專利名稱：胰高血糖素樣肽的純化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化領域。特別是，本發(fā)明涉及通過反相高相液相色譜從包含胰高血糖素樣肽和至少一種相關雜質(zhì)的組合物中純化胰高血糖素樣肽的方法。
背景技術：
對于蛋白質(zhì)和肽(多肽)的純化和分析，色譜是眾所周知并廣泛使用的方法。包括反相高效液相色譜(RP-HPLC)的這些色譜采用了許多不同的色譜原理。RP-HPLC分離的原理基于多肽溶質(zhì)和疏水連接在色譜樹脂表面的疏水締合。RP-HPLC純化通常由一個或多個下面的部分組成平衡、上樣、清洗、洗脫和再生。
RP-HPLC中最普通應用的溶劑系統(tǒng)基于水/乙腈/三氟乙酸(TFA)，通常通過增加應用于色譜柱的液體的溶劑即乙腈含量來完成溶質(zhì)的洗脫。RP-HPLC中乙腈對于多肽溶質(zhì)具有很強的選擇和變性作用(Boysen，R.I.等人，J.Biol.Chem.277，23-31(2002))，與TFA聯(lián)合(從而在低pH～2時)，這個系統(tǒng)在制藥工業(yè)和其它工業(yè)中用作標準的分析工具(Snyder，L.R.等人，“實用性HPLC方法的發(fā)展”，“生化樣品蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物以及相關化合物”第二版，第11章，John Wiley&Sons Inc.，New York，1997)。在生產(chǎn)規(guī)模低pH的乙腈也廣泛地用于多肽的純化，即用于人胰島素的純化(Kroeff，E.P.等人，J.Chromatogr.461，45-61(1989))?；谖慈〈木酆衔锏姆聪鄻渲呀?jīng)用于胰高血糖素從胰腺中的初步回收(US4,617,376)。在pH 2.8用乙腈作為有機溶劑以及甘氨酸作為緩沖成分操作色譜柱。這個步驟沒有去除相關雜質(zhì)的指示。用線性梯度在低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)中在C18柱上純化肽合成得到的各種胰高血糖素的類似物(Krstenansky，J.L.等人，J.Biochem.25，3839-3845(1986))。使用低pH的線性乙腈梯度采用TFA作為緩沖物質(zhì)在C18柱上從板鰓魚分離胰高血糖素(Conlon J.M.和Thim L.Gen.Comp.Endocrinol.60，398-405(1985))。在大腸桿菌中表達重組的雞胰高血糖素，隨后使用包括用線性梯度低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)的RP-HPLC在內(nèi)的各種步驟進行純化(Kamisoyama H.等人Anim.Sci.J.71，428-431(2000))。
使用pH 7.65的線性乙腈梯度采用50mM乙酸銨作為緩沖系統(tǒng)在C18柱上從象魚中分離胰島素和胰高血糖素(Berks B.C.，等人，Biochem.J.263，261-266(1989))。
WO 99/52934公開了用于各種胰島素衍生物的分離的RP-HPLC方法，其中通過鈣離子的加入實現(xiàn)靶組分和糖基化相關雜質(zhì)之間分離的改善。在22-25℃使用乙醇作為有機溶劑，Tris或Bis-Tris作為約7.0-7.2pH范圍的緩沖成分進行純化，所述pH在胰島素的等電點之上。
胰島素的純化方法，包括用乙醇作為有機洗脫劑在pH低時(使用磷酸銨緩沖液)以及在接近中性的pH時(使用Tris緩沖液)在C18柱上的RP-HPLC步驟也有描述(Mollerup I.等人，“生物處理技術百科全書”中的“胰島素的純化”，編輯Flickinger M.C.和Drew S.W.，pp 1491-1498，John Wiley&Sons Inc.1999)。這些方法去除了胰島素相關雜質(zhì)。
使用始于40％甲醇的水溶液和pH 3.0的10mM磷酸鹽和三乙胺緩沖液至終于50％的(乙腈/0.1M碳酸銨，pH9.0)或終于12.5％的(乙腈/0.1M Tris-HCl，pH 9.0)的多種梯度在C18柱分離上獲得了碘化胰高血糖素產(chǎn)物(Rojas F.J.等人，Endo.113，711-719(1983))。(溶劑和pH)這個混合模式的RP-HPLC根據(jù)碘化的程度分離了胰高血糖素產(chǎn)物。另外，所述方法用于分離胰高血糖素和碘化胰高血糖素的酶消化。
對于許多其它的多肽是一樣的，使用采用了線性梯度的乙腈和小量TFA作為緩沖物質(zhì)在低于靶多肽成分等電點(pI)的低pH的RP-HPLC，廣泛地純化了包括類似物和衍生物在內(nèi)的胰高血糖素樣肽。從兩個物種，即豬和人的小腸分離了GLP-1(rskov C.等人，J.Biol.Chem.264，12826-12829(1989))。使用線性梯度的乙醇/TFA系統(tǒng)獲得了純化，使用乙腈/TFA系統(tǒng)的等度洗脫獲得了額外的純化，兩個都在低pH于C18柱上進行。兩個方法都不能分離存在的兩種相關的GLP-1形式(GLP-1和NH2-末端延伸的GLP-1)。
基于乙腈/TFA的RP-HPLC系統(tǒng)已經(jīng)應用于狗回腸中GLP-1形式的研究(Namba M.等人，Biomedical Res.11(4)，247-254(1990))。有一些指示表明分開了各種形式，并且應用這個方法合成得到的GLP-1和脫-Gly37-GLP-1酰胺標準物有稍微不同的洗脫時間。低pH的基于乙腈/TFA的RP-HPLC系統(tǒng)中C4柱已經(jīng)應用于GLP-1衍生物的融合蛋白和帶有抗體片段的胰高血糖素延長蛋白-4(exendin-4)和人血清白蛋白的融合蛋白的純化(WO 02/46227)。
用低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)的梯度洗脫在C18柱上分離了多種前胰高血糖素原(preproglucagon)的切割產(chǎn)物(Noe B.D.和Andrews P.C.，Peptides7，331-336(1986))。
低pH的基于乙腈/TFA的RP-HPLC系統(tǒng)中腈丙基(cyano propyl)柱已經(jīng)用于由化學合成獲得的多種GLP-1類似物的純化(WO98/08871)。
已經(jīng)將GLP-2從兩個物種豬和人的腸之其它的胰高血糖素原(proglucagon)相關肽中分離出來(Buhl T.等人，J.Biol.Chem.263，8621-8624(1988))。使用低pH的線性梯度乙腈/TFA系統(tǒng)獲得了純化，應用了使用乙醇/TFA系統(tǒng)等度洗脫的純化，兩個都在低pH下于C18柱上進行。通過后面的方法，將GLP-2與細胞色素C氧化酶分開，然而，存在的兩種相關的GLP-2形式(GLP-2和NH2末端延伸的GLP-2)未分開。
WO 01/04156公開了合成和通過重組技術獲得的胰高血糖素延長蛋白-4變體和GLP-1變體。應用低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)的梯度洗脫在C18柱上純化肽合成獲得的變體，而應用線性梯度低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)在C8柱上純化重組肽。
WO 00/41548公開了C18柱的用途，應用低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)的梯度洗脫以純化肽合成獲得的胰高血糖素延長蛋白-3和胰高血糖素延長蛋白-4。WO 99/25727公開了C18柱的用途，應用低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)的梯度洗脫以純化肽合成獲得的多種胰高血糖素延長蛋白激動劑(胰高血糖素延長蛋白類似物和衍生物)。
使用線性梯度低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)在C18柱上分離了來自人胰腺提取物的胰高血糖素、GLP-1和GLP-2(Suda K.等人，Biomedical Res.9，39-45(1988))。
對于獲自重組技術的GLP-1類似物在C18柱上用乙醇作為有機洗脫劑而不控制色譜溶劑的pH之純化，公開了流速和溫度的作用(Schou O.，在生物制劑生產(chǎn)進展第六屆Interlaken會議上報告，Interlaken，瑞士，三月號25-28，2003)。
EP 0708179公開了固相合成的用途以產(chǎn)生多種GLP-1類似物和衍生物。采用的一個純化方案包括在45℃使用線性梯度低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)在C18柱上的純化。另一個純化方案包括在室溫下的兩個RP-HPLC步驟使用線性梯度低pH的乙腈/TFA系統(tǒng)在C4柱上的純化之后是使用線性梯度pH 7.7的乙腈/碳酸銨系統(tǒng)在C18柱上的純化。通過兩步法去除了多種相關雜質(zhì)和起始物質(zhì)，得到了靶成分約99％的HPLC純度和只有14.8％的總產(chǎn)率。
Senderoff等(J.Pharm.Sci.87，183-189(1998))使用了固相合成和使用酵母中表達的重組技術，以產(chǎn)生用于構(gòu)象改變研究的天然人GLP-1。重組GLP-1的純化方案尤其包括使用乙醇作為有機洗脫劑的兩個RP-HPLC步驟。在pH 10.7用0.05M氫氧化銨作為緩沖液進行第一個RP-HPLC步驟，而在低pH(低于pH 3)用1％乙酸作為緩沖液進行第二個RP-HPLC。純化方案得到了約98.5％的GLP-1純度，然而，所述產(chǎn)物經(jīng)歷了顯著的構(gòu)象改變而導致產(chǎn)物再溶解的困難。另外，包括第一個RP-HPLC步驟的處理步驟中涉及的高pH誘導了堿催化的降解產(chǎn)物，它們比靶化合物的生物活性要低。作為一些步驟之一而采用了第三個RP-HPLC步驟(條件未特別說明)以再處理靶GLP-1并使其回到正確的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明在應用包含醇作為有機洗脫劑之pH緩沖的溶劑用于胰高血糖素樣肽和類似物及其衍生物在接近中性的pH下的RP-HPLC純化方面是新的。與使用基于醇的溶劑系統(tǒng)的胰高血糖素樣肽RP-HPLC純化的現(xiàn)有技術領域相比，本發(fā)明推進了分離效率的增加和工業(yè)用途的應用。令人驚訝地，新的方法改善了靶胰高血糖素樣肽化合物和相關雜質(zhì)的分離并得到了更加穩(wěn)定的胰高血糖素樣肽產(chǎn)物。
RP-HPLC純化過程中接近中性pH的使用有優(yōu)勢，就是避免了這些胰高血糖素樣肽在柱上可能的聚集，這個將會在實施例中反映出來。這令人驚訝，因為如上面提出的胰島素和胰高血糖素可以在低pH操作而不會在柱上的聚集，因而呈現(xiàn)了在一邊胰島素和胰高血糖素之間以及另一邊胰高血糖素樣肽之間本性的不同。
RP-HPLC純化過程中醇的使用還有另外的優(yōu)勢，與更加常用的乙腈相比誘導了更好的肽的構(gòu)象保持。而且，乙腈(和TFA)是毒性化學物質(zhì)，由于環(huán)境和健康問題，它們不適合，應當在工業(yè)規(guī)模避免使用。醇一般毒性較小，更加適合工業(yè)使用。
附圖簡述

圖1.使用C4取代的120硅膠和pH 3.5的洗脫，Arg34-GLP-1(7-37)從作為糖基化雜質(zhì)的相關雜質(zhì)制備分離的AU280對時間的色譜圖。
圖2.使用C4取代的120硅膠和pH 7.5的洗脫，Arg34-GLP-1(7-37)從作為糖基化雜質(zhì)的相關雜質(zhì)以及截短形式Arg34-GLP-1(9-37)制備分離的AU280對時間的色譜圖。
圖3.使用C18取代的200硅膠和pH 3.5的洗脫，Arg34-GLP-1(7-37)從作為糖基化雜質(zhì)的相關雜質(zhì)制備分離的AU280對時間的色譜圖。
圖4.使用C18取代的200硅膠和pH 7.5的洗脫，Arg34-GLP-1(7-37)從作為糖基化雜質(zhì)的相關雜質(zhì)以及截短形式Arg34-GLP-1(9-37)制備分離的AU280對時間的色譜圖。
圖5.使用C18取代的120硅膠和pH 7.5的洗脫，Arg34-GLP-1(7-37)從作為糖基化雜質(zhì)的相關雜質(zhì)以及截短形式Arg34-GLP-1(9-37)制備分離的AU280對時間的色譜圖。
圖6.使用C4取代的120硅膠和pH 7.5的洗脫，在沒有pH緩沖劑的溶劑中，Arg34-GLP-1(7-37)從作為糖基化雜質(zhì)的相關雜質(zhì)制備分離的AU280對時間的色譜圖。
定義下面是本詳述中使用的術語的詳細定義。
術語從包含肽和一種或多種污染物的組合物中“純化”肽指的是通過降低至少一種污染物在組合物中的含量，增加所述肽在組合物中的純度。
如此處使用的術語“相關雜質(zhì)”指的是與靶胰高血糖素樣肽具有結(jié)構(gòu)相似性的雜質(zhì)。與靶胰高血糖素樣肽相比，相關雜質(zhì)具有不同的化學或物理結(jié)構(gòu)，例如截短的形式、延伸的形式(額外的氨基酸、各種衍生物等)、脫酰胺基的形式、錯誤折疊形式、帶有包括唾液酸化的非期望糖基化形式、氧化形式、消旋造成的形式、肽內(nèi)鏈中缺失氨基酸的形式、肽內(nèi)鏈中具有額外氨基酸的形式、?；l(fā)生在另一個非期望殘基上的形式，以及其它。
如此處使用的術語“緩沖劑”指的是降低色譜溶劑的pH隨著時間變化的傾向的化合物，否則就會發(fā)生pH變化。緩沖劑包括但不限于如下化合物，例如乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鈉、雙甘氨肽、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、磷酸鈉、硼酸鹽、TRIS(Tris-羥甲基-氨基甲烷)、乙醇胺或它們的混合物。
如此處使用的術語“胰高血糖素樣肽”指的是同源肽胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽2(GLP-2)和源自前胰高血糖素原基因的oxynthomodulin(OXM)、胰高血糖素延長蛋白以及它們的類似物和衍生物。毒蜥中(Gila monster)發(fā)現(xiàn)的胰高血糖素延長蛋白與GLP-1同源，也有促胰島素的作用。胰高血糖素延長蛋白的實例是胰高血糖素延長蛋白-4和胰高血糖素延長蛋白-3。胰高血糖素樣肽具有下面的序列(SEQ ID Nos 1-5)15 10152025 3035GLP-1 HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR GGLP-2 HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITD胰高血糖素延長蛋白-4HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS-NH2胰高血糖素延長蛋白-3HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS-NH2OXMHSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA如此處使用的與肽相關的術語“類似物”指的是修飾的肽，其中所述肽的一個或多個氨基酸殘基被其它的氨基酸殘基替代，和/或其中一個或多個氨基酸殘基被從所述肽上刪除，和/或其中一個或多個氨基酸殘基被從所述肽上刪除，和/或其中一個或多個氨基酸殘基被添加到所述肽上。氨基酸殘基這樣的添加或刪除能夠發(fā)生在肽的N末端和/或肽的C末端。常常使用兩個不同的簡單系統(tǒng)來描述類似物例如Arg34-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(7-37)指一種GLP-1類似物，其中在位置34的天然發(fā)生的賴氨酸被精氨酸替代(根據(jù)IUPAC-IUB命名法使用氨基酸的標準單個字母縮寫)。
如此處使用的與親本肽相關的術語“衍生物”指的是化學修飾的親本蛋白質(zhì)或其類似物，其中至少一種取代基不在親本蛋白質(zhì)或其類似物中，即被共價修飾的親本蛋白質(zhì)。一般的修飾是酰胺、碳水化合物、烷基基團、?；鶊F、酯、聚乙二醇化等等。GLP-1(7-37)衍生物的實例是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六?；?))-GLP-1(7-37)。
如此處使用的與肽相關的術語“它的片段”指的是具有親本肽氨基酸的至少20％之任何肽的片段。因而，對于人血清白蛋白，片段將包含至少117個氨基酸，因為人血清白蛋白具有585個氨基酸。在一個實施方案中，所述片段具有至少35％的親本肽氨基酸。在另一個實施方案中，所述片段具有至少50％的親本肽氨基酸。在另一個實施方案中，所述片段具有至少75％的親本肽氨基酸。
如此處使用的與肽相關的術語“變體”指的是修飾肽，所述修飾肽是親本肽類似物、親本肽衍生物或親本肽類似物的衍生物。
如此處使用的術語“GLP-1肽”指的是GLP-1(7-37)、GLP-1類似物、GLP-1衍生物或GLP-1類似物的衍生物。
如此處使用的術語“GLP-2肽”指的是GLP-2(1-33)、GLP-2類似物、GLP-2衍生物或GLP-2類似物的衍生物。
如此處使用的術語“胰高血糖素延長蛋白-4肽”指的是胰高血糖素延長蛋白(1-39)、胰高血糖素延長蛋白-4類似物、胰高血糖素延長蛋白-4衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物。
如此處使用的術語“血漿穩(wěn)定的胰高血糖素樣肽”指的是化學修飾的胰高血糖素樣肽，即如下面的方法測定地呈現(xiàn)了在人中至少10個小時的體內(nèi)血漿清除半衰期的類似物或衍生物。人胰高血糖素樣肽的血漿清除半衰期的測定方法是化合物溶解于等滲緩沖液，pH 7.4、PBS或任何其它合適的緩沖液。外周注射給予，優(yōu)選地在腹腔或臀上部。為了活性化合物的測定頻繁間隔采集血樣，持續(xù)時間足夠覆蓋最終清除部分(例如，劑量前、劑量后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小時)。如Wilken等人，Diabetologia43(51)A143，2000中描述地進行活性化合物濃度的測定。使用市售軟件WinNonlin 2.1版(Pharsight，Cary，NC，USA)，通過非腔室方法的使用對每個個體研究對象從濃度-時間數(shù)據(jù)計算衍生的藥代動力學參數(shù)。
如此處使用的術語“DDP-IV保護的胰高血糖素樣肽”指的是化學修飾使得所述肽，與所述肽的天然形式相比，對血漿肽酶二肽基氨肽酶-4(DPP-IV)有抗性的胰高血糖素樣肽。如此處使用的術語“免疫調(diào)節(jié)的胰高血糖素延長蛋白-4肽”指的是為胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)的類似物或衍生物的胰高血糖素延長蛋白-4肽，在人類中，與胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)相比，具有降低的免疫反應。評價免疫反應的方法是測量患者治療4周后應答胰高血糖素延長蛋白-4肽的抗體濃度。
如此處使用的術語“胰高血糖素樣肽產(chǎn)物”指的是純化的肽產(chǎn)物，它將用于藥物組合物的生產(chǎn)。因而，通常獲得作為來自最終純化、干燥或整理步驟的產(chǎn)物的胰高血糖素樣肽產(chǎn)物。所述產(chǎn)物可以是晶體、沉淀物、溶液或懸浮液。胰高血糖素樣肽產(chǎn)物作為藥物即活性藥物成分在本領域也是已知的。
如此處使用的術語“等電點”指的是例如多肽的大分子總靜電荷是零時的pH值。多肽中可以有許多帶電基團，在等電點所有這些電荷的總和是零。在高于等電點的pH時，多肽的總靜電荷是負的，而在低于等電點的pH值時，多肽的總靜電荷是正的。
如此處使用的關于組合物的術語“藥物”指的是它用于治療疾病或紊亂的組合物。
如此處使用的術語“制藥可接受的”指的是適合通常的制藥應用，即在患者不會引起副作用等等。
如此處使用的術語“有效量”指的是與不治療相比對病人的治療足夠有效的劑量。
如此處使用的術語“藥物組合物”指的是包含活性化合物或其鹽以及藥物賦形劑例如緩沖劑、防腐劑和可選地張力調(diào)節(jié)劑和/或穩(wěn)定劑的產(chǎn)品。因而，藥物組合物作為藥物制劑在本領域也是已知的。
如此處使用的術語“賦形劑”指的是通常加入到藥物組合物中的化學物質(zhì)，例如緩沖劑、張力劑、防腐劑等等。
如此處使用的術語“疾病的治療”指的是發(fā)生了疾病、病變或紊亂的患者的處理和照顧。治療的目的是與疾病、病變或紊亂搏斗。治療包括活性化合物的給予以消除或控制疾病、病變或紊亂以及減輕與疾病、病變或紊亂關聯(lián)的癥狀或并發(fā)癥。
發(fā)明描述第一個方面本發(fā)明涉及從包含胰高血糖素樣肽和至少一種相關雜質(zhì)的組合物中純化胰高血糖素樣肽的方法，所述方法是反相高效液相色譜方法，其中用于洗脫的溶劑是pH緩沖的，范圍從約pH 4到pH 10，所述溶劑包含濃度從約10％w/w至約80％w/w的醇。
洗脫靶GLP基團和雜質(zhì)，并通過有機溶劑漸進的或線性改變的梯度或等梯度地或其聯(lián)合進行一步分離。有機溶劑組分梯度將從較低到較高濃度。通過改變洗脫部分的pH和/或溫度進行洗脫也是可能的。
平衡溶液和應用的樣品可以含有或不含有有機溶劑。有機溶劑可以是但不限于任何單羥基脂肪醇(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)。色譜純化的任何部分的可選鹽組分可以是任何鹽，包括但不限于NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨等等。能使用任何緩沖組分，包括但不限于檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、TRIS緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、銨鹽緩沖劑、甘氨酸緩沖劑等等。所述方法也可以應用于任何選擇的色譜反相樹脂，可選地有任何種類的取代，包括但不限于基于硅膠的樹脂例如Kromasil100 C18，基于多聚物的樹脂例如來自Amersham Biosciences的Source，來自Applied Biosystems的Poros材料，例如Poros R1、R2和R3反相樹脂，來自Ciphergen的基于陶瓷的樹脂，基于金屬氧化物的樹脂以及其它。優(yōu)選地，使用基于二氧化硅的樹脂。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述溶劑是pH緩沖的，范圍從約pH5至約pH9。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述溶劑是在pH高于所述胰高血糖素樣肽的等電點的pH處pH緩沖的。
本發(fā)明的另一個實施方案中，為了防止洗脫步驟過程中pH從設定點大于+/-1.0pH單位的漂移，所述溶劑是pH緩沖的。
本發(fā)明的另一個實施方案中，為了防止洗脫步驟過程中pH從設定點大于+/-0.5pH單位的漂移，所述溶劑是pH緩沖的。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述醇是乙醇。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述醇是2-丙醇。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述醇選自甲醇、1-丙醇和己二醇。
本發(fā)明的另一個實施方案中，使用基于二氧化硅的色譜樹脂進行反相高效液相色譜方法。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述樹脂是取代的硅膠，例如C4-、C6-、，C8-、C12-、C16-、C18-、C20、苯基或苯取代的硅膠。
本發(fā)明的另一個實施方案中，使用為多聚基質(zhì)材料的色譜樹脂進行反相高效液相色譜方法。
對接近中性pH的胰高血糖素樣肽具有增加的選擇性的RP-HPLC方法優(yōu)選的應用于去除與靶胰高血糖素樣肽具有不同化學或物理結(jié)構(gòu)的相關雜質(zhì)，例如截短的形式，所有種類的延伸形式(額外的氨基酸、多種衍生物等等)、脫酰胺形式、不正確折疊形式、帶有例如唾液酸化的非期望的糖基化形式、氧化形式、消旋造成的形式、肽內(nèi)鏈內(nèi)缺乏氨基酸的形式、肽內(nèi)鏈內(nèi)具有額外氨基酸的形式以及其它。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述相關雜質(zhì)是所述胰高血糖素樣肽的截短形式。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述相關雜質(zhì)是所述胰高血糖素樣肽的糖基化形式。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述溶劑包含濃度從約20％w/w至約60％w/w的醇。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述溶劑包含濃度從約20％w/w至約40％w/w的醇。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物或GLP-1類似物的衍生物。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述GLP-1類似物選自Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8His22-GLP-1(7-37)，Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)，它們的類似物以及這些類似物任一項的衍生物。
本發(fā)明的另一個實施方案中，GLP-1衍生物或GLP-1類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，如一個賴氨酸，其中親脂取代基可選地經(jīng)由間隔基(spacer)附著于所述賴氨酸的ε氨基基團。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述親脂取代基具有8至40個碳原子，優(yōu)選地8至24個碳原子，例如12至18個碳原子。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述間隔基是存在的，并且選自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁?；陌被?。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是DPPIV保護的胰高血糖素樣肽。肽酶DPPIV水解胰高血糖素樣肽，受DPPIV保護的天然形式胰高血糖素樣肽的那些類似物，即在生理條件下具有DPPIV酶較低速率的水解的那些類似物，可以降低胰高血糖素樣肽的清除率。本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是血漿穩(wěn)定的胰高血糖素樣肽。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是GLP-1類似物的衍生物，它們是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷?；?))-GLP-1(7-37)。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是具有25至37個氨基酸殘基的GLP-1肽，優(yōu)選地27至35個氨基酸殘基，甚至更加優(yōu)選地29至33個氨基酸殘基。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是GLP-2、GLP-2類似物、GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物。
本發(fā)明的另一個實施方案中，GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，如一個賴氨酸，其中親脂替代基可選地經(jīng)由間隔基附著于所述賴氨酸的ε氨基基團。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述親脂取代基具有8至40個碳原子，優(yōu)選地8至24個碳原子，例如12至18個碳原子。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述間隔基是存在的，選自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁?；?aminobutyroyl)的氨基酸。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽具有27至39個氨基酸殘基，優(yōu)選地29至37個氨基酸殘基，甚至更加優(yōu)選地31至35個氨基酸殘基。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4、胰高血糖素延長蛋白-4類似物、胰高血糖素延長蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4的類似物ZP-10(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2)。
本發(fā)明的另一實施方案中，胰高血糖素延長蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物是?；蚓垡叶蓟摹?br> 本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是穩(wěn)定的胰高血糖素延長蛋白-4肽。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是DPP-IV保護的胰高血糖素延長蛋白-4肽。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是免疫調(diào)節(jié)的胰高血糖素延長蛋白-4肽。
本發(fā)明的另一個實施方案中，胰高血糖素延長蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，如一個賴氨酸，其中親脂取代基可選地經(jīng)由間隔基附著于所述賴氨酸的ε氨基基團。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述親脂取代基具有8至40個碳原子，優(yōu)選地8至24個碳原子，例如12至18碳原子。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述間隔基是存在的，選自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁?；陌被?。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4肽，它具有30至48個氨基酸殘基，33至45個氨基酸殘基，優(yōu)選地35至43個氨基酸殘基，甚至更加優(yōu)選地37至41個氨基酸殘基。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述GLP-2肽選自K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；以及它們的衍生物。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述GLP-2衍生物選自S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；S7K(3-(十六烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；E9K(3-(十六烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；M10K(3-(十六烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；T12K(3-(十六烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；I13K(3-(十六烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；N16K(3-(十六烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(辛烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(3-(壬烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(癸烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十二烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十三烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十五烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十六烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十九烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(壬烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(癸烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十二烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十三烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十五烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十九烷?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(二十烷?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；A18K(3-(十六烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；D21K(3-(十六烷?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；Q28K(3-(十六烷?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；S5K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D8K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；N11K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；I13K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D15K(3-(十六烷?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(辛烷?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(癸烷?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十三烷?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十五烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十六烷?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十八烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十九烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(二十烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(辛烷?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(壬烷?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(癸烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十一烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十二烷?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十三烷?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十四烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十五烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十六烷?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十八烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十九烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(二十烷?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D21K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；N24K(3-(十六烷?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D3E/S5K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K(3-(十六烷?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十一烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十二烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十三烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十四烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十五烷?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十七烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十八烷?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十九烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(二十烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(辛烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(壬烷?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十一烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十三烷?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十四烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十七烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十八烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十九烷?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(二十烷?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K(3-(十六烷?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K(3-(十六烷?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；andD3E/Q28K(3-(十六烷?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
例如WO 99/43361和WO 00/55119中能夠找到GLP-2、它的類似物以及GLP-2的衍生物的制備方法。
本發(fā)明進一步的實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)的促胰島素類似物，例如Ser2Asp3-胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)，其中位置2和3的氨基酸殘基分別被絲氨酸和天冬氨酸替代(這個特別的類似物作為胰高血糖素延長蛋白-3在本領域也是已知的)。
本發(fā)明進一步的實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4衍生物，其中引入的取代基選自酰胺、碳水化合物、烷基、酯和親脂取代基。胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)促胰島素衍生物及其類似物的實例是Tyr31-胰高血糖素延長蛋白-4(1-31)-酰胺。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是穩(wěn)定的胰高血糖素延長蛋白-4肽。本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是DPP-IV保護的胰高血糖素延長蛋白-4肽。本發(fā)明的另一個實施方案中，所述胰高血糖素樣肽是免疫調(diào)節(jié)的胰高血糖素延長蛋白-4肽。
例如WO 99/43708、WO 00/41546和WO 00/55119中能找到胰高血糖素延長蛋白-4、它的類似物以及胰高血糖素延長蛋白-4衍生物的制備方法。
通過肽合成能夠生產(chǎn)親本胰高血糖素樣肽，例如使用Boc或Fmoc化學的固相肽合成或其它已經(jīng)很好建立的技術。也能夠通過包含如下的方法生產(chǎn)親本胰高血糖素樣肽培養(yǎng)含有編碼所述多肽并能夠在允許所述肽表達的條件下在合適的營養(yǎng)基中表達所述多肽的宿主細胞，之后從培養(yǎng)基中回收得到的肽。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是適合生長宿主細胞的任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基，例如含有合適補充物的最低限度或復合培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)可以從商業(yè)供應商獲得，或者根據(jù)發(fā)表的配方(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的目錄中)進行制備。然后可以通過傳統(tǒng)程序從培養(yǎng)基中回收細胞產(chǎn)生的肽，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細胞，通過例如硫酸銨的鹽沉淀上清或濾液中的蛋白質(zhì)樣組分，根據(jù)所討論的肽的類型通過多種色譜純化，例如離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等等。
編碼所述親本肽的DNA序列合適地可以是基因組或cDNA來源，例如通過制備基因組或cDNA文庫并且依照標準技術(見，例如Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約，1989)通過使用合成寡核苷酸探針的雜交篩選編碼所有或部分所述肽DNA序列。用已經(jīng)建立的標準方法，例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859 1869描述的phosphoamidite方法或者Matthes等人，EMBO Journal 3(1984)，801-805描述的方法也合成性地制備編碼所述肽的DNA序列。例如如US 4,683,202或Saiki等人，Science 239(1988)，487 491描述地也可以通過使用特異性引物的多聚酶鏈式反應制備所述DNA序列。
所述DNA序列可以插入任何載體，這可很方便地用于重組DNA程序，載體的選擇將通常依賴它要引入的宿主細胞。因而，所述載體可以是自主復制的載體，即存在作為染色體外實體存在的載體，它的復制不依賴于染色體的復制，例如質(zhì)粒?；蛘?，所述載體可以是一個載體，當它引入宿主細胞時，它整合進宿主細胞基因組并與它已經(jīng)整合進入的染色體一起復制。
所述載體優(yōu)選地是表達載體，其中編碼所述肽的DNA序列可操作性地連接于所述DNA的轉(zhuǎn)錄需要的額外片段，例如啟動子。所述啟動子可以是所選宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性并且可以來源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)之基因的任何DNA序列。指揮編碼各種宿主細胞中本發(fā)明肽的DNA轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例在本領域是眾所周知的，參考例如Sambrook等人，同上。
如果需要，編碼所述肽的DNA序列可以操作性地連接于合適的終止子、聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄增強子序列和翻譯增強子序列。本發(fā)明的重組載體進一步地可以包含使得載體在正在討論的宿主細胞中復制的DNA序列。
所述載體還包含選擇性標記，例如其產(chǎn)物補足宿主細胞中缺陷的基因或者賦予例如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的藥物耐藥性的基因。
為了將本發(fā)明的親本肽導向宿主細胞的分泌途徑，重組載體中可以提供分泌信號序列(也已知為先導序列、前原序列或前序列)。所述分泌信號序列結(jié)合于編碼正確閱讀框的肽的DNA序列。分泌信號序列通常在編碼所述肽的DNA序列的5’位置。所述分泌信號通常相聯(lián)于所述肽或者來自編碼另一個分泌蛋白質(zhì)的基因。
用于連接編碼本發(fā)明肽的DNA序列、啟動子和可選地終止子和/或分泌信號序列以及將它們插入含有復制所需信息的合適載體中的步驟對于本領域技術人員都是眾所周知的(參考，例如，Sambrook等，同上)。
將DNA序列或重組載體引入的宿主細胞可以是能夠生產(chǎn)本發(fā)明肽的任何細胞，包括細菌、酵母、真菌和更高級的真核細胞。眾所周知并用于本領域的合適宿主細胞的實例是而不限于大腸桿菌、啤酒酵母或哺乳動物BHK或CHO細胞系。
含有純化的根據(jù)本發(fā)明的胰高血糖素樣肽的藥物組合物一般含有多種藥物賦形劑，例如防腐劑、等張劑和表面活性劑。藥物組合物的制備對于技術人員是眾所周知的。為了方便，參考Remington藥學科學和實習，第19版，1995。
含有純化的根據(jù)本發(fā)明的胰高血糖素樣肽的藥物組合物可以胃腸道外給予需要這樣治療的患者。胃腸道外給藥可以通過注射器，可選地筆樣注射器進行皮下注射、肌肉內(nèi)注射或者靜脈注射?；蛘?，給藥可以例如通過輸注泵的輸注進行。
本發(fā)明進一步由下面的實例說明，然而這并不被解釋為限制所保護的范圍。在前面的敘述中和下面的實例中公開的特性分開地或它們?nèi)魏温?lián)合在一起都是實現(xiàn)各種形式的本發(fā)明的材料。
實施例實施例1分析RP-HPLC。在Waters對稱RP-18，3.5μm，100，4.6×150mm柱上進行收集峰的鑒別/驗證的RP-HPLC分析。緩沖液A由7.8％(w/w)乙腈中0.15M(NH4)2SO4，pH 2.5組成，緩沖液B含有63.4％(w/w)乙腈。15分鐘內(nèi)37-44.1％B接著10分鐘內(nèi)44.1-100％B的線性梯度以1ml/min的速率進行。色譜溫度保持在60℃，在214nm進行UV檢測。
實施例2通過例如如WO 98/08871中描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Arg34GLP-1(7-37)。通過傳統(tǒng)反相色譜法純化發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中的Arg34GLP-1(7-37)，隨后是在所述肽等電點pH例如在pH 5.4沉淀。離心分離所述沉淀。
將含有Arg34GLP-1(7-37)和相關雜質(zhì)的等電點沉淀包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)溶于水中，pH調(diào)至3.5。15mL所述溶液(0.91mg/mL)上樣于用40mL 0.15mol/kg硫酸銨、5mmol/kg檸檬酸、25％(w/w)乙醇pH 3.5平衡的20mL 120 C4-取代(二甲基丁基二甲基甲硅烷基)的硅膠樹脂(顆粒大小10μm，YMC)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的35-45％乙醇(0.15mol/kg硫酸銨，5mmol/kg檸檬酸)進行洗脫。
圖1中顯示了制備性純化的色譜圖。從色譜圖能夠觀察到糖基化雜質(zhì)被分離，然而，沒有得到截短形式和靶GLP-1基團之間截然不同的峰或兩者的分離。RP-HPLC分析沒有觀察到Arg34GLP-1(7-37)和Arg34GLP-1(9-37)之間的任何分離。
實施例3如實施例2描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)，用RP-LC捕獲并沉淀。
將含有Arg34GLP-1(7-37)和相關雜質(zhì)的等電點沉淀包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)溶于水中，pH調(diào)至7.5。15mL所述溶液(0.91mg/mL)上樣于用40mL 5mmol/kg磷酸二氫鈉、210mmol/kg乙酸鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.5平衡的20mL 120 C4取代(二甲基丁基二甲基甲硅烷基)的硅膠(顆粒大小10μm，YMC)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的30-40％乙醇(5mol/kg磷酸二氫鈉，210mmol/kg乙酸鈉)進行洗脫。
圖2中顯示了制備性純化的色譜圖。僅僅從色譜圖能夠觀察到糖基化雜質(zhì)被分離，而且，在緩沖液控制色譜溶劑為pH 7.5處得到了截短形式和靶GLP-1基團之間的分離。另外，表1中給出的分離部分的RP-HPLC分析結(jié)果顯示主峰中截短形式Arg34GLP-1(9-37)的含量降低到了可以接受的水平。
表1.實施例3的RP-HPLC分析。如實施例1中描述地進行分析。
通過比較實施例1和2的色譜圖，注意到了中性pH的額外優(yōu)點得到了更高更窄的主峰因而得到了期望的更高的合并濃度。實施例1和2之間設置的非顯著性差異是控制各自色譜運行的pH的不同的緩沖系統(tǒng)以及不同的鹽系統(tǒng)。而且，采用相同的梯度傾斜度，但有不同的乙醇起始濃度以獲得相似的保留。
實施例3通過例如WO 98/08871中描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Arg34GLP-1(7-37)。通過陽離子交換色譜法純化無細胞的發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中的Arg34GLP-1(7-37)，將得到的含有Arg34GLP-1(7-37)合并物的pH調(diào)到9.0。
10mL含有Arg34GLP-1(7-37)(3.49mg/mL)和相關雜質(zhì)的等電點沉淀包括截短雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)的合并物上樣于用40mL含有0.15mol/kg硫酸銨、5mmol/kg檸檬酸、25％(w/w)乙醇pH 3.5的溶劑平衡的20mL 200 C18-取代(十八烷?；谆坠柰榛?的硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的35-45％乙醇(0.15mol/kg硫酸銨，5mmol/kg檸檬酸)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
圖3顯示了制備性純化的色譜圖。糖基化雜質(zhì)被分離，然而沒有適當?shù)叵疵摪蠫LP-1基團因為它纖維粘連在柱上，不可能全部收集。因而，不應當采用低pH結(jié)合高疏水性連接，例如C18。
實施例5
通過例如WO 98/08871中描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Arg34GLP-1(7-37)。通過如實施例4中描述的陽離子交換色譜法捕獲Arg34GLP-1(7-37)。
10mL含有Arg34GLP-1(7-37)(3.49mg/mL)和相關雜質(zhì)的合并物(室溫下pH 8.9)包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)上樣于用40mL含有250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg磷酸二氫鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶劑平衡的20mL 120 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?的硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg磷酸二氫鉀)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
圖4顯示了制備性純化的色譜圖。僅僅從色譜圖能夠觀察到糖基化雜質(zhì)被分離，而且在色譜溶劑緩沖控制的pH 7.5得到了截短形式和靶GLP-1基團之間的分離。
比較實施例4和5的色譜圖顯示只有從中性pH的色譜運行收集到靶GLP-1基團。實施例4和5之間設置的非顯著差別是不同的緩沖系統(tǒng)以控制各自色譜運行的pH以及不同的鹽系統(tǒng)。另外，采用相同的梯度傾斜度，但有不同的乙醇起始濃度以獲得相似的保留。
實施例6如實施例4中描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)并通過陽離子交換色譜捕獲。
51mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.7mg/mL)和相關雜質(zhì)的合并物(在22.5℃ pH 7.45)包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)上樣于用40mL含有250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg磷酸二氫鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶劑平衡的20mL 200 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?的硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg磷酸二氫鉀)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在4℃。
與實施例5中呈現(xiàn)的相似，在這個溫度下獲得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之間的截然不同的峰和它們的分離。該實施例和實施例5之間設置非顯著性差異是不同上樣樣品的使用。
實施例7如實施例4中描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)并通過陽離子交換色譜法捕獲。
51mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.7mg/mL)和相關雜質(zhì)的合并物(pH8.88于24.6℃)包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)上樣于用40mL含有250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg磷酸二氫鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶劑平衡的20mL 200 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?的硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的25-35％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg磷酸二氫鉀)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在50℃。
與實施例5中呈現(xiàn)的相似，在這個溫度下獲得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之間截然不同的峰和它們的分離。該實施例和實施例5之間設置的非顯著性差異是不同上樣樣品的使用。
實施例8如實施例4中描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)并通過陽離子交換色譜法捕獲。
51mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.7mg/mL)和相關雜質(zhì)的合并物(pH8.89于20.9℃)包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)上樣于用40mL含有250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg磷酸二氫鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶劑平衡的20mL 120 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?的硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg磷酸二氫鉀)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
圖5顯示了制備性純化的色譜圖。僅僅從色譜圖能夠觀察到糖基化雜質(zhì)被分離，而且緩沖液控制色譜溶劑的pH 7.5得到了截短形式和靶GLP-1基團之間的分離。實際上，用120材料比用如實施例5中描述的200材料得到了Arg34GLP-1(7-37)峰和包括Arg34GLP-1(9-37)的周圍峰之間更高的分辨。該實施例和實施例5之間設置的非顯著性差異是不同上樣樣品的使用。
實施例9如實施例4中描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)并通過陽離子交換色譜法捕獲。
63mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.6mg/mL)和相關雜質(zhì)的合并物包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)(pH 8.84于22.1℃)上樣于用40mL含有250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg磷酸二氫鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.0的溶劑平衡的20mL 120 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?的硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg磷酸二氫鉀)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
與實施例8中呈現(xiàn)的相似，在這個pH下獲得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之間截然不同的峰和它們的分離。該實施例和實施例8之間設置的非顯著性差異是不同上樣樣品的使用。
實施例10如實施例4中描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)并通過陽離子交換色譜捕獲。
如實施例9中描述的進行純化，但是溶劑的pH是8.0。
與實施例8中呈現(xiàn)的相似，在這個pH下獲得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之間截然不同的峰和它們的分離。該實施例和實施例8之間設置的非顯著性差異是不同上樣樣品的使用。
實施例11如實施例2中描述地在酵母中表達Arg34GLP-1(7-37)，通過RP-LC捕獲并沉淀。
將含有Arg34GLP-1(7-37)和相關雜質(zhì)的的等電點沉淀包括截短的雜質(zhì)Arg34GLP-1(9-37)溶于水中，pH調(diào)到7.5。15mL所述溶液(0.91mg/mL)上樣于用40mL 210mmol/kg乙酸鉀、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶劑平衡的20mL 120 C4-取代(二甲基丁基二甲基甲硅烷基)的硅膠(顆粒大小10μm，YMC)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的30-40％乙醇(210mmol/kg乙酸鉀)進行洗脫，就是說在沒有所用pH下緩沖物質(zhì)的系統(tǒng)中洗脫。
圖6顯示了制備性純化的色譜圖。僅僅從色譜圖能夠觀察到糖基化雜質(zhì)被分離，然而，沒有獲得截短形式和靶GLP-1基團之間截然不同的峰或它們的分離。
比較實施例3和11的色譜圖顯示如果緩沖物質(zhì)控制了pH，那么在pH 7.5靶GLP-1基團可以與截短的雜質(zhì)分開，因而，在沒有緩沖物質(zhì)控制pH的中性pH下進行分離降低了系統(tǒng)的分離效率。實施例3和11之間的設置中沒有其它的不同。
實施例12通過例如別處(WO 98/08871)描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Arg34GLP-1(7-37)。通過反相色譜用pH 9.0的甘氨酸緩沖液洗脫來純化發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中的Arg34GLP-1(7-37)。
33mLpH 7.5的洗脫物(1.1mg/mL)上樣于用40mL 25％乙醇、250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg檸檬酸鈉pH 6.75平衡的20mL Source 15RPC(Amersham Pharmacia Biotech)聚苯乙烯/二乙烯苯(顆粒大小15μm)柱。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL過程中用線性梯度的35-45％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg檸檬酸鈉)pH 6.75進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
獲得了Arg34GLP-1(7-37)和所述肽糖基化形式之間截然不同的峰和它們的分離。
實施例13通過例如別處(WO 98/08871)描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Arg34GLP-1(7-37)。通過反相色譜用pH 9.0的甘氨酸緩沖液洗脫來純化發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中的Arg34GLP-1(7-37)。
4.6mL所述溶液(1.1mg/mL)上樣于用6mL 25％乙醇、250mmol/kg氯化鉀、5mmol/kg NaH2PO4，pH 7.5平衡的3mL RPC PolyBio(BioSepra)(顆粒大小15μm)柱。用1.5mL平衡溶液清洗所述柱，在36mL過程中用線性梯度的35-45％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg NaH2PO4)pH 7.5進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
獲得了Arg34GLP-1(7-37)和所述肽糖基化形式之間截然不同的峰和它們的分離。
實施例14通過例如別處(WO 98/08871)描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Arg34GLP-1(7-37)。通過傳統(tǒng)的反相色譜純化發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中的Arg34GLP-1(7-37)，隨后在所述肽的等電點pH，即在pH 5.4，沉淀。離心分離所述沉淀物。
30g等電點沉淀物溶于1.5L水中。pH調(diào)至8.37。220mL所述溶液的合并物調(diào)到約pH 3.5，上樣到用45％(w/w)乙醇、20mmol/Kg檸檬酸、75mol/kg氯化鉀pH 3.5平衡的78mL Source 30S(AmershamPharmacia Biotech)柱。用160mL 45％(w/w)乙醇、20mol/kg檸檬酸、87.5mol/kg氯化鉀，pH 3.5清洗所述柱，用400mL 200mmol/kg甘氨酸，pH 9.0洗脫Arg34GLP-1(7-37)。合并洗脫物。
將160mL CIEC-合并物(1.8mg/mL)調(diào)到pH 7.5，上樣于用160mL含有250mmol/kg氯化鈉、5mmol/kg磷酸二氫鈉、25％(w/w)乙醇pH 7.0的溶劑平衡的78mL 120 C18取代(OdDMeSi)的硅膠(顆粒大小15μm)。用40mL平衡溶液清洗所述柱，在936mL過程中用線性梯度的28-38％乙醇(250mmol/kg氯化鈉，5mmol/kg磷酸二氫鉀)進行洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
獲得了Arg34GLP-1(7-37)和所述肽糖基化形式之間截然不同的峰和它們的分離。
實施例14和5之間設置的非顯著性差異是更高的上樣量、不同的上樣樣品、不同的鹽和緩沖系統(tǒng)以及更大的規(guī)模。
實施例15如WO 00/55119中描述地通過?；饔脧挠H本肽Arg34GLP-1(7-37)制備Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷?；?)GLP-1(7-37)。
Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷?；?)GLP-1(7-37)上樣于用40mL25％ w/w乙醇平衡的20mL C18取代(十六烷?；谆坠柰榛?硅膠(顆粒大小15μm)。用10mL 25％ w/w乙醇、250mmol/kg氯化鉀、20mmol/kg Bis-tris丙烷，pH 6.5清洗所述柱，在480mL過程中用線性梯度的37-47.5％乙醇(250mmol/kg氯化鉀，5mmol/kg Bis-Tris丙烷，pH 6.5)洗脫Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)。整個運行過程中溫度保持在50℃。
獲得了Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷?；?GLP-1(7-37)和未酰化以及二?；问街g截然不同的峰和它們的分離，而且，未鑒定的相關雜質(zhì)分離在后側(cè)。
實施例16通過例如WO 98/08871中描述的傳統(tǒng)重組DNA技術在酵母(啤酒酵母)中表達Lys17Arg30GLP-2(1-33)。用RP-LC捕獲Lys17Arg30GLP-2(1-33)，在Lys17Arg30GLP-2(1-33)等電點pH(pH 4.0)沉淀。羥磷灰石柱上進一步純化所述肽，用100mmol/kg磷酸二氫鉀，pH 7.8洗脫。通過陰離子交換色譜在pH 8純化捕獲合并物。
得自陰離子交換步驟的合并物上樣于用25％(w/w)乙醇、10mmol/kg磷酸二氫鈉、250mmol/kg氯化鈉pH 7.5平衡的4L 100C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅膠(顆粒大小15μm)。用7.8L 25％乙醇(10mmol/kg磷酸二氫鈉、250mmol/kg氯化鉀，pH 7.5)接著23.6L 34％乙醇(10mmol/kg磷酸二氫鈉，250mmol/kg氯化鉀，pH 7.5)清洗所述柱，在78.6L過程中用線性梯度的34-40％乙醇(10mmol/kg磷酸二氫鈉，250mmol/kg氯化鉀，pH 7.5)進行Lys17Arg30GLP-2(1-33)的洗脫。整個運行過程中溫度保持在23℃。
獲得了Lys17Arg30GLP-2(1-33)和所述肽中位氧化形式之間截然不同的峰和它們的分離。而且，Lys17Arg30GLP-2(1-33)與截短的雜質(zhì)(去His-Ala Lys17Arg30GLP-2(1-33))分開。
實施例17如WO 00/55119中描述地通過?；饔脧挠H本肽Lys17Arg30GLP-2(1-33)制備Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)。
Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)上樣于用12L40％w/w乙醇、10mmol/kg磷酸二氫鈉、250mmol/kg氯化鉀，pH 7.5平衡的4L 100 C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅膠(顆粒大小15μm)。用4L平衡溶劑和4L 43％ w/w乙醇、10mmol/kg磷酸二氫鈉、227mmol/kg氯化鈉，pH 7.5清洗所述柱。在120L過程中用線性梯度的45-60％w/w乙醇(211-94mmol/kg氯化鉀、10mmol/kg磷酸二氫鈉，pH 7.5)洗脫Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)。整個運行過程中溫度保持在23℃。
獲得了Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷?；?)GLP-2(1-33)和非?；问揭约捌渌嚓P雜質(zhì)之間截然不同的峰和它們的分離。
實施例18通過使用Fmoc化學的標準固相合成法合成胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)(帶有氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)和胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)(帶有氨基酸序列GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)。
含有相關雜質(zhì)胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)的胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，總濃度1mg肽/mL。6mL所述溶液上樣于用15.7mL含有25％ w/w乙醇、0.069％ w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 4.02的溶劑平衡的含有120 C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅膠(顆粒大小15μm)的7.85mL柱。用3.9ml平衡溶液洗柱。用157mL(20CV)過程中等溶劑梯度的36％w/w乙醇接著23.6mL(3CV)0.069％w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH4.02中線性梯度的36％至39％乙醇進行洗脫。隨后，通過7.85mL(1CV)都維持pH 4.02的0.069％w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀中不連續(xù)梯度(step gradient)至59％乙醇進行洗脫。室溫下進行實驗。
獲得了胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)之間截然不同的峰和它們的分離，胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)洗脫在胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)之前。
實施例19通過使用Fmoc化學的標準固相合成法合成胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)。
將含有相關雜質(zhì)胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)的胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，總濃度1mg肽/mL。8mL所述溶液上樣于用15.7mL含有25％ w/w乙醇、0.069％ w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 3.5的溶劑平衡的含有120 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?硅膠(顆粒大小15μm)的7.85mL柱。用3.9mL平衡溶液清洗所述柱。用110mL(14CV)過程中等溶劑梯度的37％w/w乙醇接著24mL(3CV)0.069％w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 3.5中線性梯度的37％至39％乙醇進行洗脫。隨后，通過71mL(9CV)過程中0.069％w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 4.02中線性梯度至59％的乙醇進行洗脫。室溫下進行實驗。
獲得了胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)之間截然不同的峰和它們的分離，胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)洗脫在胰高血糖素延長蛋白-4(2-39)之前。
實施例20通過使用Fmoc化學的標準固相合成法合成L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)(帶有氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)。
將含有相關雜質(zhì)D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)的L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，總濃度1mg肽/mL。8mL所述溶液上樣于用15.7mL含有25％ w/w乙醇、0.069％ w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 3.5的溶劑平衡的含有120 C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅膠(顆粒大小15μm)的7.85mL柱。用63mL(8CV)過程中等溶劑梯度的37％乙醇接著24mL(3CV)0.069％w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 3.5中線性梯度的37％至39％乙醇進行洗脫。隨后，通過71mL(9CV)過程中0.069％w/w磷酸二氫鈉一水合物、2.06％w/w乙酸鉀，pH 3.5中線性梯度至59％乙醇進行洗脫。室溫下進行實驗。
獲得了L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)之間的分離，并通過保留時間分析證實，D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)洗脫在L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)之前。
實施例21通過使用Fmoc化學的標準固相合成法合成L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)。
將含有相關雜質(zhì)D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)的L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，總濃度1mg肽/mL。8mL所述溶液上樣于用15.7mL含有25％ w/w乙醇、0.13％ w/w MES、2.06％w/w乙酸鉀，pH 6.7的溶劑平衡的含有120 C18取代(十八烷?；谆坠柰榛?硅膠(顆粒大小15μm)的7.85mL柱。用3.9mL平衡溶液清洗柱。用157mL(20CV)過程中等溶劑梯度的34％乙醇接著24mL(3CV)0.13％w/w MES、2.06％w/w乙酸鉀，pH 6.7中線性梯度的34％至39％乙醇進行洗脫。隨后，通過7.85mL(1CV)過程維持pH 6.7的0.13％w/w MES、2.06％w/w乙酸鉀中不連續(xù)梯度至59％的乙醇進行洗脫。室溫下進行實驗。
獲得了L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)之間的分離，并通過保留時間分析證實，D-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)洗脫在L-His1胰高血糖素延長蛋白-4(1-39)之前。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>胰高血糖素樣肽的純化<130>6643.000-DK<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>PRT<213>人<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>2<211>33<212>PRT<213>人<400>2His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30Asp<210>3<211>39<212>PRT<213>Glia monster<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)<223>位置39的絲氨酸被酰胺化<400>3His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>4<211>39<212>PRT<213>Gila monster<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>位置39的絲氨酸被酰胺化<400>4His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>5<211>37<212>PRT<213>人<400>5His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr Lys Arg Asn20 25 30Lys Asn Asn Ile Ala35<210>6<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(44)..(44)<223>位置44的賴氨酸被酰胺化<400>6His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys35 40<210>7<211>33<212>PRT<213>合成構(gòu)建體<400>7His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30Asp
權(quán)利要求
1.從包含胰高血糖素樣肽和至少一種相關雜質(zhì)的組合物中純化所述胰高血糖素樣肽的方法，所述方法是反相高效液相色譜方法，其中用于洗脫的溶劑是pH緩沖的，范圍從約pH4至約pH10，所述溶劑包含濃度從約10％w/w至約80％w/w的醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溶劑是pH緩沖的，范圍從約pH5至約pH9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溶劑是在高于所述胰高血糖素樣肽等電點的pH處pH緩沖的。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述溶劑是pH緩沖的，從而防止洗脫步驟中pH從設置點大于+/-1.0pH單位的pH漂移。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述溶劑是pH緩沖的，從而防止洗脫步驟中pH從設置點大于+/-0.5pH單位的pH漂移。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述醇是乙醇。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述醇是2-丙醇。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述醇選自甲醇、1-丙醇和己二醇。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中使用基于二氧化硅的色譜樹脂進行所述反相高效液相色譜方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述樹脂是取代的硅膠，例如C4-、C6-、C8-、C12-、C16-、C18-、C20-、苯基或苯取代的硅膠。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的方法，其中使用為多聚基質(zhì)材料的色譜樹脂進行所述反相高效液相色譜方法。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述相關雜質(zhì)是所述胰高血糖素樣肽的截短形式。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述相關雜質(zhì)是所述胰高血糖素樣肽的糖基化形式。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述溶劑包含濃度從約20％w/w至約60％w/w的醇。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述溶劑包含濃度從約20％w/w至約40％w/w的醇。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物或GLP-1類似物的衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述GLP-1類似物選自Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8His22-GLP-1(7-37)，Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)，它們的類似物和任何這些類似物的衍生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，如一個賴氨酸，其中親脂取代基可選地經(jīng)由間隔基連接于所述賴氨酸的ε-氨基基團。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述親脂取代基具有8至40個碳原子，優(yōu)選地8至24個碳原子，例如12至18個碳原子。
20.根據(jù)權(quán)利要求18-19任一項的方法，其中存在所述間隔基，其為選自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
21.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是DPPIV保護的胰高血糖素樣肽。
22.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是血漿穩(wěn)定的胰高血糖素樣肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述GLP-1類似物的衍生物是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷?；?))-GLP-1(7-37)。
24.根據(jù)權(quán)利要求16-23任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽具有25至37個氨基酸殘基，優(yōu)選地27至35個氨基酸殘基，甚至更加優(yōu)選地29至33個氨基酸殘基。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是GLP-2、GLP-2類似物、GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，如一個賴氨酸，其中親脂取代基可選地經(jīng)由間隔基連接于所述賴氨酸的ε-氨基基團。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述親脂取代基具有8至40個碳原子，優(yōu)選地8至24個碳原子，例如12至18個碳原子。
28.根據(jù)權(quán)利要求26-27任一項的方法，其中存在所述間隔基，其為選自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽具有27至39個氨基酸殘基，優(yōu)選地29至37個氨基酸殘基，甚至更加優(yōu)選地31至35個氨基酸殘基。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4、胰高血糖素延長蛋白-4類似物、胰高血糖素延長蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是胰高血糖素延長蛋白-4。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述胰高血糖素樣肽是ZP-10，即HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述胰高血糖素延長蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物是?；幕蚓垡叶蓟摹?br> 35.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述胰高血糖素延長蛋白-4衍生物或胰高血糖素延長蛋白-4類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，如一個賴氨酸，其中親脂取代基可選地經(jīng)由間隔基連接于所述賴氨酸的ε-氨基基團。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述親脂取代基具有8至40個碳原子，優(yōu)選地從8至24個碳原子，例如12至18個碳原子。
37.根據(jù)權(quán)利要求35-36任一項的方法，其中存在所述間隔基，其為選自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
38.通過包括如下步驟的方法生產(chǎn)的胰高血糖素樣肽產(chǎn)物a)使用根據(jù)權(quán)利要求1-37任一項的方法純化胰高血糖素樣肽，以及b)分離所述胰高血糖素樣肽以產(chǎn)生所得多肽產(chǎn)物。
39.通過包括如下步驟的方法制備的藥物組合物a)首先使用根據(jù)權(quán)利要求1-37任一項的方法純化胰高血糖素樣肽或其前體，b)然后干燥所述胰高血糖素樣肽，以及c)最后與制藥可接受的賦形劑混合。
40.治療高血糖癥的方法，包含有效量根據(jù)權(quán)利要求39的藥物組合物的胃腸道外施用，其中所述胰高血糖素樣肽是GLP-1肽。
41.治療短腸綜合征的方法，包含有效量根據(jù)權(quán)利要求39的藥物組合物的胃腸道外施用，其中所述胰高血糖素樣肽是GLP-2肽。
全文摘要
通過反相高效液相色譜法純化胰高血糖素樣肽的方法。
文檔編號A61K38/26GK1839155SQ200480024089
公開日2006年9月27日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月21日
發(fā)明者A·斯塔比, C·科恩貝克, D·L·丁維博, H·克里斯坦森, O·施歐 申請人:諾沃挪第克公司