含有的抗-FVIII抗體水平低于10 Bethesda單位/ml的病人可用高劑量的VIII因子治療。然而，這種治療存在許多問題，不僅因?yàn)樗⒉豢偸怯行В屹M(fèi)用也很高。含有的抗-FVIII抗體水平高于10 Bethesda單位/ml的受試者通常需要另外的治療方法，因?yàn)橛酶邉┝康腣III因子治療并不起作用。
本發(fā)明的組合物因此可以給予所含抗-FVIII抗體水平低于和高于10 Bethesda單位/ml的病人。
在一個(gè)更優(yōu)選地實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物給予所含抗-FVIII抗體水平高于10 Bethesda單位/ml的病人。
組合物根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)VIII和FIXa可以作為分開的藥物組合物給藥或作為單一藥物組合物而共同給藥。
FVIII和FIXa也可同時(shí)、同時(shí)但獨(dú)立或按順序給藥。
組合物可進(jìn)一步包括磷脂。
優(yōu)選地，含有FIXa的組合物可進(jìn)一步包括磷脂。
典型地，磷脂可分散于水性溶液-例如水或生理鹽水-以形成分散體，其然后與IXa因子混合。
相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可包括FVIII藥物組合物和添加有磷脂的FIXa藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括含有FVIII、FIXa和磷脂的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可基本上由FVIII藥物組合物和添加有磷脂的FIXa藥物組合物組成。根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步基本上由含有FVIII、FIXa和磷脂的藥物組合物來組成。
本發(fā)明的組合物也可含有非毒性物質(zhì)-例如天然存在的物質(zhì)。這些進(jìn)一步的物質(zhì)通常來源于血漿或富含磷脂的組織來源。這些物質(zhì)的典型的是纖維蛋白原和白蛋白。
為了制備本發(fā)明的組合物，其中的一種或多種成分可以凍干。
若是含磷脂的藥物組合物，則含有IXa因子和磷脂(與任何其它相關(guān)材料一起)的混合物可通過凍干來制備。這種情況下，組合物可通過將凍干混合物加入水性溶液來制備。
此處所述的組合物可用于人或動(dòng)物而作為人用藥和獸用藥，典型地包含任何一或多種藥物可接受稀釋劑、載體或賦形劑。治療用的可接受載體或稀釋劑在藥物領(lǐng)域中是熟知的，在例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中有所描述。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐來進(jìn)行。藥物組合物可如同含載體、賦形劑或稀釋劑一樣含有-或者除載體、賦形劑或稀釋劑外額外含有-任何合適粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包覆劑或增溶劑。
相應(yīng)地，本發(fā)明的組合物中的成分也可與一種或多種合適的藥物載體、賦形劑或稀釋劑混合，所述一種或多種合適的藥物載體、賦形劑或稀釋劑根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐來選擇。
根據(jù)不同的給藥體系對組合物/制劑有不同的要求。例如，本發(fā)明有用的藥物組合物可制備成適于非腸胃給藥，其中組合物制備成如適于經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑遞送的可注射劑型?；蛘?，可將制劑設(shè)計(jì)成適于多種途徑給藥。
防腐劑、穩(wěn)定劑、染色劑甚至調(diào)味劑均可提供于藥物組合物中。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。抗氧化劑和懸浮劑也可使用。
優(yōu)選地，藥物可接受稀釋劑或載體是水。然而，可由其它合適的稀釋劑或載體，如生理鹽水來替代。
本發(fā)明的組合物可以以含有調(diào)味或著色劑的片劑、膠囊、ovules、酏劑、溶液劑或混懸劑的形式，用于即時(shí)、延時(shí)、緩和(modified)、持續(xù)、脈沖或控制釋放給藥。
如果藥物為片劑，則可含有賦形劑-例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、二堿價(jià)磷酸鈣及甘氨酸，崩解劑如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或本薯淀粉)、乙醇酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉及某些復(fù)合硅酸鹽以及成粒粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯樹膠。此外，也可包含潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸、山萮酸甘油和滑石粉。
類似類型的固體組合物也可用作明膠膠囊填充劑。在這點(diǎn)上，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、奶糖或高分子量聚乙二醇。對于水性混懸劑和/或酏劑，該試劑可與不同的甜味劑或調(diào)味劑、著色物質(zhì)或染色劑聯(lián)合，與乳化劑和/或懸浮劑聯(lián)合，以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油聯(lián)合，以及與這些物質(zhì)的組合之間聯(lián)合。
給藥(遞送)途徑可包括，但不局限于口服給藥(例如作為片劑、膠囊劑或作為可食入的溶液)、非腸胃給藥(如通過注射形式)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給藥中的一種或多種。
藥物組合物可用于人或動(dòng)物，而作為人用藥或獸藥，典型包含任何一種或多種藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。治療用的可接受的稀釋劑、或載體在藥物領(lǐng)域中是非常熟知的，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中所述。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐來進(jìn)行。藥物組合物可如同含有載體、賦形劑或稀釋劑一樣含有-或除載體、賦形劑或稀釋劑外額外含有-任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包覆劑、增溶劑。
防腐劑、穩(wěn)定劑、染色劑甚至調(diào)味劑均可提供于藥物組合物中。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。抗氧化劑和懸浮劑也可使用。
根據(jù)不同的遞送體系對組合物/制劑有不同的要求?；蛘?，可將制劑設(shè)計(jì)成適于多種途徑給藥。
藥物組合物可經(jīng)非腸胃注射，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥。對于非腸胃給藥，組合物最佳的劑型是滅菌的水溶液，其中可含其它物質(zhì)，如足夠的鹽或單糖以使溶液與血液有相同的滲透壓。
劑量根據(jù)本發(fā)明的組合物中成分的可能劑量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。例如通過動(dòng)物研究來確定成分的最佳用量。
VIII因子的劑量在本領(lǐng)域中以國際單位(IU)來表示。一個(gè)IU表示1ml正常血漿中的VIII因子的量，約為100ng。
給予病人的實(shí)際VIII因子用量由病人臨床表現(xiàn)而定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定這一實(shí)際用量。
典型地，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，單獨(dú)給予VIII因子的劑量范圍為20-50IU/kg。
有利的是，根據(jù)本發(fā)明的組合物所給予的與FIXa及任選與磷脂聯(lián)合使用的VIII因子的量可減少多達(dá)2、4、6、8或10倍或更高(體外)。
因此，有利地，本發(fā)明的組合物提供的劑量低于20IU/kg，優(yōu)選2至10IU/Kg，有利地為2至5IU/Kg。
根據(jù)本發(fā)明，以摩爾計(jì)算，F(xiàn)IXa的濃度應(yīng)高于FVIII。
優(yōu)選地，以摩爾計(jì)算，F(xiàn)IXa的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-100倍，更優(yōu)選FIXa應(yīng)至少是FVIII濃度的20-90倍，進(jìn)一步優(yōu)選FIXa應(yīng)至少是FVIII濃度的30-70倍，還優(yōu)選FIXa應(yīng)至少是FVIII濃度的40-60倍，最優(yōu)選FIXa應(yīng)至少是FVIII濃度的50倍。
根據(jù)本發(fā)明，以摩爾計(jì)算，磷脂的濃度應(yīng)高于FVIII。
優(yōu)選地，以摩爾計(jì)算，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-1500倍。更優(yōu)選，以摩爾計(jì)算，磷脂的濃度至少是FVIII的10-1000倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-900倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-800倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-700倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-600倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-500倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的10-400倍，更優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的100-400倍，進(jìn)一步優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的200-400倍。最優(yōu)選，磷脂的濃度應(yīng)至少是FVIII的300倍。
根據(jù)不同的病人，具體劑量水平和給藥頻率可能不同，要考慮各種因素，包括使用的具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性及作用持續(xù)時(shí)間、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時(shí)間、排泄率、聯(lián)合給藥、具體病況的嚴(yán)重程度以及具體的正在進(jìn)行的治療方法。
制劑本發(fā)明的成分可制備成藥物組合物，如用本領(lǐng)域的已知方法將其與一種或多種可接受載體、稀釋劑或賦形劑混合。
核苷酸序列在這里，術(shù)語“核苷酸序列”與術(shù)語“多核苷酸”具有同等含義。
本發(fā)明的方面涉及核苷酸序列的應(yīng)用，這些序列可在數(shù)據(jù)庫中獲得。這些核苷酸序列可用于表達(dá)氨基酸序列，其可作為本發(fā)明組合物中的成分。
核苷酸序列可以是基因組的或合成的或重組來源DNA或RNA。核苷酸序列可以是雙鏈或單鏈，代表有義鏈或反義鏈或者它們的組合。
核苷酸序列可通過重組DNA技術(shù)(如重組DNA)來制備。
核苷酸序列可與天然存在的形式相同，也可以是其衍生物。
氨基酸序列在此處，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”具有同等的含義。有時(shí)，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”有相同的含義。有時(shí)，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“蛋白質(zhì)”的含義等同。
本發(fā)明的某些方面涉及氨基酸序列的應(yīng)用，其序列可在數(shù)據(jù)庫中獲得。這些氨基酸序列可用于本發(fā)明的組合物中。
氨基酸序列可從合適的來源分離得到，或通過合成或重組DNA技術(shù)來制備。
動(dòng)物檢測模型體內(nèi)模型可用于優(yōu)化或設(shè)計(jì)治療受試者中的A型血友病或B型血友病的治療方法。
動(dòng)物檢測模型可以是哺乳動(dòng)物，如非人哺乳動(dòng)物，例如大鼠、倉鼠、兔、豚鼠或小鼠。
通用重組DNA技術(shù)除非特別說明，本發(fā)明采用的是常規(guī)的化學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
這些技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)中有說明。例如參見J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F(xiàn).M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocolsin Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNAIsolation and SequencingEssential Techniques，John Wiley&Sons；M.J.Gait(編輯)，1984，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach，Irl Press以及D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of EnzymologyDNA Structure Part ASynthesis and Physical Analysis of DNA Met hodsin Enzymology，Academic Press。本發(fā)明分別通過引用的方式將這些文獻(xiàn)引入作為參考。
下面通過實(shí)施例的方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，所述實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。
實(shí)施例1材料和方法試劑TBS緩沖液50mM Tris，150mM NaCl，0.02％NaN2，pH7.4，1％人血清白蛋白(Zenalb，BPL，Elstree，UK)。牛纖維蛋白原(Diagnostic Reagents Ltd.Thame，Oxon UK)。來自NIBSC，PottersBar，Herts，UK的凍干試劑磷脂(91/542)，重組FIXa(97/562)，蝮蛇抗栓酶(74/581)，α-凝血酶(89/588)。FIXa試劑為99％的純度并用于測定在Xa因子產(chǎn)生系統(tǒng)中的FVIII和組織因子的存在與否(Barrowcliffe TW，F(xiàn)abregas P，Jardi M，Cancelas J，RabanedaM，and Feize J.Procoagulant activity of Tlymphoblastoid celldue to exposure of negatively charged phospholipid.ThrombHaemost 2002；87442-449)。
FVIII濃縮物對不同純度和制備方法獲得的一系列濃縮物進(jìn)行研究。作用FVIII濃縮物(表1)為凍干材料，作為參照制備物，也獲自NIBSC。rFVIII BDD(99/694)是重組FVIII，缺乏B-結(jié)構(gòu)域(B-結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為在止血中沒有任何作用(Lee C.Recombinant clotting factors in thetreatment of hemophilia.Thromb Haemost 1999；82516-524))。全長重組體的制備方法稍有不同(rFVIII FL1&2，96/598，96/590)，F(xiàn)L1是通過插入FVIII和vWF的cDNA到中國倉鼠卵巢細(xì)胞系而制備得到(Lee C.Recombinant clotting factors in the treatment ofhemophilia.Thromb Haemost 1999；82516-524)。FL2是通過將FVIII cDNA插入到幼倉鼠腎細(xì)胞系中而制備，它們均具有類似的純化步驟并需要白蛋白來穩(wěn)定。高純度單克隆抗體，純化的，(HP(Mo-Ab)1&2，96/574，95/640)利用在柱子中共價(jià)結(jié)合于sepharose珠的FVIII抗體，當(dāng)冷沉物通過柱子時(shí)抗體吸附FVIII，繼而用洗提緩沖液將FVIII從柱上釋放，然后可作進(jìn)一步的純化(Lee CA.Coagulationfactor replacement therapy.于Recent Advances inHaematology(Hoffbrand AV and Brenner MK，eds)，No 6.EdinburghChurchill Livingstone.1992；73-88)。高純度的離子交換純化(HP(Ion-ex)，96/600)制備如下首先通過色譜純化冷沉物，然后用離子交換樹脂通過吸附以進(jìn)一步純化FVIII(Lee CA.Coagulation factor replacement therapy.于Recent Advancesin Haematology(Hoffbrand AV and Brenner MK，eds)，No 6.EdinburghChurchill Livingstone.1992；73-88)。中間純度(IP，96/574)通過肝素和甘氨酸沉淀來純化(Kasper CK and Cota e SilvaM.Registry of clotting factor concentrates 2nd edn.于Factsand Figures，No 6.MontrealWorld Federation of Hemophilia.2000；5-6)。對照WHO濃縮物標(biāo)準(zhǔn)通過顯色方法來測定效力。
血漿人工FVIII缺陷血漿(Organon Teknika Corporation，Durham，USA)。所述血漿是化學(xué)法耗竭的，并含有正常水平的vWF。正常的無血小板的血漿從National Blood Service，Colindale，UK獲得。5個(gè)捐贈(zèng)的血漿在冷凍前匯集在一起，通過顯色反應(yīng)分析可知獲得的匯集物含有0.86IU/ml FVIII。從2個(gè)病人獲得血友病血漿，通過一步法APTT分析得知水平低于0.01IU/ml。血漿于2000g，4℃下離心15分鐘以去除血小板。
兔多克隆FVIII抗體由Dr Ingerslev贈(zèng)予。對照抗體是Gammabulin，Baxter Hyland Immuno(Immuno Ltd，Thetford，Norfolk，UK)產(chǎn)品。
凝血酶產(chǎn)生試驗(yàn)在Deca設(shè)備(Grifols，Barcelona，Spain)上進(jìn)行，通過機(jī)械終點(diǎn)測定凝塊。
凝血酶產(chǎn)生試驗(yàn)如下去除血漿中纖維蛋白使用先前描述過的蝮蛇抗栓酶(ancrod)(Houbouyan L，Padilla A，Gray E，Longstaff C，andBarrowcliffe TW.Inhibition of thrombing eneration by heparinand LMW heparinsa comparison of chromogenic and clottingmethods.Blood Coagul Fibrinolysis 1996；724-30)，終濃度為0.5IU/ml血漿，37℃保持30分鐘，然后用木制棍破壞凝塊。FVIII濃縮物加入到FVIII缺乏型血漿中使其濃度達(dá)到0.005-1IU/ml。400μl正常血漿或缺乏型血漿和FVIII濃縮物及80μl FIXa(在血漿中的濃度為14nM)在37℃共同孵育1.5分鐘，然后加入400μl磷脂(終濃度3.1μg/ml)和400μl CaCl2(終濃度7.8mM)以起始反應(yīng)。以頻繁的時(shí)間間隔取50μl次級(jí)(subsample)樣品加入到兩個(gè)Deca設(shè)備上含200μl纖維蛋白原的杯子中，記錄凝結(jié)的時(shí)間。通過α-凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線將凝結(jié)時(shí)間轉(zhuǎn)化為凝血酶單位。凝血酶產(chǎn)生曲線用曲線下面積(AUC)、血酶峰值和達(dá)到半數(shù)最大值(T1/2max)所需費(fèi)的時(shí)間來進(jìn)行量化。每組實(shí)驗(yàn)均以反向平衡順序進(jìn)行，平行兩份，并重復(fù)3或更多次。
TGT的再現(xiàn)性在3個(gè)月周期中，對正常血漿進(jìn)行了9次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，各平行兩份，獲得的曲線的3個(gè)參數(shù)表明CV范圍為8.9-14.6％。此外，對3個(gè)不同的FVIII濃度進(jìn)行了為期1周的一組5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，CV范圍在0.02IU/ml時(shí)為5-5.6％，在0.005IU/ml時(shí)為9.2-11.7％，而正常血漿(0.86IU/ml)為6.8-12.3％。
FVIII抗體實(shí)驗(yàn)將抗體加入到正常和血友病血漿中，加入的FVIII抗體稀釋度為1/1000，而對照抗體為10μg/ml。血漿和抗體于37℃孵育過夜，按前述的方法進(jìn)行凝血酶產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)。
數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)分析是用不成對斯氏t-檢驗(yàn)來分析。
實(shí)施例2TGT對FVIII的劑量反應(yīng)濃縮HP(Mo-Ab)2摻料到人工化學(xué)法耗竭的FVIII缺乏血漿，這些血漿的FVIII濃度涵蓋了較寬的范圍，從0.005至1IU/ml，并測定凝血酶產(chǎn)生(Fig 1A)。發(fā)現(xiàn)FVIII的濃度從1降低到0.005IU/ml時(shí)，曲線中由T1/2max所代表的滯后時(shí)間由64秒延長到165秒。然而，盡管是非常低水平的FVIII，凝血酶的峰值不受影響，且觀察到AUC只降低很少。甚至在FVIII濃度為0.005IU/ml時(shí)，AUC也僅比正常血漿稍有減少，分別是6287和6540iu.sec。在濃度為1(T1/2max64sec)和0.125IU/ml(T1/2max87sec)時(shí)，凝血酶比正常血漿(T1/2max118sec)產(chǎn)生更快，而濃度為0.03IU/ml(T1/2max119sec)時(shí)與正常血漿產(chǎn)生凝血酶的情況相似。
實(shí)施例3FVIII濃縮物比較當(dāng)不同的FVIII濃縮物以相同的FVIIIC濃度加入到FVIII缺乏型血漿中時(shí)，獲得的凝血酶產(chǎn)生曲線與濃縮物HP(Mo-Ab)2相似(圖1B，表2)。所有濃縮物在1IU/ml時(shí)比正常血漿更快產(chǎn)生凝血酶，且產(chǎn)生量也比正常血漿的要大。rFVIII BDD的T1/2max(48sec)比其它濃縮物(范圍在54-64sec)要短，這種差別具有統(tǒng)計(jì)分析上顯著性，p＜0.05。
實(shí)施例4嚴(yán)重血友病的血漿來自兩個(gè)患有嚴(yán)重A型血友病的病人的血漿產(chǎn)生非常驚奇的量的凝血酶(圖2，表3)，其AUC 65和69％正常血漿，盡管有低于0.01IU/ml的水平。然而，兩個(gè)病人的凝血酶產(chǎn)生的起始點(diǎn)顯著延遲，T1/2max分別為426和318秒。用FVIII抗體與之孵育過夜，可以使之完全不產(chǎn)生凝血酶，凝血酶峰值從22IU/ml至0.2IU/ml(表3)，表明這些血友病血漿的凝血酶的產(chǎn)生歸功于低水平的FVIII。另一個(gè)血漿樣品獲自于輸注后61小時(shí)的病人HP1(原始樣品是注射后37小時(shí))，該樣品產(chǎn)生微量的凝血酶(AUC為正常血漿的5％)。這表明這些條件下進(jìn)行的凝血酶產(chǎn)生試驗(yàn)在低于一步分析法檢測限度即＜0.01IU/ml的水平是敏感的。
實(shí)施例5FIXa濃度減低FIXa的濃度以便檢測FIXa對于極低FVIII濃度下產(chǎn)生凝血酶的影響(圖3A)。FIXa濃度從14nM逐漸降低，導(dǎo)致正常血漿的滯后時(shí)間延長(在14nM時(shí)的T1/2max為114秒，延長到0.2nM時(shí)的226秒)，但不改變峰高度或AUC(0.2nM時(shí)的AUC為14nM的98％)。與14nM濃度的結(jié)果相反，在血友病血漿中FIXa為0.2nM的濃度下，幾乎不產(chǎn)生凝血酶。凝血酶產(chǎn)生試驗(yàn)因而在低量FVIII時(shí)是敏感的，但同時(shí)依賴于FIXa的濃度。有實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未顯示)表明正常血漿和血友病血漿通過玻璃接觸激活產(chǎn)生與高濃度FIXa類似量的凝血酶。
實(shí)施例6在低FIXa濃度下的FVIII的劑量反應(yīng)也用相同濃縮物HP(Mo-Ab)2評定在低FIXa水平下的劑量反應(yīng)。濃縮物稀釋到血友病血漿中，并用低濃度FIXa(0.2nM)激活血漿(圖3B)。當(dāng)FVIII濃度下降時(shí)，AUC和峰高度也下降，而滯后時(shí)間卻延長(如前面所觀察到的)。與高濃度FIXa相反，峰高度和AUC保持異常，只有更高濃度的FVIII使之恢復(fù)正常。在較低FIXa濃度下，增加FVIII對凝血酶產(chǎn)生的影響更為明顯。
討論化學(xué)法耗竭型血漿被觀察到的更快產(chǎn)生凝血酶的現(xiàn)象被表明是所用特定缺乏型血漿的一種人為現(xiàn)象。在免疫耗竭型和血友病血漿中沒有觀察到相同的現(xiàn)象，但低水平下產(chǎn)生的凝血酶總量仍然很高，這是由于使用高濃度的FIXa的緣故。
使用高濃度FIXa的凝血酶產(chǎn)生試驗(yàn)(TGT)被發(fā)現(xiàn)對低水平的FVIII非常敏感。當(dāng)FVIII水平低于0.01IU/ml時(shí)，在添加FVIII濃縮物至FVIII缺陷型血漿的人工情況以及在兩個(gè)嚴(yán)重血友病血漿中，均可產(chǎn)生大量的凝血酶。早期針對TGT的工作發(fā)現(xiàn)在血友病血漿中只能檢測到非常少量的凝血酶，但只要添加小量的正常血漿即可改善其凝血酶的產(chǎn)生。Macfarlane和Biggs(A thrombin generation testthe application in haemophilia and thrombocytopenia.J ClinPathol 1953；63-8)的血漿研究表明加入0.5％正常血漿到血友病血漿中即可引起可檢測的凝血酶產(chǎn)生，然而，凝血酶的產(chǎn)生十分滯后并只能達(dá)到正常樣品平均峰高度的三分之一。Pitney和Dacie發(fā)現(xiàn)加入1％正常血漿可改善凝血酶的產(chǎn)生，但需要20％或更高才能使凝血酶的產(chǎn)生達(dá)到正常值(Pitney WR and Dacie JV.A simple method forstudying the generation of thrombin in recalcified plasma.JClin Pathol 1953；69-14)。在血友病血樣品(HP1)中使用FVIII抗體表明是由于FVIII導(dǎo)致產(chǎn)生的凝血酶低于0.01IU/ml(表3)。在更長的注射后時(shí)間以后取自該病人的重復(fù)樣品幾乎不產(chǎn)生凝血酶，這表明最初樣品產(chǎn)生的凝血酶是由于注射殘余的FVIII。另一個(gè)病人的血漿(HP2)在輸注后72小時(shí)收集，其凝血酶的產(chǎn)生不太可能歸因于注射，而可能是由于內(nèi)源的FVIII。最近的研究中，aPTT凝塊波形分析顯示在一些嚴(yán)重血友病病人中可檢測的FVIII，其水平為0.002至0.01IU/ml(Shima M，Matsumoto T，F(xiàn)ukuda K，Kubota Y，TanakaI，Nishiya K，Giles AR，and Yoshioka A.Theutility of activatedpartial thromboplastintime(aPTT)clot waveform analysisinthe investigation of hemophilia A patients with very lowlevels of factor VIII activity(FVIIIC).Thromb Haemost 2002；87436-441)。由于能夠檢測此低水平FVIII，因此暗示了進(jìn)行預(yù)防的頻率。我們揭示在低于0.01IU/ml時(shí)有相當(dāng)量的凝血酶產(chǎn)生，某些證據(jù)表明當(dāng)波谷水平低于0.01IU/ml時(shí)，關(guān)節(jié)出血仍然非常罕見(Petrini P.What factors should influence the dosage andinterval of prophylactic treatment in patients with severehaemophilia A and B？Haemophilia 2001；799-102)。雖然通常認(rèn)為預(yù)防應(yīng)當(dāng)保持在高于該水平，但沒有證明這可改善臨床結(jié)果(van den Berg HM，F(xiàn)ischer K，Mauser-Bunschoten EP，Beek FJ，Roosendaal G，van der Bom JG，and Nieuwenhuis HK.Long-termoutcome of individualized prophylactic treatment of childrenwith severe haemophilia.Br J Haematol 2001；112561-565)。
TGT對低水平FVIII的敏感性可以通過在分析中使用用以起始凝結(jié)反應(yīng)的FIXa量解釋。發(fā)現(xiàn)FIXa的濃度對于低濃度FVIII產(chǎn)生凝血酶的能力非常重要，但這種效應(yīng)隨著FVIII的正?；蛔钚』?。最初選擇高濃度FIXa是因?yàn)樗a(chǎn)生與內(nèi)部玻璃接觸激活相同的凝血酶產(chǎn)生情況。Josso et al(Josso F，and Prou-Wartelle O.Interactionof tissue factor and factor VII at the earliest phase ofcoagulation.Thromb Diath Haemorrh Suppl 1965；1735-44)表明需要組織因子(TF)和FVII來替代對體外接觸激活的需求。后來表明是TF、FVII和鈣激活FIX(sterud B，and Rapaport SI.Activation of factor IX by the reaction product of tissuefactor and factor VII.Additional pathway for initiating bloodcoagulation.Proc Natl Acad Sci USA 1977；745260-5264)。這在低濃度TF時(shí)也會(huì)出現(xiàn)，這可解釋抗血友病因子在凝血酶產(chǎn)生中的作用(Bauer KA.Activation of the factor VII-tissue factorpathway.Thromb Haemost 1997；78108-111；Keularts IM，Zivelin A，Seligsohn U，Hemker HC，and Béguin S.The role offactor XI in thrombin generation induced by low concentrationsof tissue factor.Thromb Haemost 2001；851060-1065)。此外，在低濃度TFF，少于1％的總血漿FIX被激活，得到0.9nM的血漿FIXa濃度(Laws on JH，Kalafatis M，Stram S，and Mann KG.A model forthe tissue factor pathway to thrombin.J Biol Chem 1994；26923357-23366)。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的0.2nM的低FIXa濃度因而低于此水平，但可被認(rèn)為是在凝結(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始過程中存在的生理學(xué)濃度。雖然與接觸激活相似，用于激發(fā)凝血酶產(chǎn)生的較高的14nM FIXa濃度可能高于生理學(xué)濃度，盡管在損傷之后的局部FIXa濃度可能高于0.9nM。在TGT中，還使用0.1nM至1.5nM濃度的FIXa進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Hoffman M，Monroe DM，Oliver JA，and Roberts HR.Factor IXaand Xa play distinct roles in tissue factor-dependentinitiation of coagulation.Blood 1995；8617941-1801；JestyJ.Interactions of feedback control and product inhibition inthe activation of factor X by factors IXa and VIII.Haemostasis1991；21208-218；Kumar R，Béguin S，and Hemker HC.Theinfluence of fibrinogen and fibrin on thrombin generation-evidence for feedback activation of the clotting system byclot bound thrombin.Thromb Haemost 1994；72713-721；SekiyaF，Yoshida M，Yamashita T，and Morita T.Ma gnesium(II)isacrucial constituent of the blood coagulation cascade.Potentiation of coa gulant activities of FIX by Mg2+ions.JBiol Chem 1996；2718541-8544)。不希望受任何特定理論的束縛，當(dāng)用低濃度FVIII進(jìn)行分析時(shí)，在高濃度FIXa下，F(xiàn)IXa可以保護(hù)經(jīng)降解由血友病血漿產(chǎn)生的極少量的FVIIIa(Lenting PJ，van MourikJA，Mertens K.The lifecycle of coagulation factor VIII inview of its structure and function.Blood 1998；923983-3996)，并且在更高的FIXa濃度下，F(xiàn)IXa可以增強(qiáng)FVIIIC活性(RickME.Activation of factor VIII by factor IXa.Blood 1982；60744-751)。
說明書中提到的所有公開發(fā)表的文章被結(jié)合進(jìn)來作為參考。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明描述的方法和體系的各種改進(jìn)和衍變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯然的。雖然本發(fā)明通過具體的優(yōu)選實(shí)施方式來進(jìn)行了描述，應(yīng)當(dāng)理解的是要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于這些具體的實(shí)施方式。實(shí)際上，對于生物或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員，為實(shí)施本發(fā)明對所述方式進(jìn)行的各種改進(jìn)都屬于下面的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
表1FVIII濃縮物的特性
表21IU/ml FVIII濃縮物的凝血酶產(chǎn)生情況，*＝P＜0.05，曲線下的面積(AUC)，達(dá)到半數(shù)最大峰高度所需的時(shí)間(T1/2max)，n≥3。
表3FVIII缺陷型血漿的凝血酶產(chǎn)生結(jié)果。所有缺陷型血漿含有的FVIII＜0.01IU/ml。血友病血漿(HP)，n≥3。
權(quán)利要求
1.FIXa和FVIII在制備治療受試者中的A型血友病或B型血友病的組合物中的用途，其中所述受試者不存在抗-FVIII抗體。
2.含有FIXa的組合物和含有FVIII的組合物，用于同時(shí)、同時(shí)獨(dú)立或按順序使用以治療受試者中的A型血友病或B型血友病，其中所述受試者不存在抗-FVIII抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的含有FIXa的組合物，進(jìn)一步含有磷脂。
4.FIXa在制備用于治療A型血友病或B型血友病的含有FVIII的組合物中的用途，其中FIXa的存在允許相對于不含有FIXa的組合物而言，減少所述組合物中FVIII的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述組合物被給予不存在抗-FVIII抗體的受試者。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的用途，其中所述FVIII和FIXa試劑是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物進(jìn)一步包含磷脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物被配制以為受試者提供2-10IU/kg劑量的FVIII。
9.一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有此需要的受試者含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述受試者不存在抗-FVIII抗體。
10.一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有此需要的受試者含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述組合物中含有的FVIII的量低于用不含有FIXa的組合物治療所述受試者所要求的量。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含磷脂。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物含有重組FIXa和重組FVIII。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物被配制以為受試者提供2-10IU/kg劑量的FVIII。
14.一種強(qiáng)化FVIII的方法，包括將FVIII因子和FIXa因子混合成組合物的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物進(jìn)一步含有磷脂。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中所述組合物含有重組FIXa和重組FVIII。
17.一種減少含有FVIII的組合物中的FVIII在受試者中的免疫原性的方法，包括將FVIII與FIXa共同給予所述受試者。
18.FIXa和FVIII在制備治療血友病的組合物中的用途，其中由于FIXa的存在，所述組合物中FVIII的免疫原性降低。
全文摘要
本發(fā)明涉及FIXa和FVIII在制備治療體內(nèi)不存在抗FVIII抗體的A型血友病或B型血友病病人的組合物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含F(xiàn)IXa的組合物和包含F(xiàn)VIII的組合物，其用于同時(shí)、同時(shí)獨(dú)立或按順序給藥以治療體內(nèi)不存在抗FVIII抗體的A型血友病或B型血友病病人。
文檔編號(hào)A61P7/04GK1826136SQ200480020861
公開日2006年8月30日 申請日期2004年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日
發(fā)明者T·巴羅克利菲 申請人:國家生物標(biāo)準(zhǔn)及控制研究所