專(zhuān)利名稱(chēng)：用于口服傳遞胰高血糖素樣肽(glp)－1化合物或黑色素皮質(zhì)激素4受體(mc4)激動(dòng)劑肽的 ...的制作方法
背景技術(shù)：
傳遞活性藥物的常規(guī)方法經(jīng)常受到生物、化學(xué)和物理障礙的限制。通常而言，這些障礙是由傳遞環(huán)境、靶環(huán)境或靶本身產(chǎn)生的。生物或化學(xué)活性藥物特別容易受到這些障礙的影響。在將具有生物活性或化學(xué)活性的藥理和治療藥物傳遞至動(dòng)物的過(guò)程中，物理和化學(xué)障礙是由動(dòng)物本身產(chǎn)生的。物理障礙的示例包括皮膚和各種器官膜，活性藥物必須穿過(guò)這些物理障礙才能到達(dá)靶?；瘜W(xué)障礙的示例則包括(但不限于)pH的改變、脂質(zhì)雙層和降解酶的存在。
這些障礙在口服給藥體系中顯得極為重要。如果不是存在這些生物、化學(xué)和物理障礙(如腸胃(GI)道中的pH發(fā)生改變、強(qiáng)效的消化酶以及活性藥物不能透過(guò)的腸胃膜)的話，那么口服給藥將是給予動(dòng)物多種生物或化學(xué)活性藥物的途徑。在大量的一般不能通過(guò)口服給藥的藥物中，包括生物或化學(xué)活性肽，例如降鈣素和胰島素；多糖，特別是粘多糖，包括(但不限于)肝素；類(lèi)肝素；抗生素；以及其它有機(jī)物質(zhì)。這些藥物在胃腸道內(nèi)經(jīng)酸水解、酶等迅速失效或被破壞。
早期的口服給予易受影響的藥物的方法依賴(lài)于聯(lián)合給予賦形劑或增強(qiáng)劑(如間苯二酚和非離子表面活性劑，如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)，從而人工地增加腸壁的通透性，或者聯(lián)合給予酶抑制劑(如胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟代磷酸酯)，以抑制酶對(duì)活性藥物的降解。
也有人將脂質(zhì)體作為胰島素和肝素的藥物傳遞系統(tǒng)。參見(jiàn)，例如U.S.專(zhuān)利號(hào)4,239,754；Patel等(1976)，F(xiàn)EBS Letters，62卷，第60頁(yè)，以及Hashimoto等(1970)，Endocrinology Japan，26卷，第337頁(yè)。
然而，這些藥物傳遞系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用卻不可行，這是因?yàn)?1)該系統(tǒng)需要使用毒性量的賦形劑、增強(qiáng)劑或抑制劑；(2)不能獲得適當(dāng)?shù)牡头肿恿康摹拜d荷(cargo)”，即活性藥物；(3)它們具有較差的穩(wěn)定性并且保存期短；(4)該系統(tǒng)很難生產(chǎn)；(5)該系統(tǒng)無(wú)法保護(hù)活性藥物(“載荷”)；(6)該系統(tǒng)對(duì)活性藥物產(chǎn)生不利影響；或者(7)該系統(tǒng)無(wú)法使活性藥物吸收或者不能促進(jìn)活性藥物的吸收。
最近，人們報(bào)道采用混合氨基酸的人造聚合物(類(lèi)蛋白)的微球來(lái)傳遞藥物。例如，在U.S.專(zhuān)利號(hào)4,925,673中介紹了包含藥物的類(lèi)蛋白微球載體以及它們的制備方法和用途。這些類(lèi)蛋白微球可用于傳遞多種活性藥物。
在下列文獻(xiàn)中也描述了藥物分子的傳遞方法U.S.專(zhuān)利號(hào).5,541,155；5,693,338；5,976,569；5,643,957；5,955,503；6,100,298；5,650,386；5,866,536；5,965,121；5,989,539；6,001,347；6,071,510；5,820,881；和6,242,495；也參見(jiàn)WO 02/02509；WO 01/51454；WO 01/44199；WO01/32130；WO 00/59863；WO 00/50386；WO 00/47188；和WO 00/40203。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中R1和R2獨(dú)立為H、OH、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、CF3、鹵素或NR4R4′；R3為H、C1-C6烷基；X為任選被C1-C4烷基取代的5元芳族雜環(huán)；其中所述雜環(huán)包含至少兩個(gè)或三個(gè)選自N、S和O的雜原子，其中至少一個(gè)雜原子必須為N；Y為S、CR5＝N或N＝CR5；n為2、3、4、5、6或7；R4為H、COR6、SO2R7或C1-C6烷基；R4′為H或C1-C6烷基；
R5為H或與X形成一個(gè)鍵；R6為H或C1-C6烷基且R7為H或C1-C6烷基。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及式I化合物，其中R3為H。在下文中，該化合物被稱(chēng)為式II化合物。
本發(fā)明也涉及包含式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥用載體的藥用組合物。
本發(fā)明也涉及包含式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及GLP-1化合物的藥用組合物。
本發(fā)明也涉及包含式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和MC4激動(dòng)劑肽的藥用組合物。
發(fā)明詳述下文中提到“式I化合物”或“式II化合物”時(shí)，均包括它們的藥學(xué)上可接受的鹽。
在此公開(kāi)并要求保護(hù)的本發(fā)明中，下列術(shù)語(yǔ)具有如下定義。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”意指氟、氯、溴和碘。術(shù)語(yǔ)“C1-C6烷基”代表具有1-6個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)烴部分，如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)丁基、戊基、環(huán)戊基、己基、環(huán)己基等?；鶊F(tuán)如環(huán)丁基亞甲基也包含于C1-C6烷基基團(tuán)范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“C1-C4烷基”意指特別是甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基和環(huán)丁基。“C1-C6烷氧基”基團(tuán)是通過(guò)氧連接的C1-C6烷基部分。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”作為形容詞使用時(shí)，意指對(duì)被治療患者是無(wú)害的。
術(shù)語(yǔ)“患者”包括人類(lèi)和非人類(lèi)動(dòng)物，如伴侶動(dòng)物(狗、貓、馬等)。優(yōu)選的治療患者為人類(lèi)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“GLP-1化合物”意指一個(gè)或多個(gè)天然存在的GLP-1多肽(GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2)、GLP-1片段、GLP-1類(lèi)似物、天然存在的GLP-l多肽、GLP-1片段或GLP-l類(lèi)似物的GLP-1衍生物，以及具有與GLP-1受體結(jié)合的能力并激發(fā)產(chǎn)生促胰島活性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的促胰島素分泌肽(Exendin)-3和胰島素分泌肽-4，參見(jiàn)PCT公開(kāi)號(hào)WO03/072195(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US03/03111)，在此引入該文獻(xiàn)作參考。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“MC4激動(dòng)劑肽”意指公開(kāi)于于2004年6月17日提交的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/16625的藥學(xué)上可接受的肽(文中公開(kāi)的式I、II和III肽)。
當(dāng)所述化合物與活性藥物混合形成聯(lián)合組合物時(shí)，式II化合物可以用于增加活性藥物即，GLP-1化合物或MC4激動(dòng)劑肽的口服生物利用度。所述聯(lián)合為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。本發(fā)明組合物包含式II化合物，也就是，傳遞劑(式II化合物)，和GLP-1化合物或MC4激動(dòng)劑肽。
本發(fā)明特別優(yōu)選用于傳遞GLP-1化合物或MC4激動(dòng)劑肽(活性藥物)，如果不采用本發(fā)明的方案的話，這些活性藥物在達(dá)到其靶位置(即傳遞組合物的活性藥物被釋放的位置)之前以及在給藥的動(dòng)物體內(nèi)，可能已被所面臨的條件所破壞或使其有效性顯著降低。而包含一種或多種式II化合物(優(yōu)選的并最常用的)和一種活性藥物的組合物具有這樣的用途，即對(duì)選擇的生物系統(tǒng)傳遞所述活性藥物并且提高或增強(qiáng)所述活性藥物的生物利用度(與沒(méi)有傳遞劑而進(jìn)行給藥的情況下相比)?？梢酝ㄟ^(guò)在一定時(shí)間段內(nèi)傳遞更多的活性藥物或者在特定的時(shí)間內(nèi)(如為了起效快或延遲傳遞)或在一定時(shí)間段內(nèi)(如延緩傳遞)傳遞活性藥物來(lái)提高傳遞。
本發(fā)明優(yōu)選化合物(實(shí)施方案)本發(fā)明的某些化合物特別重要并優(yōu)選。下文列舉了優(yōu)選的化合物的基團(tuán)?？梢岳斫?，所列出的每一種基團(tuán)均可以與其它列舉的基團(tuán)結(jié)合從而得到另外的優(yōu)選化合物的基團(tuán)。
n為2、3、4或5；R1和R2獨(dú)立為H、OH、OCH3CH3、CF3、Cl或Br，R1和R2獨(dú)立為H、OH、OCH3CH3或CF3；
R1和R2獨(dú)立為H、OH、OCH3或NH2；R1為H且R2為OH；R1和R2均為H；R3為H；R4為H；R4為COR6且R6為CH3；R4為SO2R7且R7為CH3；R4′為H；R7為C1-C6烷基；X為 芳基(吡啶或噻吩)取代基在4位碳原子處連接，并且鏈烷酸鏈在2位碳原子處連接；X為 芳基取代基在3位碳原子連接，并且鏈烷酸在5位碳原子連接。
制備和實(shí)施例除非特別指出，所有非水反應(yīng)均可以在干燥氮?dú)夥障逻M(jìn)行。商業(yè)級(jí)別的試劑和無(wú)水溶劑可以以直接自供應(yīng)商獲得的狀態(tài)下使用，而無(wú)需將這些成分進(jìn)行進(jìn)一步純化或干燥。采用Teflon襯的KNF真空泵以及Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，于約28mm Hg壓力下，減壓除去溶劑。采帶有熒光指示劑的用1”×3”Analtech No.02521，Whatman No.MK6F或EM Science(Merck)No.5719-2硅膠板進(jìn)行薄層層析。可以通過(guò)短波UV光、采用10％磷鉬酸的乙醇溶液或碘氣使TLC板可視化從而進(jìn)行觀察?？焖僦鶎游隹梢圆捎肒ieselgel硅膠60進(jìn)行。采用Bruker AC 300MHz核磁共振分光計(jì)得到質(zhì)子NMR譜，以ppm值表示，用四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)。用電熱熔點(diǎn)設(shè)備獲得熔點(diǎn)并且是未經(jīng)校正的。CI質(zhì)譜分析可以在Shimadzu QP-5000GC/Mass分光計(jì)(甲烷)上通過(guò)直接注射進(jìn)行。API質(zhì)譜分析可以在Finnegan LCQ Duo Ion Trap或PESciex API 150EX質(zhì)譜分光計(jì)上，采用電噴霧離子化(ESI)或大氣壓化學(xué)離子化(APCI)進(jìn)行。HPLC分析可以采用Waters Symmetry C18，5um，WAT046980，3.9×150mm柱進(jìn)行。用90∶10(0.1％TFA的H2O溶液)/(0.1％TFA的CH3CN溶液)至10∶90(0.1％TFA的H2O溶液)/(0.1％TFA的CH3CN溶液)進(jìn)行梯度洗脫20分鐘，隨后用10∶90(0.1％TFA的H2O溶液)/(0.1％TFA的CH3CN溶液)等度洗脫10分鐘，然后再用90∶10(0.1％TFA的H2O溶液)/(0.1％TFA的CH3CN溶液)等度洗脫10分鐘。流速為1mL/分鐘。UV監(jiān)測(cè)在214和254nm處進(jìn)行。
制備16-氧代-6-[N′-(吡啶-2-羰基)肼基]己酸甲酯 于室溫、氮?dú)夥障?，攪?-皮考啉基酰肼(8.05g，58.8mmol)和己二酸單甲基氯化物(10.5g，58.8mmol)的DMF(117mL)溶液12小時(shí)。減壓除去溶劑。用乙醚(300mL)研磨殘留物，過(guò)濾收集固體，溶于水(200mL)，并用乙酸乙酯(200mL)洗滌。用飽和的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至8，并用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。經(jīng)硫酸鈉干燥合并的有機(jī)萃取物并減壓除去溶劑，得到6-氧代-6-[N′-(吡啶-2-羰基)肼基]己酸甲酯(3.85g，59％)。
實(shí)施例15-(5-吡啶-2-基[1，3，4]噁二唑-2-基)戊酸甲酯
于室溫、氮?dú)夥障?，將三乙?14.4mL，104mmol)加至6-氧代-6-[N′-(吡啶-2-羰基)肼基]己酸甲酯(9.63g，34mmol)、四氯化碳(26.6g，172mmol)和三苯膦(20.3g，78mmol)的乙腈(35mL)的混合物中，并攪拌30分鐘。過(guò)濾除去固體，然后減壓除去過(guò)濾溶劑。用水(500mL)稀釋殘留物并用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。用鹽水(200mL)洗滌合并的有機(jī)萃取物，經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓除去溶劑。用乙酸乙酯研磨殘留物，過(guò)濾收集固體，得到5-(5-吡啶-2-基[1，3，4]噁二唑-2-基)戊酸甲酯(8.15g，91％)。
實(shí)施例25-(5-吡啶-2-基[1，3，4]噁二唑-2-基)戊酸于室溫、氮?dú)夥障?，?N氫氧化鈉(20mL)加至5-(5-吡啶-2-基[1，3，4]噁二唑-2-基)戊酸甲酯(8.16g，31mmol)的THF(60mL)和甲醇(20mL)溶液中，于回流下，加熱混合物12小時(shí)。減壓除去溶劑，用水(500mL)稀釋殘留物，并用乙酸乙酯(200mL)洗滌。用濃HCl調(diào)節(jié)水層的pH至pH3，并用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。用鹽水(200mL)洗滌合并的有機(jī)萃取物，經(jīng)硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，得到5-(5-吡啶-2-基[1，3，4]噁二唑-2-基)戊酸(2.05g，27％)。APCI質(zhì)譜m/z 246[C12H13N3O3+H]+。
實(shí)施例38-(3-吡啶-2-基[1，2，4]噁二唑-5-基)辛酸 于室溫、氮?dú)夥障拢瑢?N氫氧化鈉(20mL)加至8-(3-吡啶-2-基[1，2，4]噁二唑-5-基)辛酸乙酯的甲醇(100mL)溶液中，并攪拌混合物3小時(shí)。減壓除去溶劑，用水稀釋殘留物并用乙醚洗滌。用2N HCl調(diào)節(jié)水層至pH1，并真空過(guò)濾收集固體，得到目標(biāo)化合物。APCI質(zhì)譜m/z 288[C15H19N3O3-H]-。
制備22-氧代-2-噻吩-3-基己二酸甲酯 于室溫下，將碳酸氫鈉的水溶液加至辛二酸單甲酯的甲醇(50mL)溶液中，并攪拌混合物30分鐘。減壓除去溶劑，并于室溫、氮?dú)夥障?，將殘留物加?-溴代-1-噻吩-3-基乙酮的丙酮溶液中。于回流下，加熱混合物10小時(shí)，然后減壓除去溶劑。用乙醚稀釋殘留物，攪拌20分鐘，經(jīng)短硅膠柱過(guò)濾，并用乙醚洗滌兩次。減壓除去溶劑，得到目標(biāo)化合物。
實(shí)施例45-(4-噻吩-3-基噁唑-2-基)戊酸甲酯 于135-140℃、氮?dú)夥障?，?-氧代-2-噻吩-3-基己二酸甲酯、乙酰胺和三氟化硼乙醚合物的混合物加熱4小時(shí)。冷卻混合物，用飽和的NaHCO3溶液稀釋?zhuān)靡宜嵋阴ポ腿　Ｓ蔑柡偷穆然c(鹽水)水溶液洗滌有機(jī)萃取物并經(jīng)硫酸鈉干燥。減壓除去溶劑并經(jīng)硅膠快速柱層析純化殘留物，洗脫液為己烷/乙酸乙酯，得到目標(biāo)化合物。APCI質(zhì)譜m/z 266[C13H15NO3S+ H]+。
實(shí)施例55-(4-噻吩-3-基-噁唑-2-基)戊酸
于室溫下，將氫氧化鈉的水溶液加至5-(4-噻吩-3-基噁唑-2-基)戊酸甲酯的甲醇溶液中，并于40℃加熱混合物2小時(shí)。用1N HCl調(diào)節(jié)混合物pH至2，并用乙酸乙酯萃取。用水洗滌有機(jī)萃取物三次，經(jīng)硫酸鈉干燥并減壓除去溶劑。用己烷/乙酸乙酯研磨殘留物，并過(guò)濾收集固體，得到目標(biāo)化合物APCI質(zhì)譜m/z 252[C12H13NO3S+H]+。
實(shí)施例6-11，如下表1所示式II(a)化合物，可以采用與制備實(shí)施例6化合物相同的方法進(jìn)行。
表1式II(a)化合物
制備32-溴代-1-(3-甲氧基-吡啶-2-基)-乙酮
將氫化鈉(5.91g，147.8mmol)加至快速攪拌的2-溴代-3-吡啶醇的DMF(無(wú)水，200mL)溶液中。30分鐘后，加入碘甲烷(9.2mL，147.8mmol)，并于N2中攪拌2.5小時(shí)。用水淬滅并濃縮。殘留物分配在Et2O和水之間，分離各層。用Et2O(×2)自水層萃取，經(jīng)MgSO4干燥合并的層并濃縮。經(jīng)硅膠快速層析純化殘留物，洗脫液為0-25％EtOAc/己烷，得到2-溴代-3-甲氧基-吡啶(21.0g，83％)。
將碘化銅(I)(38mg，0.2mmol)加至在密封試管中的2-溴代-3-甲氧基-吡啶(188mg，1.0mmol)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫(0.68mL，2.0mmol)和DMF(無(wú)水，4mL)的混合物中。充入N2，密封，于80℃加熱3h。經(jīng)硅膠快速層析純化混合物，洗脫液為0-30％EtOAc/己烷，得到2-(1-乙氧基-乙烯基)-3-甲氧基-吡啶(151mg，84％)。
將N-溴代-琥珀酰亞胺(306mg，1.7mmol)加至攪拌的2-(1-乙氧基-乙烯基)-3-甲氧基-吡啶(305mg，1.7mg)的THF(30mL)和水(2mL)溶液中。于室溫、N2中攪拌15分鐘。經(jīng)SiO2吸附并經(jīng)硅膠快速層析，洗脫液為0-40％EtOAc/己烷，得到目標(biāo)化合物(211mg，54％)。
實(shí)施例125-[4-(3-甲氧基-吡啶-2-基)-噁唑-2-基]-戊酸甲酯 將三氟化硼醚合物(0.30mL，1.00mmol)加至含有2-溴代-1-(3-甲氧基-吡啶-2-基)-乙酮(231mg，1.00mmol)、5-氨基甲酰-戊酸甲酯(222mg，1.39mmol)和THF(無(wú)水，3mL)的密封試管中。充入N2，密封，于80℃加熱過(guò)夜。分配于飽和的NaHCO3水溶液和20％i-PrOH/CHCl3之間，分離各層。用20％i-PrOH/CHCl3(×3)萃取水層，經(jīng)MgSO4干燥合并的有機(jī)層并濃縮。用SiO2吸附并經(jīng)硅膠快速層析純化，洗脫液為1-3％甲醇/CHCl3，得到目標(biāo)化合物(97mg，33％)。MS(IS)291(M+1)+。
實(shí)施例135-[4-(3-羥基-吡啶-2-基)-噁唑-2-基]-戊酸先用三溴化硼、然后再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)水解處理5-[4-(3-甲氧基-吡啶-2-基)-噁唑-2-基]-戊酸甲酯，得到目標(biāo)化合物。
制劑由于式II化合物可能含有堿性和/或酸性部分(即，氨基和/或羧酸)，所以所述化合物可以形成藥學(xué)上可接受的鹽，如鈉鹽或鹽酸鹽或“藥學(xué)上可接受的鹽手冊(cè)性質(zhì)、選擇及應(yīng)用(Handbook of Pharmaceutical SaltsProperties，Selection and Use)”，Weinheim，紐約VHCA；Wiley-VCH，2002所述的鹽。優(yōu)選將式II化合物配制為劑量單位形式，即，在給予患者前為單一劑量形式，例如片劑或膠囊。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為含有式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、活性藥物和藥用載體的藥用組合物。
可以根據(jù)已知的方法采用熟知的和容易獲得的成分制備本發(fā)明的藥物組合物。在制備本發(fā)明制劑的過(guò)程中，可以將傳遞劑(式II化合物)與活性藥物混合，并且通常與載體混合，或用載體稀釋?zhuān)虮惠d體包裹，所述載體可以為膠囊、小袋、紙或其它容器。當(dāng)載體用作稀釋劑時(shí)，可以為作為活性藥物溶媒、賦形劑或介質(zhì)的固體、半固體或液體材料。
生物試驗(yàn)傳遞劑制劑的開(kāi)發(fā)就口服給藥的GLP-1化合物而言，每種制劑的pH范圍通常為7.4-8.4，但對(duì)于MC4激動(dòng)劑肽，則試劑的pH范圍通常為6.8-7.2(最通常為7.0)。而兩種情況下靶傳遞劑濃度通常均為150mg/mL。最初的可行性研究用于確定最終載體制劑。
簡(jiǎn)言之，將200mg傳遞劑置入I型玻璃小瓶中，向瓶中加入1mL的MilliQ水。目測(cè)各混合物的溶解性，隨后加入NaOH以增加溶解性或者加入HCl降低pH至口服范圍。然后用MilliQ水將制劑稀釋至150mg/mL。采用這種方法，通常可將制劑分成三類(lèi)水溶的、接近全溶的(如，殘留的不溶性顆粒極少，形成非常均勻的水懸浮液或霧懸浮液)以及不溶于水的(如，濃厚的懸浮液)。需要時(shí)，可將不溶于水的傳遞劑用4％w/v(水溶液)羥丙基纖維素(KlucelLF，Hercules，Wilmington，DE)配制。在此情況下，將50-100mg試劑懸浮于I型玻璃小瓶中的KlucelLF中，得到的溶液的濃度為200mg/mL。對(duì)于濃厚水溶液和KlucelLF懸浮液，將其于冰上冷卻3分鐘，然后采用Misonix SonicatorUltrasonic Processor XL(3/16thinchmicrotip)在冰上進(jìn)行探頭超聲處理30分鐘，以便減小微粒大小。然后用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH，再用MilliQ水或KlucelLF將制劑稀釋至150mg/mL。
活性藥物儲(chǔ)備溶液的制備此處所使用的GLP-1化合物(如Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH和Val8-Glu22-I33-GLP-1(7-37)OH)和MC4激動(dòng)劑肽(如Ac-Arg-環(huán)[Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2；Ac-環(huán)[hCys-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2；Ac-環(huán)[hCys-His-D-Phe-Arg-Trp-青霉胺]-NH2；和N-環(huán)己烷羰基-環(huán)[hCys-His-D-Phe-Arg-Trp-青霉胺]-NH2)分別在PCT公開(kāi)號(hào)WO 03/072195和6月17日提交的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/16625中有述及。
可以采用下述方法制備GLP-1化合物活性藥物的儲(chǔ)備溶液。簡(jiǎn)言之，將已知量的凍干活性藥物置入I型玻璃小瓶中。然后加入MilliQ水得到初濃度約7-10mg/mL的溶液?？梢酝ㄟ^(guò)用1N NaOH和5N NaOH緩慢提高介質(zhì)的pH至10.5使肽完全溶解，然后于室溫下溫育30分鐘。加入1M的Tris緩沖液(pH8.0)，得到最終的Tris緩沖液濃度為20mM，用1N HCl和5N HCl將pH調(diào)節(jié)至pH7.8。然后用低蛋白結(jié)合0.22μM針頭式過(guò)濾器(Millex GV，Millipore)將溶液過(guò)濾。肽濾液的濃度經(jīng)UV分光光度計(jì)(λmax＝280nm)測(cè)定。然后用20mM Tris緩沖液(pH7.8)將該溶液稀釋為濃度約5.0mg/mL的儲(chǔ)備液。將活性藥物溶液以每份1.0mL于-70℃存放待用。
可以采用下述方法制備MC4R激動(dòng)劑肽儲(chǔ)備溶液。簡(jiǎn)言之，將已知量的凍干MC4R激動(dòng)劑肽置于I型玻璃小瓶中。然后加入MilliQ水，得到初濃度約19-21mg/mL的溶液。用1N NaOH和5N NaOH將pH調(diào)至6.0，然后于室溫下溫育30分鐘。肽溶液的濃度經(jīng)UV分光光度計(jì)(max＝280nm；于250nm-410nm進(jìn)行光發(fā)散校正)測(cè)定。然后將溶液作為儲(chǔ)備液存放，濃度約20.0mg/mL。將肽溶液于4-8℃冷藏待用。
大鼠口服傳遞方法在這些研究中，使用重250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠(將導(dǎo)管插入股骨動(dòng)脈，Charles River，Wilmington，MA)。將動(dòng)物單獨(dú)置于不銹鋼籠中，并根據(jù)Eli Lilly and Company的動(dòng)物護(hù)理及使用策略和方法中所述方法進(jìn)行護(hù)理。于給藥前將動(dòng)物禁食至少12小時(shí)(可以進(jìn)水)。將大鼠以每組4只進(jìn)行試驗(yàn)(傳遞劑+活性藥物)。在體內(nèi)給藥前約5-10分鐘，新鮮制備每種傳遞劑的終制劑。
具體而言，將傳遞劑制劑(～165mg/mL儲(chǔ)備液)和GLP-1化合物活性藥物溶液(～5.0mg/mL儲(chǔ)備液)混合，得到傳遞劑+活性藥物的混合物。它們的終濃度分別為150mg/mL和0.5mg/mL。制劑經(jīng)口管飼法(PO)給藥，終劑量為300mg/kg傳遞劑和1.0mg/kg活性藥物。于5、10和20分鐘時(shí)，經(jīng)系統(tǒng)(股骨動(dòng)脈)插管自各動(dòng)物收集1mL血樣于含有EDTA的試管中(樣本/時(shí)間點(diǎn))。收集后迅速將試管在冰上冷凍并于約5℃/3,000rpm/15分鐘離心。分離血漿，轉(zhuǎn)移至12×75mm壓蓋(snap cap)聚丙烯樣本試管中，并迅速于-70℃存放至進(jìn)行放射性免疫測(cè)定分析。
如果是MC4激動(dòng)劑肽活性藥物，則將傳遞劑制劑(～165mg/mL儲(chǔ)備液)和肽溶液(～20.0mg/mL儲(chǔ)備液)混合，得到傳遞劑+活性藥物的混合物。它們的終濃度分別為150mg/mL和5.0mg/mL。制劑經(jīng)口管飼法(PO)給藥，終劑量為300mg/kg傳遞劑和10.0mg/kg活性藥物。于5、15、30、60、90和120分鐘時(shí)，經(jīng)系統(tǒng)(股骨動(dòng)脈)插管自每只動(dòng)物收集0.40mL血樣于含有肝素的試管中(樣本/時(shí)間點(diǎn))。收集后迅速將試管在冰上冷凍并于約5℃/3,000rpm/15分鐘離心。分離血漿，轉(zhuǎn)移至96孔板中，并迅速于-70℃存放至進(jìn)行LC/MS/MS分析。
放射免疫分析和藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析經(jīng)非特異性檢測(cè)天然肽和代謝產(chǎn)物的放射免疫分析測(cè)定大鼠血漿中的免疫反應(yīng)活性藥物的濃度。隨后采用這些濃度測(cè)定藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將血漿樣品與放射性標(biāo)記的活性藥物和兔多克隆抗血清混合，然后于～4℃下溫育過(guò)夜。結(jié)合和游離形式的免疫反應(yīng)活性藥物通過(guò)采用聚乙二醇協(xié)助的次級(jí)抗體沉淀法使結(jié)合部分沉淀進(jìn)行分離。離心收集結(jié)合的部分，放射活性經(jīng)γ計(jì)數(shù)器測(cè)定。經(jīng)加權(quán)4/5參數(shù)對(duì)數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于GLP-1化合物而言，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為9.8pg/mL-10000pg/mL，上下定量限分別為150pg/mL和4000pg/mL。而對(duì)于MC4激動(dòng)劑肽而言，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍則為5.0ng/mL-5000ng/mL，上下定量限分別為10ng/mL和5000ng/mL。藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析采用WinNonlinTMVersion 3.0(Pharsight Corporation，Mountain View，CA)進(jìn)行。血漿濃度時(shí)間數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。傳遞劑的效能以在每種傳遞劑存在下0-20分鐘內(nèi)活性藥物血漿濃度-時(shí)間曲線下的面積(AUC)來(lái)表示。在大鼠口服傳遞試驗(yàn)中，對(duì)典型的式II化合物(傳遞劑)和活性藥物進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)存在傳遞劑時(shí)的活性藥物的AUC顯著高于不存在傳遞劑時(shí)的活性藥物的AUC。
權(quán)利要求
1.式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中R1和R2獨(dú)立為H、OH、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、CF3、鹵素或NR4R4′；R3為H、C1-C6烷基；X為任選被C1-C4烷基取代的5元芳族雜環(huán)；其中所述雜環(huán)包含至少兩個(gè)或三個(gè)選自N、S和O的雜原子，其中至少一個(gè)雜原子必須為N；Y為S、CR5＝N或N＝CR5；n為2、3、4、5、6或7；R4為H、COR6、SO2R7或C1-C6烷基；R4′為H或C1-C6烷基；R5為H或與X形成一個(gè)鍵；R6為H或C1-C6烷基；且R7為H或C1-C6烷基；其中所述式I化合物不為
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R2獨(dú)立為H、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、CF3、鹵素或NR4R4′，其中X不被C1-C4烷基取代。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中R3為H。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X為 R3為H且(CH2)nCO2R3部分連接于2位。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X為 R3為H且(CH2)nCO2R3部分連接于5位。
6.下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
7.下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
8.下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
9.下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
10.下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
11.下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
12.包含下列成分的藥用組合物a)權(quán)利要求3-11中任一項(xiàng)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；以及b)GLP-1化合物。
13.權(quán)利要求14的組合物，其中所述GLP-1化合物為Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH。
14.包含下列成分的藥用組合物a)權(quán)利要求3-11中任一項(xiàng)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；以及b)MC4激動(dòng)劑肽。
15.權(quán)利要求16的組合物，其中所述MC4激動(dòng)劑肽選自下列化合物Ac-Arg-環(huán)[Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2；Ac-環(huán)[hCys-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2；Ac-環(huán)[hCys-His-D-Phe-Arg-Trp-青霉胺]-NH2；以及N-環(huán)己烷羰基-環(huán)[hCys-His-D-Phe-Arg-Trp-青霉胺]-NH2。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于口服傳遞GLP－1化合物或MC4激動(dòng)劑肽的新化合物、方法和制劑。
文檔編號(hào)A61K47/22GK1832944SQ200480022791
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月20日
發(fā)明者L·N·容海姆, J·M·麥吉爾, K·J·思拉舍, R·J·赫爾, V·米拉里克里希納 申請(qǐng)人:伊萊利利公司