專利名稱：通過施用rna改變細(xì)胞性質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改變細(xì)胞性質(zhì)。具體地，它涉及改變細(xì)胞的動(dòng)員(mobilise)、遷移、整合、增殖和分化的一種或多種能力，其中這種能力是潛在的或顯著的，以及其中可以按任何的次序表現(xiàn)出每種能力。例如，它涉及改變干細(xì)胞的性質(zhì)，包括獲得顯著的或潛在的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力。它也涉及在體內(nèi)改變干細(xì)胞性質(zhì)，包括獲得顯著的或潛在的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力。它也涉及在體外改變干細(xì)胞性質(zhì)，包括獲得動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力，其中這種性質(zhì)的改變在體外可以是顯著的或潛在的，或者只是在隨后導(dǎo)入到宿主之后在體內(nèi)、或是在隨后導(dǎo)入到體外培養(yǎng)物的其它階段之后，包括導(dǎo)入到回體(ex vivo)的樣品之后才會(huì)成為顯著的。因此，它涉及促進(jìn)功能性修復(fù)和/或再生。本發(fā)明也涉及在體外和在體內(nèi)改變細(xì)胞的基因型。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，以及涉及逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用繼續(xù)占據(jù)著科學(xué)的和非專業(yè)的出版物。干細(xì)胞是能自我更新以及也能分化成一種或多種分化細(xì)胞類型的未分化細(xì)胞。這種能分裂生成其它的干細(xì)胞以及分化的雙重能力意味著干細(xì)胞群可以保持它們的數(shù)目，同時(shí)也能生成大量的分化細(xì)胞。
干細(xì)胞存在于植物和動(dòng)物的多個(gè)部位中。盡管許多對干細(xì)胞進(jìn)行的最初研究都集中于胚胎干細(xì)胞，但是成體組織也含有干細(xì)胞。干細(xì)胞在例如正常組織的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。干細(xì)胞也生成分化細(xì)胞以取代在機(jī)體的正常工作過程中所丟失的那些細(xì)胞。例如，造血干細(xì)胞分化生成多種祖細(xì)胞，其依次生成免疫細(xì)胞的多種細(xì)胞。因此，當(dāng)成熟的免疫細(xì)胞死亡時(shí)，它們被來源于造血干細(xì)胞的新的免疫細(xì)胞所取代。通過一種類似的方式，某些類型的干細(xì)胞可以生成其它類型的干細(xì)胞。
可以常規(guī)地分離干細(xì)胞群，將其用于體外培養(yǎng)或者可以在體內(nèi)操縱。可以從多種來源中分離到干細(xì)胞，包括正常的成體組織、植入前胚胎、胎兒組織(處于發(fā)育的不同階段)和腫瘤。已經(jīng)建立了成體干細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞系?？梢詫⒏杉?xì)胞系或多或少不確定地保持在培養(yǎng)物中。也可以在培養(yǎng)物中操縱干細(xì)胞系，使得可以利用例如干細(xì)胞靶向的技術(shù)導(dǎo)入特異的遺傳修飾。然后可以將在體外培養(yǎng)或操縱的干細(xì)胞群導(dǎo)入到宿主體內(nèi)，或?qū)氲浇M織培養(yǎng)物的后繼形式內(nèi)。
任何干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用核心都是在體外和在移植到受體人、動(dòng)物及植物后控制干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力。盡管干細(xì)胞在體內(nèi)動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力是熟知的，但是人為控制干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化成靶組織中的成熟細(xì)胞的能力仍處于起步階段?，F(xiàn)有的方法很大程度上依賴于將培養(yǎng)的干細(xì)胞暴露于特異的生長因子和/或生長條件中。利用這些方法只能生成相當(dāng)有限數(shù)目的特異的分化細(xì)胞類型。
WO 95/12665揭示了一種用于將胚胎干細(xì)胞分化成所需細(xì)胞系的方法。用編碼促進(jìn)干細(xì)胞分化成特異細(xì)胞系的蛋白質(zhì)或多肽的DNA工程化胚胎干細(xì)胞。所述DNA可以編碼在特殊細(xì)胞系中所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子。
Dai等(2000)表明通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將人促紅細(xì)胞生成素受體基因轉(zhuǎn)移到鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)可以增強(qiáng)分化中的胚狀體的紅細(xì)胞生成。
WO 01/00650揭示了用于通過導(dǎo)入來自較少分化的細(xì)胞類型(例如卵母細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)而將受體細(xì)胞(例如人體細(xì)胞)去分化的方法。
Tada等(2001)證實(shí)成體胸腺細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的融合可以將體細(xì)胞的后生型的某些方面重設(shè)為胚胎干細(xì)胞的某些方面。例如，雜合體在體內(nèi)顯示出多能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明與細(xì)胞性質(zhì)的改變有關(guān)。具體地，它涉及改變細(xì)胞的分化以及細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力。本發(fā)明也與細(xì)胞基因型的改變以及與分化的控制有關(guān)。
不希望受理論上的限制，本發(fā)明依據(jù)于兩個(gè)假設(shè)(a)通過經(jīng)來自需要再生的組織的RNA向效應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移信息而支配用于組織再生的細(xì)胞的行為；和(b)通過經(jīng)RNA將信息從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因型的改變。
因此，本發(fā)明與促進(jìn)由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)、通過影響細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化、成體細(xì)胞和一般意義上的干細(xì)胞的分化以及它們獲得動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力來治療多種疾病狀態(tài)有關(guān)。本發(fā)明也與細(xì)胞基因型的改變、和通過改變細(xì)胞基因型治療多種疾病狀態(tài)有關(guān)。本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成所需的分化細(xì)胞類型是可能的，以及相反地逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞也是可能的。本發(fā)明者也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化成整合到靶組織內(nèi)的所需分化細(xì)胞類型是可能的，逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞是可能的，以及改變細(xì)胞的基因型也是可能的。通過向靶細(xì)胞提供特異的RNA序列可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
影響細(xì)胞命運(yùn)或基因型的能力容許誘導(dǎo)多種臨床有用的現(xiàn)象，包括容許修復(fù)患病細(xì)胞、組織和器官，容許改變細(xì)胞的遺傳組成，容許誘導(dǎo)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞命運(yùn)，容許隨意地改變免疫學(xué)特征譜(profile)，容許誘導(dǎo)特殊的免疫功能等等。誘導(dǎo)干細(xì)胞在體內(nèi)的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的能力意味著可以在完整生物體中，特別是在動(dòng)物體內(nèi)有利地促進(jìn)干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)和基因型改變。
因此，本發(fā)明提供了一種用于將一種細(xì)胞性質(zhì)改變?yōu)橐环N或多種所需細(xì)胞類型的性質(zhì)的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所需細(xì)胞的細(xì)胞性質(zhì)被改變的條件下提供給一群細(xì)胞，分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA序列。
分離的RNA可以是可從一種或多種具有感興趣的性質(zhì)的細(xì)胞類型中提取的或提取的。分離的RNA可以包括可從一種或多種具有感興趣的性質(zhì)的細(xì)胞類型中提取的RNA序列。因此，并不總是必需從所需細(xì)胞類型中提取RNA；例如，利用重組表達(dá)系統(tǒng)可以合成產(chǎn)生賦予所述細(xì)胞類型有利的性質(zhì)的RNA序列。通過體外擴(kuò)增分離的RNA可以生成更大量的所需RNA。
可以在體外或在體內(nèi)將細(xì)胞群暴露于RNA。在體外，細(xì)胞群例如可以是細(xì)胞培養(yǎng)物，例如在細(xì)胞培養(yǎng)皿或滾瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)物、或生長在支持物、膜、植入物、支架或基質(zhì)上的細(xì)胞；或組織，例如生長在體外的分離的組織。在體內(nèi)，細(xì)胞群可以是生物體，例如人患者、或從生物體中分離到的組織，例如器官、器官的特異部分、或特異的細(xì)胞類型或多種細(xì)胞類型的集合(collection)。
可以用本發(fā)明的方法在體內(nèi)或在體外提高干細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)方面提供了誘導(dǎo)細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或來源于動(dòng)物或植物的組織的全能或多能干細(xì)胞分化成一種或多種所需細(xì)胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA。然后可以將以這種方式在體外生成的細(xì)胞輸送給受體。對于體內(nèi)處理而言，干細(xì)胞可以駐留在患者體內(nèi)并在原位暴露于RNA?；蛘撸梢詫⒔?jīng)過或未經(jīng)過上述預(yù)處理的干細(xì)胞本身或聯(lián)合本發(fā)明的RNA一起施用給組織或生物體，以誘導(dǎo)干細(xì)胞在治療對象體內(nèi)的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化。細(xì)胞和RNA也可以與治療特殊疾病有效的其它治療應(yīng)用同時(shí)、分開或順序施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可從一種或多種干細(xì)胞類型或干細(xì)胞活性組織中提取的RNA可以任選地與細(xì)胞例如干細(xì)胞同時(shí)、分開或順序施用。例如，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自胚胎的或胎兒的、全身的、器官的、器官的特異部分的、或特異的細(xì)胞類型的或細(xì)胞類型的收集物的RNA與干細(xì)胞、或來源于體外處理的干細(xì)胞特別是骨髓干細(xì)胞的細(xì)胞同時(shí)、分開或順序施用。
在一些情況中，可以用分離的RNA本身誘導(dǎo)原位分化。同樣，可以用分離的RNA本身誘導(dǎo)原位動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化。同樣，可以用分離的RNA本身誘導(dǎo)原位基因型修飾。因此，在另一方面，本發(fā)明也提供了能誘導(dǎo)細(xì)胞特別是干細(xì)胞的分化的RNA在治療或在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了能誘導(dǎo)細(xì)胞特別是干細(xì)胞的遷移、動(dòng)員、整合、增殖和分化的RNA在治療或在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途，包括修復(fù)患病細(xì)胞、誘導(dǎo)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞命運(yùn)、改變細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜、和誘導(dǎo)特殊的所需免疫功能或性質(zhì)。本發(fā)明也提供了能誘導(dǎo)細(xì)胞特別是干細(xì)胞的基因型修飾的RNA在治療或在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途，包括修復(fù)患病細(xì)胞、改變細(xì)胞的遺傳組成、誘導(dǎo)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞命運(yùn)、改變細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜、和誘導(dǎo)特殊的所需免疫功能或性質(zhì)?？梢詫⒎蛛x的RNA作為一種藥物提供給細(xì)胞群，其中RNA構(gòu)成了藥物的主要活性成分。
可以用分離的RNA誘導(dǎo)干細(xì)胞在體內(nèi)的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的RNA。本發(fā)明也提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的能誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化的RNA。例如，可以用這些方法促進(jìn)干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)，包括修復(fù)患病細(xì)胞、改變細(xì)胞的遺傳組成、誘導(dǎo)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞命運(yùn)、改變細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜、和誘導(dǎo)特殊的所需免疫功能或性質(zhì)。
因此，可以用包括可從特殊的所需類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系中提取的RNA的分離的RNA促進(jìn)在體內(nèi)由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)，和提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病。這些損害例如可以歸結(jié)于疾病、衰老或遺傳組成(makeup)或遺傳突變、外傷、手術(shù)、任何其它形式的治療、疾病、或意外的或有意的病態(tài)。
或者，可以將RNA聯(lián)合其它的活性劑一起施加給細(xì)胞群，活性劑包括例如干細(xì)胞、或根據(jù)上述方法在體外來源于干細(xì)胞的細(xì)胞?？梢酝瑫r(shí)地、順序地或分開地施用RNA和其它活性劑。
可以用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化成一種或多種所需細(xì)胞類型。本發(fā)明的這個(gè)方面提供了一種誘導(dǎo)干細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或來源于動(dòng)物或植物的組織的全能或多能干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化成一種或多種所需細(xì)胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA。在一些實(shí)施方案中，在體外處理全能或多能干細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，在患者體內(nèi)，在體內(nèi)處理全能或多能干細(xì)胞。所采用的干細(xì)胞可以是成體干細(xì)胞。
也可以用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)成體細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化成一種或多種所需的干細(xì)胞類型。在這個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種用于獲得干細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明提供了一種在體外逆轉(zhuǎn)細(xì)胞系的分化細(xì)胞或來自動(dòng)物或植物的組織的分化細(xì)胞的分化以生成所需類型的全能或多能干細(xì)胞或干細(xì)胞系的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所需的將分化細(xì)胞的分化逆轉(zhuǎn)成所述類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系類型的條件下提供給所述分化細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述分離的RNA包括可從所需類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系中提取的RNA。本發(fā)明提供了用這種方法獲得的干細(xì)胞。本發(fā)明也提供了這些細(xì)胞在生產(chǎn)用于提高或校正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物上的用途。在其它方面，本發(fā)明提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的這些細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所采用的干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，以及所需細(xì)胞類型包括胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞系。因此，本發(fā)明也提供了從成體干細(xì)胞生成胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。
更普遍的，所采用的干細(xì)胞可以是來自胚胎后發(fā)育階段，例如胎兒、新生兒、幼體、或成體、或這些階段內(nèi)的任何亞階段，以及所需細(xì)胞類型包括胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞系。本發(fā)明因此提供了一種從這些胚胎后階段細(xì)胞生成胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。例如，本發(fā)明容許通過來自同一個(gè)體的自體(成體)干細(xì)胞的衍生作用生成用于治療成體的、具有胚胎干細(xì)胞性質(zhì)的干細(xì)胞。
某些類型的干細(xì)胞只存在于特殊的發(fā)育階段(例如，某一類型的產(chǎn)紅細(xì)胞的干細(xì)胞存在于胎兒發(fā)育的某一階段的肝內(nèi)，而具有這種類型的行為的肝干細(xì)胞在成體中并不存在)。因此，本發(fā)明提供了一種從在發(fā)育的其它階段可獲得的干細(xì)胞生成只存在于發(fā)育的某些特異階段的干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所采用的干細(xì)胞是特殊類型的干細(xì)胞(例如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞)以及所需細(xì)胞類型包括不同類型的干細(xì)胞(例如神經(jīng)干細(xì)胞)。本發(fā)明提供了從一種類型的干細(xì)胞生成具有另一種干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞的方法。
根據(jù)天然宿主的發(fā)育階段，任何特殊類型的干細(xì)胞可以具有不同的能力。因此，在一些實(shí)施方案中，所采用的干細(xì)胞是特殊類型的和特殊發(fā)育階段的干細(xì)胞(例如，成體的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞)以及所需細(xì)胞類型包括具有屬于不同發(fā)育階段的干細(xì)胞的性質(zhì)的相同或不同類型的干細(xì)胞(例如，新生兒的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞)。因此，本發(fā)明也提供了一種從不同發(fā)育階段的相同或不同的類型的干細(xì)胞生成具有屬于某一發(fā)育階段的特殊類型的干細(xì)胞的性質(zhì)的細(xì)胞的方法。
從干細(xì)胞生成分化細(xì)胞的能力意味著可以獲得大量的所需分化細(xì)胞。另外，從分化細(xì)胞生成干細(xì)胞的能力提供了一種比直接分離干細(xì)胞更為簡單、更少勞動(dòng)強(qiáng)度和更少侵襲性的提供干細(xì)胞的方法。這也意味著可以從成體組織中獲得高度多能干細(xì)胞，這使得不必使用胚胎組織。通過聯(lián)合用于生產(chǎn)干細(xì)胞和用于分化干細(xì)胞的技術(shù)，可以生成大量的所需分化細(xì)胞。本發(fā)明的方法和藥物意味著可以在組織培養(yǎng)物中和在完整生物體特別是在動(dòng)物中控制分化。
也可以用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)成體細(xì)胞分化成其它的、不同的成體細(xì)胞類型。這些分化的實(shí)例包括修復(fù)患病(包括癌變)細(xì)胞、改變細(xì)胞的遺傳組成、誘導(dǎo)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞命運(yùn)、改變細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜、和誘導(dǎo)特殊所需的免疫功能或性質(zhì)。
本發(fā)明也提供了用上述方法獲得的細(xì)胞。這些分化細(xì)胞可被用于生產(chǎn)用于治療多種疾病的藥物。因此，在其它方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或退化或遺傳疾病的藥物中的用途。本發(fā)明包括治療方法，其包括向需要治療的患者施用治療有效量的這些細(xì)胞。而且，分化細(xì)胞可被用于診斷和/或研究的目的和/或用于生產(chǎn)用于診斷和/或治療的試劑。因此，在其它方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞在診斷或研究和在生產(chǎn)用于診斷或研究的試劑中的用途。
利用本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)用本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化。因此，在其它方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)分化細(xì)胞的方法，其包括(a)實(shí)施本發(fā)明的方法以從分化細(xì)胞生成干細(xì)胞或干細(xì)胞系；(b)對干細(xì)胞或干細(xì)胞系實(shí)施本發(fā)明的方法以生成分化細(xì)胞。所述方法可以在體內(nèi)和/或在體外實(shí)施。
本發(fā)明也提供了用這些方法獲得的細(xì)胞?？梢杂毛@得的細(xì)胞治療多種疾病。因此，本發(fā)明也提供了這些細(xì)胞在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途以及這些細(xì)胞用于診斷或研究的用途。在其它方面，本發(fā)明提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的這些細(xì)胞。
在一些情況中，通過本方法可以將所需的遺傳修飾導(dǎo)入干細(xì)胞、或來源于干細(xì)胞的細(xì)胞。


圖1通過受體動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力評(píng)價(jià)腦RNA分化的干細(xì)胞對大鼠腦的年齡相關(guān)性損害的作用。年齡468到506天大的外飼養(yǎng)(ex-breeder)雄性大鼠靜脈內(nèi)給予未處理的骨髓干細(xì)胞或經(jīng)腦RNA提取物處理的骨髓干細(xì)胞。顯示了接受未處理的干細(xì)胞的對照大鼠的結(jié)果(實(shí)心塊)和接受了腦處理干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)大鼠的結(jié)果(空心圓)。結(jié)果表明了實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)能力的顯著增加。
圖2脊髓RNA分化的干細(xì)胞對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的動(dòng)物模型的作用。SOD1小鼠靜脈內(nèi)給予經(jīng)脊髓RNA提取物處理的骨髓干細(xì)胞、未處理的骨髓干細(xì)胞或生理鹽水。顯示了接受了脊髓RNA處理的干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)小鼠的結(jié)果(實(shí)心塊)、接受了未處理的干細(xì)胞的對照小鼠的結(jié)果(空心三角)和接受了生理鹽水的對照小鼠的結(jié)果(實(shí)心圓)。結(jié)果表明用脊髓來源的RNA對干細(xì)胞的預(yù)處理顯著地提高了干細(xì)胞治療在已建立的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病模型中的療效。
圖3通過受體動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力評(píng)價(jià)供體組織發(fā)育階段對腦RNA分化的干細(xì)胞對小鼠腦的年齡相關(guān)性損害的作用的影響。254-299天大的C57/B1小鼠靜脈內(nèi)給予經(jīng)胎兒(E15)腦RNA提取物處理的骨髓干細(xì)胞、成體(90天)腦RNA提取物處理的骨髓干細(xì)胞或未處理的骨髓干細(xì)胞。顯示了接受了未處理的干細(xì)胞的對照小鼠的結(jié)果(實(shí)心塊)、接受了胎腦處理的干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)小鼠的結(jié)果(實(shí)心圓)和接受了成體腦處理的干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)小鼠的結(jié)果(空心三角)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)小鼠增加了學(xué)習(xí)能力，接受了胎腦處理的干細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出顯著地更快的學(xué)習(xí)能力。
圖4通過受體動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力評(píng)價(jià)直接注射骨髓干細(xì)胞來源的RNA對大鼠腦的年齡相關(guān)性損害的作用。將骨髓干細(xì)胞RNA或經(jīng)RNaze處理的骨髓干細(xì)胞RNA注射到年齡433到579天之間大的外飼養(yǎng)的雄性大鼠的右側(cè)腦室內(nèi)。顯示了接受了RNaze處理的干細(xì)胞RNA的對照大鼠的結(jié)果(實(shí)心塊)和接受了干細(xì)胞RNA的實(shí)驗(yàn)大鼠的結(jié)果(空心圓)。結(jié)果表明對照大鼠不能學(xué)習(xí)任務(wù)，而經(jīng)干細(xì)胞RNA處理的動(dòng)物能學(xué)會(huì)任務(wù)，其具有與年輕大鼠相當(dāng)?shù)哪芰Α?br> 詳細(xì)描述本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)給細(xì)胞提供來自特殊來源的RNA序列可以影響細(xì)胞性質(zhì)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明與促進(jìn)由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)有關(guān)?！靶迯?fù)”意思是組織的恢復(fù)、再生、加固、更新、復(fù)壯、或部分或完全再生或更新。由干細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)可以出現(xiàn)在體外或出現(xiàn)在體內(nèi)。本發(fā)明也與干細(xì)胞向成體的、特化的細(xì)胞的分化、成體特化的細(xì)胞向干細(xì)胞的分化、和特化的成體細(xì)胞向不同特化的其它成體細(xì)胞的分化有關(guān)。通過給靶細(xì)胞提供特異的RNA序列可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。本發(fā)明也與在體外或體內(nèi)對細(xì)胞的基因型的修飾有關(guān)。
本發(fā)明通常與細(xì)胞性質(zhì)的改變有關(guān)。“性質(zhì)”意思是細(xì)胞的任何所需的性質(zhì)，包括為存在于細(xì)胞表面之內(nèi)或之上的、或細(xì)胞所分泌的生物分子類型反映的生物性質(zhì)。所需性質(zhì)包括細(xì)胞內(nèi)的特殊生物分子的活性狀態(tài)、或細(xì)胞所具有的一種特殊行為的能力。
性質(zhì)可以是潛在的性質(zhì)或者是細(xì)胞內(nèi)明顯的性質(zhì)。性質(zhì)可以是一種特殊的表型，其意思是任何可觀察到的生理的或生化的特征。這樣的表型變化可以是例如細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)、改變的免疫功能、改變的MHC限制、改變的一種或多種蛋白的活性等等。所需的表型變化可以是更為極端的，例如細(xì)胞功能從一種組織更改(redirection)為另一種組織，例如肝細(xì)胞更改為腎細(xì)胞。這樣的表型變化可以是腫瘤細(xì)胞活性向健康細(xì)胞活性的逆轉(zhuǎn)。
因此性質(zhì)可以是細(xì)胞所擁有的任何所需功能。術(shù)語“功能”意思是包括所需細(xì)胞類型所實(shí)現(xiàn)的任何生物活性。功能實(shí)例包括那些特異于特殊組織的功能，特殊組織例如是腦(例如，皮層、小腦、海馬、視網(wǎng)膜、黑質(zhì)、腦室下區(qū))、脊髓、肝臟、腎臟、肌肉、神經(jīng)組織(周圍神經(jīng)、中樞神經(jīng)、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì))、心臟組織(例如，心房、心室、瓣膜、心臟神經(jīng)支配)、免疫細(xì)胞、血液、胰腺組織、胸腺組織、脾臟、皮膚和胃腸道、肺、骨、軟骨、肌腱、毛囊、感覺器官(例如，耳、眼)、任何腺體包括內(nèi)分泌、外分泌、旁分泌腺體，例如甲狀腺、胸腺、垂體、腎上腺、胰腺、生殖系統(tǒng)(例如，睪丸、前列腺、精囊、卵巢、子宮、輸卵管、乳腺)、牙、血管、消化道組織(例如，胃、膽囊、小腸、結(jié)腸)。在更詳細(xì)的水平上，組織類型內(nèi)的特殊細(xì)胞類型的功能可能是感興趣的功能，例如在腦組織內(nèi)，神經(jīng)元細(xì)胞或皮質(zhì)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)具有更為特化的功能。仍在更詳細(xì)的水平上，所需功能可以是在分子水平上的功能，其中需要在細(xì)胞表面上表達(dá)特異分子，例如對于免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞就需要特異的T細(xì)胞受體。徹底地羅列所有的所需功能是不可能的，在每種情況中可能需要的等價(jià)功能對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
性質(zhì)的改變可能造成細(xì)胞進(jìn)行向著更為特化的形式或功能的分化，例如從干細(xì)胞向具有特化功能的成體細(xì)胞(例如肝細(xì)胞)的分化。改變也可以造成細(xì)胞進(jìn)行向著較少特化的形式或功能的逆向分化，例如從成體特化細(xì)胞向干細(xì)胞的逆向分化。改變也可以造成細(xì)胞及其子代獲得了動(dòng)員、向一種或多種組織、器官或其它部位遷移、和/或與之整合、和增殖的行為?！皠?dòng)員”意思是休眠靜息狀態(tài)的干細(xì)胞的變化，以及當(dāng)在體內(nèi)時(shí)，指的是其離開休眠靜息的位置?！斑w移”意思是干細(xì)胞從它們的動(dòng)員或人為輸送的位點(diǎn)移向和移到靶組織?！罢稀币馑际歉杉?xì)胞的相互作用以及它們與靶細(xì)胞群及環(huán)境的整合。
改變也可以造成細(xì)胞及其子代獲得了在遷移和整合之前、之中或之后增殖的行為?！霸鲋场币馑际羌?xì)胞及其子代的分裂以提供新組織。
改變也可以造成細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以獲得改變的、可遺傳的基因型。這樣一種改變的基因型可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞通過體細(xì)胞突變獲得的或細(xì)胞已經(jīng)繼承的遺傳突變。通過這種方式，可以治療或預(yù)防遺傳疾病。這樣一種改變的基因型可以提供一種遺傳改變，它提供了一種附加的、修飾的、可去除的或有缺陷的功能。這種轉(zhuǎn)化方法是一種基因治療的形式，其中細(xì)胞被遺傳學(xué)改變，優(yōu)選地是可遺傳的，使得改變可以被傳遞給任何子代。因此，用于提供被遺傳學(xué)修飾的，優(yōu)選的是可遺傳的細(xì)胞的本發(fā)明的方法可用于體細(xì)胞或生殖細(xì)胞的基因治療。其它的實(shí)例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種指導(dǎo)干細(xì)胞分化為一種或多種所需細(xì)胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述群中的干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給一群干細(xì)胞，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA序列。本發(fā)明也提供了一種在體外指導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化為一種或多種所需細(xì)胞類型、或在體內(nèi)與靶組織整合的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述群中的干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給一群干細(xì)胞，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的或提取到的。
本發(fā)明容許將分化的方向指定為一種特殊的特化(speciality)。例如，可以將干細(xì)胞指定為肝功能，或更特異地指定為肝細(xì)胞的功能。本發(fā)明容許特殊類型的干細(xì)胞，例如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)員。本方法容許遷移并整合到特殊的組織內(nèi)，例如左側(cè)股骨。
本發(fā)明提供了用于可控地操縱任何細(xì)胞特別是干細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞分化成所需分化細(xì)胞類型的方法和藥物。這些方法包括通過指定干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化提高由干細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)。
這些方法包括誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成一種或多種所需的成體細(xì)胞類型。另外，本發(fā)明也提供了用于誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞的方法?？梢越M合兩種方法，使得例如可以從分化細(xì)胞獲得干細(xì)胞，然后分化以提供不同的或相同的細(xì)胞類型的分化細(xì)胞。在后一種分化之前，可以擴(kuò)增干細(xì)胞的數(shù)目和/或按所需的模式操縱例如以導(dǎo)入所需的遺傳修飾。
例如，可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化以實(shí)現(xiàn)特異的終末分化狀態(tài)。利用本發(fā)明的方法，保證分化細(xì)胞與預(yù)期受體是免疫相容的也是可能的。選擇誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成哪種類型的細(xì)胞的能力意味著可能從單一的干細(xì)胞系或干細(xì)胞系生成多種不同的細(xì)胞類型。可以將本發(fā)明的RNA分子、或所獲得的分化細(xì)胞類型應(yīng)用于治療，或應(yīng)用于生產(chǎn)用于治療多種疾病的藥物。具體的，它們可以被用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病。本發(fā)明也提供了用于在體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化以及促進(jìn)由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能再生和/或修復(fù)的方法和藥物。
這些方法包括誘導(dǎo)一種細(xì)胞類型的干細(xì)胞分化成一種或多種其它的所需干細(xì)胞類型；誘導(dǎo)成體細(xì)胞分化成一種或多種所需的干細(xì)胞類型以及誘導(dǎo)成體細(xì)胞分化成其它的、不同的成體細(xì)胞類型。
利用RNA影響細(xì)胞命運(yùn)的能力容許修復(fù)患病細(xì)胞，容許改變細(xì)胞的遺傳組成，容許誘導(dǎo)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞命運(yùn)，容許隨意改變免疫學(xué)特征譜，容許誘導(dǎo)特殊的免疫功能等等。
干細(xì)胞可以用本發(fā)明生成或分化任何合適的干細(xì)胞。也可以用本發(fā)明在體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化。干細(xì)胞一般被理解為一種能自我更新的細(xì)胞，它也能分化成一種或多種特異的分化細(xì)胞類型。干細(xì)胞可以是多能的，即它們可以能生成多種不同的分化細(xì)胞類型。在一些情況中，干細(xì)胞可以是全能的，即它們可以能生成其所來源的生物體中的所有不同的細(xì)胞類型。本發(fā)明適用于多能干細(xì)胞或全能干細(xì)胞。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用本發(fā)明分化或獲得成體干細(xì)胞。已知干細(xì)胞出現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)的多個(gè)部位。通過本發(fā)明分化或獲得的干細(xì)胞可以是那些來自其中存在干細(xì)胞的任何器官和組織的干細(xì)胞。實(shí)例包括來自骨髓、造血系統(tǒng)、神經(jīng)元系統(tǒng)、腦的干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞。具體地，干細(xì)胞可以是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞或造血干細(xì)胞，在一個(gè)優(yōu)選的情況中，它們可以是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)元干細(xì)胞。具體地，當(dāng)用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)干細(xì)胞分化時(shí)，干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
干細(xì)胞可以是植物或動(dòng)物干細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的情況中，干細(xì)胞是動(dòng)物干細(xì)胞和優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞可以是人干細(xì)胞。或者，干細(xì)胞可以是來自非人動(dòng)物以及特別是來自非人哺乳動(dòng)物。干細(xì)胞可以是那些家養(yǎng)動(dòng)物或農(nóng)業(yè)上重要的動(dòng)物的干細(xì)胞。動(dòng)物可以是例如綿羊、豬、牛、馬、公牛、或家禽或其它商業(yè)飼養(yǎng)的動(dòng)物。動(dòng)物可以是狗、貓或鳥，以及特別是家養(yǎng)動(dòng)物。動(dòng)物可以是非人靈長類動(dòng)物，例如猴。例如，靈長類動(dòng)物可以是黑猩猩、大猩猩、或猩猩。干細(xì)胞可以是嚙齒類動(dòng)物干細(xì)胞。例如干細(xì)胞可以來自小鼠、大鼠、或倉鼠。
在另一個(gè)優(yōu)選的情況中，干細(xì)胞可以是植物干細(xì)胞。已知干細(xì)胞存在于種子和發(fā)育中的或成體的植物中的多個(gè)部位。在本發(fā)明中分化的或獲得的干細(xì)胞可以是那些來自其中存在干細(xì)胞的任何組織的干細(xì)胞。實(shí)例包括來自頂端和根部分生組織的干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞來自農(nóng)業(yè)上重要的植物。植物例如可以是玉米、小麥、水稻、馬鈴薯、生產(chǎn)可食用水果的植物或其它商業(yè)上種植的植物。
在多種情況中，可以用分化細(xì)胞治療對象或用于藥物的生產(chǎn)。在這些情況中，干細(xì)胞可以來自預(yù)期受體。特別地可以是這樣一種情況，其中為了逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞，利用本發(fā)明的方法獲得干細(xì)胞。在其它的情況中，干細(xì)胞可以來源于不同的對象，但是選擇與預(yù)期受體免疫相容。在一些情況中，干細(xì)胞可以來自預(yù)期受體的親屬，例如同胞、半同胞、表親、父母或孩子、以及特別地是來自同胞。干細(xì)胞可以來自無關(guān)對象，其已經(jīng)被組織分型并且發(fā)現(xiàn)其具有一種免疫學(xué)特征譜，它使得預(yù)期受體不會(huì)形成免疫應(yīng)答或只會(huì)形成很少的免疫應(yīng)答，對對象無害。但是，在多種情況中，干細(xì)胞、或用于生成干細(xì)胞的分化細(xì)胞可以來自無關(guān)對象，只要可以用本發(fā)明使得干細(xì)胞與預(yù)期受體免疫相容。例如，干細(xì)胞和受體可以具有或可以不具有組織相容單元型(例如，HLA單元型)。
在一些情況中，干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞、新生兒干細(xì)胞、或幼體干細(xì)胞。胚胎、胎兒、新生兒、或幼體干細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞以及特別地是全能干細(xì)胞。細(xì)胞可以是來自發(fā)育的任何階段或亞階段，具體地它們可以是來源于胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(例如胚胎干細(xì)胞)。胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細(xì)胞可以來自或來源于在此提及的任何生物體。胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細(xì)胞可以是人干細(xì)胞或非人干細(xì)胞及特別地是非人動(dòng)物干細(xì)胞(例如非人靈長類動(dòng)物)。胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細(xì)胞可以是嚙齒類動(dòng)物干細(xì)胞，以及特別地是小鼠胚胎干細(xì)胞。在一些情況中，可以回收胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細(xì)胞，然后將其用于生產(chǎn)治療同一對象的藥物，通常是在他們生命的一些階段。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中采用了胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細(xì)胞，它們是來自于已經(jīng)建立了的胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細(xì)胞系。特別地這是針對人細(xì)胞的情況。在一些情況中，干細(xì)胞可以從胚胎外組織中獲得或來源于此。干細(xì)胞可以來自臍帶，以及特別地可以來自臍帶血。
因?yàn)楣舱叩脑?，在某些司法管轄區(qū)內(nèi)，干細(xì)胞不可以是具有形成人的能力的全能干細(xì)胞。特別的情況是干細(xì)胞是人胎兒或胚胎干細(xì)胞。
本發(fā)明也適用于干細(xì)胞系。干細(xì)胞系通常是已經(jīng)從生物體中分離到的并維持在培養(yǎng)物中的干細(xì)胞群。因此，本發(fā)明可以適用于干細(xì)胞系，包括成體、胎兒、胚胎、新生兒或幼體干細(xì)胞系。干細(xì)胞系可以是克隆干細(xì)胞系，即它們可能來源于單一的干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以適用于現(xiàn)有的干細(xì)胞系，特別地適用于現(xiàn)有的胚胎和胎兒干細(xì)胞系。在其它情況中，本發(fā)明可以適用于新建立的干細(xì)胞系。
干細(xì)胞可以是現(xiàn)有的干細(xì)胞系?？梢杂糜诒景l(fā)明的現(xiàn)有的干細(xì)胞系的實(shí)例包括Geron提供的人胚胎干細(xì)胞系和Reneuron提供的神經(jīng)干細(xì)胞系。在優(yōu)選的情況中，干細(xì)胞系可以是一種可免費(fèi)獲得的干細(xì)胞系，其使用權(quán)限是對外開放的，以及特別地它是一種現(xiàn)有的干細(xì)胞系。
對于人胚胎干細(xì)胞系，在一個(gè)優(yōu)選的情況中，將使用預(yù)先存在的干細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中使用了人胚胎干細(xì)胞系，細(xì)胞系可以是這樣一種細(xì)胞系，其中在2001年8月9日下午9時(shí)EDT之前開始的衍生過程(與胚胎的破壞一起開始)。人胚胎干細(xì)胞系優(yōu)選地可以是一種從因生殖目的所捐贈(zèng)的胚胎中所生成的細(xì)胞系，其中該胚胎已經(jīng)不再需要被用于最初的目的，因?yàn)槔缢鼈儗τ谛枨笠呀?jīng)是過剩的。優(yōu)選地應(yīng)該獲得了使用胚胎生成細(xì)胞系的知情同意書。在一個(gè)優(yōu)選的情況中，所采用的人胚胎干細(xì)胞系將滿足布什總統(tǒng)在2001年8月9日所宣布的要求，這對于獲得用于胚胎干細(xì)胞研究的美國聯(lián)邦基金是必需的。這些被認(rèn)為滿足要求的干細(xì)胞系是來自澳大利亞BresaGen Inc.、CyThera Inc.、瑞典斯德哥爾摩的Karolinska研究所、澳大利亞墨爾本的Monash大學(xué)、印度Bangalore的國立生物科學(xué)中心(National Centre for Biological Sciences)、印度Mumbai的Reliance Life Sciences、以色列海法的Technion-IsraelInstitute of Technology、加州大學(xué)舊金山分校、瑞典Goteborg的Goteborg大學(xué)、和Wisconsin Alumni Research Foundation的干細(xì)胞系。
在此對干細(xì)胞的參考文獻(xiàn)通常包括也適用于干細(xì)胞系的所提及的實(shí)施方案，除非例如有證據(jù)顯示靶細(xì)胞是新分離的干細(xì)胞或干細(xì)胞是體內(nèi)固有的干細(xì)胞。本發(fā)明適用于新分離的干細(xì)胞以及也適用于包括干細(xì)胞的細(xì)胞群。也可以用本發(fā)明控制干細(xì)胞在體內(nèi)的分化。
在本發(fā)明的方法中的最初步驟可以是分離適當(dāng)?shù)母杉?xì)胞。用于分離特殊類型干細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且可以用于獲得在本發(fā)明中所使用的干細(xì)胞?？梢杂帽痉椒ɡ鐝谋景l(fā)明藥物的預(yù)期受體中回收干細(xì)胞?？梢杂酶杉?xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物特征分離干細(xì)胞，例如通過細(xì)胞分選。可以從在此所提及的任何類型的對象中獲得干細(xì)胞，特別地是從那些患有在此所提及的任何疾病的對象中獲得。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以利用本發(fā)明的方法逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化生成干細(xì)胞而獲得干細(xì)胞。具體地，從對象中回收分化細(xì)胞，在體外處理以生成干細(xì)胞，然后在回輸?shù)綄ο笾?和/或之后)可以按需操縱并分化所獲得的干細(xì)胞。因?yàn)楦杉?xì)胞通常只占個(gè)體內(nèi)存在細(xì)胞的極少數(shù)，因此這個(gè)方法可能是優(yōu)選的。這也意味著從特異個(gè)體中獲得干細(xì)胞是更為容易的，并且可以消除了對胚胎干細(xì)胞的需要。另外，這樣的一個(gè)方法通常比分離干細(xì)胞本身的方法有著更少勞動(dòng)強(qiáng)度和花費(fèi)。在一些情況中，可以從對象中分離出干細(xì)胞，在體外將其分化，然后回輸?shù)较嗤膶ο笾小＿@樣的回體方法是特別優(yōu)選的。
在一些情況中，靶干細(xì)胞可能是原位的，即它們可能是存在于對象體內(nèi)。因此，在其它方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的RNA在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也包括使用本發(fā)明的分離的RNA提高或矯正組織或細(xì)胞損害或治療遺傳疾病的方法，其中分離的RNA能誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。這樣的一種方法可以被用于例如治療退行性腦病或腦或脊髓損害。它也可以被用于治療例如肝病、心臟病、骨骼肌或心肌疾病和I型糖尿病的疾病。此外，它可以被用于對抗年齡相關(guān)性退行性疾病。
在這些實(shí)施方案中，干細(xì)胞可以是在此所提及的任何類型的干細(xì)胞，以及可以是在此所提及的任何生物體中的干細(xì)胞。靶干細(xì)胞可以存在于此處所提及的、干細(xì)胞所存在的機(jī)體內(nèi)的任何器官、組織或細(xì)胞群中。靶干細(xì)胞通常是天然存在于對象中的固有干細(xì)胞，但是在一些情況中，可以將利用本發(fā)明的方法所生成的干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到對象內(nèi)，然后用RNA轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)分化。
多種用于在培養(yǎng)物中分離、維持、擴(kuò)增、定性和操縱干細(xì)胞的技術(shù)是已知的，并且都可以被采用。在一些情況中，可以將遺傳修飾導(dǎo)入到干細(xì)胞的基因組內(nèi)。干細(xì)胞本身接受這樣的操縱，用例如PCR或Southern印跡技術(shù)可以建立并容易地篩選出克隆系?？梢杂美缁虼虬谢螂S機(jī)整合的技術(shù)將變化導(dǎo)入到細(xì)胞的基因組內(nèi)。
在一些時(shí)候，干細(xì)胞可以來源于具有遺傳缺陷的個(gè)體。然后可以進(jìn)行修飾以糾正或改善缺陷。例如，可以將缺失或缺陷基因的功能拷貝導(dǎo)入到細(xì)胞的基因組內(nèi)。可以用基因打靶導(dǎo)入所需的特異變化以及特別地是修飾缺陷基因使其變?yōu)檎??？梢杂梦稽c(diǎn)特異性重組酶去除在基因打靶過程中所涉及的選擇標(biāo)記物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以從具有遺傳缺陷的個(gè)體中獲得分化細(xì)胞，利用本發(fā)明的方法從分化細(xì)胞中獲得干細(xì)胞，糾正或改善遺傳缺陷，然后將從其中獲得的干細(xì)胞或分化細(xì)胞用于治療原始對象或用于生產(chǎn)用于治療原始對象的藥物。
在一些情況中，可以選擇干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙哂刑禺惖幕蛐汀＠?，可以用干?xì)胞生產(chǎn)分化細(xì)胞以治療具有遺傳缺陷的對象。干細(xì)胞可能缺少遺傳缺陷。例如，可以從從缺少該缺陷的對象親屬中獲得的分化細(xì)胞中獲得或生產(chǎn)干細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以來源于未患有該疾病的同胞。在一個(gè)優(yōu)選的情況中，可以用本發(fā)明的方法使得細(xì)胞與預(yù)期宿主免疫相容或更好的免疫相容。
RNA分子為了生成所需的細(xì)胞性質(zhì)的變化，本發(fā)明采用特異的RNA。所采用的RNA是包括可從包括下述細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA的RNA，所述細(xì)胞類型是誘導(dǎo)靶細(xì)胞具有一種細(xì)胞性質(zhì)或用于治療受體所需的，所采用的RNA是包括可從包括組織或細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞類型中提取的RNA的RNA，所述組織或細(xì)胞類型是再生或修復(fù)所需的。因此，在其中目標(biāo)是例如誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成所需的分化細(xì)胞類型的情況中，給靶細(xì)胞所提供的RNA通常是一種分離的RNA，它包括可從包括所需分化細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA序列。分離的RNA可以包括一種可從包括所需分化細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的或提取到的RNA。
RNA來源的均一程度部分是由所需組織類型的特異性決定的。RNA可以是從特殊的組織類型中提取的，或RNA序列可以來源于特殊的組織類型，例如腦(例如，皮層、小腦、海馬、視網(wǎng)膜、黑質(zhì)、腦室下區(qū))、脊髓、肝臟、腎臟、肌肉、神經(jīng)組織(周圍、中樞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì))、心臟組織(例如，心房、心室、瓣膜、心臟神經(jīng)支配)、免疫細(xì)胞、血液、胰腺組織、胸腺組織、脾臟、皮膚、和胃腸道、肺、骨、軟骨、肌腱、毛囊、感覺器官(例如，耳、眼)、任何內(nèi)分泌、外分泌、或旁分泌腺體、例如甲狀腺、胸腺、垂體、腎上腺、胰腺、生殖系統(tǒng)(例如，睪丸、前列腺、精囊、卵巢、子宮、法羅皮奧管、乳腺)、牙、血管、消化道組織(例如，胃、膽囊、小腸、結(jié)腸)。這些組織是由多種不同的細(xì)胞類型所構(gòu)成的，例如腦組織的組成細(xì)胞包括多種亞型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管組織、結(jié)締組織和腦固有干細(xì)胞。RNA可以來自特殊部位的特殊類型的組織，例如左側(cè)脛骨或左側(cè)額葉。因此，更為均一的細(xì)胞群可以包括神經(jīng)元，因此其中所需的細(xì)胞命運(yùn)本身是特異的(例如，用于治療年齡相關(guān)性腦病)，RNA可以是從神經(jīng)元提取的，或RNA序列可以是來源于神經(jīng)元。更為特異的，RNA可以來自特異的神經(jīng)元類型例如皮層神經(jīng)元。更為特異地，RNA可以是來自特異類型的皮層神經(jīng)元，例如多巴胺能皮層神經(jīng)元。在這樣的一些實(shí)施方案中，RNA來自純化的細(xì)胞來源。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所采用的RNA來源于特殊的組織類型或細(xì)胞或細(xì)胞系或細(xì)胞類型的組、或一個(gè)細(xì)胞系或單一細(xì)胞類型，或RNA序列來源于這樣的來源，還可以使用來自特異發(fā)育階段的供體中的這些材料的來源。因此，RNA可以來源于來自特殊發(fā)育階段的神經(jīng)元，其中發(fā)育階段與預(yù)期受體的發(fā)育階段相同、或更早或更晚。例如，用于治療心臟退行性的RNA是可以從幼體供體的心臟組織中提取的。發(fā)育階段包括胚胎、胎兒、新生兒、幼體或成體、或任一這些階段的任一亞階段。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所采用的、用于治療處于某一發(fā)育階段的受體中的組織或器官的RNA可以來源于與靶組織相關(guān)的組織或細(xì)胞類型，但是其中確切類型的來源組織只出現(xiàn)在不同的發(fā)育階段。例如，可以用來源于新生兒或年輕幼體的牙組織的RNA治療成體中的牙組織。
在本發(fā)明中所用的其它優(yōu)選的均一的、純化的RNA來源包括胎兒、新生兒或幼體細(xì)胞的純制品以及胚胎干細(xì)胞的純制品。
在需要將分化細(xì)胞的分化逆轉(zhuǎn)為所需的干細(xì)胞類型的情況中，所提供的RNA通常是一種分離的RNA，其包括可從希望獲得的所需干細(xì)胞類型中提取的RNA序列。RNA可以從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取或提取到。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，為了實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)的再生或修復(fù)，所采用的RNA來源于干細(xì)胞，并將其施用到整個(gè)生物體、或器官、或組織內(nèi)。這可以造成受體干細(xì)胞群本身的再生和活化，并對通常由這些干細(xì)胞所支持的組織隨之產(chǎn)生繼發(fā)的再生作用。在這種情況中，所提供的RNA通常是分離的RNA，其包括可從干細(xì)胞類型或干細(xì)胞活性組織中提取的RNA序列。RNA可以是可從干細(xì)胞類型或干細(xì)胞活性組織中提取或提取到的RNA。富含干細(xì)胞的組織的實(shí)例包括胎兒組織和胚胎組織、或來自正在進(jìn)行生長修復(fù)或再生期的更遲發(fā)育階段的組織。
細(xì)胞RNA提取物通常包括一個(gè)異質(zhì)群的不同的RNA分子種類。在異質(zhì)群中的RNA分子類型可以包括信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA)、核內(nèi)小RNA(snRNA)、胞質(zhì)內(nèi)小RNA(scRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)RNAs、剪接相關(guān)RNAs、信號(hào)識(shí)別顆粒RNAs、線性RNA、環(huán)狀RNA、抑制RNA(例如siRNA)、單鏈RNA、雙鏈RNA等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA包括包括所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞的RNA提取物，具體地RNA可以包括或基本上由來自所需細(xì)胞類型的提取物所組成。
因此優(yōu)選地從供體材料制備富含RNA的提取物。供體材料可以是例如死后所獲得的器官類型的來源。也可以從與受處理的細(xì)胞相同的來源、或從與所處理的細(xì)胞的預(yù)期受體獲得供體材料。例如，RNA提取物可以來自器官或組織或從器官或組織中分離到的細(xì)胞。例如，RNA提取物可以來自器官、組織或從下組中所分離到的細(xì)胞，所述組包括但不限于腦、脊柱、心臟、腎臟、脾臟、皮膚、胃腸道或肝臟。在一些實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的方法或藥物處理來源器官、組織或細(xì)胞一或多次。提取物可以來自具有特異選擇的表型的細(xì)胞系、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或具有特異的免疫學(xué)特征譜的供體組織。
RNA通常包括可從與所處理的靶細(xì)胞相同的物種中提取的RNA序列。因此，在對于為其提供RNA的靶細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞的情況中，RNA常常包括可從動(dòng)物細(xì)胞，以及特別地從與所處理的靶細(xì)胞相同物種動(dòng)物中提取的RNA序列或提取到的RNA。同樣，對于靶細(xì)胞是植物細(xì)胞的情況，RNA常常包括可從植物細(xì)胞中，以及與靶細(xì)胞相同物種的植物細(xì)胞中提取的RNA序列或提取到的RNA。
RNA可以包括從在此所提及的任何生物體或生物體組中可提取的RNA序列或提取到的RNA。RNA可以包括從在此所提及的任何干細(xì)胞類型或分化細(xì)胞類型中可提取的RNA序列或提取到的RNA。
在一些實(shí)施方案中，RNA可以包括可從與所處理的細(xì)胞的受體不同的發(fā)育階段中提取的RNA序列或提取到的RNA。例如，發(fā)育階段可以比所處理的細(xì)胞的受體更為不成熟?；蛘?，發(fā)育階段可以是更活躍的細(xì)胞產(chǎn)生階段。例如，通過用從供體胚胎組織獲得的來自神經(jīng)系統(tǒng)的RNA治療可以實(shí)現(xiàn)對脊髓損害的治療。發(fā)育階段也可以是一個(gè)表現(xiàn)出干細(xì)胞活性增強(qiáng)的階段。例如，在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA可以包括可從胎兒、新生兒、幼體或胚胎發(fā)育階段中提取的RNA序列或提取到的RNA。例如，對于RNA是可從腦細(xì)胞或組織中提取的情況，供體可以是處于正在發(fā)生廣泛的神經(jīng)發(fā)生的發(fā)育階段，例如胎兒發(fā)育階段。本發(fā)明者已經(jīng)證實(shí)提供可從早期發(fā)育階段的細(xì)胞中提取的RNA具有有利的作用，特別是對于啟動(dòng)由干細(xì)胞介導(dǎo)的組織修復(fù)。
在其它實(shí)施方案中的發(fā)育階段可以比所處理的細(xì)胞的受體更成熟，或是更不活躍的細(xì)胞產(chǎn)生階段。在一些實(shí)施方案中，RNA可以包括可從已經(jīng)被以任何方式預(yù)處理(例如，化學(xué)或物理處理)的或預(yù)條件化的(例如，鍛煉肌肉組織或誘導(dǎo)生殖組織的特殊生殖階段)組織中提取的RNA序列或提取到的RNA，這些預(yù)處理或預(yù)條件化可以修飾可提取的RNA的活性。例如，可以從已經(jīng)被應(yīng)激或損害的組織中提取RNA。
用如上討論的本發(fā)明的RNA進(jìn)行的對細(xì)胞性質(zhì)的改變可以造成靶細(xì)胞采取與從中可提取RNA的生物體相似或相同的免疫學(xué)特征譜。術(shù)語“免疫學(xué)特征譜”在此用于包括預(yù)期受體中的靶細(xì)胞的免疫學(xué)性質(zhì)。因此，可以用本發(fā)明按所需方式改變靶細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜。可以用此確保所生成的細(xì)胞、或從細(xì)胞中所生成的產(chǎn)物具有特異的免疫學(xué)特征譜。具體地，因此可以選擇提供給靶細(xì)胞的RNA，使得所形成的細(xì)胞、或細(xì)胞的產(chǎn)物具有一種免疫學(xué)特征譜，這樣它們在預(yù)期的受體體內(nèi)不具有免疫原性或只生成很小的不顯著的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地這不會(huì)形成有害的表型。因此，在優(yōu)選的情況中所提供的RNA是可從預(yù)期受體或免疫相容的對象的細(xì)胞或組織中提取的RNA序列或提取到的RNA，特別是從中可提取的RNA。這些方法學(xué)在給患者提供同種異體移植物或異種移植物時(shí)是特別有用的，可將排異的危險(xiǎn)減少到最小或預(yù)防排異的危險(xiǎn)。
改變細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜的能力可以意味著提供RNA的干細(xì)胞或分化細(xì)胞本身與預(yù)期受體不必是免疫相容的。這意味著細(xì)胞例如干細(xì)胞可能不必必需是從預(yù)期受體中分離到的，例如可以使用現(xiàn)有的干細(xì)胞或來自更為便利來源的干細(xì)胞。這也可以意味著可以采用具有特異的所需基因型的細(xì)胞以及具體的是干細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)化成相容的免疫學(xué)特征譜。例如，預(yù)期受體可以具有遺傳缺陷，而向其提供了RNA的干細(xì)胞或分化細(xì)胞可以來自不具有相同缺陷的不同對象。利用本發(fā)明可以使得供體細(xì)胞與預(yù)期受體免疫相容，同時(shí)也代償了遺傳缺陷。
因此可以用利用本發(fā)明的RNA對細(xì)胞性質(zhì)的改變改變細(xì)胞的免疫性質(zhì)，這樣就可以施用相對于所治療的個(gè)體是同種異體的或甚至是異種的細(xì)胞，這具有最小化的細(xì)胞排異危險(xiǎn)。例如，可以將在注射之前用人RNA處理過的豬細(xì)胞導(dǎo)入到人患者體內(nèi)，通過細(xì)胞表面分子表達(dá)的改變以及將它們用自身分子取代而將排異的危險(xiǎn)最小化，否則，所述細(xì)胞表面分子將被所治療的個(gè)體識(shí)別為非自身的。因此，分離的RNA可以包括可從與所處理的靶細(xì)胞不同的物種中提取的RNA序列或提取到的RNA。
可以用利用如上討論的本發(fā)明的RNA對細(xì)胞性質(zhì)的改變增強(qiáng)患病患者的免疫功能。例如，可以從或經(jīng)自然抗性或經(jīng)疫苗接種對疾病免疫或相對免疫的患者或物種中分離到用于治療的RNA序列。RNA可以具有給所治療的對象賦予抗性的作用，例如通過誘導(dǎo)從中提取到RNA的個(gè)體的細(xì)胞所已經(jīng)具有的所需免疫功能或性質(zhì)。一個(gè)實(shí)例是病原性或病毒性疾病的發(fā)病率。在這樣的情況中，可能是從相同或不同物種的抗病個(gè)體的免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞中提取的RNA賦予了所治療的個(gè)體所需的免疫功能。一個(gè)實(shí)例可以是HIV的情況，其對黑猩猩或某些組的人都具有很小的致病作用。為了賦予人患者對AIDS的抗性，可以將從黑猩猩或這些組的人的免疫細(xì)胞中提取的RNA施用給人或給從人中分離到的免疫細(xì)胞，然后將其重新導(dǎo)入到人體內(nèi)。
可以用利用如上討論的本發(fā)明的RNA對細(xì)胞性質(zhì)的改變逆轉(zhuǎn)腫瘤生長。在此假定通過將腫瘤細(xì)胞暴露到可從健康細(xì)胞、或處于早期發(fā)育階段中的細(xì)胞中提取的RNA序列或提取到的RNA，腫瘤細(xì)胞可以被誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)成為正常的、健康的表型，或變得易感于免疫系統(tǒng)或遺傳完整性維護(hù)系統(tǒng)例如p53介導(dǎo)的凋亡的清除。
RNA的制備目前存在著多種用于提取供體RNA的技術(shù)?？梢杂眠@些技術(shù)獲得提供給靶細(xì)胞的RNA。或者，可以用這些技術(shù)提供RNA以鑒定RNA提取物中的必需RNA分子的序列(例如通過分級(jí)分離和篩選)。因此，本發(fā)明包括一種用于篩選RNA序列的方法，所述RNA序列能將所需的性質(zhì)從一種細(xì)胞類型賦予給另一種細(xì)胞類型，其包括步驟i.從包括所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取RNA；ii.將所提取到的RNA分成不同的部分；iii.將一個(gè)部分提供給一種或多種測試細(xì)胞和/或測試受體；iv.分析測試細(xì)胞或受體的從中提取出RNA的所需細(xì)胞類型所具有的改變的性質(zhì)。
其中將向測試細(xì)胞或受體賦予改變的性質(zhì)的部分鑒定為包括能賦予所需性質(zhì)的RNA序列。
通過將RNA提取物分級(jí)分離并利用合適分析的分析RNA功能，這個(gè)篩選方法鑒定出能將所需性質(zhì)從一種細(xì)胞類型賦予給另一種細(xì)胞類型的RNA序列。合適分析的一個(gè)實(shí)例是在下面的實(shí)施例1中所述類型的實(shí)驗(yàn)。分析包括將分離的RNA提供給一群細(xì)胞，分離的RNA包括可從包括特殊細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA；并確定細(xì)胞性質(zhì)是否被改變?yōu)樗鏊杓?xì)胞類型的性質(zhì)。這樣，提取物中的RNA可以被鑒定為對于本發(fā)明的目的不是必需的，并可以將其忽略(即將RNA組合物簡單化或標(biāo)準(zhǔn)化)，最終只留下起到所需活性作用的RNA分子或RNA分子的組。
因此，本發(fā)明也預(yù)期了(envisage)在RNA提取物中的已經(jīng)被鑒定為能將所需性質(zhì)從一種細(xì)胞類型賦予到另一種細(xì)胞類型的特異RNA序列、特異RNA亞型、或特殊RNA結(jié)構(gòu)的用途?？梢匀斯ず铣蛇@些RNA分子。在一些情況中，RNA可以是基于可提取序列的序列的人工或合成的RNA或RNA類似物。類似物可以根據(jù)穩(wěn)定性或能進(jìn)入靶細(xì)胞的能力或其它所需性質(zhì)選擇。
因此，在本發(fā)明中所采用的RNA也可以是一種包括可從包括如下一或多種細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA序列的RNA，所述一或多種細(xì)胞類型所具有的一種細(xì)胞性質(zhì)是意欲誘導(dǎo)靶細(xì)胞以便使之具有的細(xì)胞性質(zhì)。因此，對于目標(biāo)是例如誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成所需的分化細(xì)胞類型的情況，提供給靶細(xì)胞的RNA通?？梢允且环N分離的RNA，其包括可從包括所需分化細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA序列。
或者，可以例如從供體來源中制備RNA。合適的技術(shù)包括用冷或熱苯酚提取法制備?；蛘撸ㄟ^采用商業(yè)化可獲得的試劑盒可以從特異組織或細(xì)胞中制備RNA，特別地，這些試劑盒基于蛋白的變性以及經(jīng)離心分離RNA。例如，在一個(gè)優(yōu)選的提取方案(冷苯酚)中，將原代供體組織或細(xì)胞勻漿于一體積的生理鹽水中。加入等體積的95％飽和苯酚，最初在超速離心機(jī)中在18,000rpm下離心30分鐘。保留水相，并通過加入1M MgCl2將其變成0.1M MgCl2溶液。然后加入兩體積乙醇，沉淀約30分鐘。在6,000rpm下最終離心15分鐘，生成了富含RNA的沉淀，可以將其保留并儲(chǔ)存在乙醇中?；蛘撸梢杂萌魏紊虡I(yè)化可獲得的RNA提取試劑盒(例如，RNAzolTM)制備活性的富含RNA的提取物。但是，提取RNA的精密方法學(xué)對于本發(fā)明通常不是關(guān)鍵的。
在一些情況中，可以采用RNA提取物的特異部分。例如，可以根據(jù)提供給靶細(xì)胞的RNA種類的大小和特殊的重量范圍將RNA群分級(jí)分離。分級(jí)分離也可以基于重量、電荷、或可識(shí)別的普通化學(xué)特征(例如，結(jié)構(gòu)、核苷酸特殊的共有序列或形式的存在)、或大小、重量或電荷或普通化學(xué)特征的任何組合。
在一些實(shí)施方案中，所采用的RNA可以包括或由提取物中存在的mRNA序列組成。在一些實(shí)施方案中，RNA部分或RNA分子可以特異地影響分化過程的一些部分，但不影響其它部分。例如，一種RNA類型或分子可以只誘導(dǎo)遺傳改變，但對例如遷移、終末分化、整合或增殖都沒有任何作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA類型或分子可以影響除遺傳修飾以外的所有因素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA類型或分子只能影響遷移的定位、或只能影響增殖的程度、或只能影響終末分化的表型細(xì)胞類型，但不能影響任何其它方面。在一些情況中，RNA可以包括可從不同的細(xì)胞類型或組織中提取的序列的混和物。例如，RNA種類可以包括可從兩種、三種、四種、五種或更多的不同的細(xì)胞類型中提取的序列的混和物。對于需要分化干細(xì)胞的情況，RNA可以是例如可從不同的細(xì)胞類型中提取的，以生成具有兩種細(xì)胞類型特征的分化細(xì)胞。對于將RNA提供給具有遺傳缺陷的靶細(xì)胞的情況，RNA可以是可從包括和缺乏該缺陷的細(xì)胞中提取的序列的混和物。例如，RNA可以包括從來自具有缺陷的對象的細(xì)胞和來自缺乏缺陷的另一個(gè)對象的相同類型的細(xì)胞中提取的RNA提取物的混和物。在一些情況中，可以不存在可從所需細(xì)胞類型中提取的特異序列。例如，可以去除缺陷基因的轉(zhuǎn)錄物。例如，通過選擇性降解或通過雜交可以實(shí)現(xiàn)對特異序列的去除?？梢杂煤嗣阜纸馓禺愋蛄?。也可以用具有一定程度特異性的RNase分子。
可以往可提取序列中加入或從中去除特異序列。例如，在一些情況中，RNA可以來源于預(yù)期為所產(chǎn)細(xì)胞的最終受體的對象，以及該對象可以缺乏特異的基因序列或具有有缺陷的基因序列。在這些情況中，可以往提取物中加入對應(yīng)于編碼缺失或缺陷基因的表達(dá)產(chǎn)物的RNA的額外RNA。在這些情況中，可以修復(fù)、修飾、去除或選擇性降解靶向的遺傳序列。
對于RNA是可從干細(xì)胞中提取的情況中，優(yōu)選干細(xì)胞包括在此所提及的任何干細(xì)胞，以及特別是成體干細(xì)胞。干細(xì)胞例如可以是造血干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)元干細(xì)胞。對于RNA是可從分化細(xì)胞中提取的情況中，分化細(xì)胞可以是任何的分化細(xì)胞，以及特別是成體分化細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分化細(xì)胞可以選自骨髓細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、或造血細(xì)胞。分化細(xì)胞可以來自任何的哺乳動(dòng)物器官，例如腎臟、肝臟、心臟、胰腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖器官和其它器官。
在一些實(shí)施方案中，可從細(xì)胞中提取的并在本發(fā)明的方法中所用的分離的RNA在衍生作用上是天然的。這意味著RNA不含有非天然的序列，并完全是由來自細(xì)胞所屬物種的RNA組成的。在一些實(shí)施方案中，RNA不含有病毒的、外源逆轉(zhuǎn)錄病毒或病原體序列。在一些實(shí)施方案中，RNA是均一的混和物，不含有siRNA、miRNA或其它類型的干擾RNA。在一些實(shí)施方案中，RNA可以不編碼蛋白(例如，RNA在沒有位于蛋白編碼區(qū)兩側(cè)的框內(nèi)起始和終止密碼子)。在一些實(shí)施方案中，RNA不是可從腫瘤細(xì)胞中提取的。在一些實(shí)施方案中，RNA不含有一類直接激活抗病毒的免疫應(yīng)答的雙鏈RNA(例如，通過與Toll受體結(jié)合)。在一些實(shí)施方案中，RNA不含有反義RNA(例如，沒有與也存在的RNA轉(zhuǎn)錄物的有義鏈互補(bǔ)的RNA)。本發(fā)明所用的RNA可以是整合的或非整合的。它能或不能復(fù)制。它可以有或可以沒有5’帽。它可以有或可以沒有聚腺苷酸尾。它可以作用為或可以不作用為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶的底物。
修飾的RNA和類似物本發(fā)明一般涉及RNA的用途。該RNA包括能從包括所需特征的細(xì)胞中提取的序列。RNA向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)移引起了靶細(xì)胞的所需變化，該變化是由RNA決定的。
如在此所示的，決定變化的RNA是活性的，甚至當(dāng)在靶細(xì)胞RNA的苯酚提取物內(nèi)被輸送時(shí)仍是活性的。該苯酚提取物含有多種不同的RNA分子。如果活性與提取物內(nèi)特異的RNA分子和/或序列有關(guān)，為了簡化制備和質(zhì)量控制，優(yōu)選地是輸送特異的RNA而不是復(fù)合物混和物。通過純化RNA提取物可以制備特異的RNA，或者可以合成或人工制備特異的RNA(例如，通過化學(xué)合成，至少部分化學(xué)合成，或通過在從模板核酸中轉(zhuǎn)錄出特異的RNA之后的純化)。
因此本發(fā)明提供了一種用于制備本發(fā)明所用的RNA的方法，其包括用化學(xué)手段、至少部分合成RNA的步驟。本發(fā)明也提供了一種用于制備本發(fā)明所用的RNA的方法，其包括步驟將所述RNA的模板與RNA聚合酶接觸，從而聚合酶可以與模板相互作用以生成所述RNA。RNA聚合酶可以是RNA依賴性RNA聚合酶，但通常是DNA依賴性RNA聚合酶(即模板優(yōu)選是DNA，例如質(zhì)粒形式的DNA)。
可以修飾RNA分子以增加細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期?？赡艿男揎棸ǎ幌抻谠诜肿拥?’和/或3’末端添加側(cè)翼序列或在分子的骨架內(nèi)應(yīng)用硫代磷酸或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵。這個(gè)概念在生產(chǎn)PNA中是固有的，并可以將其擴(kuò)展到這些分子的任何一種分子中，通過包含非傳統(tǒng)的堿基例如次黃嘌呤核苷、queosine和butosine、以及腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙?；?、甲基化、硫化及相似的修飾形式，這些修飾形式是不容易被內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶所識(shí)別的。堿基例如假尿嘧啶、甲基胞嘧啶和次黃嘌呤核苷可以存在于這些RNA分子中。也可能包括DNA核苷酸以形成DNA/RNA嵌合體。修飾骨架的應(yīng)用是本發(fā)明的修飾RNA分子的優(yōu)選特征。
也可以使用RNA類似物和模擬物?？梢杂美鏚irshenbaum等(1999)所述的方法制備并使用模擬天然RNA結(jié)構(gòu)的聚合物。這些修飾的分子和類似物在此可以被認(rèn)為是“RNA”，盡管從嚴(yán)格的化學(xué)觀點(diǎn)上看，它們并不是簡單的核糖核酸。
給靶細(xì)胞提供RNA可以在體外或在體內(nèi)給靶細(xì)胞提供RNA。RNA也可以被用于生產(chǎn)用于在原位給靶細(xì)胞提供RNA的藥物的生產(chǎn)。這特別是對于將RNA提供給動(dòng)物體內(nèi)的靶細(xì)胞的情況。對于植物，本發(fā)明也提供了在體外和在體內(nèi)將RNA提供給靶細(xì)胞的方法。通過任何合適的技術(shù)都可以將RNA提供給靶細(xì)胞。
用于給細(xì)胞提供核酸分子的多種方法都是已知的，并且都可以采用。例如，合適的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體包囊化(encapsulation)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微球包囊化、利用病毒包膜顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)和微注射。可以采用Graham&van der Eb(1978)的磷酸鈣沉淀法。在美國專利No.4,399,216中已經(jīng)描述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面，可以將其采用。對于多種用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)，見Keown等(1990)和Mansour等(1988)。在一些情況中，RNA或被包裹的RNA可以與化學(xué)試劑結(jié)合，這增強(qiáng)了靶細(xì)胞對其的攝取。例如，可以將含RNA顆粒的RNA與特異于合適受體的抗體連接。這樣的靶向化學(xué)物可以增加所有細(xì)胞類型的攝取，或可以具有特異于特殊細(xì)胞類型或干細(xì)胞類型的作用?；蛘?，可以施用沒有與這些試劑結(jié)合的RNA，例如裸RNA。在一些情況中，可將RNA簡單地加入到細(xì)胞的培養(yǎng)基中一段合適的時(shí)間。例如，可以將細(xì)胞和RNA一起培養(yǎng)從1分鐘到10天，優(yōu)選的是從1個(gè)小時(shí)到5天，更優(yōu)選的是從6個(gè)小時(shí)到2天。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將RNA與細(xì)胞一起培養(yǎng)12到24個(gè)小時(shí)，特別是12個(gè)小時(shí)。對于提供的RNA是包括RNA序列的脂質(zhì)體形式，可以采用相似的時(shí)間段。
在其它實(shí)施方案中，RNA可以被用于治療方法或用于容許將RNA在體內(nèi)提供給干細(xì)胞或其它細(xì)胞的藥物的生產(chǎn)。在這些情況中，RNA通常被配制，使得藥物是適合于施用給預(yù)期對象的形式。
藥物可以是RNA處于脂質(zhì)體內(nèi)以促進(jìn)輸送或被包裝在病毒包膜顆粒內(nèi)的形式。RNA可以是裸RNA分子或與蛋白質(zhì)、特別是與已知能增加細(xì)胞對核酸攝取的蛋白質(zhì)復(fù)合的RNA分子。
可以在給予其它治療之前、與之同時(shí)或之后聯(lián)合施用藥物，這增加了藥物在體外或在體內(nèi)保持其活性狀態(tài)的時(shí)間。例如，可以將已知的RNase抑制物用于這種治療。或者，可以給予飽和劑量的無效(inactive)或犧牲(sacrificial)RNA以阻斷現(xiàn)有RNase活性。
可以在全身或局部給予其它治療之前、與之同時(shí)或之后聯(lián)合施用藥物，這增加了藥物在體外或在體內(nèi)的攝取或作用。例如，在組織損害后以局灶或全身方式分泌的分子可以增強(qiáng)藥物的攝取。這些分子可以來源于受損組織本身，或來源于干細(xì)胞來源。在另一個(gè)實(shí)例中，可以聯(lián)合本發(fā)明的RNA在體外使用已知的特異組織的組織分化非RNA誘導(dǎo)物，例如用視黃酸有助于神經(jīng)元組織的分化。在另一個(gè)實(shí)例中，可以與藥物聯(lián)合使用已知的組織培養(yǎng)物的非RNA支持物，例如在脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)物中的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
可以用任何合適的途徑輸送包括RNA的藥物。例如，可以腸胃外施用藥物，并可以經(jīng)靜脈內(nèi)、直腸、口服、耳、骨內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮膚、皮內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部、胸內(nèi)、眶內(nèi)、腦脊液內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)(或其它粘膜)、肺、吸入、或其它適當(dāng)?shù)慕o藥途徑輸送藥物?？梢詫⑺幬镏苯邮┯玫剿杵鞴倩蚪M織上，或可全身施用。在特別優(yōu)選的給藥途徑中，包括通過直接器官注射、血管通路、或通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下途徑?？梢砸赃@種方式配制RNA以有助于向靶細(xì)胞輸送。
可以提供金屬顆粒上的RNA。在一些情況中，可以施用藥物，使得將裸RNA提供給靶細(xì)胞。對于所提供的RNA存在于脂質(zhì)體或其它顆粒內(nèi)的情況，在顆粒表面上可以具有靶向分子，以容許靶向預(yù)期的干細(xì)胞。例如，顆粒可以包括靶干細(xì)胞或靶分化細(xì)胞上的受體的配體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將RNA經(jīng)用Felgner等(1987)的方法所制備的脂質(zhì)體輸送到細(xì)胞內(nèi)。其它合適的脂質(zhì)里包括免疫脂質(zhì)體(例如，US4,957,735)。
也可以將RNA制品與細(xì)胞例如干細(xì)胞一起施用給生物體。施用可以是同時(shí)的、分開的或順序的。也可以與治療特殊疾病的其它有效的治療同時(shí)地、分開地或順序地施用本發(fā)明的細(xì)胞和RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以與細(xì)胞例如干細(xì)胞同時(shí)地、分開地或順序地施用可從一種或多種干細(xì)胞類型或干細(xì)胞活性組織中提取的RNA。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以與干細(xì)胞特別是骨髓干細(xì)胞同時(shí)地、分開地或順序地施用全胚胎RNA、胎兒RNA、新生兒RNA、或幼體RNA。表明通過共注射胚胎衍生的RNA部分與干細(xì)胞提高了由干細(xì)胞介導(dǎo)的組織修復(fù)和再生。
細(xì)胞和藥物組合物本發(fā)明提供了用本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞。提供的細(xì)胞可以是在合適容器中的冷凍細(xì)胞。可以提供培養(yǎng)物中的細(xì)胞。也提供了細(xì)胞的提取物，例如全細(xì)胞提取物。
本發(fā)明也提供了包括本發(fā)明的多種RNA分子、干細(xì)胞和/或分化細(xì)胞的藥物組合物?？梢詫NA分子、干細(xì)胞和分化細(xì)胞與在藥物領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑一起配制?？梢圆捎煤线m的用于配制細(xì)胞和核酸的技術(shù)?？梢蕴峁┥睇}水或注射用水中的細(xì)胞或核酸。配方的確切性質(zhì)將依賴于一些因素，包括所施用的特殊物質(zhì)和所需的給藥途徑。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，19thEdition，Mack Publishing Company，Eastern Pennsylvania，USA中充分地描述了合適的劑型類型，通過引用的方式將其全文并入本申請?；赗NA的藥物在本領(lǐng)域是已知的。例如，“Ampligen”(Hemispherx Pharma)是一種包括雙鏈RNA分子的藥物。
除了上面提及的成分之外，本發(fā)明的組合物通常還包括一種或多種藥學(xué)可接受的載體，其包括本身不會(huì)誘導(dǎo)生成對接受組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、緩慢代謝的大分子例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、糖、和脂聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)。這些載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員都是熟知的。組合物也可以含有稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。另外，可以存在輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等等。無菌無致熱原的、磷酸緩沖的生理鹽水是一種常用的載體。在Gennaro(2000)中可得到對藥學(xué)可接受的賦形劑的全部討論。
本發(fā)明的組合物通常是水樣的形式(例如，溶液或懸浮液)，但是它們還可以是干燥的形式(例如凍干)。液體制劑容許直接施用來自其包裝形式的組合物，不需要在水性介質(zhì)中進(jìn)行復(fù)水(reconstitution)，因此其是注射用的理想劑型。組合物可以存在于藥瓶內(nèi)，或它們可以存在于預(yù)先填滿的注射器中。注射器可以有或沒有針頭。一個(gè)注射器將包括單一劑量的組合物，其中一個(gè)藥瓶可以包括單個(gè)劑量或多個(gè)劑量。
可以以單位劑量的形式或以多個(gè)劑量的形式包裝本發(fā)明的組合物。對于多個(gè)劑量的形式，藥瓶優(yōu)選地是預(yù)先填滿的注射器。可以常規(guī)建立有效的劑量體積，但是用于注射的典型的人劑量體積是0.5ml。
用于患者給藥的組合物的pH值優(yōu)選地是在6和8之間，優(yōu)選地約為7。通過在組合物中包含緩沖液可以維持穩(wěn)定的pH值(例如，組氨酸或磷酸緩沖液)。組合物通常將是無菌的和/或無致熱原的。組合物相對于人體應(yīng)當(dāng)是等滲的。本發(fā)明的組合物可以包括提供張力的鈉鹽(例如氯化鈉)。
本發(fā)明的組合物可以包括一種抗微生物素，特別是當(dāng)組合物被包裝成多劑量形式時(shí)。用于給靶細(xì)胞提供在此所討論的RNA的多種RNA制品和組合物也可以包括增加RNA穩(wěn)定性的試劑。例如，它們可以包括RNase抑制劑或其它穩(wěn)定RNA和/或不含RNA避免降解的試劑。也可以處理RNA制品以去除其它類型的分子，例如可以用蛋白酶或DNase處理去除蛋白和/或DNA。因此，組合物可以基本上沒有DNA和/或蛋白。
本發(fā)明的一些藥物組合物包括根據(jù)上述任一實(shí)施方案的從細(xì)胞或組織中提取到的RNA的組合，單獨(dú)或與干細(xì)胞聯(lián)合?？梢耘c其它的活性試劑一起給患者施用本發(fā)明的細(xì)胞，例如一種或多種抗炎劑、抗凝劑和/或人血清白蛋白(優(yōu)選地是重組的)，它們通常是在同一個(gè)注射液中。通常給患者施用細(xì)胞，細(xì)胞基本上是其離開培養(yǎng)物時(shí)的形式。但是，在一些情況中，可以在生產(chǎn)和施用之間處理細(xì)胞?？梢栽谏a(chǎn)和施用之間保存細(xì)胞(例如深低溫保存)。細(xì)胞可以存在于維持培養(yǎng)基中。
特別感興趣的特異組合包括從腦組織、神經(jīng)元細(xì)胞、皮層神經(jīng)元等中提取到的RNA與干細(xì)胞例如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的組合物；脊髓RNA與干細(xì)胞例如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的組合；胎兒RNA與干細(xì)胞例如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的組合；胚胎來源的RNA例如胚胎干細(xì)胞RNA與干細(xì)胞例如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的組合。治療的實(shí)例包括用骨髓干細(xì)胞和胎兒腦RNA治療Alzheimer病；用骨髓干細(xì)胞和來自從幼體供體中獲得的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)物的RNA治療帕金森病；用來自幼體或成體尸體的RNA處理過的骨髓干細(xì)胞治療心臟?。挥脕碜哉３审w尸體的胰腺的胰島細(xì)胞的RNA處理的CD34+的循環(huán)干細(xì)胞治療糖尿??；用經(jīng)來源于少突膠質(zhì)的原代培養(yǎng)物的RNA處理過的骨髓干細(xì)胞治療多發(fā)性硬化。將這些組合物同時(shí)地、分開地或順序地施用給患有疾病的患者體內(nèi)，疾病是適合于本發(fā)明治療的疾病(盡管在每種情況中，通過只給受體直接施用RNA也可以實(shí)現(xiàn)治療)。上面顯示了這些疾病的實(shí)例。其中，一起施用干細(xì)胞和RNA，它們可以被分開或混和包裝，然后它們可以被分開或混和施用。
給對象施用治療有效量的藥物、組合物、細(xì)胞或RNA分子。根據(jù)多種參數(shù)可以確定出劑量，特別是根據(jù)所用的物質(zhì)、所治療的患者的種族、年齡、體重和病變包括免疫狀態(tài)、給藥途徑、和所需的用藥方案。醫(yī)生能為任何特殊的患者確定出所需的給藥途徑和劑量?？梢越Y(jié)合所治療的對象的年齡、體重和病變、退行性的類型和嚴(yán)重度以及給藥的頻率和途徑確定出劑量。
提供給靶細(xì)胞的RNA的量將足以給細(xì)胞性質(zhì)帶來所需的改變。例如，RNA的濃度(例如在本發(fā)明的組合物中)可以從10ng到5mg/ml，優(yōu)選地從100ng/ml到2.5mg/ml，更優(yōu)選地從1μg/ml到500μg/ml，甚至更優(yōu)選地從5μg/ml到100μg/ml，以及仍更優(yōu)選地從10到50μg/ml。在一個(gè)特別優(yōu)選的情況中，RNA濃度可以從15到40μg/ml，優(yōu)選地從20到35μg/ml以及特別是25μg/ml。這些濃度可以應(yīng)用于體外或體內(nèi)的應(yīng)用。在一些情況中，可以施用總共100ng到0.1g的RNA，優(yōu)選地從1μg到50mg，更優(yōu)選地從100μg到10mg，仍更優(yōu)選地從250μg到1mg的RNA?？梢蕴峁┤魏魏线m的濃度和/或量的RNA?？梢圆捎么蠓秶臐舛群?或量的RNA，以及根據(jù)向靶細(xì)胞或組織輸送RNA的方法、RNA的來源和是否在體外或在體內(nèi)提供，精確的濃度和/或量都可以有所不同。為了帶來所需的改變，常規(guī)將提供給靶細(xì)胞的RNA的量最優(yōu)化。
本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明的RNA(包括RNA模擬物、類似物和修飾RNA)的藥物組合物，其中組合物(i)具有6和8之間的pH值；(ii)包含一種緩沖液；(iii)是無菌的；以及(iv)基本上沒有致熱原。組合物中的RNA優(yōu)選地是均一的。RNA優(yōu)選地是組合物中的活性藥物制劑。組合物優(yōu)選地位于一個(gè)容器內(nèi)，將容器標(biāo)簽以說明組合物的藥用目的。
用于治療對象的藥物和方法可以用本發(fā)明所提供的干細(xì)胞、RNA和分化細(xì)胞治療大量疾病以及生產(chǎn)合適的藥物。具體地，可以用本發(fā)明的RNA和細(xì)胞提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病，以及生產(chǎn)合適的藥物。
本發(fā)明可以采用多種方法治療這些疾病并提供合適的藥物。具體地，給所治療的對象施用本發(fā)明的藥物可以造成(a)為了在原位誘導(dǎo)細(xì)胞(例如干細(xì)胞)的分化，給對象施用本發(fā)明的RNA；或?yàn)榱嗽谠徽T導(dǎo)細(xì)胞(例如干細(xì)胞)的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化，給對象施用本發(fā)明的RNA；(b)給對象施用本發(fā)明獲得的干細(xì)胞；(c)給對象施用利用本發(fā)明的方法獲得的分化細(xì)胞；(d)在施用細(xì)胞(例如干細(xì)胞或分化細(xì)胞)之前、與之聯(lián)合或之后給對象施用本發(fā)明的RNA，其中通過本發(fā)明的方法可能已經(jīng)改變或沒有改變細(xì)胞；和/或(e)在給對象施用細(xì)胞之前、或之后，用本發(fā)明的RNA處理干細(xì)胞。
(f)給對象施用利用本發(fā)明的方法所獲得的具有改變的性質(zhì)的細(xì)胞或干細(xì)胞；一般而言，在本發(fā)明的(b)到(f)的部分，在一些情況中，可能需要利用本發(fā)明的方法提供在數(shù)目上有所缺少、耗竭或有功能缺陷的細(xì)胞類型?？梢越o特異的部位或更大的區(qū)域提供本發(fā)明的細(xì)胞。例如，可以給損害或損傷的組織或器官的部位例如傷骨或斷骨提供細(xì)胞?？梢越o神經(jīng)損傷的部位提供細(xì)胞，特別是給脊柱損傷的部位?？梢越o受損的或患病的肝臟、腎臟、心臟或其它器官提供細(xì)胞。對于受損的或有缺陷的心肌疾病的情況，例如心臟病的情況，死亡的或受損的細(xì)胞可以被放大或取代。同樣地，可以給患有肝病例如肝纖維化或其它類型的肝臟損害的對象提供細(xì)胞。通常提供了利用本發(fā)明的方法獲得的分化細(xì)胞或具有改變的性質(zhì)(潛在的或明顯的)的細(xì)胞，但是在一些情況中，可以提供利用本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞，并容許其原位分化。
a)RNA治療在此顯示了給對象施用從腦細(xì)胞中提取到的RNA具有刺激患者體內(nèi)的固有干細(xì)胞以增厚腦皮層的作用。此外，已經(jīng)證實(shí)從已知顯示出增加干細(xì)胞活性的發(fā)育階段中制備的RNA能刺激內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制。在上述方法學(xué)的一個(gè)實(shí)施方案中，給對象施用本發(fā)明的RNA在原位誘導(dǎo)了細(xì)胞(例如干細(xì)胞)的分化，通過這種方式促進(jìn)了由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)。給藥可以在原位誘導(dǎo)細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和分化，以促進(jìn)由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)。
因此，本發(fā)明的這個(gè)方面提供了一種在體內(nèi)指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)分化為一種或多種所需細(xì)胞類型或組織的功能或性質(zhì)的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞的所需分化的條件下提供給一群細(xì)胞，分離的RNA包括可從包括所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的或提取到的。細(xì)胞群優(yōu)選是組織，例如生長在體外的分離的組織或生物體例如人類患者。
本發(fā)明也提供了一種提高或矯正對象中的組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的方法，方法包括誘導(dǎo)對象中的全能或多能的固有干細(xì)胞分化(例如具有動(dòng)員、遷移、整合和增殖)成一種或多種所需的細(xì)胞類型(例如在靶位置)，該方法包括將分離的RNA序列在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需分化(例如動(dòng)員、遷移、整合和增殖)的條件下提供給原位固有干細(xì)胞，分離的RNA序列包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA。RNA可以是可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的或提取到的。可以用本發(fā)明的方法在體內(nèi)或在體外提高由干細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)部分提供了一種誘導(dǎo)動(dòng)物或植物的組織中的全能或多能干細(xì)胞分化成一種或多種所需細(xì)胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所述分化的條件下提供給所述干細(xì)胞，分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的或提取到的。干細(xì)胞停留在生物體內(nèi)并在原位暴露于RNA。
可以用本發(fā)明治療、緩解和逆轉(zhuǎn)腫瘤生長。上面假設(shè)通過將腫瘤細(xì)胞暴露于可從健康細(xì)胞或處于早期發(fā)育階段的細(xì)胞中提取的RNA序列(例如胎兒RNA、胚胎細(xì)胞RNA、新生兒RNA或幼體RNA)，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為更正常、健康的表型。在本發(fā)明的這個(gè)部分，用于治療腫瘤細(xì)胞的RNA序列可以來源于從患者或相關(guān)個(gè)體、無關(guān)個(gè)體、或甚至不同物種的個(gè)體中分離到的健康細(xì)胞。優(yōu)選地，RNA是來自緊密相關(guān)的個(gè)體。用于治療的RNA所起源的細(xì)胞類型優(yōu)選是與致腫瘤組織相似的細(xì)胞類型或相同的細(xì)胞類型。如熟練人員所知道的那樣，目前存在多種用于分型腫瘤細(xì)胞的技術(shù)。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以用本方法在患者體內(nèi)(任選地在原位)將一種細(xì)胞類型的所需性質(zhì)任意地賦予給另一種細(xì)胞類型。例如，通過相同的方式，可以將所需的免疫學(xué)特征譜賦予給靶細(xì)胞，通過從具有所需性質(zhì)的細(xì)胞類型中提取RNA并將靶細(xì)胞暴露于該RNA可以將特殊細(xì)胞類型所具有的所需性質(zhì)賦予靶細(xì)胞。實(shí)例包括從訓(xùn)練有素的運(yùn)動(dòng)員的肌肉細(xì)胞中提取RNA，以賦予被治療患者所需的功能；轉(zhuǎn)移疫苗接種或天然抗病個(gè)體中對疾病的抗性；和強(qiáng)化患病患者的免疫功能。
在一些情況中，本發(fā)明的藥物和方法可以包括將本發(fā)明的RNA提供給原位靶干細(xì)胞。這可以造成固有干細(xì)胞分化生成所需的分化細(xì)胞類型?？梢詫⑦@樣的一種方法用于任一種上面所提及的病變和疾病。在這樣的一種方法中，通常輸送RNA，使得它僅僅影響相當(dāng)局限的一群干細(xì)胞。優(yōu)選地，靶向的干細(xì)胞可以是那些生成疾病所涉及的特殊細(xì)胞類型的細(xì)胞，但并不一直都是這樣。例如，對象可能患有免疫系統(tǒng)疾病，就可以靶向于造血干細(xì)胞。
通過給適合的組織或器官局部提供RNA可以實(shí)現(xiàn)向所選定的干細(xì)胞群的輸送。例如，RNA的施用可以是靜脈內(nèi)、直腸、口服、耳內(nèi)、骨內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮膚、皮內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部、胸內(nèi)、眶內(nèi)、腦脊液內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)(或其它粘膜)、肺、或吸入到感興趣的位置。例如，可以通過局部注射提供RNA。可以通過將RNA注射到血管或其它脈管內(nèi)并到達(dá)所需的靶位置以提供RNA?？梢酝ㄟ^局部注射到所需組織以施用RNA?？梢酝ㄟ^在此所提及的任一途徑施用RNA，如肌內(nèi)注射或經(jīng)ballistic輸送。在一些情況中，可以實(shí)現(xiàn)局部輸送，因?yàn)樗峁┑腞NA是一種能特異地將RNA靶向于所選定細(xì)胞的形式。例如，可以提供脂質(zhì)體或其它顆粒內(nèi)的RNA，它們具有針對于特異的所需干細(xì)胞類型的靶向分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以經(jīng)直接器官注射、血管通路、或經(jīng)肌內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下途徑施用RNA。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下實(shí)現(xiàn)RNA的施用●從包括任一在此所提及的組織類型的所需組織類型中制備RNA提取物；●直接給受影響的器官注射RNA或經(jīng)如上定義的全身輸送的方式注射RNA；和●RNA誘導(dǎo)固有干細(xì)胞的分化，造成了例如所需細(xì)胞類型的增殖、遷移和修復(fù)。
在一些實(shí)施方案中，RNA序列是可從一種或多種分化細(xì)胞類型中提取的或提取到的。例如，在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，RNA來源于原代組織，例如腦組織。在其它的實(shí)施方案中，RNA是可從一種或多種干細(xì)胞類型或干細(xì)胞活性組織中提取的。例如，在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，RNA來源于成體干細(xì)胞，例如骨髓干細(xì)胞。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，RNA來源于胎兒、新生兒、幼體或胚胎組織。
b)利用干細(xì)胞的治療在一些情況中，可以給對象施用利用本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞，而不是施用具有用本方法經(jīng)來自非干細(xì)胞的細(xì)胞的RNA所改變的性質(zhì)的分化細(xì)胞或干細(xì)胞。可以施用干細(xì)胞以放大那些已經(jīng)存在于對象體內(nèi)的干細(xì)胞。在一些情況中，可以給組織損害的部位施用干細(xì)胞，然后容許其自然分化。在一些情況中，可以加入干細(xì)胞以放大那些已經(jīng)作為缺少固有干細(xì)胞群中存在的一些缺陷和特別是遺傳缺陷的附加干細(xì)胞存在的干細(xì)胞。例如，對象可以具有一種遺傳疾病，它造成了特殊細(xì)胞類型或細(xì)胞系的缺失、特殊細(xì)胞類型或細(xì)胞系數(shù)目的減少或造成了特殊細(xì)胞類型或細(xì)胞系的缺陷。然后可以轉(zhuǎn)移缺少缺陷的干細(xì)胞以補(bǔ)償遺傳缺陷，因?yàn)樗鼈兛梢陨伤璧募?xì)胞類型或細(xì)胞系或者它們生成了缺少功能缺陷的細(xì)胞或細(xì)胞系。施用的干細(xì)胞可以增殖以保持它們的數(shù)目，并且也生成了分化細(xì)胞，因此具有長期持續(xù)的作用，減少了頻繁治療的需要。事實(shí)上，干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可以造成病變的永久治愈或緩解。
對象例如可以具有遺傳缺陷所引起的一種免疫缺陷。轉(zhuǎn)移利用本發(fā)明獲得的沒有缺陷的干細(xì)胞群可能足以治療疾病，因?yàn)樗傻拿庖呒?xì)胞群將缺少缺陷并且是有功能的。在一些情況中，疾病可能是由感染特別是由病毒感染所引起的，并且干細(xì)胞可能具有避免干細(xì)胞被感染的一些修飾。在其它情況中，可以將利用本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其自身干細(xì)胞群已經(jīng)被清除的對象中。例如，對象已經(jīng)被暴露于放射線或化學(xué)劑，造成了干細(xì)胞數(shù)目的減少。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對于干細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到對象的情況，干細(xì)胞來源于同一個(gè)對象，利用本發(fā)明從它們的分化細(xì)胞中生成干細(xì)胞。在其它情況中，干細(xì)胞可以分化自一個(gè)免疫相容的無關(guān)個(gè)體。在一些情況中，用于獲得干細(xì)胞的分化細(xì)胞可以來自不同的個(gè)體，但是提供給細(xì)胞的RNA可以來自預(yù)期受體或遺傳相容的受體。RNA的提供可以造成干細(xì)胞與預(yù)期受體是免疫相容的。
c)利用分化細(xì)胞的治療在一個(gè)其它的實(shí)施方案中，可以給對象施用利用本發(fā)明獲得的分化細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以從預(yù)期受體中獲得或生成用于獲得分化細(xì)胞的干細(xì)胞?？梢允┯迷诖怂峒暗娜魏我环N分化細(xì)胞類型，以及對象可以患有在此所提及的任何一種疾病和病變。
可以給疾病所影響的局限部位施用分化細(xì)胞。例如，在糖尿病中，它們可以被輸送到胰腺；在脊髓損害中，它們可以被輸送到脊髓神經(jīng)；對于腦部疾病，可以輸送到腦部等等。在一些情況中，可以給對象提供出現(xiàn)在一種結(jié)構(gòu)中的或作為結(jié)構(gòu)的一部分的分化細(xì)胞。例如，可以將分化細(xì)胞包被的支架插入到血管中或者可以給受損的或患病的肝臟提供置于基質(zhì)上的肝細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了一種提高或矯正對象中的組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的方法，方法包括給對象施用在體外通過誘導(dǎo)干細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或從動(dòng)物的組織中獲得的全能或多能干細(xì)胞分化成一種或多種所需細(xì)胞類型而獲得的有效量的分化細(xì)胞，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA。在一個(gè)特別優(yōu)選的方法中，從所治療的對象中獲得所用的干細(xì)胞。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過利用本發(fā)明的方法在體外誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞而獲得所用的干細(xì)胞，以及特別地從對象中獲得用于獲得干細(xì)胞的分化細(xì)胞。
d)RNA和細(xì)胞的聯(lián)合治療本發(fā)明的RNA可以聯(lián)合其它的活性劑施用給細(xì)胞群，活性劑包括例如于細(xì)胞(具有或不具有改變的、潛在的或明顯的性質(zhì))或分化細(xì)胞。可以同時(shí)地、順序地或分開地施用RNA和其它的活性劑。
也可以采用這些成分的組合。例如，可以給對象施用包括干細(xì)胞的藥物，然后可以施用包括本發(fā)明的能誘導(dǎo)分化的RNA的藥物，以在原位誘導(dǎo)它們的分化或改變。在其它的方法學(xué)中，可以在導(dǎo)入RNA后導(dǎo)入干細(xì)胞?？梢酝瑫r(shí)地、分開地或順序地施用本發(fā)明的細(xì)胞和RNA。也可以與治療特殊疾病有效的其它治療同時(shí)地、分開地或順序地施用本發(fā)明的細(xì)胞和RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以與細(xì)胞例如干細(xì)胞同時(shí)地、分開地或順序地施用可從一種或多種干細(xì)胞類型或干細(xì)胞活性組織中提取的RNA。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以與干細(xì)胞特別是骨髓干細(xì)胞同時(shí)地、分開地或順序地施用全胚胎RNA、胎兒RNA、新生兒或幼體RNA。顯示了通過共同注射胚胎來源的RNA部分和干細(xì)胞提高了由干細(xì)胞介導(dǎo)的組織修復(fù)和再生。
e)在施用之前用RNA處理細(xì)胞施用本發(fā)明這個(gè)方面的本發(fā)明的藥物可能包括在給對象施用干細(xì)胞之前用本發(fā)明的RNA處理干細(xì)胞。這個(gè)方法具有增強(qiáng)對象中干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化的作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用根據(jù)本發(fā)明上述的任一實(shí)施方案從一種或多種分化細(xì)胞類型中可提取的或提取到的RNA序列處理干細(xì)胞。例如，在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，可以在將骨髓干細(xì)胞施用給對象之前用腦RNA預(yù)處理骨髓干細(xì)胞，對象是例如患有年齡相關(guān)性腦部損害的對象。在此已經(jīng)成功地證實(shí)逆轉(zhuǎn)并因此治療了年齡相關(guān)性腦部疾病。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，在將骨髓干細(xì)胞施用給對象之前，用脊髓RNA預(yù)處理骨髓干細(xì)胞，例如對象患有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病。在此已經(jīng)證實(shí)這對于公認(rèn)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的模型是有效的。
f)利用具有改變的性質(zhì)的干細(xì)胞的治療在一個(gè)其它的實(shí)施方案中，可以給對象施用利用本發(fā)明獲得的具有改變的性質(zhì)的干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在體外用RNA處理之后即刻，在當(dāng)一些改變的性質(zhì)仍是潛在的而不是明顯的時(shí)候，施用細(xì)胞，其中可以在受體體內(nèi)出現(xiàn)更晚階段的遷移、整合、增殖和分化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在增殖和分化都已經(jīng)是明顯的時(shí)候施用細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以從預(yù)期受體中獲得或衍生的用于獲得具有明顯的或潛在的改變的性質(zhì)的干細(xì)胞。相對于在此所提及的任一分化細(xì)胞類型，可以施用具有潛在的或明顯的改變的性質(zhì)的細(xì)胞，以及對象可以是患有在此所提及的任一疾病和病變的對象。
可以將具有潛在的或明顯的改變的性質(zhì)的細(xì)胞施用給受疾病所影響的局部部位。例如，在糖尿病中，它們可以被輸送到胰腺；在脊髓損傷中，它們可以被輸送到脊髓神經(jīng)；對于腦部疾病可以輸送到腦部等等。在一些情況中，可以給對象提供存在于一種結(jié)構(gòu)上或作為結(jié)構(gòu)的一部分的所述細(xì)胞。例如，可以將經(jīng)所述細(xì)胞包被的支架插入到血管內(nèi)或可以給受損的或患病的肝臟提供基質(zhì)中的肝細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以根據(jù)更常用的途徑施用具有改變的性質(zhì)的細(xì)胞，例如通過施用到循環(huán)內(nèi)、腹腔內(nèi)、施用到腦脊液內(nèi)、胸腔內(nèi)。
通過給例如合適的組織或器官局部提供細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)具有潛在的或明顯的改變的性質(zhì)的細(xì)胞的輸送。例如，細(xì)胞的施用可以是經(jīng)靜脈內(nèi)、骨內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮膚、皮內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部、胸腔內(nèi)、眶內(nèi)、腦脊液內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)(或其它粘膜)、肺、吸入到相關(guān)位置。例如，可以通過局部注射提供細(xì)胞。通過將細(xì)胞注射到血管或其它管路內(nèi)使其到達(dá)所需的靶位置。可以通過給所需組織局部注射而施用細(xì)胞。可以通過在此所提及的任一途徑例如經(jīng)肌肉內(nèi)注射施用細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以經(jīng)直接器官注射、血管通路、或經(jīng)肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、或皮下途徑施用細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了一種提高或矯正對象中的組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的方法，方法包括給對象施用有效量的具有明顯的或潛在的改變的性質(zhì)的細(xì)胞，這些細(xì)胞是在體外通過改變干細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或從動(dòng)物的組織中獲得的全能或多能干細(xì)胞的性質(zhì)而獲得的，方法包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的性質(zhì)的改變的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型或組織的組織或細(xì)胞中提取的RNA。在特別優(yōu)選的方法中，從所治療的對象中獲得所用的干細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過利用本發(fā)明的方法在體外誘導(dǎo)分化細(xì)胞的分化的逆轉(zhuǎn)以提供干細(xì)胞而獲得所用的干細(xì)胞，以及特別的，從對象中獲得用于獲得干細(xì)胞的分化細(xì)胞。
可以用本發(fā)明治療或改善退行性腦病、腦或脊髓損傷或其它神經(jīng)元疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以給患有退行性疾病的對象提供細(xì)胞，特別是患有年齡相關(guān)性退行性疾病的對象。利用本發(fā)明的藥物所治療的疾病或損害可以影響腦部。對象例如可以是患有退行性腦病的對象。腦部疾病的實(shí)例具體地包括帕金森病、帕金森型疾病、Alzhermer’s病、癡呆、其它年齡相關(guān)性腦部病變和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病。也可以治療多發(fā)性硬化?？梢灾委煹牧硪环N疾病是糖尿病，特別是1型和2型糖尿病，通過提供產(chǎn)胰島素的朗格漢斯細(xì)胞島取代或放大(augment)有缺陷的細(xì)胞。本發(fā)明也可以用于患有由關(guān)節(jié)的損害，例如關(guān)節(jié)炎所引起的疾病對象。
本發(fā)明也提供了一種用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的制劑(agent)，該制劑包括在此定義的RNA或分化細(xì)胞(或具有潛在的或明顯的改變性質(zhì)的細(xì)胞)、或兩者的組合。例如，本發(fā)明提供了對退行性疾病和年齡相關(guān)的任何器官的退行性，例如心臟病、充血性心臟衰竭、心臟瓣膜功能不全、靜脈瓣膜功能不全、退行性腎臟疾病、和退行性肝臟疾病的治療。本發(fā)明也提供了在血管意外所引起的損害之后的組織再生，血管意外例如是缺血、血栓形成、動(dòng)脈瘤和褥瘡。
本發(fā)明也提供了一種用于再生、修復(fù)或取代經(jīng)任何形式的病理學(xué)、年齡或外傷所引起的受損的或缺失的組織的方法。例如，本發(fā)明提供了一種用于在脊柱的外傷性損害之后的再生和修復(fù)的方法。
在上述的治療對象的方法中，可以如在此的任何地方所定義的那樣定義干細(xì)胞、分化細(xì)胞、改變細(xì)胞、RNA、提供RNA和其它方面。對于上述的試劑，RNA或分化細(xì)胞或改變細(xì)胞可以是任何的在此所定義的RNA或分化細(xì)胞或改變細(xì)胞。
在體外用于逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以生產(chǎn)干細(xì)胞的方法。因此本發(fā)明提供了一種在體外逆轉(zhuǎn)細(xì)胞系的分化細(xì)胞或從動(dòng)物或植物的組織中獲得的分化細(xì)胞的分化以生產(chǎn)所需類型的全能或多能干細(xì)胞或干細(xì)胞系的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)將分化細(xì)胞的分化逆轉(zhuǎn)成所述類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系類型的條件下提供給所述分化細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，分離的RNA包括可從所需類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需類型的細(xì)胞中提取的或提取到的。
現(xiàn)有的用于分離干細(xì)胞的方法常常是辛苦的并需要來自對象的大量材料，逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞的能力提供了更為便利的可選擇方法，它更不費(fèi)時(shí)，更經(jīng)濟(jì)和更少侵襲性。具體地，對于需要從患有疾病的對象中獲得干細(xì)胞的情況，由于從患者中回收干細(xì)胞或有限量的可回收材料所需方法的侵襲性，從這樣一個(gè)對象中直接分離到干細(xì)胞簡直是不現(xiàn)實(shí)的。本發(fā)明的方法也具有的優(yōu)點(diǎn)是它可以獲得很廣范圍的干細(xì)胞以及所獲得的干細(xì)胞具有分化成很廣范圍的分化細(xì)胞類型的能力。
在本發(fā)明中所采用的分化細(xì)胞可以是任何適合的分化細(xì)胞，包括在此所提及的任何分化細(xì)胞。具體地，分化細(xì)胞可以是容易接近的細(xì)胞?？梢詮钠つw樣品或從口腔中獲得分化細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的情況中，分化細(xì)胞可以是成纖維細(xì)胞以及特別是皮膚成纖維細(xì)胞。在一些情況中，可以從體液以及特別是從血液中獲得細(xì)胞。在一些情況中，可以使用白細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞。
利用在此所述的任何方法都可以提供RNA。在給細(xì)胞提供RNA之后，可以培養(yǎng)并傳代所形成的干細(xì)胞。通過檢查細(xì)胞形態(tài)并檢查干細(xì)胞特異標(biāo)記物的存在可以確認(rèn)分化的逆轉(zhuǎn)。通過檢查被傳代的細(xì)胞經(jīng)幾代后沒有發(fā)生分化也可以確認(rèn)干細(xì)胞自我更新的能力。也可以檢測細(xì)胞分化成特異細(xì)胞的能力。可以確定出所獲得的干細(xì)胞的核型，特別是可以檢查其核型以保證細(xì)胞的核型在經(jīng)過數(shù)代后仍是穩(wěn)定的?？梢詳U(kuò)增干細(xì)胞?？梢詫⒏杉?xì)胞的樣品冷凍用于以后的施用或參照。具體地，可以冷凍已經(jīng)進(jìn)行少數(shù)代傳代的細(xì)胞的樣品，例如已經(jīng)進(jìn)行少于10代、少于5代、兩代或1代傳代的細(xì)胞。從常用的干細(xì)胞群中可以建立克隆干細(xì)胞系，并選擇出其特異的所需特征例如它們的發(fā)育能力。
也可以操縱所形成的干細(xì)胞以導(dǎo)入所需的遺傳修飾。例如，如果原有的分化細(xì)胞包括一種遺傳缺陷，就可以糾正該缺陷?？梢詫?dǎo)入能功能性彌補(bǔ)缺失的或有缺陷的序列的序列。可以導(dǎo)入缺失的或有缺陷的基因的功能拷貝或其它序列?？梢杂美鏟CR和Southern印跡技術(shù)篩選和鑒定具有所需修飾的克隆?？梢苑只⒃u(píng)價(jià)所獲得的干細(xì)胞，以檢查缺陷是否已經(jīng)被糾正?？梢杂美缁虼虬屑夹g(shù)將位點(diǎn)特異性改變導(dǎo)入到基因的內(nèi)源性拷貝中?？梢月?lián)合位點(diǎn)特異性重組酶采用這些技術(shù)以去除在打靶中所用的選擇性標(biāo)記。具體地，利用這些技術(shù)可以糾正單基因疾病?？梢约m正顯性和隱性疾病。
在本發(fā)明利用干細(xì)胞的任一方面都可以使用所獲得的干細(xì)胞。它們也可以被用于干細(xì)胞的任何其它應(yīng)用。例如，它們可以被用于非人嵌合動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物的產(chǎn)生。
在此顯示了利用從胚胎干細(xì)胞中提取到的RNA可以從成體干細(xì)胞生成胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。也顯示了當(dāng)用多種干細(xì)胞來源的RNA部分處理時(shí)，其它的分化成體組織可以被分化成干細(xì)胞樣組織。
本發(fā)明提供了利用上述方法獲得的細(xì)胞。在一些情況中，可以提供作為在合適容器中等份冷凍的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了細(xì)胞的細(xì)胞提取物。
用于在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法本發(fā)明也提供了用于在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法。通過給細(xì)胞提供一種RNA序列實(shí)現(xiàn)分化，所述RNA序列包括可從需要將干細(xì)胞分化為其的細(xì)胞類型中提取的RNA。RNA可以是可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的或提取到的。具體地，本發(fā)明提供了一種在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或從動(dòng)物或植物的組織中獲得的全能或多能干細(xì)胞分化成一種或多種所需細(xì)胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，分離的RNA包括可從包括所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA序列。
在本方法中可以使用任何干細(xì)胞，包括在此所提及的任一干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的方法逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化以提供干細(xì)胞可以獲得被分化的干細(xì)胞。在預(yù)計(jì)所獲得的分化細(xì)胞被用于對象的治療或用于生產(chǎn)治療對象的藥物的情況中，干細(xì)胞可以來源于預(yù)期受體。在一些情況中，干細(xì)胞可以來源于具有遺傳缺陷的受體，在這些情況中，優(yōu)選地可以糾正或改善干細(xì)胞中的遺傳缺陷。
利用在此所討論的任一方法可以將RNA提供給靶干細(xì)胞。
可以將干細(xì)胞誘導(dǎo)成任何所需細(xì)胞類型，包括在此所提及的任一細(xì)胞類型。在一個(gè)優(yōu)選的情況中，干細(xì)胞被分化成穩(wěn)定的終末分化的細(xì)胞類型。終末分化細(xì)胞類型一般可以被認(rèn)為是一種不會(huì)天然分化生成任何其它細(xì)胞類型的細(xì)胞類型，以及它通常處于譜系的末端。在一些情況中，干細(xì)胞可以被分化成干細(xì)胞和譜系終末細(xì)胞之間的中間細(xì)胞。這些中間物可以具有一定程度的增殖能力。
分化細(xì)胞可以是器官或組織中的細(xì)胞，例如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、皮膚、胃腸道、眼、或生殖器官。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分化細(xì)胞類型可以是一種在特殊病變下缺少的、數(shù)目減少的或有缺陷的細(xì)胞類型。病變可以是在此所提及的任一病變，包括損傷、退行性疾病或遺傳疾病所造成的病變。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分化細(xì)胞可以是朗格漢斯細(xì)胞島，所形成的細(xì)胞可以被用于治療糖尿病。在另一種情況中，分化細(xì)胞可以是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種細(xì)胞，它可以被用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷，特別是治療腦部疾病或脊髓損傷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以被分化成神經(jīng)元細(xì)胞。
在一些情況中，被分化的干細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞，而不是全能干細(xì)胞。在這些情況中，干細(xì)胞例如可以被分化成一種細(xì)胞類型，該細(xì)胞類型是已知干細(xì)胞在其從中分離的生物體中可以分化的一種細(xì)胞類型。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以被分化成神經(jīng)元細(xì)胞。具體地，它們可以被分化成表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白(NeuN)的神經(jīng)元細(xì)胞。典型地，通過提供分離的RNA可以將骨髓干細(xì)胞分化成神經(jīng)元細(xì)胞，所述分離的RNA包括可從一種或多種類型的腦細(xì)胞或腦細(xì)胞系中提取的RNA。在一些情況中，RNA可以包括可從腦組織中提取的RNA，特別地它可以包括一種可從腦組織中提取到的RNA。在一個(gè)特別優(yōu)選的情況中，RNA可以包括可從皮層神經(jīng)元或皮層神經(jīng)元細(xì)胞系中提取的RNA。在一些情況中，可以采用可從在非腦的其它部位所發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元中提取的或可從來源于這些神經(jīng)元的細(xì)胞系中提取的RNA。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化成肌肉細(xì)胞，特別是骨骼肌細(xì)胞。所提供的RNA序列典型地包括可從肌肉細(xì)胞或肌肉細(xì)胞系中、特別是從肌肉干細(xì)胞中提取的或提取到的RNA。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用脊髓來源的RNA預(yù)處理骨髓干細(xì)胞，顯著地提高了干細(xì)胞治療已建立的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病模型的療效。在這個(gè)實(shí)施方案中，所提供的RNA序列典型地包括可從脊髓細(xì)胞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的其它細(xì)胞中提取的或提取到的RNA。這個(gè)方法學(xué)也可以包括在體內(nèi)施用這些RNA以原位影響干細(xì)胞的增殖、遷移和功能整合。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，已經(jīng)顯示用腦來源的RNA對干細(xì)胞的預(yù)處理增加了它們的增殖、遷移和功能整合到受體的神經(jīng)系統(tǒng)中。此外，來源于更不成熟的發(fā)育階段、處于活躍細(xì)胞增殖階段的RNA表現(xiàn)出更為顯著的對干細(xì)胞刺激的作用以及它們對年齡和疾病相關(guān)性損害的必然的改善作用。本方法學(xué)也可以包括在體內(nèi)施用這些RNA以原位影響干細(xì)胞的增殖、遷移和功能整合。
本發(fā)明提供了利用上述方法獲得的細(xì)胞。在一些情況中，可以提供作為合適容器中的等份冷凍的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了細(xì)胞的細(xì)胞提取物。
在一些情況中，當(dāng)干細(xì)胞被分化時(shí)，干細(xì)胞可以存在于一種結(jié)構(gòu)之內(nèi)或之上，例如支持物、膜、植入物、支架或基質(zhì)，或者分化細(xì)胞可以被加入到這樣一種結(jié)構(gòu)中。然后可以將結(jié)構(gòu)用于生產(chǎn)用于治療在此所提及的任一病變的藥物。例如也可以制備不同的分化細(xì)胞類型的混和物以模擬在體內(nèi)出現(xiàn)在一起的群。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，體外方法可以包括●根據(jù)已建立的方案提供并在體外培養(yǎng)干細(xì)胞群；●給干細(xì)胞提供從所需靶組織類型(例如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌肉或上面所提及的任一分化細(xì)胞類型)中提取的RNA；和●將細(xì)胞維持在培養(yǎng)物中；在一個(gè)其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，體外方法還可以包括步驟●從所需靶組織類型(例如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌肉或上面所提及的任一分化細(xì)胞類型)中提取RNA。
在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，或1)作為裸RNA提取物，或2)經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，或3)經(jīng)對受體細(xì)胞的電穿孔或其它已建立的方法，可以將RNA優(yōu)選地提供給干細(xì)胞。
然后優(yōu)選地可以將所形成的分化細(xì)胞配制成藥物，其能通過合適的途徑例如經(jīng)皮下、真皮下、靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)途徑給施用給對象。
一般概念術(shù)語“包括”涵蓋了“包含”和“組成”，例如包括“X”的組合物可以由X唯一地構(gòu)成，或可以包含一些附加的物質(zhì)例如X+Y。
術(shù)語“基本上”并不排除“完全地”，例如“基本上沒有”Y的組合物可以完全不含Y。如果需要，可以從本發(fā)明的定義中刪除術(shù)語“基本上”。
與數(shù)值x有關(guān)的術(shù)語“大約“意思是例如x±10％。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明。
實(shí)施例1從骨髓基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞骨髓采集和培養(yǎng)從成體Sprague Dawley大鼠中獲得骨髓基質(zhì)(間質(zhì))干細(xì)胞。該技術(shù)基于Owen和Fridenstein(1988)的方案，并代表著一種典型的已建立的適用于體外擴(kuò)增的成體干細(xì)胞來源。簡單地，在按計(jì)劃殺死鼠(斷頸)之后，在死亡的5分鐘內(nèi)切下脛骨和股骨。去除骨骼上的所有結(jié)締組織和肌肉組織，在無菌條件下進(jìn)行所有的其它操作。
通過用含有10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基(α-MEMS-Gibco Invitrogen Co.UK)沖洗骨骼，排出骨骼中的骨髓。通過將連接在5ml塑料管上的25號(hào)針頭插入到骨骼的頸部(遠(yuǎn)端和近端的切口)并經(jīng)骨骼排出2ml培養(yǎng)基而實(shí)現(xiàn)沖洗。將培養(yǎng)基和骨髓樣品收集在無菌的通用容器內(nèi)。隨后，通過經(jīng)19號(hào)針頭輕輕地碾磨約10次將骨髓細(xì)胞分離。然后將1ml抽吸物放置到6孔板(SLS Ltd.UK)內(nèi)。然后往每個(gè)孔內(nèi)加入2ml新鮮的α-MEMS，使得每個(gè)板內(nèi)的細(xì)胞密度為約12,000-15,000個(gè)細(xì)胞/ml。然后將板在37℃、5％CO2的空氣中孵育并留置24到48個(gè)小時(shí)(Harrison&Rae，1997)。
在這個(gè)時(shí)間段之后，通過抽吸板內(nèi)的培養(yǎng)基，從非塑料粘附的細(xì)胞中分離出骨髓來源的干細(xì)胞。留下了塑料粘附的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，然后加入2ml新鮮的α-MEMS(10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素)支持。每48個(gè)小時(shí)供應(yīng)一次新的培養(yǎng)基，直到板被經(jīng)顯微鏡分析確認(rèn)的集落形成單位(CFU)鋪滿(Owen&Friedenstein，1988，如前)。在優(yōu)化條件下，在37℃需要5到7天。所形成的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫組化確認(rèn)為基質(zhì)干細(xì)胞。
RNA操作制備腦勻漿液，并用RNA的商業(yè)分離試劑盒或標(biāo)準(zhǔn)的基于苯酚的操作法分離RNA。在最初的實(shí)驗(yàn)中，用基于Kirby(1956)的冷苯酚提取法制備RNA。從8只新近殺死的大鼠中新近切下腦。稱量除了小腦的8克腦，并加入5ml磷酸緩沖鹽水(PBS)。在玻璃Teflon勻漿器內(nèi)將混和物勻漿約4分鐘。加入相同體積的95％飽和苯酚。將所形成的溶液在室溫下放置15分鐘，然后在超速離心機(jī)內(nèi)在18,000rpm離心30分鐘。保留水相，并加入1M MgCl2使得MgCl2的濃度為0.1M。然后加入2倍體積的乙醇，然后沉淀約30分鐘。最后在6,000rpm下離心15分鐘生成富含RNA的沉淀，將其保留并儲(chǔ)存在乙醇中。將所形成的RNA風(fēng)干并溶解在如上定義的6ml新鮮培養(yǎng)基內(nèi)。
往每個(gè)鋪滿骨髓干細(xì)胞的孔內(nèi)加入1ml含有RNA的培養(yǎng)基，24小時(shí)。24小時(shí)之后，去除RNA培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基取代。每12小時(shí)觀察細(xì)胞的表型變化。
另外，將細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以確定RNA在骨髓干細(xì)胞中所誘導(dǎo)的是神經(jīng)元表型。通過測試所處理的細(xì)胞的神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在下面的表中顯示了所獲得的結(jié)果。

對細(xì)胞的檢查表明在應(yīng)用腦來源的RNA后24個(gè)小時(shí)，RNA誘導(dǎo)細(xì)胞分化變?yōu)榍逦纳窠?jīng)元表型。未處理的骨髓干細(xì)胞仍保持經(jīng)典的集落形成單位形態(tài)。但是，早到處理后12個(gè)小時(shí)，腦RNA處理的干細(xì)胞就表現(xiàn)出經(jīng)典的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。另外，這些細(xì)胞表達(dá)常用于神經(jīng)元的免疫化學(xué)標(biāo)記物。對照細(xì)胞沒有表達(dá)。表型的這種變化可傳代存活(x3)，因此表現(xiàn)為受體干細(xì)胞分化中的穩(wěn)定變化。通過隨后的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了供體組織RNA改變干細(xì)胞分化的作用，其中經(jīng)RNaze的預(yù)處理消除了RNA的誘導(dǎo)作用，而其對強(qiáng)蛋白酶胰蛋白酶對供體腦RNA的處理具有抗性。
用來源于骨骼肌的供體RNA重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)所誘導(dǎo)的分化的特異性。如上制備干細(xì)胞并用肌肉來源的RNA(利用商品化可獲得的試劑盒RNAzol制備的)處理干細(xì)胞，清楚地表現(xiàn)出向肌肉表型的穩(wěn)定的分化改變。通過用受磷蛋白和毒傘素的免疫染色確認(rèn)這一點(diǎn)。在肌肉研究中，經(jīng)不同方法的RNA輸送，將干細(xì)胞暴露于肌肉來源的RNA(用不同的RNA分離技術(shù)所獲得的)。經(jīng)用Felgner等(1987)的方法制備的脂質(zhì)體將RNA輸送給干細(xì)胞。從這些研究中可以得出結(jié)論對干細(xì)胞的誘導(dǎo)是特異于供體組織來源的，經(jīng)通常適用于將核酸輸送給細(xì)胞的多種技術(shù)可以給干細(xì)胞添加RNA。
實(shí)施例2通過受體動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力評(píng)價(jià)腦RNA分化的干細(xì)胞對大鼠腦的年齡相關(guān)性損害的作用如上實(shí)施例1所述在體外制備骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿時(shí)，將細(xì)胞暴露于腦RNA(如上制備)12小時(shí)。供體干細(xì)胞來源于有色大鼠品系(Lister Hooded)。提供了來自不同大鼠品系(SpragueDawley)的供體RNA和受體動(dòng)物。
受體Sprague Dawley大鼠是年齡在468-506天之間的外飼養(yǎng)雄性大鼠。已知這些高齡動(dòng)物不能學(xué)會(huì)找到水迷宮中的隱藏平臺(tái)(Stewart&Morris，1993；Bagnall&Ray，2000)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受0.5ml腦RNA處理的干細(xì)胞的靜脈內(nèi)注射，等同于一個(gè)6孔板的腦RNA處理細(xì)胞的產(chǎn)量。對照動(dòng)物接受相同量的未處理的干細(xì)胞。簡單地，通過用橡膠刮棒將細(xì)胞與塑料板機(jī)械分離并經(jīng)抽吸收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞，從板中收集細(xì)胞，包括處理的(實(shí)驗(yàn))或未處理的(對照)細(xì)胞。經(jīng)在1000rpm下旋轉(zhuǎn)5分鐘濃縮細(xì)胞，并使細(xì)胞達(dá)到上面所列的濃度。不知情地進(jìn)行所有的注射操作。對于兩組而言，經(jīng)尾部靜脈實(shí)施注射。
在注射后14天，在常用的空間學(xué)習(xí)任務(wù)Morris水迷宮中不知情地評(píng)價(jià)老齡大鼠。每只動(dòng)物在3天的時(shí)間內(nèi)接受每天3次游泳，試驗(yàn)中間間隔10分鐘(Stewart&Morris，1993)。記錄下每只動(dòng)物在每個(gè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的潛伏期。每個(gè)試驗(yàn)由60秒的游泳構(gòu)成。如果在間隔之后，動(dòng)物還沒有找到平臺(tái)，試驗(yàn)者輕輕地將其引導(dǎo)到平臺(tái)。在達(dá)到平臺(tái)之后，容許動(dòng)物停留10秒鐘以便在回到飼養(yǎng)籠之前定位其位置。通過在重復(fù)試驗(yàn)中縮短找到平臺(tái)的時(shí)間可以證明學(xué)習(xí)能力。
在圖1中顯示了研究的結(jié)果。靜脈內(nèi)接受沒有暴露于RNA的干細(xì)胞的對照大鼠(n＝9)不能學(xué)會(huì)這個(gè)任務(wù)，在多次試驗(yàn)中都沒有縮短其反應(yīng)潛伏期。但是，接受了經(jīng)腦RNA處理的干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出與年輕嚙齒類動(dòng)物相當(dāng)?shù)娘@著的學(xué)習(xí)能力(p＜0.0000000001)。從這個(gè)研究中可以得出兩個(gè)結(jié)論。首先，經(jīng)RNA處理的干細(xì)胞能顯著地改善年齡相關(guān)的空間學(xué)習(xí)缺陷。對照未處理的干細(xì)胞則不能。第二，應(yīng)當(dāng)注意到所捐贈(zèng)的干細(xì)胞是來自于不同的大鼠品系，以及不需要受體動(dòng)物成為免疫缺陷的。因此，結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞不僅分化成了能功能改善的合適的神經(jīng)組織，它們還獲得了一種使得它們能被受體接受的免疫狀態(tài)。應(yīng)當(dāng)注意到供體腦RNA來源于受體的同胞動(dòng)物，供體細(xì)胞來源于不同系。
結(jié)果不僅確認(rèn)了RNA分化的干細(xì)胞能通過恢復(fù)行為能力修復(fù)年齡相關(guān)性損害，而且這樣處理的細(xì)胞還獲得了供體RNA的免疫特征。這就提供了一種改變干細(xì)胞系或干細(xì)胞庫的免疫學(xué)特征譜以生成具有與受體特異相容性的分化細(xì)胞的策略。
實(shí)施例3經(jīng)外源性RNA刺激的分化、遷移和整合對固有干細(xì)胞的體內(nèi)刺激。
在實(shí)施例1和2中獲得了外源性RNA對干細(xì)胞的強(qiáng)刺激作用，和這些細(xì)胞對修復(fù)哺乳動(dòng)物模型中的年齡相關(guān)性損害的作用，現(xiàn)在進(jìn)一步給出其它的實(shí)施例，確立原代組織來源的RNA對宿主動(dòng)物的固有干細(xì)胞的作用。為此，新生大鼠在出生后第1天就接受了腹腔內(nèi)注射供體表達(dá)GFP的粗制骨髓。每只動(dòng)物接受了含有約800,000個(gè)細(xì)胞的0.2ml注射液。這些外來細(xì)胞容易與宿主骨髓整合，并因?yàn)槠渖飳W(xué)環(huán)境而容易被觀察到。在90天大時(shí)，隨機(jī)地將GFP骨髓移植動(dòng)物分成兩組。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受腦RNA注射，對照動(dòng)物接受生理鹽水注射。如實(shí)施例1所述制備實(shí)驗(yàn)?zāi)XRNA。進(jìn)行皮下注射。每只動(dòng)物接受了含有與一個(gè)全腦等價(jià)的供體RNA的0.5ml注射液。對照接受了等價(jià)的生理鹽水注射液。
所獲得的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比對照動(dòng)物具有顯著增厚的受體皮層(p＜0.0001)。另外，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的顯著數(shù)量的分化神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞都表現(xiàn)出GFP的表達(dá)，說明在應(yīng)用外源性腦RNA之后固有骨髓干細(xì)胞對腦部的浸潤。
實(shí)施例4通過從皮層神經(jīng)元的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中分離到的外源RNA誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。
根據(jù)Saneto和de Vellis(1987)的方案，在實(shí)驗(yàn)室中建立了胚胎皮層神經(jīng)元的純化培養(yǎng)物。簡單地，在懷孕16天時(shí)，殺死定時(shí)交配的Sprague Dawley雌性大鼠。用70％乙醇消毒腹部區(qū)域，并暴露出子宮。然后切下含有胚胎的子宮，并將其放置在100mm培養(yǎng)皿內(nèi)。為了預(yù)防污染，所有的上述操作都在無菌罩外面的凈化臺(tái)上進(jìn)行。在無菌條件下進(jìn)行所有的其它操作。
然后用生理鹽水沖洗整個(gè)子宮，并將其轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。然后從子宮中切割下胚胎并將其放置在一個(gè)新的用于腦部切割的培養(yǎng)皿內(nèi)。暴露出腦組織并用刮勺輕輕地將其取出，在解剖顯微鏡下解剖出皮層。然后在生理鹽水中清楚地切開腦膜。在處理了皮層之后，反復(fù)地通過10ml玻璃吸管將其輕輕地弄碎。然后將細(xì)胞懸浮液流經(jīng)Nitex130過濾器(篩孔大小130μm)，并在40g下離心過濾。然后將沉淀重新分散在無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Saneto&deVellis，1987，如前)，并流經(jīng)Nitex130(篩孔大小33μm)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。
往懸浮液中補(bǔ)加胰島素(5μg/ml)和運(yùn)鐵蛋白(100μg/ml)以形成神經(jīng)元專用培養(yǎng)基。將細(xì)胞按1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植在經(jīng)多賴氨酸(2.5μg/ml)預(yù)先包被的24孔培養(yǎng)板上。用表達(dá)標(biāo)記物神經(jīng)纖維蛋白，而不表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的生化及免疫標(biāo)記物的免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)培養(yǎng)物中含有超過95％的神經(jīng)元(Saneto&deVellis，1987，如前)。在鋪板后，每3天更換培養(yǎng)基，并在RNA提取之前維持培養(yǎng)物12天。
根據(jù)廠商的說明利用商業(yè)試劑盒(RNAzol)從原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物中提取RNA。收集所形成的RNA并在應(yīng)用到如實(shí)施例1中所制備的大鼠骨髓細(xì)胞的鋪滿集落之前將其重新溶解在骨髓培養(yǎng)基中(如實(shí)施例1所定義)。每個(gè)受體骨髓培養(yǎng)孔都接受了從一個(gè)完整的24孔原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中提取的總RNA(盡管多種外源性RNA的濃度都獲得了相似的結(jié)果)。
在應(yīng)用溶解在培養(yǎng)基中的外源性RNA后24個(gè)小時(shí)，顯微鏡下檢查骨髓干細(xì)胞。對照骨髓干細(xì)胞接受了相等量的RNAzol制備的骨髓干細(xì)胞RNA。
結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)干細(xì)胞孔都清楚地產(chǎn)生了分化神經(jīng)元，其神經(jīng)元標(biāo)記物染色陽性。在骨髓RNA處理的孔中沒有發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分化的可觀察到的變化。這些結(jié)果說明來自純化細(xì)胞來源的供體RNA可以誘導(dǎo)高度特異的干細(xì)胞分化。
外源性RNA部分的分化誘導(dǎo)作用對于RNaze對供體RNA的預(yù)處理是敏感的，而對胰蛋白酶是不敏感的。這說明是RNA介導(dǎo)了這個(gè)作用。利用包括脂質(zhì)體或電穿孔的多種輸送方法和載體外源輸送廣泛范圍的RNA劑量可以重復(fù)這些作用。
實(shí)施例5經(jīng)外源性應(yīng)用從干細(xì)胞來源中獲得的RNA部分對終末分化細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)化在實(shí)施例1到4中給出了RNA組織提取物對干細(xì)胞分化的強(qiáng)大的和特異的作用，提供最后一個(gè)技術(shù)實(shí)施例。在此，從培養(yǎng)的于細(xì)胞中獲得了供體的富含RNA的提取物。通過向終末分化的成體成纖維細(xì)胞外源性應(yīng)用干細(xì)胞來源的RNA部分以探討受體的成熟分化細(xì)胞是否能再分化成干細(xì)胞的特征和行為，并測試其逆轉(zhuǎn)分化的能力。所獲得的結(jié)果顯示可以從分化組織中生成干細(xì)胞類型組織。
根據(jù)Kawaja等(1992)的方案，獲得成體大鼠(Lister Hooded)的成纖維細(xì)胞，并將其保持在培養(yǎng)條件下。將皮膚的活檢物(近1cm2)放置在含有磷酸緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)的無菌Petri皿內(nèi)。然后將活檢物浸泡(3x)在另一個(gè)裝滿70％乙醇的皿中，然后放回到新鮮的PBS中，并將其切成1-2mm的碎片。將這些分離塊放置到預(yù)先裝有1ml Delbecco基本必需培養(yǎng)基(加有10％胎牛血清(FBS)和0.1％谷氨酰胺，也加有10單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)的60mm組織培養(yǎng)皿內(nèi)。在5％CO2和37℃下孵育培養(yǎng)物。
在這些的培養(yǎng)條件下兩天之后，成纖維細(xì)胞開始從分離塊中遷出，在此階段加入附加的2-3ml營養(yǎng)培養(yǎng)基。
當(dāng)板達(dá)到近90％被鋪滿時(shí)，通過將培養(yǎng)物與1-2ml胰蛋白酶溶液孵育將細(xì)胞傳代，轉(zhuǎn)移到15ml離心管內(nèi)，然后在臺(tái)式離心機(jī)(benchcentrifuge)中室溫下離心10分鐘。去除上清液，將細(xì)胞沉淀物重懸在10ml培養(yǎng)基中。將細(xì)胞在未處理的6孔板中保持到匯合，每個(gè)板都加有含有0.5ml細(xì)胞懸浮液的2ml培養(yǎng)基。此時(shí)它們還可以被進(jìn)一步傳代。
供體DNA來源于如實(shí)施例1中所報(bào)道的保持在培養(yǎng)物中的成體大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞或來源于根據(jù)Reynolds&Weiss(1992)的方案培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(神經(jīng)球)。按照產(chǎn)品說明，用RNAzole分離法制備所有的富含RNA的提取物。因此，可以獲得兩種供體RNA部分1)骨髓干細(xì)胞RNA(BMS-RNA)和2)神經(jīng)干細(xì)胞RNA(NS-RNA)。按從0.75μg/ml到500μg/ml的不同濃度將這些RNA部分分別溶解在成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，并將其加入到保持在最終培養(yǎng)孔中的成體分化成纖維細(xì)胞5天。用干細(xì)胞來源的外源性RNA對成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出跨度范圍很大的劑量。
在所獲得的結(jié)果中，沒有用外源性干細(xì)胞RNA處理的分化成纖維細(xì)胞沒有表現(xiàn)出表型的變化。在RNA應(yīng)用48個(gè)小時(shí)之后，用25μg/ml RNA劑量的外源性的NS-RNA或BMS-RNA處理的成纖維細(xì)胞都表現(xiàn)出清楚的形態(tài)學(xué)變化。NS-RNA處理的受體成纖維細(xì)胞所形成的浮球具有神經(jīng)球的表觀和特征，從這些神經(jīng)表型細(xì)胞中開始發(fā)散出那些容易在形態(tài)上被鑒定為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞。例如在25μg/ml的BMS-RNA處理的受體成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出間質(zhì)干細(xì)胞的經(jīng)典的雙極形態(tài)并且能粘附塑料。
隨后的試驗(yàn)顯示當(dāng)如實(shí)施例1中所述用外源性RNA進(jìn)一步誘導(dǎo)時(shí)，這些細(xì)胞能生成神經(jīng)元和肌肉組織。外源性干細(xì)胞來源的RNA部分的逆分化誘導(dǎo)作用對于用RNaze對供體RNA的預(yù)處理是敏感的，而對胰蛋白酶是不敏感的。這說明作用是由RNA所介導(dǎo)的。利用經(jīng)各種轉(zhuǎn)運(yùn)方法和載體包括脂質(zhì)體或電穿孔外源性轉(zhuǎn)運(yùn)的廣泛范圍的RNA劑量可以重復(fù)這些作用。
因此，當(dāng)分化的成體組織被各種干細(xì)胞來源的RNA部分處理時(shí)，它們可被逆分化成干細(xì)胞樣組織。所形成的細(xì)胞的性質(zhì)反映出供體干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、行為和能力。因此，提供了一種新的和倫理上較少爭議的獲得用于各種在退行性醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用的全能和多能干細(xì)胞的方法。
實(shí)施例6脊髓RNA處理的骨髓干細(xì)胞和未分化的骨髓干細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的動(dòng)物模型中的比較SOD1小鼠是一種已建立好的人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的動(dòng)物模型。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在70-90日齡時(shí)表現(xiàn)出后肢癱瘓，以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失并在120-135日齡時(shí)死亡。在這個(gè)研究中使用了30只動(dòng)物。確認(rèn)所有的動(dòng)物都表達(dá)SOD1基因型。將動(dòng)物隨機(jī)地分成如下的三個(gè)組(i)組1-與脊髓RNA一起孵育的骨髓干細(xì)胞；(ii)組2-僅有骨髓干細(xì)胞；和(iii)組3-PBS注射液。
如實(shí)施例1所述收集并培養(yǎng)供體骨髓干細(xì)胞。利用在實(shí)施例1中所述的Kirby方案從新近殺死的成體C57/B1小鼠中制備出脊髓RNA。將在組1中所用的干細(xì)胞與脊髓RNA孵育5個(gè)小時(shí)(250μg/ml)，在新鮮培養(yǎng)基中洗滌兩次，然后將其濃縮在0.1ml中，以用于給每只動(dòng)物注射約90,000個(gè)細(xì)胞。將組2中用于注射的干細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中，不暴露于RNA并給予5個(gè)小時(shí)對新鮮培養(yǎng)基的等價(jià)暴露。
每個(gè)組中的受體動(dòng)物都接受了經(jīng)尾部靜脈的注射。利用30G針頭實(shí)施注射。對72日齡到86日齡之間的受體動(dòng)物實(shí)施注射，此時(shí)所有的動(dòng)物都表現(xiàn)出后肢癱瘓。每日記錄下在每種條件中存活動(dòng)物的數(shù)目。另外，在簡單的跑步測試中每周評(píng)價(jià)肢體運(yùn)動(dòng)以觀察后肢和前肢的功能。
在圖2中顯示了這個(gè)研究的結(jié)果。用脊髓來源的RNA對干細(xì)胞的預(yù)處理顯著地提高了干細(xì)胞治療在已建立的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病模型中的療效。未處理的骨髓來源的干細(xì)胞的確具有一些作用，但是用RNA預(yù)分化干細(xì)胞這一新的步驟顯著地提高了作用。從這個(gè)實(shí)施例中還注意到，在RNA干細(xì)胞組中的所有存活動(dòng)物(6)以及在僅有干細(xì)胞組中的存活者(1)的治療前癱瘓完全復(fù)原，并且所述治療防止了這種正常地進(jìn)行性疾病的進(jìn)一步進(jìn)展。
實(shí)施例7RNA供體組織的年齡和發(fā)育階段對干細(xì)胞遷移、整合和修復(fù)的作用已經(jīng)在各種應(yīng)用中認(rèn)識(shí)到了供體組織來源的RNA對干細(xì)胞的作用，這里提供了一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例，探討了在RNA提取之前的供體組織的發(fā)育階段對干細(xì)胞增殖、遷移和整合到宿主組織內(nèi)的作用。
如在實(shí)施例1中所列的從表達(dá)Tau-GFP的小鼠中收集并培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞。受體動(dòng)物(N＝24)是254-299天大的C57/B1小鼠，它們被隨機(jī)地分成三個(gè)受體組(n＝8)。干細(xì)胞培養(yǎng)物被隨機(jī)分到三種用于注射前RNA處理的條件(i)組1胎兒(E15)腦RNA+干細(xì)胞；(ii)組2成體(90天)腦RNA+干細(xì)胞；和(iii)組3干細(xì)胞+沒有RNA。
利用在實(shí)施例1中詳細(xì)描述的Kirby法提取RNA，并將上面詳細(xì)描述的合適來源的RNA以200μg/ml的濃度溶解在培養(yǎng)基中。每孔的受體培養(yǎng)物在2ml補(bǔ)加1ml含RNA培養(yǎng)基(組1和2)的新鮮培養(yǎng)基中或3ml新鮮培養(yǎng)基(組3)中孵育12個(gè)小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞兩次并將其在0.3μl新鮮培養(yǎng)基中濃縮為含有約40,000個(gè)細(xì)胞以用于注射。將動(dòng)物麻醉，并利用立體定位系統(tǒng)將細(xì)胞注射到腦的左側(cè)腦室內(nèi)。在手術(shù)后20天，利用在實(shí)施例2中報(bào)告的用于大鼠的相同的訓(xùn)練方案，在小鼠Morris水迷宮中評(píng)價(jià)所有的組。這個(gè)年齡的小鼠表現(xiàn)出與利用該訓(xùn)練方法的老齡大鼠相似的空間學(xué)習(xí)的缺陷。在訓(xùn)練之后，殺死受體大鼠，并檢查腦組織的皮層厚度，并用熒光顯微鏡評(píng)價(jià)表達(dá)GFP的細(xì)胞的存活、增殖和遷移。
在圖3中顯示了行為的結(jié)果。當(dāng)與組3中的動(dòng)物比較時(shí)，在組1和組2中的動(dòng)物在Morris水迷宮中都表現(xiàn)出極好的學(xué)習(xí)能力。這還顯示出外源性RNA處理對干細(xì)胞在修復(fù)年齡相關(guān)性腦損害中的刺激作用(見實(shí)施例2和6)。另外，胎兒RNA+干細(xì)胞組比成體RNA+干細(xì)胞組表現(xiàn)出顯著更快的任務(wù)的達(dá)成(p＜1×10-10)。這些數(shù)據(jù)說明當(dāng)用于處理用于組織修復(fù)的干細(xì)胞時(shí)，來源于正出現(xiàn)廣泛神經(jīng)發(fā)生時(shí)的發(fā)育階段的RNA可能具有更為顯著的作用。對皮層厚度的檢查進(jìn)一步支持了這個(gè)結(jié)論。
對在每只動(dòng)物中的20個(gè)同一解剖橫切面中的皮層厚度的測定顯示出成體RNA+干細(xì)胞受體和僅有干細(xì)胞組之間的顯著差異(p＜1×10-5)，這證實(shí)了相似的大鼠的數(shù)據(jù)(見實(shí)施例3)。但是，在胎兒RNA+干細(xì)胞組中的皮層測定值也顯著地比成體RNA組更厚。在熒光顯微鏡下的光學(xué)觀察顯示成體RNA+干細(xì)胞組在整個(gè)被注射側(cè)的以及對側(cè)的半球都有廣泛分布的表達(dá)GFP的細(xì)胞。但是，胎兒RNA+干細(xì)胞動(dòng)物在整個(gè)兩個(gè)半球的皮層內(nèi)比成體RNA組多約30％的細(xì)胞。在僅有干細(xì)胞組中，表達(dá)GFP的細(xì)胞主要位于注射的側(cè)腦室的下緣以及嗅球。只是偶爾有細(xì)胞位于同側(cè)皮層。
從這個(gè)研究中可以得出結(jié)論用腦來源的RNA對干細(xì)胞的預(yù)處理增加了干細(xì)胞的增殖、遷移和功能遷移到受體神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。另外，來源于更不成熟的發(fā)育階段(活躍的細(xì)胞繁殖階段)的RNA可能對干細(xì)胞刺激以及干細(xì)胞所造成的年齡和疾病相關(guān)的改善作用具有更為明顯的作用。
實(shí)施例8成體干細(xì)胞來源的RNA對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞及其活性的刺激作用的比較在實(shí)施例3中提供的證據(jù)顯示內(nèi)源性RNA對固有骨髓干細(xì)胞恢復(fù)年齡相關(guān)性行為缺陷具有刺激作用。也描述了(實(shí)施例5)干細(xì)胞來源的RNA能影響分化組織。本實(shí)施例探討了直接注射骨髓干細(xì)胞來源的RNA是否能刺激內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制改善年齡相關(guān)性行為缺陷?，F(xiàn)在已知各種內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)方法，包括神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的直接神經(jīng)生成以及干細(xì)胞分泌能影響受損的分化組織的生存因子。
如實(shí)施例1中所述收集并體外培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞。然后選擇用于RNA提取的匯合的培養(yǎng)物。利用商業(yè)產(chǎn)品RNAzol按產(chǎn)品說明書實(shí)施RNA提取。然后將所形成的骨髓RNA溶解在PBS(200μg/ml)中，準(zhǔn)備用于注射到受體體內(nèi)。
受體Sprague Dawley大鼠是年齡在433天和570天之間的外飼養(yǎng)(ex-breeder)的雄大鼠。因?yàn)閲?yán)重的年齡相關(guān)性對CNS的損害，這些動(dòng)物不能學(xué)習(xí)或記憶Morris水迷宮任務(wù)。匹配年齡將受體分成兩組，每組10只動(dòng)物(i)組1-接受15μl干細(xì)胞RNA注射；和(ii)組2-接受15μl用RNaze處理的干細(xì)胞RNA注射(見實(shí)施例1)。
在麻醉下，經(jīng)立體定位將RNA注射到右側(cè)腦室內(nèi)。簡而言之，將受體大鼠麻醉，刮干凈頭部并將其置于立體定位框內(nèi)。用100％乙醇消毒皮膚，經(jīng)縱向切口暴露出顱骨。在囟門前1.5mm和中線外側(cè)1.5mm處鉆出1.5mm寬的孔。用30G皮下針頭的尖部切開可見的硬腦膜。經(jīng)立體定位將裝滿內(nèi)容物的管子插入到側(cè)腦室內(nèi)，并以5μl逐漸地射入內(nèi)容物。在去除之前將管子在原位留置2分鐘，用縫線閉合切口。
在注射后14天，如實(shí)施例2中所述在Morris水迷宮中盲向評(píng)價(jià)老齡大鼠。
在圖4中顯示了這個(gè)研究的結(jié)果。接受失活的干細(xì)胞RNA(RNase處理過的)對照大鼠不能學(xué)會(huì)任務(wù)。在試驗(yàn)過程中沒有應(yīng)答時(shí)間的縮短。但是，用干細(xì)胞RNA處理的動(dòng)物都學(xué)會(huì)了任務(wù)，其在能力上與年輕大鼠相當(dāng)。
干細(xì)胞來源的RNA對刺激老齡受體腦中的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制具有顯著的作用(p＝1.28×10-45)。通過對固有神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)生成本身的刺激或通過增加在組織修復(fù)中所涉及的分泌性分子產(chǎn)物的產(chǎn)生都可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)作用。
也已經(jīng)用125μg/μl劑量的胎兒(E12)來源的全腦RNA(n＝8)和注射PBS的對照(n＝8)重復(fù)了這個(gè)試驗(yàn)，具有相似的刺激作用。注射胎兒RNA的動(dòng)物比對照進(jìn)行地明顯更好(p＜1×10-5)。這個(gè)重復(fù)試驗(yàn)說明從已知顯示增加的干細(xì)胞活性的發(fā)育階段中制備的RNA也能用于刺激內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制。
實(shí)施例9胎腦提取的RNA對受損的腦組織的體外作用實(shí)施例8中的兩個(gè)研究的結(jié)果說明來源于干細(xì)胞活性組織的外源性RNA或干細(xì)胞來源的RNA不僅可能影響內(nèi)源性干細(xì)胞，也可能影響固有分化細(xì)胞。實(shí)施例5也顯示了這一點(diǎn)。當(dāng)前的描述探討了胎腦來源的RNA對放置在體外的成體腦皮層細(xì)胞的作用。
已經(jīng)知道胎兒神經(jīng)元能在組織培養(yǎng)物中存活，而成體皮層神經(jīng)元不能很好地存活。主要原因是細(xì)胞在最初的細(xì)胞制備和鋪板過程中遭受的損害。已知分解外傷能產(chǎn)生不可修復(fù)的損害。已經(jīng)假設(shè)來自活躍發(fā)育的(胎兒)組織中的RNA可以修復(fù)這樣的損害，并增強(qiáng)這些細(xì)胞的存活。
利用在實(shí)施例1中所述的Kirby方案從3g新鮮的胎兒(E18)皮層中提取RNA。
通過在實(shí)施例4中所述的技術(shù)(Saneto&deVallis，1987)培養(yǎng)成體神經(jīng)組織。這個(gè)方案生成了極好的胎兒皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)物，但是利用這個(gè)方法，成體皮層的制備物不能存活。從48天大的SpragueDawley大鼠中切割下來源皮層，并將其以約1×105個(gè)細(xì)胞的密度鋪板到24孔板內(nèi)。據(jù)此制備出96孔板。在鋪板后24個(gè)小時(shí)，觀察到所有的孔都有大量的死亡的、壞死的和即將死亡的細(xì)胞。用150μg溶解在神經(jīng)元培養(yǎng)基中的胎腦RNA處理每個(gè)24孔板中的12個(gè)孔。每個(gè)對照孔接受新鮮的培養(yǎng)基。再留置細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，然后所有的孔都接受新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換。每3天重復(fù)培養(yǎng)基更換一次。每24個(gè)小時(shí)觀察細(xì)胞一次。
在培養(yǎng)基更換后24個(gè)小時(shí)的最初觀察顯示所有對照孔都是死亡細(xì)胞。沒有看到活細(xì)胞，觀察到漂浮的碎片塊，并且在所有對照孔的底部發(fā)現(xiàn)了厚厚一層的死物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)所有的對照孔都具有混濁的變色的提示死培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。試驗(yàn)孔表現(xiàn)為較健康，但仍含有一些死物質(zhì)。但是，可看到活細(xì)胞。
在72個(gè)小時(shí)(第二次培養(yǎng)基更換)之后，所有對照孔都是死細(xì)胞(并被清除)。試驗(yàn)孔含有經(jīng)培養(yǎng)基更換清除了的細(xì)胞碎片，但是在所有孔中，仍有一些活細(xì)胞粘附在板上。從許多細(xì)胞中都可看到向外長出小的軸突以及清楚的神經(jīng)形態(tài)學(xué)。
在96個(gè)小時(shí)之后，所有試驗(yàn)孔都具有茂密的神經(jīng)元，許多都具有可見的軸突和樹突樣結(jié)構(gòu)。17/48(35％)孔表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞接觸和連通性。
在120個(gè)小時(shí)之后，所有試驗(yàn)組都含有大量的表現(xiàn)出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群。在所有孔中都有明顯的廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
再保持細(xì)胞30天，并始終都表現(xiàn)出神經(jīng)形態(tài)學(xué)。
這個(gè)實(shí)施例顯示了出用于培養(yǎng)成體神經(jīng)組織的新的方法學(xué)。此外，它說明從富含干細(xì)胞的胎兒組織來源中提取到的RNA對受損細(xì)胞具有明顯的解救作用。這提示了一種通過可經(jīng)各種方法被轉(zhuǎn)運(yùn)到老齡的、患病的組織或難治的創(chuàng)傷或傷口的胎兒的或培養(yǎng)的干細(xì)胞而進(jìn)行組織修復(fù)和再生的新方法。
實(shí)施例10大鼠胚胎RNA增加干細(xì)胞參與組織再生的用途成年哺乳動(dòng)物包括人類在多個(gè)組織和器官中都具有比胎兒階段更差的再生能力，在胎兒階段常常具有廣泛的再生能力。與這種再生能力喪失有關(guān)的兩個(gè)主要因素是疤痕組織的形成和將新細(xì)胞補(bǔ)充到受損組織中的分泌分子的喪失。雖然多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)告所注射的干細(xì)胞在受損組織內(nèi)的整合，但這只是相當(dāng)小的級(jí)別。假設(shè)如果可以在成體中重演胎兒階段的信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制，應(yīng)該可以提高干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)表現(xiàn)出很少的修復(fù)或沒有表現(xiàn)出修復(fù)的結(jié)構(gòu)的主要再生的能力。這包括與疤痕相關(guān)的舊損傷，已知疤痕能抑制干細(xì)胞遷移、整合和修復(fù)的能力。所用的方法是完整胚胎RNA和干細(xì)胞的共注射。所提供的實(shí)施例舉例說明了在注射完整大鼠胚胎RNA和骨髓干細(xì)胞之后，成體大鼠中的已有的耳穿孔病灶的完全再生。
從定時(shí)配對的Lister Hooded大鼠的子宮中取出15天大的胎兒。用Turex勻漿器在冷PBS中機(jī)械地分離胎兒組織。利用在實(shí)施例1中所述的Kirby方案提取RNA。
如實(shí)施例1中所述培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞，并如實(shí)施例7中所述將其濃縮成注射液。
損傷模型包括在注射時(shí)年齡為137和149天之間的雄性ListerHooded大鼠。所有大鼠在注射日期之前30天時(shí)接受了一個(gè)左耳的1.5mm的穿孔損傷，以建立一個(gè)舊損傷的模型。在這個(gè)年齡的大鼠不再生耳組織。
試驗(yàn)動(dòng)物(n＝6)都接受了尾部靜脈注射800μg溶解在0.3ml PBS中的胚胎RNA。1個(gè)小時(shí)之后，動(dòng)物接受了第二次注射，注射了懸浮在0.3ml α-MEMS培養(yǎng)基中的約2×105個(gè)骨髓干細(xì)胞。對照動(dòng)物(n＝6)接受了初次尾部靜脈注射約2×105個(gè)骨髓干細(xì)胞，隨后在1個(gè)小時(shí)之后第二次注射了0.3ml PBS。另一組是沒有處理的對照(n＝6)，它們是耳部受損的但沒有接受處理。
每天觀察動(dòng)物的任何耳部損傷再生的征象。結(jié)果顯示在未處理對照組沒有組織修復(fù)或重塑的證據(jù)。相似地，僅僅注射干細(xì)胞的對照也沒有表現(xiàn)出任何修復(fù)的證據(jù)，除了在一只動(dòng)物的損傷部位的周圍的輕微的炎癥反應(yīng)持續(xù)了17個(gè)小時(shí)。所有用胚胎RNA和干細(xì)胞聯(lián)合處理的試驗(yàn)動(dòng)物在注射后6到9天之間都顯示出損傷的完全閉合。在6只試驗(yàn)動(dòng)物的5只中，有著損傷的完全重塑直到?jīng)]有任何可見的疤痕或原始病變的證據(jù)的程度。動(dòng)物3表現(xiàn)出病變的完全閉合，但仍有可見的皮膚覆蓋的凹陷。
結(jié)果清楚地顯示共注射胚胎來源的RNA部分與干細(xì)胞能顯著地提高由干細(xì)胞介導(dǎo)的組織修復(fù)和再生。從這個(gè)實(shí)施例以及本發(fā)明人的其它相似的研究中可以清楚地看到，胚胎RNA改變了組織周圍的宿主組織環(huán)境以引導(dǎo)所注射的干細(xì)胞進(jìn)入到受損區(qū)域。此外，相似地改變了舊的損傷疤痕以提供干細(xì)胞浸潤以及隨后的病變修復(fù)的可行的環(huán)境。通過這樣的共治療，干細(xì)胞被補(bǔ)充到受損組織中，然后一旦進(jìn)入位置則可以通過相關(guān)組織類型的再生逆轉(zhuǎn)該損害。最為重要的事實(shí)是在本實(shí)施例中所用的損害模型是單獨(dú)干細(xì)胞注射所不能修復(fù)的相當(dāng)舊的損傷。本發(fā)明提供了一種提高任何潛在的干細(xì)胞治療的療效的新方法。利用從保持在組織培養(yǎng)物中的胎兒組織中提取的并早至干細(xì)胞注射之前48個(gè)小時(shí)將其注射的RNA也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。還沒有研究更長的間隔。相似地，RNA和干細(xì)胞的同步注射實(shí)現(xiàn)了相似的受損組織的大部修復(fù)。推定胚胎RNA重新生成了胎兒期間的可行的再生環(huán)境和信號(hào)傳導(dǎo)環(huán)境。
實(shí)施例11從成年大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中生成大鼠胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞雖然在許多研究實(shí)驗(yàn)室中都把更多的重點(diǎn)放在了成體干細(xì)胞的可塑性上，但是其它的實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為胚胎干細(xì)胞會(huì)給未來的再生醫(yī)學(xué)提供最大的希望。胚胎干細(xì)胞具有一些實(shí)際的缺點(diǎn)例如生成胚胎干細(xì)胞的倫理問題、細(xì)胞系的污染或合適細(xì)胞的可得性。本實(shí)施例嘗試用胚胎干細(xì)胞提取的RNA將成體骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。
按照Fandrich等(2002)的方案實(shí)施對大鼠胚胎干細(xì)胞(RESC)的分離、生長和維持。簡而言之，從來源于定時(shí)配對的Sprague Dawley大鼠的4到5日齡胚泡的解離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出RESC。將胚胎干細(xì)胞維持在絲裂霉素處理過的胚胎成纖維細(xì)胞的滋養(yǎng)層上。培養(yǎng)基由高葡萄糖的Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基、10％熱滅活的胎牛血清、1％200mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素溶液(50IU/50μg)、胰島素(0.09mg/ml)、1000U/ml LIF和5ml核苷溶液(如在Ruhnke等，2003中所報(bào)告的)構(gòu)成。
這些細(xì)胞生長為有特征的光滑的圓形簇團(tuán)，并且對于一種常用的ES標(biāo)記物堿性磷酸酶染色呈陽性。
按照產(chǎn)品說明書，用RNAzol制劑從這些RESC中提取到RNA。如在實(shí)施例6中所述的將成體骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板中。將每個(gè)匯合孔分成試驗(yàn)(n＝12)或?qū)φ?n＝12)。試驗(yàn)孔在常規(guī)培養(yǎng)基更換時(shí)接受了3ml含有150μg RESC RNA的骨髓培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)。對照動(dòng)物接受了3ml骨髓培養(yǎng)基。在24個(gè)小時(shí)之后，在實(shí)驗(yàn)組的一些細(xì)胞的形態(tài)上已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的變化。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞典型的集落形成單位出現(xiàn)了斷裂，以及大量的聚集的光滑圓形簇團(tuán)的細(xì)胞漂浮出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。這種形態(tài)學(xué)是RESC培養(yǎng)物的提示。在對照孔中沒有出現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)。抽吸出漂浮的聚集結(jié)構(gòu)及培養(yǎng)基并將其放置到如上面所述的RESC培養(yǎng)基中的滋養(yǎng)層上，并長期培養(yǎng)維持。在60天內(nèi)它們保持漂浮的圓形聚集形態(tài)學(xué)。在培養(yǎng)60天后，這些細(xì)胞的堿性磷酸酶(ES標(biāo)記物)染色呈陽性。也抽吸出對照孔的培養(yǎng)基并將其放置在與進(jìn)行RESC培養(yǎng)相同的孔內(nèi)，沒有出現(xiàn)聚集的漂浮結(jié)構(gòu)。
這個(gè)試驗(yàn)說明了一種用于從成體干細(xì)胞生成胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的新方法，它所遇到的倫理問題較少。
實(shí)施例12體內(nèi)注射來自有運(yùn)動(dòng)耐力大鼠的肌肉RNA誘導(dǎo)了久坐(sedentary)大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力已知運(yùn)動(dòng)對于肌肉解剖學(xué)和生理學(xué)都是有益的。在反復(fù)運(yùn)動(dòng)過程中，骨骼肌的微損害誘導(dǎo)了干細(xì)胞活性和肌肉細(xì)胞生物學(xué)的改變。這些改變促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)耐力的增加。
將從運(yùn)動(dòng)大鼠的后肢肌肉中提取到的RNA注射到久坐動(dòng)物內(nèi)，以探討這樣的處理對受體動(dòng)物在劇烈運(yùn)動(dòng)期間的能力的作用。運(yùn)動(dòng)任務(wù)包括在旋轉(zhuǎn)圓筒內(nèi)的奔跑。大鼠容易學(xué)會(huì)通過按圓筒的旋轉(zhuǎn)速度所指示的合適的速度奔跑而停留在裝置上。當(dāng)動(dòng)物累了并停止奔跑后，它就掉到了裝滿碎紙片的塑料柜中。一旦掌握了奔跑技巧，動(dòng)物將在裝置上快樂地奔跑直到精疲力竭。在裝置上最初訓(xùn)練一段時(shí)間之后，將奔跑時(shí)間記錄為對運(yùn)動(dòng)耐力的測定值。
每日按如下的合適的運(yùn)動(dòng)方案訓(xùn)練試驗(yàn)供體大鼠(n＝10)周1-每天給予動(dòng)物5次試驗(yàn)(10分鐘)，試驗(yàn)間的間隔為1個(gè)小時(shí)。旋轉(zhuǎn)速度被設(shè)定為15mm/秒。一旦動(dòng)物掉下，將其放置回到圓筒上直到完成試驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)時(shí)間。在這個(gè)適應(yīng)周中，所有動(dòng)物都輕易地掌握了這項(xiàng)運(yùn)動(dòng)技能。
周2-每天給予動(dòng)物5次試驗(yàn)，將速度增加到37mm/秒，以及1個(gè)小時(shí)的試驗(yàn)間的間隔。如果動(dòng)物掉下，馬上將其放回到裝置上。每個(gè)試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間為15分鐘。
周3-每天給予動(dòng)物試驗(yàn)一次，速度與前相同，但一直奔跑直到第一次掉下。
周4-每天給予動(dòng)物試驗(yàn)一次，奔跑速度為97mm/秒直到第一次掉下。
對照供體大鼠(n＝10)沒有被暴露于運(yùn)動(dòng)裝置，在整個(gè)4周的運(yùn)動(dòng)期內(nèi)仍留在它們的籠子中。
在第4周結(jié)束時(shí)犧牲兩組供體，并切下后肢肌肉。用在實(shí)施例1中所列的方法提取RNA。然后儲(chǔ)存900μg劑量的RNA用于注射。
將受體動(dòng)物(n＝20)分成兩個(gè)匹配的組。所有的受體動(dòng)物都接受了1周的裝置上的定位訓(xùn)練，如在供體的第1周訓(xùn)練中所述的那樣。它們沒有接受其它的訓(xùn)練。
在最后的定位試驗(yàn)后1天，受體大鼠接受了注射到尾部靜脈內(nèi)的含有900μg RNA的0.3ml PBS。試驗(yàn)受體動(dòng)物接受了運(yùn)動(dòng)肌肉RNA，對照動(dòng)物接受了未運(yùn)動(dòng)的RNA。
在注射后1周，所有大鼠都接受了如下的奔跑試驗(yàn)以15mm/秒的速度輕輕地奔跑5分鐘。所有的大鼠在這個(gè)時(shí)期都是能平衡的并能安逸地奔跑。在5分鐘的平衡試驗(yàn)之后，速度被增加到了97mm/秒，記錄直到掉下/跳下的持續(xù)時(shí)間作為運(yùn)動(dòng)耐力的測定值。
在兩組之間有著明顯的差異。接受未運(yùn)動(dòng)的RNA的受體有著3.54分鐘的平均運(yùn)動(dòng)時(shí)間。接受來自運(yùn)動(dòng)大鼠的肌肉RNA的受體有著6.19分鐘的平均運(yùn)動(dòng)時(shí)間。
與對照比較，從運(yùn)動(dòng)鍛煉的動(dòng)物中提取的RNA增強(qiáng)了受體動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力。這些初步的數(shù)據(jù)說明通過體內(nèi)應(yīng)用RNA可以將運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉增強(qiáng)作用轉(zhuǎn)移給未接受過實(shí)驗(yàn)的(naive)肌肉。這可以提供一種有價(jià)值的各種肌肉退行性疾病的治療方法或一種提高疾病、衰老或年齡相關(guān)性病態(tài)中的肌肉量的新方法。此外，該技術(shù)在農(nóng)業(yè)上也是有價(jià)值的。
應(yīng)理解上面僅僅通過實(shí)施例的方式描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)可以進(jìn)行修飾。
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權(quán)利要求
1.一種將一種細(xì)胞的性質(zhì)向一種或多種所需細(xì)胞類型的性質(zhì)改變的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)改變細(xì)胞性質(zhì)的條件下提供給一細(xì)胞群，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述分離的RNA提供給患者體內(nèi)的細(xì)胞群。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述性質(zhì)是表型的性質(zhì)。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述性質(zhì)是一種細(xì)胞功能。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述性質(zhì)的改變涉及一種遺傳轉(zhuǎn)化，以使得所述細(xì)胞群獲得一種改變的、可遺傳的基因型。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞性質(zhì)的改變是干細(xì)胞向成體的特化細(xì)胞的分化。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞性質(zhì)的改變是成體的特化細(xì)胞向干細(xì)胞的逆分化。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞性質(zhì)的改變是特化成體細(xì)胞向具有不同特性的成體細(xì)胞的分化。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞性質(zhì)的改變是免疫學(xué)特征譜的變化。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法提高了患者體內(nèi)干細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在患者體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法實(shí)現(xiàn)患病細(xì)胞的修復(fù)，改變細(xì)胞的遺傳組成，誘導(dǎo)特異細(xì)胞類型和/或細(xì)胞命運(yùn)，改變細(xì)胞的免疫學(xué)特征譜，和/或誘導(dǎo)特殊的所需免疫功能或性質(zhì)。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其還包括向患者提供干細(xì)胞的步驟。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述提供干細(xì)胞的步驟與所述的提供分離的RNA的步驟是順序進(jìn)行的、同時(shí)進(jìn)行的、或分開進(jìn)行的。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離的RNA包括可從處于與所處理細(xì)胞的發(fā)育階段不同的發(fā)育階段的細(xì)胞中提取的RNA序列。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離的RNA包括可從處于比所處理細(xì)胞的增殖階段更為活躍的細(xì)胞增殖階段的細(xì)胞中提取的RNA序列。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離的RNA包括可從來自表現(xiàn)出對疾病或病變具有免疫性或抗性的個(gè)體的細(xì)胞中提取的RNA序列。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離的RNA包括可從胎兒細(xì)胞、新生兒細(xì)胞、幼體細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞中提取的RNA序列。
19.一種在體內(nèi)或在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或來源于動(dòng)物或植物組織的全能或多能干細(xì)胞分化成一種或多種所需細(xì)胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA。
20.一種在體內(nèi)或在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞系的全能或多能干細(xì)胞或來源于動(dòng)物或植物組織的全能或多能干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化的方法，其包括將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)所述干細(xì)胞的所需分化的條件下提供給所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細(xì)胞類型的組織或細(xì)胞中提取的RNA。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是于細(xì)胞。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述干細(xì)胞是成年動(dòng)物干細(xì)胞或成體干細(xì)胞系。
23.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或來源于這些細(xì)胞的干細(xì)胞系。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述成體干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞或神經(jīng)元干細(xì)胞或相應(yīng)衍生的干細(xì)胞系。
25.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是人干細(xì)胞或人干細(xì)胞系。
26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞被導(dǎo)致分化成一種或多種穩(wěn)定的終末細(xì)胞類型。
27.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞在分化之前被遺傳修飾。
28.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞來源于所述所需細(xì)胞的預(yù)期受體。
29.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA包括從與所處理的細(xì)胞的個(gè)體來源不同的組織或細(xì)胞中提取的RNA，所述提取的RNA來源于具有與所需細(xì)胞的預(yù)期受體相容的免疫學(xué)特征譜的供體。
30.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中一種全組織或全細(xì)胞RNA提取物作為RNA提取物被提供用于細(xì)胞攝取。
31.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中可從一種或多種類型的腦細(xì)胞或腦細(xì)胞系中提取的RNA被提供用于細(xì)胞攝取。
32.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞且所提供的分離的RNA包括可從一種或多種類型的腦細(xì)胞或骨骼肌或兩者任一相應(yīng)的衍生細(xì)胞系中提取的RNA。
33.權(quán)利要求1到31中任一項(xiàng)的一種能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的RNA在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。
34.權(quán)利要求32的用途，其中所述RNA適合于在體內(nèi)誘導(dǎo)全能或多能干細(xì)胞的分化以治療退行性腦病或腦部或脊髓損傷。
35.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的用途，其中所述RNA適合于在體內(nèi)誘導(dǎo)全能或多能干細(xì)胞的分化以治療選自肝病、心臟病、骨骼肌或心肌疾病或I型糖尿病的疾病。
36.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的用途，其中在體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化以對抗年齡相關(guān)性退行性疾病。
37.一種在體外逆轉(zhuǎn)細(xì)胞系的分化細(xì)胞或從動(dòng)物或植物組織中獲得的分化細(xì)胞的分化以生成一或多種所需類型的全能或多能干細(xì)胞或干細(xì)胞系的方法，其包括將分離的RNA提供給所述分化細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物由此實(shí)現(xiàn)所需的分化細(xì)胞向所述類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系類型的分化逆轉(zhuǎn)，所述分離的RNA包括可從所需類型的干細(xì)胞或干細(xì)胞系中提取的RNA。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述細(xì)胞是在權(quán)利要求20到24的任一項(xiàng)中所定義的細(xì)胞。
39.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述分化細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和造血細(xì)胞或來源于這些細(xì)胞的細(xì)胞系。
40.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述分化細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞系，以及RNA是可從骨髓干細(xì)胞或神經(jīng)元干細(xì)胞中提取的RNA。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所提供的分離的RNA包括從骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞或衍生自兩者中任一的干細(xì)胞系中提取的RNA。
42.一種生產(chǎn)分化細(xì)胞的體外方法，其包括i)實(shí)施權(quán)利要求36到40中任一項(xiàng)的方法以從分化細(xì)胞中生成干細(xì)胞或干細(xì)胞系；ii)對所述干細(xì)胞或干細(xì)胞系實(shí)施權(quán)利要求I到31中任一項(xiàng)的方法以生成分化細(xì)胞。
43.權(quán)利要求41的方法，還包括將遺傳修飾引入到干細(xì)胞內(nèi)。
44.通過權(quán)利要求1到31、或36到42中任一項(xiàng)的方法獲得的細(xì)胞。
45.權(quán)利要求43的細(xì)胞在生產(chǎn)用于提高或矯正組織或細(xì)胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。
46.一種篩選能將所需的性質(zhì)從一種細(xì)胞類型賦予給另一種細(xì)胞類型的RNA序列的方法，所述方法包括步驟a)從包括所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取RNA；b)將所提取的RNA分成不同的部分；c)向測試細(xì)胞提供一個(gè)部分；d)分析測試細(xì)胞的改變的性質(zhì)，所述改變的性質(zhì)是提取RNA所用的所需細(xì)胞類型所具有的；其中將改變的性質(zhì)賦予測試細(xì)胞的部分被鑒定為包括能賦予所需性質(zhì)的RNA序列的部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用RNA改變細(xì)胞性質(zhì)。具體地，本發(fā)明涉及改變細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化的能力。例如，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，包括獲得遷移、整合、和增殖的能力。本發(fā)明也涉及在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、整合、增殖和/或分化。因此，本發(fā)明涉及促進(jìn)由干細(xì)胞介導(dǎo)的功能修復(fù)。本發(fā)明也涉及逆轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的分化。通過將分離的RNA在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞性質(zhì)的改變的條件下提供給一群細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)所有這些作用，所述分離的RNA包括可從包括所需細(xì)胞類型的細(xì)胞中提取的RNA序列。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101072866SQ200480025874
公開日2007年11月14日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者斯蒂芬·雷 申請人:里伯斯代姆有限公司