專利名稱：單細(xì)胞蛋白材料的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單細(xì)胞蛋白材料(SCP)的用途。該SCP材料降低血漿中膽固醇的濃度，并降低肝中的甘油三酸酯。SCP還誘導(dǎo)脂肪酸模式的有利變化，并降低血漿中高半胱氨酸地濃度。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及SCP作為抗動脈粥樣硬化和心臟保護(hù)劑的用途，或者以藥物或者以功能食品給出。而且，本發(fā)明涉及該SCP材料作為營養(yǎng)組合物的用途。
背景技術(shù)：
最近，對新蛋白源的開發(fā)特別關(guān)注，它們可以加入到食品中用于人和/或動物消費(fèi)。已提出許多不同含蛋白質(zhì)的材料在人類食品中作為較傳統(tǒng)蛋白源，例如魚肉、大豆制品和血漿的替代品，或者作為動物飼料。這些材料包括單細(xì)胞微生物例如含有大量蛋白質(zhì)的真菌、酵母和細(xì)菌。這些可以通過單細(xì)胞繁殖生長，并且已經(jīng)開發(fā)出幾種生物合成方法用于在烴或其它底物上通過生長單細(xì)胞微生物來制備蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在，最廣泛使用的含蛋白質(zhì)的微生物(本文也簡稱為“單細(xì)胞蛋白”)是得自真菌或酵母的微生物。單細(xì)胞蛋白材料可以直接用于食品，例如作為噴霧干燥的產(chǎn)品。
WO01/60974公開了一種賦予單細(xì)胞材料功能性質(zhì)的方法。所述產(chǎn)品可以用作膠凝劑或乳化劑。
本發(fā)明者已顯示本發(fā)明的單細(xì)胞蛋白材料具有幾種有益的生物學(xué)作用，并且這種材料可以用作藥物或功能食品。
我們顯示，單細(xì)胞蛋白材料降低血漿膽固醇和高半胱氨酸的濃度，并且還降低肝三酰甘油的濃度?；谶@些發(fā)現(xiàn)，預(yù)料該單細(xì)胞材料對狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病、血栓形成、心肌梗塞、中風(fēng)和脂肪肝將具有預(yù)防和/或治療作用。用單細(xì)胞蛋白材料治療代表了治療這些疾病的一種新方法。
單細(xì)胞生物例如細(xì)菌由許多極小的細(xì)胞組成，這些細(xì)胞各自含有包封在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)。
方便地，單細(xì)胞材料可以通過發(fā)酵法生產(chǎn)，其中將氧和合適的底物例如液態(tài)或氣態(tài)烴、醇或碳水化合物，例如甲烷、甲醇或天然氣，與營養(yǎng)礦物溶液一起加入到含有微生物的管狀反應(yīng)器中。大量的這類方法在本領(lǐng)域?yàn)楣⑶颐枋鲞^。
用于本發(fā)明特別優(yōu)選的是由對烴部分或者天然氣發(fā)酵獲得的單細(xì)胞蛋白材料。尤其優(yōu)選的是由天然氣發(fā)酵獲得的單細(xì)胞蛋白。隨著發(fā)酵罐內(nèi)微生物的濃度增加，將一部分反應(yīng)器內(nèi)容物或肉湯抽出并且可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)，例如離心和/或超濾分離微生物。方便地，在這種發(fā)酵方法中，將從發(fā)酵罐中連續(xù)取出肉湯并且它將具有1-5％重量，例如約3％重量的細(xì)胞濃度。
根據(jù)本發(fā)明可以使用由兩種或更多種微生物生產(chǎn)的單細(xì)胞材料。盡管這些可以在相同或者分開的發(fā)酵罐中生產(chǎn)，但是通常這些將在相同發(fā)酵罐中于相同發(fā)酵條件下生產(chǎn)。由單獨(dú)的發(fā)酵過程生產(chǎn)的材料可以混合在一起然后均化。
用于本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)菌包括莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)(Bath)，是最初從Bath，England的溫泉中分離的一種嗜熱菌，可從Norferm Danmark AS，Odense，Denmark獲得。莢膜甲基球菌(Bath)在約45℃下生長最好，盡管在37℃-52℃之間也可以生長。它是革蘭氏陰性的、非運(yùn)動性球形細(xì)胞，通常成對出現(xiàn)。胞內(nèi)膜以I型甲烷營養(yǎng)菌的泡狀復(fù)盤特性的束排列。莢膜甲基球菌(Bath)在遺傳上是非常穩(wěn)定的生物，沒有已知的質(zhì)粒。它可以利用甲烷或甲醇生長并利用氨、硝酸鹽或分子氮作為蛋白質(zhì)合成的氮源。
適用于本發(fā)明的其它細(xì)菌包括異養(yǎng)菌Alcaligenes acidovoransDB3、堅(jiān)硬芽孢桿菌(Bacillus firmus)DB5和短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)DB4，它們各自在約45℃的溫度下生長最好。這些菌株可以從Norferm Danmark AS，Odense，Denmark獲得。
A.acidovorans DB3是一種革蘭氏陰性的、需氧的、運(yùn)動桿菌，屬于假單胞菌科，它可以使用乙醇、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽用于生長。短芽孢桿菌DB4是一種革蘭氏陰性的、形成內(nèi)生孢子的、需氧桿菌，屬于芽孢桿菌屬，它可以利用乙酸鹽、D-果糖、D-甘露糖、核糖和D-塔格糖。堅(jiān)硬芽孢桿菌DB5是一種革蘭氏陰性的、形成內(nèi)生孢子的、運(yùn)動性、芽孢桿菌屬的需氧桿菌，它可以利用乙酸鹽、N-乙?；?葡糖胺、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、D-葡萄糖、甘油和甘露醇。
適用于本發(fā)明的方法的酵母可以選自酵母屬(Saccharomyces)和念珠菌屬(Candida)。使用天然氣作為唯一碳和能源的發(fā)酵方法的一個(gè)實(shí)例是描述在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)中的方法。該方法基于在甲烷上生長的甲烷營養(yǎng)菌莢膜甲基球菌的連續(xù)發(fā)酵。使用空氣或純氧氣氧合并使用氨作為氮源。除了這些底物之外，細(xì)菌培養(yǎng)物典型地將還需要水、磷酸鹽(例如以磷酸的形式)和幾種礦物質(zhì)，它可以包括鎂、鈣、鉀、鐵、銅、鋅、錳、鎳、鈷和鉬，通常以硫酸鹽、氯化物或硝酸鹽的形式使用。所有在用于制備單細(xì)胞材料的礦物質(zhì)應(yīng)屬于食品級質(zhì)量。
天然氣主要由甲烷組成，盡管其組成將隨不同的氣田而變化。通常，可以預(yù)料到天然氣含有約90％甲烷、約5％乙烷、約2％丙烷和一些高級烴。在天然氣的發(fā)酵過程中，甲烷被甲烷營養(yǎng)菌氧化成生物質(zhì)和二氧化碳。甲醇、甲醛和甲酸是代謝中間體。甲醛以及一定程度的二氧化碳被同化成生物質(zhì)。然而，甲烷營養(yǎng)菌不能使用包括碳-碳鍵的底物用于生長，并且天然氣的剩余組分，即乙烷、丙烷和一定程度的高級烴，被甲烷營養(yǎng)菌氧化產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸(例如乙烷被氧化成乙酸)。這些產(chǎn)物會抑制甲烷營養(yǎng)菌，因此在制備生物質(zhì)期間它們的濃度保持低，優(yōu)選低于50mg/l是重要的。解決這一問題的一個(gè)方案是組合使用一種或多種異養(yǎng)菌，它們能夠利用甲烷營養(yǎng)菌產(chǎn)生的代謝物。
這樣的細(xì)菌也能夠利用經(jīng)細(xì)胞溶解釋放到發(fā)酵肉湯中的有機(jī)材料。為了避免形成泡沫這是重要的，并且也用于使被不希望的細(xì)菌污染的培養(yǎng)的危險(xiǎn)性最小化。甲烷營養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌的組合獲得穩(wěn)定且高產(chǎn)率的培養(yǎng)。
在制備單細(xì)胞材料過程中，通常將發(fā)酵混合物的pH調(diào)整至約6-7，例如調(diào)整至6.5±0.3。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇調(diào)節(jié)pH的合適的酸/堿。在這一點(diǎn)上特別適用的是氫氧化鈉和硫酸。發(fā)酵期間發(fā)酵罐內(nèi)的溫度應(yīng)優(yōu)選保持在40℃-50℃的范圍內(nèi)，最優(yōu)選45℃±2℃。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明的是包括如下細(xì)菌的組合的微生物培養(yǎng)物甲烷營養(yǎng)菌莢膜甲基球菌(Bath)、和異養(yǎng)菌Alcaligenes acidovoransDB3和堅(jiān)硬芽孢桿菌DB5，任選組合有短芽孢桿菌DB4(所有菌株都可以從Norferm Danmark AS，Odense，Denmark獲得)。A.acidovorans DB3的作用是利用由莢膜甲基球菌(Bath)從天然氣中的乙烷和丙烷產(chǎn)生的乙酸鹽和丙酸鹽。A.acidovorans DB3可以占所得生物質(zhì)的總細(xì)胞數(shù)的至多10％，例如約6-8％。短芽孢桿菌DB4和堅(jiān)硬芽孢桿菌DB5的作用是利用培養(yǎng)基中的溶解產(chǎn)物和代謝物。通常，在連續(xù)培養(yǎng)期間短芽孢桿菌DB4和堅(jiān)硬芽孢桿菌DB5將各自占細(xì)胞數(shù)的不到1％。
用于制備單細(xì)胞材料的合適發(fā)酵罐為環(huán)狀發(fā)酵罐，例如DanskBioprotein的DK 1404/92、EP-A-418187和EP-A-306466中所述的發(fā)酵罐，或者氣升式反應(yīng)器。優(yōu)選的反應(yīng)器描述在申請人的PCT申請WO 03/016460中，將其加入本文作為參考。具有靜態(tài)混合器的環(huán)狀發(fā)酵罐由于發(fā)酵罐的活塞式流動特性而能夠高度利用氣體(例如至多95％)。沿環(huán)在幾個(gè)位置引入氣體并且保持與液體接觸直到在環(huán)末端將它們分離到頭部空間中?？梢允褂?-3％生物質(zhì)(以干重為基礎(chǔ))和0.02-0.50h-1，例如0.05-0.25h-1的稀釋速率實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵。
可以使用其它發(fā)酵罐制備單細(xì)胞材料，它們包括管狀發(fā)酵罐和攪拌槽發(fā)酵罐。
理想地，通過發(fā)酵天然氣制得的生物質(zhì)或單細(xì)胞材料，將包括60-80％重量粗蛋白；5-20％重量粗脂肪；3-10％重量灰分；3-15％重量核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg磷；至多350mg/kg鐵；和至多120mg/kg銅。特別優(yōu)選，生物質(zhì)將包括68-73％，例如約70％重量粗蛋白；9-11％，例如約10％重量粗脂肪；5-10％，例如約7％重量灰分；8-12％，例如約10％重量核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg磷；至多310mg/kg鐵；和至多110mg/kg銅。優(yōu)選，蛋白質(zhì)內(nèi)容物中氨基酸圖譜應(yīng)在營養(yǎng)上有利地具有高比例的較重要的氨基酸半胱氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸和精氨酸。通常它們分別可以約0.7％、3.1％、5.2％、7.2％、2.5％和6.9％的量存在(以氨基酸的總量的百分?jǐn)?shù)表示)。通常脂肪酸主要包括飽和棕櫚酸(約50％)和單不飽和的棕櫚油酸(約36％)。產(chǎn)物中礦物質(zhì)含量通常將包括大量的磷(約1.5％重量)、鉀(約0.8％重量)和鎂(約0.2％重量)。
通常，由連續(xù)發(fā)酵法獲得的單細(xì)胞蛋白材料將經(jīng)過離心和過濾，例如超濾，除去存在的大多數(shù)水并形成含水糊劑或漿的過程。離心期間生物質(zhì)的干物質(zhì)含量通常從約2％重量增加至約15％重量，例如增加至約12％重量。超濾，可以在40-50℃，例如42-46℃之間的溫度下進(jìn)行，將生物質(zhì)進(jìn)一步濃縮至含有10-30％，優(yōu)選15-25％，例如15-22％重量單細(xì)胞材料的產(chǎn)物。超濾期間使用的尺寸排除通常在約100,000道爾頓的范圍內(nèi)。
超濾之后可以將生物質(zhì)冷卻，優(yōu)選冷卻至10-30℃，例如至約15℃的溫度，例如將濃縮蛋白漿從超濾裝置通過熱交換器，之后將其保持在緩沖罐中于恒溫下，例如在10-20℃，更優(yōu)選5-15℃的溫度下并在5.5-6.5的范圍內(nèi)的pH下持續(xù)1-24小時(shí)，優(yōu)選5-15小時(shí)，例如5-12小時(shí)。任選，可以將單細(xì)胞蛋白材料滅菌。
另外，可以任選將單細(xì)胞材料均化以便將細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破碎。該均化可以任意常規(guī)方式進(jìn)行，但是可以在常規(guī)高壓均化機(jī)中進(jìn)行，其中細(xì)胞可以通過首先加壓，例如直到150MPa(1500bar)的壓力，然后將均化機(jī)內(nèi)部減壓而破碎。優(yōu)選，施加到生物質(zhì)的總壓降將在40MPa-120MPa(400-1200bar)的范圍內(nèi)，例如約80MPa(800bar)。壓降可以分步，即它可以包括一個(gè)或多個(gè)步驟，盡管通常它將包括一個(gè)或兩個(gè)步驟，優(yōu)選單一步驟。在以兩步法進(jìn)行均化的情況下優(yōu)選第二步的壓降應(yīng)低于均化機(jī)中總壓降的1/5，優(yōu)選低于1/10，例如約1/20。均化期間材料的溫度應(yīng)優(yōu)選不超過50℃。均化步驟詳細(xì)描述在申請人的PCT申請WO 01/60974，將其加入本文作為參考。
本文所述的均化步驟能夠制備包含，優(yōu)選基本上由粉碎的細(xì)胞材料組成的產(chǎn)物。例如，破碎的細(xì)胞材料將以至少80％，優(yōu)選至少90％重量的量存在。典型地，產(chǎn)物將是含有可溶性和微粒細(xì)胞組分的相對粘的漿液。盡管它可以直接用作食品的添加劑或者作為藥品，然而經(jīng)常將其進(jìn)一步加工以從產(chǎn)物中除去過量水。任何其它干燥步驟的選擇將取決于均化之后產(chǎn)物的水含量和最終產(chǎn)物的所需水分含量。
典型地，產(chǎn)物將進(jìn)一步根據(jù)本領(lǐng)域公知的噴霧干燥技術(shù)加工。可以使用任意有或者沒有流化床裝置的常規(guī)噴霧干燥器，例如3-SPD型噴霧干燥器，可從APV Anhydro，Denmark獲得。優(yōu)選噴霧干燥器的空氣的入口溫度可以是約300℃，出口溫度可以是約90℃。優(yōu)選最終產(chǎn)物將具有約2-10％重量，例如6-8％重量的水含量。所得產(chǎn)物通常將具有0.1-0.5mm的粒徑。
特別優(yōu)選，均質(zhì)步驟之后即刻進(jìn)行噴霧干燥?；蛘?，可能必需，或者真正需要，將均化產(chǎn)物貯藏或者保存在，例如貯藏或緩沖罐中，然后進(jìn)一步加工。在這樣的情況下，已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的貯藏條件可以減少噴霧干燥之后最終產(chǎn)物的膠凝性能。均化材料的膠凝性能可以通過將其貯藏在低于20℃和pH＜7，優(yōu)選＜6.5，特別優(yōu)選pH在5.5-6.5，例如5.8-6.5的范圍內(nèi)來保持。在這些條件下，產(chǎn)物可以貯藏直到24小時(shí)，膠凝性能沒有任何實(shí)質(zhì)損失。
我們已發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞材料具有幾個(gè)有益的生物學(xué)作用，例如降低血漿和肝中膽固醇的濃度的能力。該材料還增加線粒體β-氧化。因此本發(fā)明的單細(xì)胞材料可以用作藥物組合物。
而且，單細(xì)胞材料特別適用于作為食品中的功能組分，特別是當(dāng)用作動物飼料和寵物食品中的天然血漿的代用品時(shí)。當(dāng)用于寵物食品時(shí)，可以將其它成分例如脂肪、糖、鹽、調(diào)味劑、礦物質(zhì)等加入到該產(chǎn)物中。然后將產(chǎn)物成型為在外觀和質(zhì)地上類似天然肉塊的大塊。本發(fā)明的產(chǎn)品還具有它易于配制成含有必需營養(yǎng)素，易于被動物消化并且對動物可口的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種單細(xì)胞蛋白材料，它用于制備治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化、冠心病、狹窄、血栓形成、心肌梗塞、中風(fēng)和脂肪肝的藥物或營養(yǎng)制品。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)清楚地顯示，本發(fā)明的SCP材料降低血漿中高半胱氨酸的濃度。高半胱氨酸是疾病例如動脈粥樣硬化、冠心病、狹窄、血栓形成、心肌梗塞和中風(fēng)的危險(xiǎn)因素，并且因此預(yù)測本發(fā)明的SCP材料將有效地預(yù)防和治療這些疾病。
數(shù)據(jù)還顯示，通過給藥SCP使得肝中三酰甘油的水平降低，并且預(yù)測該SCP材料可用于治療和預(yù)防脂肪肝。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及一種單細(xì)胞蛋白材料，它用于制備治療和/或預(yù)防高膽固醇血癥的藥物或營養(yǎng)組合物，這是由于我們已顯示所述材料能夠降低膽固醇的血漿濃度。
再一實(shí)施方式涉及單細(xì)胞蛋白材料在制備用于降低血漿中高半胱氨酸濃度的藥物或營養(yǎng)組合物中的用途。在表現(xiàn)出上述疾病之前可以建立高水平的高半胱氨酸。給藥該SCP材料具有一般的高半胱氨酸降低效果，并且本發(fā)明的材料因此特別適于預(yù)防上述疾病的發(fā)生，并降低這些疾病的危險(xiǎn)性。
結(jié)果還顯示SCP材料具有一般的心臟和動脈保護(hù)特性，并且我們預(yù)測可以給予該材料以降低與動脈和心臟有關(guān)的疾病的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明的目的在于將該材料以預(yù)防藥或藥用藥物、或者以功能飼料或食品材料給藥；該料可以給藥到人和非人動物。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及一種包括該單細(xì)胞蛋白材料的飼料材料。該材料例如可用于喂養(yǎng)農(nóng)業(yè)動物，例如家禽(gallinaceousbirds)，牛、羊、山羊或豬哺乳動物，家畜或?qū)櫸?，例如狗或貓，和魚或貝殼類，例如鮭魚、鱈魚、羅非魚、蛤類、牡蠣、龍蝦或蟹類。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式使用通過發(fā)酵包括甲烷營養(yǎng)菌的微生物培養(yǎng)物制得的SCP材料。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式還包括一種或多種異養(yǎng)菌。一種優(yōu)選實(shí)施方式使用甲烷營養(yǎng)菌莢膜甲基球菌(Bath)、和異養(yǎng)菌Alcaligenes acidovorans DB3和堅(jiān)硬芽孢桿菌DB5的組合，任選混合有短芽孢桿菌DB4(所有菌株都得自Norferm Danmark AS，Odense，Denmark)。
附圖簡述


圖1顯示了單細(xì)胞材料(SCP)降低血漿中膽固醇的濃度。
圖2顯示了單細(xì)胞材料(SCP)降低肝中三酰甘油的濃度。
圖3顯示了SCP材料抑制ACAT酶。
圖4顯示了單細(xì)胞材料增加線粒體β-氧化。
本申請所用的定義
動物
在本文中術(shù)語“動物”包括人和農(nóng)場(農(nóng)業(yè))動物，特別是經(jīng)濟(jì)上重要的動物，例如牛、羊、山羊和豬哺乳動物，特別是產(chǎn)生適合人食用的產(chǎn)品，例如肉、蛋和乳的那些。而且，該術(shù)語打算包括魚和貝殼類，例如鮭魚、鱈魚、羅非魚、蛤類和牡蠣。該術(shù)語還包括家畜例如狗和貓。
治療
與本發(fā)明的藥物應(yīng)用有關(guān)，術(shù)語“治療”是指降低疾病的嚴(yán)重度。
預(yù)防
術(shù)語“預(yù)防”是指預(yù)防給定的疾病，即在發(fā)生所述病況之前給藥本發(fā)明的化合物。這意味著本發(fā)明的化合物可用作預(yù)防劑或者作為功能食品或飼料中的組分以便預(yù)防給定疾病的危險(xiǎn)或發(fā)生。
單細(xì)胞蛋白材料(SCM)是一種包括單細(xì)胞微生物的材料。該微生物尤其可以是真菌、酵母和細(xì)菌。該SCP材料優(yōu)選含有高比例的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的化合物的給藥
優(yōu)選，本發(fā)明的材料經(jīng)口施用，盡管可以使用任意已知類型的給藥途徑或方案。就口服藥物組合物而言，可以使用如下載體材料例如水、明膠、樹膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、油、聚鏈烯二醇、凡士林等。這種藥物制劑可以為單位劑量形式，并且可以另外含有其它有治療價(jià)值的物質(zhì)或常規(guī)藥物佐劑例如防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等。這些藥物制劑可以為常規(guī)液體形式例如片劑、膠囊、糖錠劑、安瓿劑等，以常規(guī)劑量形式例如干安瓿劑和栓劑等。
此外，本發(fā)明的化合物適宜地與用于抗擊或預(yù)防特定疾病的其它治療組合給藥。
參照以下實(shí)施例可以更充分地理解本發(fā)明。然而，它們不應(yīng)解釋為對本發(fā)明范圍的限制。
作為營養(yǎng)組合物，可以將該單細(xì)胞材料以任何常規(guī)方式配制成飼料或食品。
試驗(yàn)部分
下面非限制性實(shí)施例用于進(jìn)一步描述本發(fā)明。
化學(xué)物質(zhì)棕櫚酰-L-肉堿(54Ci/mmol)購自Amersham。用于實(shí)時(shí)RT-PCR的化學(xué)物質(zhì)得自Applied Biosystems。所有其它化學(xué)物質(zhì)從普通商業(yè)源獲得并且屬于試劑級。
單細(xì)胞蛋白(SCP)材料
用于試驗(yàn)的SCP材料如實(shí)施例1所示制得。
動物和處理
4-5周齡雄性肥胖Zucker大鼠(Crl:(ZUC)/faBR)得自CharlesRiver，Germany，試驗(yàn)開始時(shí)平均120±3g，以12小時(shí)亮-暗循環(huán)保持在室內(nèi)，溫度為20±3℃，相對濕度為65±15％。到達(dá)的第二天將大鼠隨機(jī)化、單獨(dú)放置在代謝籠中并分成三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每一組6只動物。使大鼠適應(yīng)試驗(yàn)條件和試驗(yàn)膳食持續(xù)4天，之后收集7天糞便。半純化膳食(表1)，含有SCP或酪蛋白(對照)形式的20％粗蛋白(Nx6,25)。
表1
試驗(yàn)膳食的組成
1大豆油的脂肪酸組成(g/100g脂肪)18:2n-6(54.1±0.5)、18:1n-9(21.8±0.2)、16:0(11.2±0.1)、18:3n-3(6.1±0.2)、18:0(3.7±0.1)、18:1n-7(1.5±0.1)、20:0(0.5±0.1)、22:0(0.5±0.1)。
2維生素(mg/kg膳食)8mg維生素A(4000I.U.)、2mg維生素D3(1000I.U.)、60mg維生素E(30I.U.)、0.1mg維生素K(0.05I.U.)、1000mg酒石酸氫膽堿、4mg硫胺素、3mg核黃素、6mg維生素B6、20mg煙酸、8mg泛酸鈣、1mg folin、5mg維生素B12(0.05I.U.)。
3礦物質(zhì)(g/kg膳食)8.5g CaCO3、6.2g CaHPO4x2H2O、12.3gKH2PO4、1.4g MgCO3、0.4NaCO3、0.8g NaCl、0.02g CuSO4x5H2O、0.002g NaF、0.0002g KI、0.2g FeSO4xH2O、0.05g ZnSO4xH2O。
動物每天給予等量的飼料，進(jìn)行調(diào)整滿足生長動物的需要。動物自由接觸自來水。適應(yīng)之后大鼠喂養(yǎng)22或23天(在第22天將每組中3只大鼠殺死并在第23天殺死余下的大鼠)，每周測定體重。喂養(yǎng)結(jié)束時(shí)，動物用1∶1 Hypnorm/Dormicum(芬太尼/氟阿尼酮-咪達(dá)唑侖)經(jīng)皮下麻醉、0.2mL/100g體重，進(jìn)行心臟穿刺收集血樣(在肝素中)，并將肝切開。將一部分肝立即在液N2中冷凍，而剩余肝在冰上冷卻勻化。該方案得到挪威國家活動物生物試驗(yàn)委員會的批準(zhǔn)。
亞細(xì)胞部分的制備
將得自大鼠的肝單獨(dú)在冰冷蔗糖溶液(0.25mol/L蔗糖于10mmol/L HEPES緩沖液pH 7.4和1mmol/L EDTA中)中使用Potter-Elvehjem均化機(jī)均化。如Berge，R.K.等人(Berge，R.K.，F(xiàn)latmark，T.& Osmundsen，H.(1984)，Enhancement of long-chainacyl-CoA hydrolase activity in peroxisomes and mitochondria of ratliver by peroxisomal proliferators.Eur J Biochem 141637-644)中所述，將這些亞細(xì)胞部分分離。簡言之，勻漿在1000xg下離心10分鐘以從核部分分離出后核部分。在10000xg下持續(xù)10分鐘由該后核部分制備富含線粒體的部分。通過在23500xg下離心該后線粒體部分30分鐘，制備富含過氧化物酶體的部分。由該后過氧化物酶體部分在100000xg下持續(xù)75分鐘分離富含微粒體的部分。收集剩余上清液作為胞質(zhì)部分。該步驟在0-4℃下進(jìn)行，并且將這些部分貯存在-80℃。使用BioRad蛋白質(zhì)測定試劑盒(BioRad，Heraules，CA)和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物測定蛋白質(zhì)。
酶測定
基本上如Bremer(Bremer，J.(1981)，The effect of fasting on theactivity of liver carnitine palmitoyltransferase and its inhibition bymalonyl-CoA.Biochim Biophys Acta 665628-631)所述測定肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶I(CPT-I)活性。CPT-I的試驗(yàn)含有20mmol/L HEPES pH7.5、70mmol/L KCl、5mmol/L KCN、100μmol/L棕櫚?；?CoA、10mg BSA/mL和0.6mg組織蛋白/mL。反應(yīng)用200μmol/L[甲基-14C]L-肉堿(200cpm/nmol)開始。CPT-II的測定條件相同，只是省去BSA而含有0.01％ Triton X-100。組織蛋白濃度是2.5μg/mL。使用130mg蛋白質(zhì)和14C-油酰基-CoA作為底物測定?；?輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)。產(chǎn)物在TLC板上使用己烷∶二乙醚∶乙酸(80∶20∶1)作為流動相進(jìn)行分離，并在閃爍計(jì)數(shù)器(Win Spectral 1414液體閃爍計(jì)數(shù)器，Wallac)中計(jì)數(shù)。使用80mg蛋白質(zhì)和14C-HMG-CoA作為底物測定3-羥基-3-甲基戊二?；?HMG)-CoA還原酶。產(chǎn)物在TLC板上使用丙酮∶苯(1∶1)作為流動相進(jìn)行分離，并在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。如Roncari(Roncari，D.A.(1981)Fatty acid synthase from human liver.MethodsEnzymol 71 Pt C73-79)所述測定脂肪酸合酶，根據(jù)Skorve等人.(Skorve，J.，al-Shurbaji，A.，Asiedu，D.，Bjorkhem，I.，Berglund，L.&Berge，R.K.(1993)On the mechanism of the hypolipidemic effect ofsulfur-substituted hexadecanedioic acid(3-thiadicarboxylic acid)innormolipidemic rats.J Lipid Res 341177-1185)進(jìn)行改進(jìn)，并通過測定結(jié)合到丙二酸單酰-CoA的NaH14CO3的量來確定乙?；?CoA羧化酶。
脂質(zhì)分析
在Tecnicon Axon系統(tǒng)(Miles，Tarrytown，NY)中，用Bayer甘油三酸酯和膽固醇酶促試劑盒(Bayer，Terrytown，NY)和PAP 150磷脂酶促試劑盒(bioMerieux，Lyon，F(xiàn)rance)測定整個(gè)肝和肝素化血漿中的脂質(zhì)。首先按照Bligh and Dyer(Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(1959)Arapid method of total lipid extraction and purification.Can J BiochemPhysiol 37911-91)提取肝脂質(zhì)。
糞甾醇
按照Suckling等人(Suckling，K.E.，Benson，G.M.，Bond，B.，Gee，A.，Glen，A.，Haynes，C.& Jackson，B.(1991)，Cholesterol loweringand bile acid excretion in the hamster with cholestyramine treatment，Atherosclerosis 89183-190)，作一些改進(jìn)制備糞便總膽汁酸。將2mL在乙醇中的NaBH(mg/mL)加入到0.1g粉狀干糞便中。在室溫下使該混合物反應(yīng)1小時(shí)，之后加入50μl的2mol/L HCl以除去任意過量的NaBH。用正己烷從樣品中萃取中性甾醇(兩次連續(xù)洗滌)，之后樣品用200μl 10mol/L NaOH在110℃下水解過夜。將240μl該水解物與2.8mL水一起供應(yīng)到Bond Elut C18柱(Varian，200mg，3mL)，它預(yù)先用3mL甲醇和3mL水活化。膽汁酸保留在柱內(nèi)，用3mL的20％水中的甲醇洗滌兩次，之后膽汁酸用3mL甲醇洗脫。膽汁酸在45℃下風(fēng)干并溶解在1mL異丙醇中。使用總膽汁酸診斷試劑盒(Sigma 450A)在Tecnicon Axon系統(tǒng)上酶促測定總膽汁酸。
氨基酸
在6M HCl中于110±2℃下水解22小時(shí)并用異硫氰酸苯酯按照Cohen和Strydom的方法(34)預(yù)衍生化之后測定膳食中的氨基酸。用9∶1過甲酸(89％)∶H2O2(30％)(v/v)將半胱氨酸和胱氨酸氧化獲得半胱磺酸之后測定飼料中的總半胱氨酸。然后將樣品在6M HCl中于110±2℃下水解22小時(shí)，再如上述的氨基酸分析進(jìn)行處理。在配備有鋰柱的Biochrom 20加上氨基酸分析儀(Amersham PharmaciaBiotech、Sweden)中，用如上所述(24)后柱水合茚三酮衍生法測定肝和血漿中的氨基酸。分析之前，肝樣品通過添加2體積的5％磺基水楊酸，在冰上保持30分鐘并在5000xg下離心15分鐘進(jìn)行萃取和去蛋白。上清液以4∶1(v/v)與內(nèi)標(biāo)(2.5mmol/L正亮氨酸在0.1mol/L HCl中)混合。血漿樣品以1∶1與內(nèi)標(biāo)(1mmol/L正亮氨酸在0.1mol/L HCl中)混合，在10000xg下離心5分鐘，之后在過濾管(切割10kDa，Biomax PB聚醚砜膜，Millipore Corp.，USA)中在10000xg下將上清液離心30分鐘。
脂肪酸組成
從樣品中用2∶1氯仿∶甲醇(v/v)(35)萃取脂肪酸。樣品經(jīng)過濾、皂化和在12％ BF3的甲醇(v/v)中酯化。使用Lie和Lambertsen所述的方法(Lie，O.& Lambertsen，G.(1991)Fatty acid composition ofglycerophospholipids in seven tissues of cod(Gadus morhua)，determined bv combined high-performance liquid chromatographyand gas chromatography.J Chromatogr 565119-129)分析肝和血漿中的總脂質(zhì)的脂肪酸組成。使用配備有50m CP-sil 88(Chrompack，Middelburg，荷蘭)融合硅石毛細(xì)管柱(內(nèi)徑0.32mm)的Carlo Erba氣相色譜儀(′柱上冷′注射，69℃持續(xù)20秒，以25℃min-1升高至160℃并在160℃下保持28分鐘，以25℃min-1升高至190℃并在190℃保持17分鐘，以25℃min-1升高至220℃并在220℃下保持9分鐘)分離脂肪酸甲酯。使用標(biāo)準(zhǔn)甲酯混合物(Nu-Chek-Prep，Elyian，MN，USA)通過保留時(shí)間鑒定脂肪酸。使用連接到GLC的積分儀(TurbochromNavigator，Version 4.0)計(jì)算脂肪酸組成(重量百分?jǐn)?shù))。
使用氯仿和甲醇的混合物從血漿富含三酰甘油的脂蛋白部分萃取脂質(zhì)，并通過薄層色譜法在硅膠板(0.25mm硅膠60，Merck)上分離，在己烷-二乙醚-乙酸(80∶20∶1，v/v/v)中展開并使用若丹明6G(0.05％在甲醇中，Sigma)和紫外光顯影。刮掉斑點(diǎn)并轉(zhuǎn)移到含二十一烷酸(21:0)作為內(nèi)標(biāo)的管中。向樣品中加入BF3-甲醇轉(zhuǎn)酯化。為了除去中性甾醇和不能皂化的物質(zhì)，將脂肪?；柞サ妮腿∥镌?.5mol/L KOH的乙醇-水溶液(9∶1)中加熱，然后將回收的脂肪酸用BF3-甲醇再酯化。在GC8000Top氣相色譜儀(Carlo Erba Instrument)上分析這些甲酯，該色譜儀配備有火焰電離檢測器(FID)、程序控制溫度的蒸發(fā)注射器、AS 800自動采樣器(Carlo Erba Instrument)和含有高極性SP 2340相并且膜厚0.20pm(Supelco)的毛細(xì)管柱(60m×0.25mm)。初始溫度是130℃，以1.4℃/min升溫至最終溫度214℃。注射器溫度是235℃。檢測器溫度是235℃，使用氫氣(25mL/min)、空氣(350mL/min)和氮?dú)庾鳛檠a(bǔ)充載氣(30mL/min)。使用氫氣作為載氣(1.6mL/min)使樣品以恒定流量運(yùn)行樣品。分流比是20∶1。通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物(LarodanFine Chemicals，Malmo，Sweden)比較陽性鑒定這些甲酯并通過質(zhì)譜法核實(shí)。用基于二十一烷酸作為內(nèi)標(biāo)的Chrom-Card A/D 1.0色譜儀站(Carlo Erba Instruments)進(jìn)行脂肪酸的定量。
?；?CoA-酯
通過反相高效液相色譜法測定肝中?；?CoA酯。將100mg凍肝在冰冷1.4mol/L HClO4和2mmol/L D-二硫蘇糖醇中均化獲得10％(w/v)勻漿，并在12000xg下離心1分鐘。將122μl冰冷3mol/L K2CO3和0,5mol/L三乙醇胺加入到500μl上清液中。在冰上10分鐘之后，溶液在12000xg、4℃下離心1分鐘。將40μl上清液注入到高效液相色譜柱中，并按照Demoz等人(39)測定?；?CoA酯，具有如下改進(jìn)將洗脫緩沖液A調(diào)整至pH 5.00，梯度洗脫特征如下0分鐘，83.5％A；10分鐘，55％ A；17分鐘，10％ A，并且流速是1.0mL/min。
實(shí)時(shí)定量RT-PCR
使用Trizol(Gibco BRL)將所有RNA純化，并在總體積100μl中使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Applied Biosystems)將1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄。將其中省去RNA的反應(yīng)用作陰性對照，并且將其中稀釋RNA的反應(yīng)用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
使用Primer Express(Applied Biosystems)設(shè)計(jì)Δ9、Δ6和Δ5去飽和酶、過氧化物酶體增殖子-活化的受體(PPAR)α和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物和Taqman探針。使用GAPDH和18S rRNA作為內(nèi)源性對照。18S rRNA的引物和Taqman探針購自Applied Biosystems。
每個(gè)樣品一式三份在ABI 7900序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。對Δ9、Δ6和Δ5去飽和酶、PPARα和GAPDH而言，每20μl反應(yīng)含有3μl第一鏈cDNA、1x Universal Master Mix(AppliedBiosystems)、300nmol/L的每個(gè)正向和反向引物、和250nmol/LTaqman探針。對18S rRNA而言，反應(yīng)含有3μl第一鏈cDNA、1xUniversal Master Mix(Applied Biosystems)和1x 18S探針/引物反應(yīng)混合物。所有反應(yīng)都使用以下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行50℃持續(xù)2分鐘和95℃持續(xù)10分鐘，接著40個(gè)循環(huán)的95℃持續(xù)15秒鐘和60℃持續(xù)1分鐘，通常如Applied Biosystems推薦。使用每個(gè)未知樣品的Ct讀數(shù)(treshold循環(huán)數(shù))計(jì)算去飽和酶、PPARa和GAPDH和18S rRNA的量。對每一樣品而言，將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化成GAPDH和18S rRNA。
結(jié)果以每個(gè)試驗(yàn)組中6只動物的平均SEM報(bào)道。統(tǒng)計(jì)分析是通過單向Anova Dunett′s試驗(yàn)(Prism，GraphPad)進(jìn)行的。
實(shí)施例1
單細(xì)胞蛋白(SCP)材料的制備
含有莢膜甲基球菌(Bath)，Ralstonia sp.、Brevibacillus agri和Aneurinibacillus sp的微生物培養(yǎng)物，它們都可以從Norferm DanmarkAS，Odense，Denmark商購獲得，在環(huán)型發(fā)酵罐中通過在銨/無機(jī)鹽培養(yǎng)基(AMS)中于45℃、pH 6.5下并以0.15h-1的稀釋速率連續(xù)需氧發(fā)酵天然氣制得。該AMS培養(yǎng)基每升含有以下物質(zhì)10mg NH3、75mgH3PO4·2H2O、380mg MgSO4·7H2O、100mg CaCl2·2H2O、200mgK2SO4、75mg FeSO4·7H2O、1.0mg CuSO4·5H2O、0.96mgZnSO4·7H2O、120μg CoCl2·6H2O、48μg MnCl2·4H2O、36g H3BO3、24g NiCl2·6H2O和1.20μg NaMoO4·2H2O。
發(fā)酵罐中充滿在125℃下熱殺菌10秒鐘的水。根據(jù)它們的消耗調(diào)整不同營養(yǎng)物的添加。用2-3％生物質(zhì)(以干重的基礎(chǔ))進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。
連續(xù)收獲具有表2中給出的特性的單細(xì)胞材料
表2
單細(xì)胞蛋白(SCP)材料的組成
*以干重為基礎(chǔ)，粗蛋白含量為約70％。
生物質(zhì)在工業(yè)連續(xù)離心機(jī)中于3,000rpm下經(jīng)過離心，接著使用排除尺寸為100,000道爾頓的膜超濾。所得產(chǎn)物然后在熱交換器中于約130℃下進(jìn)行約90秒鐘的滅菌。
實(shí)施例2.
SCP降低血漿膽固醇的濃度。
給予肥胖Zucker大鼠含有20％ SCP作為唯一蛋白源的膳食。該SCP如上面實(shí)施例1所述制得。
與喂食酪蛋白作為飼料蛋白的大鼠相比，在喂食SCP的Zucker大鼠中血漿膽固醇水平降低57％。結(jié)果示于圖1。結(jié)果清楚地證實(shí)SCP降低血漿中膽固醇的水平并且可用作膽固醇降低劑。
實(shí)施例3
SCP降低肝中三酰甘油的濃度
圖2顯示SCP誘導(dǎo)肝中三酰甘油(TG)的濃度降低約50％。這說明本發(fā)明的化合物可用作脂質(zhì)降低劑，并可用于治療和預(yù)防脂肪肝。
實(shí)施例4
SCP抑制?；?CoA膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)的活性
?；?CoA膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)催化脂肪?；?CoA被酯化成膽固醇的反應(yīng)。然后可以將膽固醇酯以液滴的形式貯存在細(xì)胞質(zhì)中或者作為一部分VLDL以及游離膽固醇分泌。因此，ACAT在VLDL分泌和接下來的膽固醇酯累積以及心血管疾病的危險(xiǎn)中起主要作用。在本Zucker大鼠試驗(yàn)中，SCP蛋白改變富含三酰甘油的脂蛋白部分中脂質(zhì)分類的組成，即與喂食酪蛋白的大鼠相比，膽固醇酯和磷脂含量更低，而三酰甘油含量更高。圖3顯示與喂食酪蛋白的大鼠相比，在喂食SCP蛋白的大鼠中ACAT活性降低。由于存在有力證據(jù)證實(shí)ACAT活性增加在動脈粥樣硬化的進(jìn)展中起著重要作用，該發(fā)現(xiàn)說明以飼料補(bǔ)充物或藥物給予的SCP可以保護(hù)心臟。
圖3顯示與喂食酪蛋白的Zucker大鼠相比，在喂食SCP的大鼠中ACAT活性降低約20％。
實(shí)施例5
SCP增加線粒體β-氧化
圖4顯示SCP增加線粒體β-氧化。增加的脂肪酸氧化是SCP的脂質(zhì)降低效果下的重要因素。增加的脂肪酸代謝將使用于酯化的脂肪酸的量減少，并由此減少肝產(chǎn)生和分泌VLDL。從圖4可以看出與對照相比，SCP顯著增加棕櫚酰基-輔酶A的氧化。
實(shí)施例6
SCP干擾脂質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)
本數(shù)據(jù)說明SCP材料干擾脂質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并且可以促進(jìn)內(nèi)源性配體的累積。盡管PPARα的未變化的肝mRNA水平(數(shù)據(jù)未顯示)，但是與喂食酪蛋白的大鼠相比，喂食SCP的大鼠中肝、血漿和富含三酰甘油的脂蛋白部分中脂肪酸組成發(fā)生變化，并且該變化在肝和血漿中不平行(表3和4)。與喂食酪蛋白的大鼠相比，在喂食SCP的大鼠中肝中飽和14:0、16:0和18:0脂肪酸的濃度增加。在喂食SCP的大鼠中，肝中幾種單不飽和脂肪酸的濃度降低。與肝相反，在血漿中發(fā)現(xiàn)對飽和以及單不飽和脂肪酸的相反效果。在血漿中，通過喂食SCP，飽和脂肪酸14:0和16:0增加。在喂食SCP的大鼠中單不飽和脂肪酸18:1n-9增加約2倍。在喂食SCP的動物中發(fā)現(xiàn)20:4n-6增加兩倍。因此預(yù)測其肝伸長活性增加。喂食SCP的動物顯示血漿18:2n-6濃度增加，而它們顯示20:4n-6的血漿濃度降低。結(jié)果它們的血漿中20:4n-6/18:2n-6比降低。在喂食SCP的大鼠中肝中測定的所有n-3脂肪酸增加。通過喂食SCP，血漿中18:3n-3增加4倍。在喂食SCP的大鼠中20:5n-3顯著增加。
表3
喂食SCP或酪蛋白3周后Zucker大鼠的肝中的脂肪酸組成1
表4
喂食SCP或酪蛋白3周后Zucker大鼠的血漿中的脂肪酸組成1
實(shí)施例7
SCP降低血漿中高半胱氨酸的濃度
已提出增加水平的高半胱氨酸，即高高半胱氨酸血癥與動脈疾病有關(guān)，因此我們測定了大鼠的血漿樣品中高半胱氨酸的水平。
通過全自動熒光試驗(yàn)測定總血漿高半胱氨酸。由30μlNaBH4/DMSO溶液(6mol/L)還原30μl血漿。1,5分鐘后加入20μl乙腈中的熒光試劑monobromobimane(25mmol/L)并使其反應(yīng)3分鐘。通過將20μl樣品注入到強(qiáng)陽離子交換柱中，然后柱轉(zhuǎn)換到環(huán)己基二氧化硅柱中，立即用HPLC分析。SCX柱經(jīng)過等度洗脫，CH柱用20mmol/L甲酸鹽緩沖液中的線性甲醇梯度(17-35％，在5分鐘內(nèi))洗脫。在4.5分鐘的保留時(shí)間下洗脫出高半胱氨酸。結(jié)果示于表5。
表5.
高半胱氨酸的血漿濃度
權(quán)利要求
1、單細(xì)胞蛋白材料在制備用于治療和/或預(yù)防動物中動脈粥樣硬化、冠心病、狹窄、血栓形成、心肌梗塞、中風(fēng)和脂肪肝的藥物或營養(yǎng)制品中的用途。
2、單細(xì)胞蛋白材料在制備用于治療和/或預(yù)防高膽固醇血癥的藥物或營養(yǎng)組合物中的用途。
3、單細(xì)胞蛋白材料在制備用于降低血漿中高半胱氨酸的濃度的藥物或營養(yǎng)組合物中的用途。
4、單細(xì)胞蛋白材料在制備用于藥物或營養(yǎng)心臟保護(hù)組合物中的用途。
5、單細(xì)胞材料在制備用于改變脂肪?；Ｊ胶透纳浦|(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的藥物或營養(yǎng)中的用途。
6、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的單細(xì)胞蛋白材料的用途，其中所述動物是人。
7、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的單細(xì)胞蛋白材料的用途，其中所述動物是農(nóng)業(yè)動物，例如家禽、牛、羊、山羊或豬哺乳動物。
8、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的單細(xì)胞蛋白材料的用途，其中所述動物是家畜或?qū)櫸?，例如狗或貓?br> 9、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的單細(xì)胞蛋白材料的用途，其中所述動物是魚或貝殼類，例如鮭魚、鱈魚、羅非魚、蛤類、牡蠣、龍蝦或蟹類。
10、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的用途，其中所述單細(xì)胞材料是包含甲烷營養(yǎng)菌的微生物培養(yǎng)物。
11、根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述微生物培養(yǎng)物還包括一種或多種異養(yǎng)菌。
12、根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述微生物培養(yǎng)物包括含有莢膜甲基球菌、Ralstonia sp.、Brevibacillus agri和Aneurinibacillus sp.的微生物培養(yǎng)物的組合。
13、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的用途，其中莢膜甲基球菌是SPC材料的主要或唯一組分。
14、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的用途，其中單細(xì)胞培養(yǎng)物是通過連續(xù)發(fā)酵，優(yōu)選用2-3％生物質(zhì)(以干重計(jì))操作生產(chǎn)的。
15、根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)的用途，其中發(fā)酵之后的單細(xì)胞材料在工業(yè)連續(xù)離心機(jī)中經(jīng)過離心，優(yōu)選在3,000rpm下，接著使用排除尺寸優(yōu)選是100,000道爾頓的膜進(jìn)行超濾。
16、根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述單細(xì)胞材料還經(jīng)過滅菌步驟，優(yōu)選在熱交換器中。
17、根據(jù)權(quán)利要求12-16中一項(xiàng)的用途，其中所述單細(xì)胞材料還經(jīng)過均化步驟。
18、根據(jù)權(quán)利要求12-17中一項(xiàng)的用途，其中所述單細(xì)胞材料通過噴霧干燥干燥。
19、根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中在噴霧干燥之前該材料在小于20℃的溫度和小于約6.5的pH下保存在貯存罐中。
20、根據(jù)權(quán)利要求1-19中一項(xiàng)的用途，其中所述單細(xì)胞材料由對烴部分或天然氣發(fā)酵獲得。
21、根據(jù)權(quán)利要求1-20中一項(xiàng)的用途，其中所述組合物是食品級產(chǎn)品或添加劑，例如動物飼料或?qū)櫸锸称贰?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種單細(xì)胞蛋白材料(SCP)的用途。該SCP材料降低了血漿中膽固醇的濃度，并降低了肝中甘油三酸酯的濃度。SCP還誘導(dǎo)脂肪酸圖譜的有利變化，并降低血漿中高半胱氨酸的濃度。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及SCP作為抗動脈粥樣硬化和心臟保護(hù)劑的用途，或者以藥用或者以營養(yǎng)組合物，例如以功能食品給出。
文檔編號A61P9/10GK1845749SQ20048002548
公開日2006年10月11日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者R·貝格, G·克勒佩 申請人:伯格生物醫(yī)藥有限公司, 拜奧食品飼料有限公司