專利名稱：皮膚再生系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)物。更具體地，本發(fā)明涉及使角質(zhì)形成細胞增殖以隨后用于皮膚生長和再生的培養(yǎng)基、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明還涉及用于皮膚原位生長和再生的組合物。
背景技術(shù)：
胰島素樣生長因子(IGF)IGF-I和IGF-II是參與包括增生、DNA合成、分化、細胞周期進展及細胞凋亡抑制的多種細胞過程的促有絲分裂肽生長因子(Keiss等，1994，Hormone Research 4166；Wood & Yee，2000，J.Mammary Gland Biology and Neoplasia 51；Jones & Clemmons，1995，Endocrine Rev.163)。這些作用是通過結(jié)合其酪氨酸-激酶連接的細胞表面受體I型IGF受體(IGF-IR)而介導(dǎo)的。IGF還由一個稱為IGFBP的特異性結(jié)合蛋白家族緊密調(diào)節(jié)，這些特異性結(jié)合蛋白主要的作用是結(jié)合游離的IGF并由此調(diào)節(jié)其半衰期、特異性和活性(Clemmons，1998，Mol.Cell.Endocrinol.140 19)。
近來，已表明玻連蛋白(VN)直接結(jié)合IGF-II(Upton等，1999.Endocrinology 140 2928-31)，而IGF-I在某些IGFBP存在下能結(jié)合VN(國際公開WO 02/24219；Kricker等，2003，Endocrinol.1442807-15)。VN，一種ECM結(jié)構(gòu)和粘著分子，以與IGF-II對它的生物學(xué)相關(guān)受體IGF-IR的親和性(Upton等，1999，同上)相似的親和性結(jié)合IGF-II這一發(fā)現(xiàn)揭示了ECM中IGF作用與VN之間的特異性物理聯(lián)系。另外，結(jié)合于VN的IGF-II和通過IGFBP結(jié)合于VN的IGF-I能在體外在包括人角質(zhì)形成細胞的多種細胞中刺激協(xié)同功能反應(yīng)(國際公開WO 02/24219；Noble等，2003，同上；Kricker等，2003，同上)。
創(chuàng)傷、燒傷和潰瘍是消耗性和令人痛苦的皮膚病癥，其需要精心和昂貴的治療，許多情況下其治療僅部分成功。例如，當(dāng)前超過520000個澳大利亞人被診斷有糖尿病，而其中超過5％將患上足部潰瘍。這些創(chuàng)傷嚴(yán)重?fù)p害患者的生活質(zhì)量，往往導(dǎo)致延長的住院治療，且可能最終導(dǎo)致截肢。實際上，所進行的大多數(shù)下肢截肢是由于非愈合性潰瘍。
治愈創(chuàng)傷、燒傷和潰瘍的越來越優(yōu)選的方法為用體外培養(yǎng)的自體或同種異體的角質(zhì)形成細胞代替死的或受損的皮膚。典型地，角質(zhì)形成細胞在確定成分培養(yǎng)基中在外源性因子例如血清或牛垂體提取物存在下培養(yǎng)，并通常和優(yōu)化角質(zhì)形成細胞生長的飼養(yǎng)細胞一起培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
通?，F(xiàn)有技術(shù)中的體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)由于包含前述的外源性因子而相對昂貴。另外，動物源的外源性因子例如血清和牛垂體提取物成分相對不易確定(poorly defined)，且可能含有例如引起CJD、HIV和其它疾病的傳染性物質(zhì)。
為此，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP和VN的蛋白復(fù)合物在無血清存在下刺激離體的原代細胞培養(yǎng)物顯著增殖反應(yīng)。更特別地，包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP和VN的蛋白復(fù)合物可用于增強角質(zhì)形成細胞生長以用于皮膚替代、燒傷和創(chuàng)傷愈合以及需要離體皮膚生長的其它治療性處理。
因此，一方面，本發(fā)明提供一種細胞培養(yǎng)基，其包含(i)選自IGF-I和IGF-II的至少一種IGF；和(ii)無血清或在不含所述的至少一種IGF的情況下不支持細胞生長的量的血清。
在一個實施方案中，該培養(yǎng)基包含IGF-I和IGFBP。
第二方面，本發(fā)明提供包含培養(yǎng)容器和第一方面的細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
應(yīng)理解本發(fā)明的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)系統(tǒng)可進一步包含玻連蛋白(VN)和/或纖連蛋白(FN)或其片段。
第三方面，本發(fā)明提供一種細胞培養(yǎng)方法，該方法包括在第一方面的細胞培養(yǎng)基和/或第二方面的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)一種或多種細胞的步驟。
第四方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含根據(jù)第三方面的方法培養(yǎng)產(chǎn)生的一種或多種細胞以及藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物適用于角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞的氣霧劑遞送。
第五方面，本發(fā)明提供遞送角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞用于皮膚原位再生的方法，所述方法包括將第四方面的藥物組合物遞送給個體以促進皮膚再生的步驟。
此方面的優(yōu)選實施方案提供使皮膚原位再生的方法，所述方法包括以下步驟(i)將一種或多種角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞噴在個體的皮膚上；(ii)使所述角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞生長以原位形成再生皮膚。
本申請的全文中，除非另外說明，“包括”、“包含”和“含有”的使用是開放式而非封閉式的，因而所述及的實體或?qū)嶓w組可包括一個或多個其它未述及的實體或?qū)嶓w組。
附圖簡述

圖1在分離蛋白復(fù)合物和飼養(yǎng)細胞存在而無血清存在下角質(zhì)形成細胞的生長。相對于其中胎牛血清和3t3細胞均存在的常規(guī)方法有VitroGro(+3t3細胞)的剛分離的角質(zhì)形成細胞的平均生長。P0、P1和P2相對于細胞已收獲和再鋪板的次號(P0＝從皮膚樣品分離后即刻的細胞行為表現(xiàn))。數(shù)據(jù)通過MTT染色獲得，MTT被生長細胞轉(zhuǎn)化為有色底物。由于不同供體組織之間大的差異，因此誤差棒未顯示。
圖2在分離的蛋白復(fù)合物和飼養(yǎng)細胞存在而無血清存在下生長后的角質(zhì)形成細胞形態(tài)。細胞在胎牛血清和小鼠3t3細胞存在下生長3周(A)或在VitroGro(B；玻連蛋白、IGFBP5和IGF-I)和小鼠3t3細胞存在而無血清存在下生長3周。圖解比例尺為大約200微米(μm)。
圖3包含IGFBP3或IGFBP5的分離蛋白復(fù)合物的相對活性。對照＝補充10％胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)角質(zhì)形成細胞生長培養(yǎng)基。VitroGro-3＝玻連蛋白、IGFBP3和IGF-I(無血清)。VitroGro-5＝玻連蛋白、IGFBP5和IGF-I(無血清)。所有培養(yǎng)物均在γ照射的小鼠3t3細胞存在下生長。
圖4IGF蛋白復(fù)合物支持離體的角質(zhì)形成細胞的擴展。來源于成人皮膚的接種于IGF蛋白復(fù)合物上的角質(zhì)形成細胞存活并以與接種于照射的小鼠3T3細胞上的細胞在胎牛血清存在下相當(dāng)?shù)乃俣壬L。通過以下方法觀察細胞生長(a)視覺檢查培養(yǎng)形態(tài)/融合；和(b)利用MTT測定法定量。(a)由左至右飼養(yǎng)層+牛血清；無飼養(yǎng)層或血清的對照；無飼養(yǎng)層或血清的IGF-I+IGFBP5+VN；(b)由左至右Green培養(yǎng)基+飼養(yǎng)層+牛血清；Green培養(yǎng)基+單獨的飼養(yǎng)層；Green培養(yǎng)基-胰島素+IGF-I，+IGFBP-3+VN；Green培養(yǎng)基-胰島素+IGF-I，+IGFBP-5+VN。VN以300ng/孔存在。IGF-I或IGF-II以100ng/孔存在，而IGFBP以300ng/孔存在。
圖5補充附加生長因子的IGF蛋白復(fù)合物進一步增強角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)物的生長。來源于成人皮膚的角質(zhì)形成細胞在加入表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的IGF蛋白復(fù)合物上培養(yǎng)，并通過[3H]-亮氨酸摻入法測定蛋白質(zhì)合成。接種于三聚物IGF-I、IGFBP5和VN蛋白復(fù)合物或二聚物IGF-II和VN蛋白復(fù)合物的細胞以等同于Define Keratinocyte Media(DKM，Invitrogen)的速度生長。另外加入EGF(100ng/孔)和bFGF(100ng/孔)的IGF蛋白復(fù)合物與DKM相比顯著增強蛋白質(zhì)合成(p＜0.05)。IGF-I或IGF-II以100ng/孔存在，VN以300ng/孔存在，而IGFBP以300ng/孔存在。
圖6TISSOMAT對角質(zhì)形成細胞生存力的影響。噴霧遞送角質(zhì)形成細胞至直徑150mm的膠原蛋白包被培養(yǎng)皿后的細胞分布和生長。細胞以兩種不同的濃度噴霧以確定覆蓋噴霧面積所需的細胞數(shù)。用于噴霧的培養(yǎng)物最初在對照(有血清)或有IGFBP3和IGF-I的玻連蛋白(VitroGro)上生長。所有培養(yǎng)物均在3t3細胞存在下制備。然后在培養(yǎng)物于膠原蛋白包被板上于血清存在(設(shè)計為模擬遞送至創(chuàng)面后的條件)下生長7天后以結(jié)晶紫染色。噴霧體積0.2ml，壓力20psi，高度＝10cm。
圖7TISSOMAT對角質(zhì)形成細胞生存力的影響。培養(yǎng)物使用添加血清的常規(guī)培養(yǎng)基建立。(A)噴霧細胞入收集管后數(shù)分鐘內(nèi)進行錐蟲藍排除試驗。染料不能透過成活細胞。(B)MTT轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)為生存力的量度，其提供噴霧細胞后24小時具有代謝活性的指示。
具體實施例方式
本發(fā)明從下述發(fā)現(xiàn)而提出包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP和VN的培養(yǎng)基在無血清存在下刺激離體的原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生顯著的增殖反應(yīng)，血清是離體的角質(zhì)形成細胞生長所一般需要的。
另外，對飼養(yǎng)細胞的絕對需要可以被至少部分消除，尤其是在細胞培養(yǎng)物最初建立以后的細胞培養(yǎng)后期中。
因而本發(fā)明提供了改進目前臨床離體皮膚再生的最佳實踐的技術(shù)。另外，本發(fā)明也提供了來自組織活檢物的角質(zhì)形成細胞的來源和建立。在一種優(yōu)選的形式中，本發(fā)明提供了角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基和系統(tǒng)，其利用從患者自身血清分離或重組產(chǎn)生的自體玻連蛋白，從而進一步使對異種或同種異體的支持系統(tǒng)的使用最小化并且免于使用成分不太明確(poorly-defined)的補充產(chǎn)品。因此這將提供可轉(zhuǎn)化為批準(zhǔn)的治療應(yīng)用的基于自體細胞的組織工程系統(tǒng)。
為本發(fā)明的目的，“分離的”是指已經(jīng)從其天然狀態(tài)中分離的或者進行了其它的人工操作的物質(zhì)。分離的物質(zhì)可以是基本上沒有在其天然狀態(tài)下通常伴隨的成分，或者可以操作以使之處于人工狀態(tài)，與其天然狀態(tài)中通常伴隨的成分共存。分離的物質(zhì)可以是天然的、化學(xué)合成的或重組形式。
如本文所用，“合成的”是指不是天然存在的，而是通過人工技術(shù)干涉而產(chǎn)生的。在合成的蛋白質(zhì)和核酸中，這包含了通過本領(lǐng)域熟知的重組或化學(xué)合成和組合技術(shù)產(chǎn)生的分子。
“蛋白質(zhì)”是指氨基酸聚合物。所述氨基酸可以是本領(lǐng)域熟知的天然或非天然氨基酸，D-或L-氨基酸。
“肽”是指具有少于五十(50)個氨基酸的蛋白質(zhì)。
“多肽”是指具有五十(50)或更多個氨基酸的蛋白質(zhì)。
在具體的方面，本發(fā)明提供細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含至少IGF-I和/或IGF-II，使得不需要或需要相當(dāng)?shù)退降耐庠葱浴游镌吹囊蜃永缪?，而細胞生長和/或生存力仍得以維持。
應(yīng)理解本發(fā)明適用于對IGF-I和/或IGF-II反應(yīng)的任何哺乳動物細胞類型。
通常，這樣的細胞為來源于中胚層的細胞如上皮細胞、成肌細胞及它們的祖細胞、骨髓和樹突細胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明可應(yīng)用于上皮細胞，包括皮膚上皮細胞例如角質(zhì)形成細胞、角質(zhì)形成祖細胞和角膜上皮細胞。實際上，皮膚和角膜上皮細胞均可認(rèn)為是“角質(zhì)形成細胞”，因為它們均產(chǎn)生角蛋白。
角質(zhì)形成細胞和/或其祖細胞可來源于正常皮膚、例如得自創(chuàng)傷或潰瘍或得自毛囊的外根鞘(ORS)細胞的皮膚活檢物，但并不限于此。
因此應(yīng)理解，本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法和系統(tǒng)可以有潛力地用于工程替代任何存在上皮細胞的組織，例如口腔和呼吸道粘膜(口、鼻、氣管和食管的內(nèi)層)和生殖-泌尿組織(例如陰道、膀胱)。這些組織也可能被燒傷和其它創(chuàng)傷所損傷，同樣可使用以與皮膚活檢物類似的方法培養(yǎng)的培養(yǎng)移植物進行治療。
本發(fā)明也可應(yīng)用于在培養(yǎng)中通常也需要血清的人胚胎干(hES)細胞。
因此，應(yīng)理解“無血清或在不含所述的至少一種IGF的情況下不支持細胞生長的量的血清”指沒有血清或比通常體外最佳細胞生長和/或發(fā)育所需要的血清的量或濃度的少得多。
“血清”指來源于血液的一部分，其包含多種大分子、類脂質(zhì)和微量元素的載體蛋白質(zhì)、細胞附屬物和擴散因子、低分子量營養(yǎng)物質(zhì)、激素和生長因子。操作上，血清可定義為除去紅細胞、血小板和凝結(jié)的血漿成分后剩余的血液蛋白質(zhì)、非細胞部分。最廣泛使用的細胞培養(yǎng)用動物血清為胎牛血清FBS，盡管成年牛血清、馬血清和其蛋白質(zhì)部分(例如血清白蛋白部分V)也可使用。
典型地，哺乳動物細胞需要5-10％的血清，其根據(jù)細胞類型、培養(yǎng)持續(xù)時間、存在或不存在飼養(yǎng)細胞和/或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員清楚的培養(yǎng)系統(tǒng)的其它成分和其它因子。
因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明考慮少于5％的血清，更優(yōu)選少于2％的血清，甚至更優(yōu)選少于1％的血清或有利地不超過0.5％、0.4％、0.3％或0.2％的血清(v/v)。
在一個特別有利的實施方案中，本發(fā)明考慮不含血清或不超過0.1％或0.05％的血清(v/v)。
在存在IGF-I的實施方案中，優(yōu)選IGF-I為進一步包含IGFBP和玻連蛋白(VN)的蛋白復(fù)合物的一種成分。
IGFBP選自IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5和IGFBP6。
優(yōu)選地，IGFBP為IGFBP3或IGFBP5。
更優(yōu)選地，IGFBP為IGFBP5。
在一個存在IGF-II的實施方案中，優(yōu)選IGF-II為進一步包含玻連蛋白(VN)的分離蛋白復(fù)合物的一種成分。
還應(yīng)理解玻連蛋白(VN)可為單體或多聚體形式。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明包含純化的自體VN。
優(yōu)選地，角質(zhì)形成細胞在本領(lǐng)域通常使用的培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)。因此應(yīng)理解，在培養(yǎng)期間存在的IGF、VN和IGFBP的各自的量將取決于例如培養(yǎng)容器的大小、容器中存在的液體培養(yǎng)基的量、細胞密度和本領(lǐng)域已知的其它因素等因素。
為了指導(dǎo)，在1.9cm2孔中，優(yōu)選的量如下VN50-5000ng，更優(yōu)選100-500ng或有利地250-350ng；IGF0.1-1000ng，更優(yōu)選10-200ng或有利地50-150ng；和IGFBP1-1000ng，更優(yōu)選30-700ng或有利地300-500ng。
適宜地，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含其它確定成分。非限制性的、在某些情況下任選的成分包括熟知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基例如DMEM或Ham培養(yǎng)基、抗生素例如鏈霉素或青霉素、人血清白蛋白(HSA)、磷脂(例如磷脂酰膽堿)、氨基酸補充物例如L-谷氨酸、抗氧化劑例如β-巰基乙醇、運鐵蛋白、緩沖液例如碳酸鹽緩沖液、HEPES和通常由細胞培養(yǎng)箱提供的二氧化碳源。
本發(fā)明還考慮使用調(diào)節(jié)細胞生長、分化、存活和/或遷移的其它生物活性蛋白，例如表皮生長因子(EGF；Heldin等，1981，Science 41122-1123)、成纖維細胞生長因子(FGF；Nurcombe等，2000，J.Biol.Chem.275 30009-30018)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF；Taraboletti等，1997，Cell Growth.Differ.8471-479)、骨橋蛋白(Nam等，2000，Endocrinol.141 1100)、血小板反應(yīng)蛋白-1(Nam等，2000，同上)、腱生蛋白-C(Arai等，1996，J.Biol.Chem.2716099)、PAI-1(Nam等，1997，Endocrinol.1382972)、纖溶酶原(Campbell等，1998，Am.J.Physiol.275 E321)、纖連蛋白(Campbell等，1999，J.Biol.Chem 27430215)、纖維蛋白(Campbell等，1999，同上)或運鐵蛋白(Weinzimer等，2001，J.Clin.Endocrinol.Metab.86 1806)。
優(yōu)選的其它生物活性蛋白為EGF和bFGF。
其它生物活性蛋白例如EGF和bFGF可以以每1.9cm2培養(yǎng)孔0.1-1000ng或有利地1-100ng存在。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明考慮使用具有肝素結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域的任何生長因子。
在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明考慮除了分離蛋白復(fù)合物外使用LIF和/或抑制細胞分化的其它活性劑。
在再一個具體的實施方案中，本發(fā)明考慮在本發(fā)明的培養(yǎng)基、系統(tǒng)和/或方法中使用聚L-賴氨酸和聚L-精氨酸和與玻連蛋白相互作用的分泌型細胞物質(zhì)中的一種或多種，所述分泌型細胞物質(zhì)例如膠原、纖連蛋白、粘多糖/蛋白多糖、層粘連蛋白、涎蛋白和/或粘蛋白的聚合物。
還提出本發(fā)明可以在至少在細胞培養(yǎng)的最初建立期之后在無飼養(yǎng)細胞存在下促進細胞培養(yǎng)。
在角質(zhì)形成細胞和/或角質(zhì)形成祖細胞中，飼養(yǎng)細胞(如照射的3t3飼養(yǎng)細胞)可能在無血清培養(yǎng)的最初6-7天存在，其后飼養(yǎng)細胞可以對于直至兩次傳代細胞不存在。
根據(jù)前述，盡管不希望被任何具體的理論所束縛，但仍認(rèn)為IGF-I與IGFBP和VN一起形成分離蛋白復(fù)合物，而IGF-II與VN一起形成復(fù)合物，從而在細胞培養(yǎng)中發(fā)揮生物效應(yīng)。
術(shù)語“分離蛋白復(fù)合物”在本文中與國際公開WO 02/24219和國際申請PCT/AU 2004/000117中所用的一致。
分離蛋白復(fù)合物可以預(yù)先形成并包含在本發(fā)明的培養(yǎng)基中或者可在培養(yǎng)容器中形成。
典型地，玻連蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合、固定、包被或者締合于培養(yǎng)容器上。添加的IGF和任選的IGFBP與結(jié)合、固定、包被或者締合于培養(yǎng)容器的玻連蛋白和/或纖連蛋白一起形成復(fù)合物。
如國際申請PCT/AU 2004/000117中所述，本發(fā)明的分離蛋白復(fù)合物可包含生長因子(例如IGF-I和IGF-II)或生長因子的能夠結(jié)合關(guān)聯(lián)生長因子受體(例如IGF 1型受體)的至少一個結(jié)構(gòu)域。
本文中，“結(jié)構(gòu)域”指生長因子的能夠結(jié)合關(guān)聯(lián)生長因子受體的至少那部分或區(qū)域。典型地，盡管不排出其它情況，所述關(guān)聯(lián)生長因子受體由細胞表達，并且所述的生長因子的至少一個結(jié)構(gòu)域與所述關(guān)聯(lián)生長因子受體的結(jié)合或連接引發(fā)細胞反應(yīng)如細胞生長、分化、存活和/或遷移。
特別關(guān)于IGF-I，所述結(jié)構(gòu)域合適地包含第24位氨基酸殘基，其不是亮氨酸殘基。
典型地，所述殘基為酪氨酸。
特別關(guān)于IGF-II，所述結(jié)構(gòu)域合適地包含第27位氨基酸殘基，其不是亮氨酸殘基。
典型地，所述殘基為酪氨酸。
特別關(guān)于IGF-I，在一個實施方案中所述結(jié)構(gòu)域包含或由IGF-I的第1-70位殘基組成。
在另一個實施方案中，所述結(jié)構(gòu)域包含或由IGF-I的第4-70位殘基組成。
還應(yīng)理解本發(fā)明的分離蛋白復(fù)合物的另一種成分為玻連蛋白或纖連蛋白的至少一個整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
這包括并涵蓋了VN或FN的能夠結(jié)合αv整聯(lián)蛋白的任何結(jié)構(gòu)域。
更優(yōu)選地，該整聯(lián)蛋白為αvβ3整聯(lián)蛋白或αvβ5整聯(lián)蛋白。
如國際申請PCT/AU 2004/000117中所述，分離蛋白復(fù)合物的完全生物活性不需要VN(和類似的FN)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)。
關(guān)于VN，VN(和類似的FN)的聚陰離子區(qū)域是最可能的與IGF-II或IGF-I/IGFBP復(fù)合物相互作用所需要的。
聚陰離子區(qū)域為成熟VN序列的第53-64位氨基酸殘基。
根據(jù)前述，本發(fā)明考慮了不包含HBD和/或VN或FN的聚陰離子區(qū)域的合成嵌合蛋白的實施方案。
關(guān)于不包含HBD和/或聚陰離子區(qū)域的VN蛋白質(zhì)及其氨基酸序列，這些可以是天然蛋白質(zhì)例如54kDa雞卵黃VN(缺少HBD)或可以通過VN蛋白質(zhì)或氨基酸序列的缺失、突變或截短而工程化，使得HBD和/或聚陰離子區(qū)域不存在或至少基本上無功能。
根據(jù)前述應(yīng)容易理解，本發(fā)明的分離蛋白復(fù)合物可以為非共價結(jié)合的寡蛋白復(fù)合物、共價交聯(lián)(可逆或不可逆)的寡蛋白復(fù)合物的形式或合成嵌合蛋白的形式。
因此，在一個具體的方面，本發(fā)明提供合成嵌合蛋白形式的分離蛋白復(fù)合物。
所本文所用，“嵌合蛋白”包含衍生自VN或FN的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的連續(xù)的氨基酸序列和生長因子或生長因子的至少一個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
盡管不希望被任何具體的理論所束縛，但認(rèn)為合成的嵌合蛋白可能能夠共連接和共激活所述生長因子的關(guān)聯(lián)受體和VN或FN的整聯(lián)蛋白受體，從而刺激、誘導(dǎo)、增加或促進細胞遷移。
根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白的優(yōu)點是它們易于通過化學(xué)合成或重組方法產(chǎn)生，并預(yù)期在體內(nèi)更穩(wěn)定，因為它們不依賴于非共價寡蛋白復(fù)合物中所需要的蛋白-蛋白相互作用。
在這點上，盡管包含IGF-I的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離蛋白復(fù)合物也包含IGFBP，但認(rèn)為根據(jù)前述的作用模式，IGFBP優(yōu)選在IGF-I/VN合成嵌合體中不存在。
優(yōu)選地，嵌合蛋白進一步包含“接頭序列”，其位于生長因子序列和VN或FN氨基酸序列之間并與二者相鄰。
在一個實施方案中，所述接頭序列包含一個或多個甘氨酸殘基和一個或多個絲氨酸殘基。
接頭序列的具體實例可以選自Gly4Ser；Gly4Ser3和(Gly4Ser)3，但并不限于此。
在另一個實施方案中，接頭序列包含纖溶酶切割識別位點，例如根據(jù)序列Leu Ile Lys Met Lys Pro。
在再一個實施方案中，接頭序列包含膠原酶-3切割識別位點，例如根據(jù)序列Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys。
上述是生長因子、生長因子結(jié)合蛋白和/或玻連蛋白/纖連蛋白的生物活性片段的實例。
在一個實施方案中，所述“生物活性片段”具有不少于“全長”蛋白的生物活性的10％，優(yōu)選不少于25％，更優(yōu)選不少于50％和甚至更優(yōu)選不少于75％、80％、85％、90％或至少95％。
還考慮了根據(jù)本發(fā)明可使用的變體生長因子、生長因子結(jié)合蛋白和/或玻連蛋白/纖連蛋白和/或編碼核酸。
在一個實施方案中，“變體”具有已被不同的氨基酸置換的一或多個氨基酸。本領(lǐng)域中已熟知一些氨基酸可以被改變?yōu)榫哂袕V泛相似性質(zhì)而不改變蛋白的活性性質(zhì)的氨基酸(保守取代)。
在一個實施方案中，變體與本文所述的氨基酸序列至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％以及有利地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。
優(yōu)選地，序列相同性是在本發(fā)明的合成蛋白的至少60％，更優(yōu)選至少75％，甚至更優(yōu)選至少90％及有利地在基本全長之上測定的。
為了確定序列相同性百分比，氨基酸和/或核苷酸序列的最佳排比可通過算法的計算機執(zhí)行(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science DriveMadison，WI，USA，引入本文作為參考)進行或通過檢查和所選的各種方法中的任一個產(chǎn)生的最佳排比(即與比較窗相比產(chǎn)生的最高同源百分比)進行。也可以參考BLAST程序家族如Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.253389所公開的，該文獻引入本文作為參考。
在另一個實例中，“序列相同性”可理解為指通過DNASIS計算機程序(Version 2.5 for windows；可由Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA獲得)計算的“匹配百分比”。
在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel等(John Wiley & Sons Inc NY，1995-1999)的Unit 19.3中可找到序列分析的詳細論述。
本發(fā)明還考慮了生長因子、生長因子結(jié)合蛋白和/或玻連蛋白/纖連蛋白的衍生物。
如本文所用，“衍生物”例如通過本領(lǐng)域熟知的與其它化學(xué)基團加成、綴合或復(fù)合或者通過翻譯后修飾技術(shù)加以改變。
氨基酸的“添加”可以包括與其它肽或多肽融合。其它肽或多肽例如可有助于蛋白的純化。例如，這些包括多組氨酸標(biāo)記、麥芽糖結(jié)合蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)、蛋白A或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
本發(fā)明考慮的其它衍生物包括但不限于側(cè)鏈修飾、蛋白合成中摻入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交聯(lián)劑和對蛋白構(gòu)象施加限制的其它方法。本發(fā)明考慮的側(cè)鏈修飾的非限制實例包括如下的氨基修飾例如通過用乙酸酐進行?；?；用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基進行?；?；用甲基亞氨逐乙酸酯進行脒化；用氰酸鹽進行氨基的甲氨?；?；用吡哆醛-5-磷酸進行賴氨酸的吡哆醛化(pyridoxylation)然后用NaBH4還原；通過與醛反應(yīng)進行還原烷化然后用NaBH4還原；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)進行氨基的三硝基苯化。
巰基基團可通過如下的方法修飾例如過甲酸氧化為半胱氨酸；使用4-氯汞基苯磺酸、4-氯汞基苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚、氯化苯汞和其它汞制劑形成汞衍生物；和其它硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其它取代馬來酰亞胺反應(yīng)；用碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化；和堿性pH下用氰酸鹽進行甲氨?；?br> 組氨酸殘基的咪唑環(huán)可以通過用焦碳酸二乙酯進行N-乙酯基化或通過用碘乙酸衍生物進行烷基化來修飾。
肽合成中摻入非天然氨基酸和衍生物的實例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。
CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，John wiley & Sons NY(1995-2001)的第15章中提供了蛋白的化學(xué)衍生物的進一步實例。
根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法制備。
在一個實施方案中，蛋白質(zhì)可為基本上純的天然形式。
一個具體的實例為純化的自體玻連蛋白。
另一個實施方案中，蛋白質(zhì)可通過化學(xué)合成制備?；瘜W(xué)合成技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知的，不過本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，John Wiley &Sons NY(1995-2001)的第18章中合適方法學(xué)的實例。
在再一個實施方案中，蛋白質(zhì)可作為重組蛋白制備。
重組蛋白為本領(lǐng)域所眾所周知，技術(shù)人員可參考例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press，1989)，尤其是第16和17部分；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel等，(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，尤其是第10和16章；以及CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，尤其是第1、5和6章中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案，以上文獻均引入本文作為參考。
重組蛋白可進一步包含融合配偶體(partner)。
熟知的融合配偶體實例包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和六組氨酸(HIS6)，它們對用通過親和層析分離融合蛋白特別有用。對于用親和層析純化融合蛋白，親和層析的相關(guān)基質(zhì)分別為谷胱甘肽-、直鏈淀粉-及鎳或鈷綴合的樹脂。許多此類基質(zhì)可以“試劑盒”形式獲得，例如用于(HIS6)融合配偶體的QIAexpressTM系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。
在一些情況下，融合配偶體還具有蛋白酶如因子Xa或凝血酶的切割位點，其使得相關(guān)蛋白酶部分地消化本發(fā)明的融合蛋白，從而從中釋放重組蛋白。然后釋放的蛋白通過隨后的層析分離從融合配偶體中分離。
根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白也包括其范圍內(nèi)的“表位標(biāo)記”，表位標(biāo)記通常為可獲得特異性抗體的短肽序列。易于獲得特異性單克隆抗體的表位標(biāo)記的熟知實例包括c-真菌、血細胞凝集素和FLAG標(biāo)記。
對于表達而言合適的宿主細胞可以是原核或真核細胞，例如大腸桿菌(Escherichia coli)(例如DH5α)、酵母細胞、利用桿狀病毒表達系統(tǒng)的Sf9細胞、CHO細胞、COS、CV-1、NIH3T3和HEK293細胞，但并不限于此。
本發(fā)明進一步考慮了使用細胞例如角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞，其能夠表達至少一種選自以下的重組蛋白(i)重組IGF；(ii)重組IGFBP；(iii)重組玻連蛋白；(iv)上文所述的重組嵌合蛋白；和(v)其它生物活性蛋白例如EGF或bFGF。
根據(jù)一個具體的實施方案，IGF、VN和/或IGFBP的旁分泌/自分泌表達可使角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞能夠在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，且不需要向培養(yǎng)基中加入一種或多種生長因子、IGFBP和/或玻連蛋白。
重組蛋白表達可通過向角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞中引入表達構(gòu)建體而獲得。
典型地，該表達構(gòu)建體包含可操作地與啟動子連接或相連的表達核酸(編碼重組蛋白)。
啟動子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。
組成型或誘導(dǎo)型的啟動子包括例如四環(huán)素阻抑型、蛻皮激素誘導(dǎo)型、乙醇誘導(dǎo)型和金屬硫蛋白誘導(dǎo)型啟動子。啟動子可以是天然存在啟動子(例如α結(jié)晶啟動子、ADH啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)、人延長因子α啟動子和病毒啟動子如SV40、CMV、HTLV衍生啟動子)或組合一個以上啟動子元件的合成雜交啟動子(例如SRα啟動子)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，表達載體包含可選擇的標(biāo)記基因?？蛇x擇的標(biāo)記不論是對轉(zhuǎn)化菌(例如bla、kanR和tetR)還是對轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞(例如潮霉素、G418和嘌呤霉素)的選擇目的都有用。
表達構(gòu)建體可通過熟知的方法如電穿孔、微粒轟擊、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡萄糖、陽離子脂質(zhì)體、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(lipofectamine)等引入哺乳動物細胞例如角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞中，但所述的方法并不限于上述方法。
關(guān)于有潛力應(yīng)用于角質(zhì)形成細胞中重組生長因子蛋白表達的方法學(xué)的非限制性具體實例，可以參考Supp等，2000，J.Invest.Dermatol.1145和Supp等，2000，Wound Repair Regen.826-35。
藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含一種或多種使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的細胞例如但不限于角質(zhì)形成細胞，以及藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物可用于促進或有利于細胞遷移、組織再生和傷口愈合。
一般地，本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要用于治療性或預(yù)防性處理中。例如，藥物組合物可以以治療制劑或化妝品制劑形式應(yīng)用于皮膚修復(fù)、創(chuàng)傷愈合、燒傷愈合及其它皮膚病學(xué)治療。
優(yōu)選地，所述藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑適于給予哺乳動物，優(yōu)選適于給予人。
在一個具體的實施方案中，所述藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的自體或同種異體的角質(zhì)形成細胞。
“藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”是指可安全用于全身給藥的固體或液體填料、稀釋劑或包囊物質(zhì)。根據(jù)具體的給藥途徑，可以使用本領(lǐng)域熟知的各種載體。這些載體可以選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水和鹽如無機酸鹽包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽和硫酸鹽，有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽及無致熱原水。
描述藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的有用參考文獻是Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，該文獻引入本文作為參考。
可以使用任何安全的給藥途徑為患者提供本發(fā)明的組合物。例如可以使用口服、直腸、腸胃外、舌下、口含、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)皮等途徑。
劑型包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液劑、糖漿、錠劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、經(jīng)皮貼劑等。這些劑型還可包括用于此目的特別設(shè)計的注射或植入的控釋裝置或者修改的以此方式作用的其它植入物形式。
控釋制劑可以通過例如用疏水性聚合物包括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂族醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素包衣而得到?？蒯尶梢酝ㄟ^使用其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球而實現(xiàn)?？蒯屩苿┖瓦f送裝置的非限制性實例包括滲透泵、聚丙交酯共乙交酯(PLG)聚合物基微球、水凝膠基聚合物、化學(xué)交聯(lián)的葡聚糖凝膠例如OctoDEXTM和右旋乳酸鹽-HEMA。
上述組合物可以與劑型相容的方式和藥學(xué)有效量給予。在本發(fā)明中給予患者的劑量應(yīng)足以在適當(dāng)?shù)囊欢螘r間內(nèi)在患者體內(nèi)產(chǎn)生有益的應(yīng)答。給予的活性劑的量可由要治療的對象的年齡、性別、體重及其一般健康狀況和醫(yī)生判斷而決定的因素來決定。
關(guān)于用于創(chuàng)傷愈合的藥物組合物，特別參見美國專利5,936,064及國際公開WO 99/62536，兩篇文獻引入本文作為參考。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的組合物適用于原位噴霧遞送。
術(shù)語“噴霧”涵蓋和包括通常描述小滴形式的液體懸浮液的術(shù)語例如“氣霧劑”或“霧劑”或“冷凝劑”。
根據(jù)本發(fā)明，盡管任選，不過該噴霧或氣霧劑組合物可進一步包含選自IGF-I和IGF-II的至少一種IGF或在一個具體的實施方案中包含含有IGF、VN和IGFBP的分離蛋白復(fù)合物，以促進皮膚細胞原位生長和遷移。還可以包含其它生物活性蛋白如EGF和/或bFGF。
盡管不希望被任何具體的理論所束縛，但本發(fā)明考慮存在于所述噴霧組合物中的IGF復(fù)合物中的VN的固有“粘性”會有利于IGF-I、IGF-II和其它生長因子如EGF和bFGF的遞送。
典型地，本發(fā)明的噴霧組合物將通過諸如配備有遞送出口的密封罐來遞送。
例如用于豬模型中傷口愈合的氣霧化角質(zhì)形成細胞遞送系統(tǒng)的實例已由Navarro等，2000，J Bum Care Rehabil 21 513提供。還參見Grant等，2002，Br J Plast Surg 55219，其描述了氣霧化角質(zhì)形成細胞和纖維蛋白膠用于豬模型中傷口愈合的應(yīng)用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的噴霧組合物基本上不含血清。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的皮膚噴霧組合物包含Tissomat(Baxter Healthcare)，其有利于纖維蛋白膠的噴霧施用，通過遞送進入調(diào)節(jié)器控制的壓縮醫(yī)用級氣體流中使液體氣霧化。在10-30psi之間的壓力是適宜的，不過觀察到隨著壓力增加生存力降低。噴霧的細胞的濃度可以為每毫升50-150萬個。在20psi下施用0.2毫升的細胞懸液足以覆蓋約25平方厘米的面積(基于體外生長7天后細胞覆蓋表面積的測量)。細胞優(yōu)選在無血清生長培養(yǎng)基中遞送，但也可懸浮于纖維蛋白膠如可商購獲得的Tisseel/Tissucol(BaxterHealthcare)中。
還考慮了使用注射器(如配有噴霧帽的注射器)遞送本發(fā)明的組合物可以獲得相似的功效。
治療應(yīng)用在一個具體的方面，本發(fā)明提供治療燒傷、創(chuàng)傷和潰瘍的方法以及與化妝品皮膚治療有關(guān)的方法，用以改善或增強皮膚質(zhì)量或皮膚外觀。
這些方法特別針對于哺乳動物，更特別是人的治療。不過，還應(yīng)理解本發(fā)明可以具有用于治療馴養(yǎng)動物、家畜和工作動物的獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供用于使離體的原代角質(zhì)形成細胞增殖的培養(yǎng)基、系統(tǒng)和方法，這些細胞可根據(jù)本發(fā)明給予個體。
在一個具體的實施方案中，角質(zhì)形成細胞為根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的自體或同種異體的角質(zhì)形成細胞。
這些方法包括給予上文所述的藥物組合物，并且可以是如美國專利6,090,790所述的通過顯微針注射入特定的組織部位的方式，可以是如美國專利6,054,122所述的施用于創(chuàng)傷、燒傷或潰瘍的局部軟膏、洗劑或密封敷料的方式，或者可以是如國際公開WO 99/47070所述的釋放該組合物的植入物的方式。
還存在為產(chǎn)生皮膚替代物的目的通過其對皮膚細胞進行遺傳修飾的方法，例如通過對所需要的生長因子的表達進行遺傳工程化(Supp等，2000，J.Invest.Dermatol.114 5)。Bevan等，Biotechnol.Gent.Eng.Rev.16 231提供了這一領(lǐng)域的綜述的實例。
還考慮了用轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細胞“接種”受者，如國際公開WO99/11789所述。
這些方法可用于刺激細胞遷移并從而有利于或促進創(chuàng)傷和燒傷愈合、皮膚損傷如潰瘍的修復(fù)、如通過體外培養(yǎng)自體皮膚而進行的組織替代和移植、內(nèi)臟如腎和肺的表皮細胞再生以及損傷的神經(jīng)組織的修復(fù)。
皮膚替代治療在本領(lǐng)域中已熟知，可使用共培養(yǎng)的上皮/角質(zhì)形成細胞系，例如Kehe等，1999，Arch.Dermatol.Res.291 600所述，或體外培養(yǎng)的原代(通常是自體的)表皮、真皮和/或角質(zhì)形成細胞。這些技術(shù)也可利用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。
Terskikh & Vasiliev，1999，Int.Rev.Cytol.188 41和Eaglestein &Falanga，1998，Cutis 621提供了本領(lǐng)域綜述的一般實例。
更具體地，Izumi等，2000，J.Dent.Res.79 798描述了在顱面外科中有用的替代口腔粘膜的制備。胎兒角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞可于體外擴展產(chǎn)生移植用皮膚以治療皮膚損傷，如Fauza等，J.Pediatr.Surg.33 357所述，而來自體外在透明質(zhì)酸來源的生物材料上培養(yǎng)的真皮和表皮成分的皮膚替代物已經(jīng)顯示出在燒傷治療中的潛在應(yīng)用(Zacchi等，1998，J.Biomed.Mater.Res.40 187)。
本發(fā)明還考慮了聚合物支架用于促進替代皮膚工程化，如Sheridan等，2000，J.Control Release 14 91和Fauza等，1998，同上中所述，以及微球制劑用于將皮膚細胞遞送至創(chuàng)傷和燒傷部位(LaFrance& Armstrong，1999，Tissue Eng.5 153)。
通常為治療用途制備的角質(zhì)形成細胞片是燒傷傷口最終閉合的原因。該片移植技術(shù)適用于所有的部分皮層燒傷且在治療無外界幫助傷口和供體部位幾乎不可能較早永久閉合的大表面積創(chuàng)傷中最有用。這是在最近的巴厘島爆炸中導(dǎo)致燒傷患者死亡的損傷類型。
目前，從患者皮膚活檢一片50分幣大小的皮膚生長成足以覆蓋整個成人的皮膚是可能的。此培養(yǎng)過程需要17天。
不過，急需更早的皮膚替代以減少患者創(chuàng)傷、感染風(fēng)險、形成瘢痕和目前對永久性皮膚移植之前昂貴的暫時皮膚替代的需求。另外，培養(yǎng)的皮片包含許多皮膚細胞，一些是成熟的而一些是未成熟的。允許培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞達到融合(這對產(chǎn)生皮膚片是必需的)的簡單行為造成細胞過早地喪失其原始特征即分化。當(dāng)施用培養(yǎng)的皮膚片時，僅有未成熟細胞能夠附著于患者并生長。因為僅小部分面積粘附，所以這些片因患者的摩擦或移動很容易引起損傷，而且有時導(dǎo)致整個移植片的失去。另外，在片移植中，片中的成熟細胞越多，越可能不發(fā)生移植以及細胞本身將不在創(chuàng)面本身上增生和遷移。因而很清楚，越早施用未成熟的皮膚細胞將產(chǎn)生越好的移植發(fā)生并減少瘢痕。
因此本發(fā)明提供一種噴霧或氣霧劑遞送方法，該方法將離體培養(yǎng)的皮膚細胞遞送于患者燒傷、潰爛或創(chuàng)傷的皮膚上，能夠比現(xiàn)有的片移植技術(shù)早得多地以未成熟皮膚細胞覆蓋患者身體的更大表面積。此可早至僅7天。這也將顯著減少瘢痕形成、休克和熱量損失，并將能夠更快恢復(fù)部分皮層燒傷以及全皮層燒傷的皮膚功能。
根據(jù)本發(fā)明，盡管任選，所給予的噴霧劑或氣霧劑可進一步包含含有IGF、VN和IGFBP以及EGF和/或bFGF的分離蛋白復(fù)合物以促進皮膚細胞原位生長和遷移。
患者自身的皮膚細胞(自體皮膚)和供者皮膚細胞(同種異體或異種皮膚)可培養(yǎng)并用于早期燒傷閉合。供者細胞不表達移植抗原，因此它們不引起患者的免疫反應(yīng)。不過供者皮膚細胞最終被患者自身的皮膚細胞所替代。
盡管優(yōu)選自體細胞，但皮膚噴霧劑中同種異體或異種細胞的使用可允許立即施用于急需的患者?；蛘?，可在大約七天內(nèi)培養(yǎng)足夠的自體皮膚細胞用于治療性噴霧。
本發(fā)明考慮的另一治療為治療燒傷患者實現(xiàn)全皮層創(chuàng)傷的早期閉合，因為在去除了皮膚表面(表皮)和深層(真皮)的創(chuàng)面上不易獲得培養(yǎng)皮膚。本發(fā)明考慮了使用真皮替代物聯(lián)合皮膚噴霧劑來實現(xiàn)這些最嚴(yán)重?fù)p傷的早期永久性閉合?？紤]的替代物為生物及合成的真皮替代物。例如，來源于尸體的去表皮、去細胞的包含本發(fā)明的分離蛋白復(fù)合物的真皮支架可以用合成表皮(敷料)來覆蓋。約7天后，該真皮本發(fā)明的發(fā)明人假設(shè)該真皮將被自體內(nèi)皮細胞高度浸潤。此時，合成真皮將被移走，而患者自身離體擴展的成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞將被施用于該異體真皮(allo-dermis)。
預(yù)期皮膚噴霧劑而非表皮片會成功，因為真皮替代物作為營養(yǎng)穩(wěn)定支架將促進皮膚細胞以及通常皮膚中存在的其它重要細胞的遷移和固著。這將在全皮層皮膚損傷中導(dǎo)致改善的培養(yǎng)皮膚細胞的獲得。
為了使本發(fā)明更易于理解和用于實際應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員參考下面的非限制性實施例。
實施例實施例1無血清存在下人原代角質(zhì)形成細胞的生長材料和方法生長因子濃度/對培養(yǎng)塑膠的預(yù)吸附加入VN、IGF和IGFBP的標(biāo)準(zhǔn)方法用于所有的研究中。培養(yǎng)塑膠通過在37℃下在無血清培養(yǎng)基中與150ng/cm2的玻連蛋白溫育2小時來制備。然后去除VN溶液，并用含有IGFBP(250ng/cm2)、IGF-I(50ng/cm2)和EGF(50ng/cm2)的無血清培養(yǎng)基替代。生長因子于4℃(冰箱中)下過夜以吸附于VN處理的塑膠上。第二天，去除生長因子溶液，并用含有50ng/ml VN、50ng/ml IGFBP、15ng/cm IGF-I和15ng/cm EGF的生長培養(yǎng)基(如下所定義)替代。細胞以下面給出的密度加入。培養(yǎng)基一般每3天換一次。每一培養(yǎng)物培養(yǎng)約6天然后傳代即每代之間約有6天。
生長培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和Ham’sF12培養(yǎng)基的3∶1混合物，常規(guī)補充有L-谷氨酰胺(2mM)、霍亂毒素(0.1μg/ml)、腺嘌呤(180μM)、氫化可的松(0.4μg/ml)和非必需氨基酸混合物(1％v/v)。
陽性對照培養(yǎng)基包含附加的10％胎牛血清、胰島素(5μg/ml)和表皮生長因子(EGF，10ng/ml)。
接種密度培養(yǎng)物在25×104/cm2密度的生長停止的小鼠3t3細胞存在下培養(yǎng)。3t3細胞通過使用前立即用γ照射來使得“生長停止”。
角質(zhì)形成細胞根據(jù)傳代數(shù)以兩種不同的密度接種。初始培養(yǎng)物(P0)通過接種3.8×104/cm2細胞來建立。接著的培養(yǎng)物(P1、P2等)通過再接種6.4×103/cm2密度的收獲細胞來建立。P0培養(yǎng)物使用較高的接種密度是因為僅有一部分新收獲的細胞將在培養(yǎng)中顯示進行的增殖。因而，培養(yǎng)這些細胞能夠擴展增殖亞群。
結(jié)果與用含血清的常規(guī)生長培養(yǎng)基培養(yǎng)的培養(yǎng)物的比較參照圖1，此圖顯示了相對于其中胎牛血清和3t3細胞均存在的常規(guī)方法，有VitroGro(+3t3細胞)的新分離的角質(zhì)形成細胞的平均生長。P0、P1和P2相對于細胞已收獲和再接種的次號(P0＝從皮膚樣品分離后即刻的細胞行為表現(xiàn))。數(shù)據(jù)通過MTT染色獲得。數(shù)據(jù)顯示在分離蛋白復(fù)合物存在而無血清存在下的培養(yǎng)物持續(xù)地達到在10％血清存在下達到的細胞生長的至少90％。
參照圖2A和2B，VitroGro上生長的皮膚細胞顯示與胎牛血清存在下生長的那些皮膚細胞具有相似的外觀(圖2A)。目前正在進行基于分子標(biāo)記物的存在的更詳細的比較以確定這一結(jié)論。應(yīng)用的技術(shù)將包括免疫細胞化學(xué)、熒光活化細胞分類(FACS)分析法、蛋白質(zhì)印跡法和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。也考慮使用最新技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteonomic)和基因陣列技術(shù)。研究的主要標(biāo)記物將包括細胞角蛋白(CK1和CK10，CK6，CK14和CK19)和推定的角質(zhì)形成祖細胞標(biāo)記物(例如p63、α9-整聯(lián)蛋白、α6-整聯(lián)蛋白bri/CD71dim)。特別地應(yīng)將注意力放在比較推定的祖細胞標(biāo)記物的表達上，因為它們很可能關(guān)系到移植后培養(yǎng)物的臨床功效。另外，也可進行常規(guī)的體外功能測定檢測細胞的反應(yīng)(粘附、遷移、增殖)。
參照圖3，很清楚包含IGFBP5的分離蛋白復(fù)合物比含有IGFBP3的復(fù)合物就角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生而言更有效。
實施例2無血清存在下有或無飼養(yǎng)細胞的人原代角質(zhì)形成細胞的生長材料和方法原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)使用基本上與Rheinwald & Green，1977，Nature 265 421的原始報道相同的標(biāo)準(zhǔn)方法從成人皮膚分離出角質(zhì)形成細胞。簡單地，其包括37℃下在DispaseII溶液中消化皮膚樣品一小時。之后將回收的上皮細胞在37℃下用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA再消化10分鐘以分離細胞。滅活殘余的胰蛋白酶活性，然后清洗回收的細胞，共接種在含或不含致死量照射的3T3小鼠成纖維細胞的組織培養(yǎng)皿中。使用這些標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)的“對照”細胞在補充有10％胎牛血清、0.1％青霉素-鏈霉素溶液、0.4μg/ml氫化可的松、0.1μg/ml的霍亂毒素、10ng/ml人重組表皮生長因子(EGF)、5μg/ml胰島素、5μg/ml運鐵蛋白和2nM三碘甲狀腺原氨酸的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長，而用分離生長因子復(fù)合物處理的細胞使用除了不含胰島素外其它均相同的培養(yǎng)基。在用以與分離蛋白復(fù)合物處理組合的培養(yǎng)基中不含胰島素以最小化胰島素與1型IGF受體的競爭性結(jié)合。分離生長因子復(fù)合物包被皿上培養(yǎng)的細胞也不同于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)的細胞，因為這些細胞將接種在不具有照射的小鼠成纖維細胞的板上。
蛋白合成測定角質(zhì)形成細胞來源于成人皮膚活檢物，并采用加入Green培養(yǎng)基、血清和飼養(yǎng)細胞的標(biāo)準(zhǔn)方法擴展直至第2代。然后評價這些細胞在IGF+VN復(fù)合物存在或不存在下對蛋白合成的刺激。這里，24孔板以300ng玻連蛋白包被2小時，然后清洗去除未結(jié)合的玻連蛋白。然后孔與要檢測的生長因子以及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-5一起培養(yǎng)，所述的生長因子即表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II，加入孔中，并允許與玻連蛋白過夜結(jié)合。第二天清洗孔兩次以去除任何未結(jié)合的生長因子，使板風(fēng)干。然后收獲角質(zhì)形成細胞并以1×105個細胞/孔的密度與1uCi/孔的[3H]-亮氨酸一起接種在無血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。在選擇的孔中，將細胞接種在Define KeratinocyteMedia(DKM)(Invitrogen)中，Define Keratinocyte Media是一種可商購獲得的用于角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)的產(chǎn)品。然后將板培養(yǎng)48小時，然后清洗去除任何未摻入的[3H]-亮氨酸。通過從溶解的蛋白沉淀物取樣進行β-閃爍計數(shù)來測定[3H]-亮氨酸對重新合成的蛋白的摻入。
MTT-Esta測定使用帶有受致死量照射的小鼠3T3細胞飼養(yǎng)層的全補充Green培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)分離人角質(zhì)形成細胞并建立培養(yǎng)物。細胞擴展至第3代并接種于胎牛血清(FCS)和3T3細胞存在或不存在的Green培養(yǎng)基的24孔板中。在選擇的處理中，孔用分離蛋白復(fù)合物包被?？着c300ng玻連蛋白一起溫育2小時，然后吸出，之后加入IGF-I和IGFBP3或IGFBP5，或IGF-II。將培養(yǎng)板過夜培養(yǎng)并在接種細胞前吸出。評價培養(yǎng)物的代謝活性，采用以前描述的MTT-esta測定法(Ealey等，1988，J Mol Endocrinol 1R1-R4)來測定。
結(jié)果鑒于細胞系中用分離生長因子復(fù)合物得到顯著增強的功能反應(yīng)(國際公開WO 02/24219；Noble等，2003，同上；Kricker等，2003，同上)，我們最近將我們的研究擴展至源自成人皮膚的角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)物。特別地，我們檢測了分離生長因子復(fù)合物替代目前用于分層自體移植的角質(zhì)形成細胞的離體擴展的最佳臨床實踐中的血清和飼養(yǎng)細胞的潛能。盡管該方法是燒傷患者可利用的具有顯著進步的治療，但是源自患者的角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)是在胎牛血清(FBS)存在下進行的，胎牛血清是成分半確定(semi-defined)的生物異源產(chǎn)品，是一種潛在的病原。另外，在角質(zhì)形成細胞衍生和建立的早期，使用源于另一種物質(zhì)即小鼠3T3成纖維細胞的飼養(yǎng)層作為細胞因子和基質(zhì)成分的來源以促進細胞附著和生長。FBS也對這些作用有貢獻。
因為(i)IGF占飼養(yǎng)細胞分泌的細胞因子的大部分；(ii)我們已經(jīng)確定，VN代替對血清的任何需要而促進以低密度接種的原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞對塑料器皿的附著；(iii)我們用在分離生長因子復(fù)合物上培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞系獲得的效果與用含10％FBS的培養(yǎng)基得到的效果相當(dāng)，所以我們假設(shè)補充有分離生長因子復(fù)合物的培養(yǎng)基具有提供更好的自體角質(zhì)形成細胞工程應(yīng)用的潛力。此假設(shè)由IGF為刺激角質(zhì)形成細胞增殖的關(guān)鍵促分裂原，而角質(zhì)形成細胞本身并不分泌IGF-I的事實所支持。盡管無血清培養(yǎng)基如KGMTM(Clonetics)和EpiLifeTM(Sigma-Aldrich)已商業(yè)化地開發(fā)出來用于角質(zhì)形成細胞的擴展，但是這些培養(yǎng)基需要加入牛垂體提取物，其也是成分不確定(undefined)的生物異源物質(zhì)和潛在的病原，或者需要加入昂貴的補充物。另外，當(dāng)前大多數(shù)無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基的應(yīng)用要求非常高的接種密度，這使試圖快速培養(yǎng)大量的角質(zhì)形成細胞的目的失敗并導(dǎo)致這些實踐很少被常規(guī)臨床應(yīng)用所采用。
我們直接檢驗了我們的假設(shè)，結(jié)果例示于圖4中。在此實驗中，角質(zhì)形成細胞源自成人皮膚并使用常規(guī)方法建立，生長7天。然后細胞通過胰蛋白酶作用傳代并以低密度(8500個角質(zhì)形成細胞/cm2)接種于分離生長因子復(fù)合物包被的組織培養(yǎng)塑膠上，并且在無飼養(yǎng)細胞、去除FBS和胰島素(圖4)下再培養(yǎng)7天。發(fā)現(xiàn)在這些條件下培養(yǎng)的細胞比僅采用目前最佳臨床實踐(即在FBS和3T3存在下培養(yǎng)；圖4)培養(yǎng)的細胞擴展更快速。在分離蛋白復(fù)合物存在下生長的集落的邊緣表明角質(zhì)形成細胞外觀上是移動的、健康的和正在增殖的。圖4中所示的最里面的細胞顯示在接近融合的角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)物中觀察到的典型扁平形態(tài)，以及在該情況下僅7天得到的融合。通過MTT測定法對在這些蛋白復(fù)合物存在下角質(zhì)形成細胞增殖的定量證實了這些結(jié)果(圖4B)。
后來的數(shù)據(jù)趨于表明角質(zhì)形成細胞在無飼養(yǎng)細胞(也無血清)存在下生長良好的能力限于細胞培養(yǎng)的后期，因為飼養(yǎng)細胞似乎對來自初始活檢物的培養(yǎng)物的建立是重要的。
其它生長因子EGF和bFGF的作用顯示于圖5中。我們檢測了第3代人皮膚角質(zhì)形成細胞(源自成人皮膚活檢物)并評價了通過補充IGF+VN復(fù)合物48小時對蛋白合成的刺激。這些處理用在確定的角質(zhì)形成細胞-SFM(DKM)(Invitrogen)中培養(yǎng)的細胞平行測試，確定的角質(zhì)形成細胞-SFM是可商購獲得的用于角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)的產(chǎn)品，其包含不確定量的胰島素、EGF和bFGF。發(fā)現(xiàn)DKM刺激蛋白質(zhì)合成的增加高于對照孔(-VN)148％，其顯著性地高于(p＜0.05)單獨使用VN(+VN)或無VN和生長因子(-VN)的作用。二聚物IGF-II+VN復(fù)合物和三聚物IGF-II+VN+IGFBP-5復(fù)合物也分別顯著地刺激蛋白質(zhì)合成增加134％和161％(p＜0.05)。實際上對于DKM、二聚復(fù)合物和三聚復(fù)合物觀察到的蛋白質(zhì)合成的刺激作用沒有顯著性差異(p＞0.05)，表明這兩種復(fù)合物與商購的DKM相比在刺激角質(zhì)形成細胞蛋白質(zhì)合成上是等效的。
當(dāng)EGF、bFGF或兩種生長因子組合加入三聚復(fù)合物中時，觀察到有216％、248％和213％的增加。所有這些反應(yīng)均顯著高于DKM(p＜0.05)。另外，當(dāng)EGF或者EGF和bFGF加入二聚復(fù)合物中時，分別得到蛋白質(zhì)合成192％和198％的顯著地增加，其也顯著地高于DKM(p＜0.05)。這些結(jié)果突出表明將EGF和bFGF加入蛋白復(fù)合物中刺激比商購獲得的用于角質(zhì)形成細胞無血清和無飼養(yǎng)培養(yǎng)的產(chǎn)品更高的蛋白質(zhì)合成。
實施例3皮膚噴霧技術(shù)材料和方法這有兩點要強調(diào)。首先，VitroGro上產(chǎn)生了足夠數(shù)量的細胞以支持一周內(nèi)的噴霧細胞懸液的施用。因此該技術(shù)與已商用的技術(shù)(Clinical Cell Culture Ltd)相當(dāng)，但具有無血清的優(yōu)點。第二，VitroGro上生長的細胞噴霧后保持存活。我們所用的遞送系統(tǒng)為Tissomat(Baxter Healthcare)。Tissomat遞送系統(tǒng)被設(shè)計用于纖維蛋白膠的噴霧施用，通過遞送進入調(diào)節(jié)器控制的壓縮醫(yī)用級氣體流中使液體氣霧化。不過，我們也預(yù)期使用其它的噴霧方法(配有噴霧帽的注射器)能獲得相似的結(jié)果。在10-30psi之間的壓力是適宜的，不過觀察到隨著壓力增加生存力降低。噴霧的細胞的濃度可以為每毫升50-150萬個。在20psi下施用0.2毫升的細胞懸液足以覆蓋大約25平方厘米的面積(基于體外生長7天后細胞覆蓋表面積的測量)。細胞可在無血清生長培養(yǎng)基中遞送，但也可懸浮于纖維蛋白膠例如可商購獲得的Tisseel/Tissucol(Baxter Healthcare)中。我們的研究表明纖維蛋白膠應(yīng)在使用前調(diào)整，通過用注射用無菌水稀釋至等滲狀態(tài)并進一步用無菌鹽水將最終的纖維蛋白膠成分調(diào)整至1-10mg/ml的纖維蛋白原和10-100單位/ml的凝血酶。
結(jié)果圖6顯示噴霧遞送角質(zhì)形成細胞至直徑150mm的膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿后細胞分布和生長。重要地，噴霧后VitroGro上生長的細胞顯示良好的生存力。細胞以兩種不同的濃度噴霧以確定所需覆蓋噴霧面積的細胞數(shù)。用于噴霧的培養(yǎng)物最初在對照(有血清)或有IGFBP3和IGF-I的玻連蛋白(VitroGro)上生長。所有培養(yǎng)物在3t3細胞存在下制備。噴霧后，細胞在血清存在下生長以模擬在創(chuàng)面上可能經(jīng)歷的條件。培養(yǎng)物用結(jié)晶紫染色以顯示細胞分布。
如圖7中所示，可見用Tissomat遞送系統(tǒng)噴霧培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的效果。對于這些初步實驗，培養(yǎng)物使用添加血清和飼養(yǎng)細胞的常規(guī)培養(yǎng)基建立。圖7A中，錐蟲藍排除試驗在噴霧細胞入收集管后數(shù)分鐘內(nèi)進行，其基于染料不能透過成活細胞的原理進行。如圖7B中所示，MTT轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)為更有力的生存力的量度，因為其提供噴霧后細胞24小時具有代謝活性的指示。
在圖7A和7B中，可以看到最佳的遞送壓力為10-20psi，不過在30psi的遞送壓力下生存力仍是可接受的。
實施例4皮膚噴霧臨床試驗皮膚活檢物的獲得選擇合適的供體部位，并通過剃毛和用消毒劑擦拭來準(zhǔn)備。在手術(shù)室中局麻下取大約10平方厘米面積的分層皮膚移植物。將該活檢物置于含抗生素的無菌鹽水溶液中，并立即送至皮膚培養(yǎng)實驗室進行處理。供體部位將根據(jù)參見的外科醫(yī)生的判斷以O(shè)psite或其它敷料敷蓋。
角質(zhì)形成細胞的分離和培養(yǎng)當(dāng)皮膚培養(yǎng)物運送到時，每個患者的活檢物將在無菌緩沖液中清洗并在室溫下于抗生素中溫育1小時以減小在隨后的培養(yǎng)中污染的可能性。表皮和真皮層將通過胰蛋白酶消化分離。刮擦該分離組織的對面，刮下的細胞(主要為基底角質(zhì)形成細胞)經(jīng)清洗并重懸于含大豆胰蛋白酶抑制劑的無血清培養(yǎng)基中。將最終的細胞懸液接種在含有生長停止的小鼠3t3成纖維細胞(2.5×104/cm2)和5ml DMEM/F12培養(yǎng)基的25cm2的組織培養(yǎng)瓶中，該DMEM/F12培養(yǎng)基中補充有玻連蛋白(VN，50ng/cm2)、胰島素樣生長因子I(IGF-I，15ng/cm2)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5，50ng/cm2)、表皮生長因子(EGF，15ng/cm2)、腺嘌呤(180μM)、霍亂毒素(0.1μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、氫化可的松(0.4μg/ml)和非必需氨基酸(1％v/v)。培養(yǎng)瓶用VN(300ng/cm2)、IGF-I(100ng/cm2)、IGFBP5(500ng/cm2)和EGF(100ng/cm2)預(yù)處理以促進蛋白復(fù)合物的預(yù)吸附。培養(yǎng)3天后使用新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)6天后，通過在含EDTA的緩沖鹽水中溫育去除3t3細胞。剩下的角質(zhì)形成細胞通過再與胰蛋白酶/EDTA溫育來收獲，并在含大豆胰蛋白酶抑制劑的緩沖鹽水中洗滌。將回收的細胞調(diào)至2×106/ml的濃度并于含0.2％人血清白蛋白的緩沖鹽水中送至手術(shù)室。
角質(zhì)形成細胞懸液的制備和遞送根據(jù)廠商說明書將TISSEEL Duo 500置于37℃下解凍。一旦解凍，纖維蛋白原和凝血酶注射器從其各自的固定器上移出并施予到無菌塑膠管中。纖維蛋白原成分用注射用無菌水1∶1稀釋，然后進一步用儲備的患者細胞懸液(2×106個細胞/ml，如步驟2中制備)1∶4稀釋。凝血酶成分將用注射用無菌水1∶0.25(即4∶1)稀釋。將等體積的每種改進成分(纖維蛋白原+細胞和凝血酶)裝入單獨的1ml注射器中并經(jīng)由Duploject噴霧嘴與TISSOMAT連接。施用中，兩個注射器相等地下壓使得各成分進一步1∶1混合。因而，噴霧產(chǎn)品中的最終濃度為0.8×106個細胞/ml、170IU/ml的凝血酶和4.7mg/ml的纖維蛋白原。大約0.5ml的混合溶液將從10cm的高度在20psi下連續(xù)地遞送至每個20cm2的分層創(chuàng)面上。因此施用細胞的平均接種密度將為0.2×105/cm2。每次噴霧的高度和距離(interval)與手寬(高度)和三個手指的總寬(距離)近似。在進行常規(guī)的分層自體移植(燒傷治療或攣縮緩解)的過程中，進行傷口的治療。噴霧中每個傷口均約有一半用無菌罩覆蓋用作未經(jīng)治療的對照?？梢允褂脙蓚€供體部位一個經(jīng)治療的，另一個未經(jīng)治療的。每個傷口將在細胞懸液施用之前和之后進行拍照。治療的傷口將用Opsite硅酮敷料覆蓋。
根據(jù)已建立的方案進行手術(shù)后的臨床護理和評價。
實施例5ORS來源的細胞的生長和遷移原代外根鞘(ORS)培養(yǎng)物來源于從同意的糖尿病患者的頭皮獲得的生長期毛囊并用Limat & Hunziker，2002，Cells Tissues Organs 17279-85和國際公開WO 01/59442所述的方法培養(yǎng)。細胞將使用預(yù)形成的人有絲分裂后真皮成纖維細胞飼養(yǎng)層和上述的用于皮膚來源的角質(zhì)形成細胞的補充有胎牛血清的培養(yǎng)基進行離體擴展。培養(yǎng)物將維持在亞融合狀態(tài)以用于最大量的三代傳代及進行分離蛋白復(fù)合物存在而無血清和飼養(yǎng)細胞存在下的細胞生長的形態(tài)和功能評價。
對確定為皮膚來源的角質(zhì)形成細胞生長的最佳的特定復(fù)合物進行測試。
建立了離體擴展的ORS來源的角質(zhì)形成祖細胞在分離蛋白復(fù)合物存在下的生長和遷移，然后確定來自生長期ORS的細胞的初始衍生以及其后的原代培養(yǎng)是否也能在無血清和無飼養(yǎng)細胞條件下進行。因此，生長期毛囊的ORS將外植至細胞培養(yǎng)插入物的微孔膜上，并且代替用有絲分裂后真皮成纖維細胞飼養(yǎng)層包被膜插入物的下面，將用分離蛋白復(fù)合物包被該下表面。細胞將只在無血清培養(yǎng)基中或得自患者的自體血清補充的培養(yǎng)基中或含有分離蛋白復(fù)合物的培養(yǎng)基中生長。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將分離蛋白復(fù)合物存在下培養(yǎng)的ORS來源細胞的生長速度與插入物上培養(yǎng)的細胞相比較。
也將通過如Limat & Hunziker，2002，同上所述的將細胞與空氣接觸來制備表皮等價物(equivalent)，并通過組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)(例如基底膜樣結(jié)構(gòu)、透明角質(zhì)顆粒、角蛋白小體)和免疫組織化學(xué)(例如角蛋白、整聯(lián)蛋白、gp80、內(nèi)皮蛋白、絲角蛋白)標(biāo)準(zhǔn)進行表征。如果成功，ORS來源祖細胞和此生長因子+VN技術(shù)的使用將不僅顯著減少生產(chǎn)成本，也將增加安全性，從而加速與基于細胞的治療的批準(zhǔn)相關(guān)的管理問題。
實施例6純玻連蛋白的制備患者血液純化的自體VN(典型以0.4mg/ml存在)將用于支持患者自身的角質(zhì)形成細胞的離體生長。我們將評價針對玻連蛋白產(chǎn)生的單克隆抗體，其已成功用于從人血清中純化玻連蛋白(Underwood等，2001，J Immunol Methods.247 217-24)。選擇用于評價的單克隆抗體將采用與從血清中純化VN所述的相似方法來與支持純化基質(zhì)偶聯(lián)。此時，我們估計將需要0.25mg VN來培養(yǎng)1m2的患者細胞，這應(yīng)當(dāng)很容易從20ml患者血液中得到。將改良Underwood等，2001，同上的純化方法，重點在于最小操作性和簡單化目的是研發(fā)出理想地僅需2-3步清洗步驟的一次性親和純化基質(zhì)。由于VN將來自患者自身，因此對純VN的需求降低，只要得到的VN仍能有效地促進細胞生長。因此將評價使用研發(fā)的方案純化的VN對于促進角質(zhì)形成細胞生長的功效，以及通過標(biāo)準(zhǔn)生化分析例如SDS-PAGE、N-末端蛋白質(zhì)測序、電噴霧質(zhì)量分析、IGF-和IGFBP-結(jié)合來評價，并與從Promega Pty.Ltd購買的VN相比較。
本說明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而不將本發(fā)明限定于任一個實施方案或特定的特征集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以對舉例的具體實施方案進行各種不偏離本發(fā)明范圍的修飾和改變。
本文提及的所有計算機程序、算法、專利和科學(xué)文獻在此均引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其包含(i)選自IGF-I和IGF-II的至少一種IGF；和(ii)無血清或在不含所述的至少一種IGF的情況下不支持細胞生長的量的血清。
2.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中血清不存在或以不超過1％(v/v)的濃度存在。
3.權(quán)利要求2的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中血清以不超過0.5％(v/v)的濃度存在。
4.權(quán)利要求3的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中血清以不超過0.1％(v/v)的濃度存在。
5.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中血清不存在。
6.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中所述IGF為IGF-H。
7.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中所述IGF為IGF-I。
8.權(quán)利要求7的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其進一步包含選自IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5和IGFBP6的IGFBP。
9.權(quán)利要求8的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中所述IGFBP選自IGFBP3和IGFBP5。
10.權(quán)利要求9的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中所述IGFBP為IGFBP5。
11.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其進一步包含玻連蛋白(VN)或其片段。
12.權(quán)利要求11的哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述VN片段不包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)。
13.權(quán)利要求12的哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述VN片段包含聚陰離子區(qū)域。
14.權(quán)利要求13的哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述VN片段能夠結(jié)合選自αvβ3整聯(lián)蛋白或αvβ5整聯(lián)蛋白的整聯(lián)蛋白受體。
15.權(quán)利要求11的哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中玻連蛋白(VN)為純化的自體玻連蛋白(VN)。
16.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其包含分離蛋白復(fù)合物形式的IGF-I、IGFBP和玻連蛋白。
17.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其包含分離蛋白復(fù)合物形式的IGF-II和玻連蛋白。
18.權(quán)利要求6或權(quán)利要求17的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其中所述分離蛋白復(fù)合物為合成的嵌合蛋白。
19.權(quán)利要求1的哺乳動物細胞培養(yǎng)基，其進一步包含EGF和/或bFGF。
20.一種哺乳動物細胞系統(tǒng)，其包含培養(yǎng)容器和權(quán)利要求1-19之任一項的哺乳動物細胞培養(yǎng)基。
21.權(quán)利要求20的哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含固定、結(jié)合或締合于所述培養(yǎng)容器的玻連蛋白和/或纖連蛋白或其片段。
22.一種細胞培養(yǎng)方法，所述方法包括在權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)一種或多種細胞的步驟。
23.權(quán)利要求22的方法，其中至少部分的培養(yǎng)持續(xù)時間中不存在飼養(yǎng)細胞。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述的一種或多種細胞為上皮細胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的一種或多種細胞為角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述的一種或多種細胞為角膜細胞。
27.一種用于氣霧劑遞送角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞的藥物組合物，其包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求22-26之任一項的方法培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞以及藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其進一步包含拋射劑。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物，其進一步包含纖維蛋白膠。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其進一步包含選自IGF-I和IGF-II的至少一種IGF。
31.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中IGF-I和/或IGF-II存在于分離蛋白復(fù)合物中。
32.一種遞送角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞用于皮膚原位再生的方法，所述方法包括將權(quán)利要求27-31之任一項的藥物組合物噴在個體的皮膚上以促進皮膚再生的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其進一步包括使所述的角質(zhì)形成細胞或角質(zhì)形成祖細胞生長以原位形成再生皮膚的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種消除或至少減少對外源性成分例如血清和飼養(yǎng)細胞的需求的細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。所述細胞培養(yǎng)基包含IGF和玻連蛋白或纖連蛋白及任選的IGFBP，且特別適用于使角質(zhì)形成細胞增殖以隨后用于皮膚生長和再生。本發(fā)明還涉及利用培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的氣霧劑遞送的用于皮膚原位生長和再生的組合物和方法。
文檔編號A61K35/12GK1829791SQ200480022144
公開日2006年9月6日 申請日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月28日
發(fā)明者茲·厄普頓, 達明·哈金, 戴維·利弗斯利 申請人:昆士蘭技術(shù)大學(xué)