專利名稱：包含水包油乳液的疫苗制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水包油型乳液、及其作為佐劑的用途和含有其的藥物、免疫或疫苗組合物。
相關技術的描述在疫苗中使用佐劑是公知的。佐劑是這樣的化合物當與疫苗抗原組合時，與疫苗抗原單獨誘導的應答相比較，提高了對疫苗抗原的免疫應答。促進抗原免疫原性的策略中有使疫苗抗原成為顆粒的那些，聚合或乳化疫苗抗原的那些，封裝疫苗抗原的方法，提高宿主先天細胞因子應答的方法，以及使疫苗抗原靶向抗原呈遞細胞的方法(Nossal，1999，F(xiàn)undamental Immunology.Paul(編輯)，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa，；Vogel和Powel，1995，Vaccine Design.The subunit and Adjuvant Approach.Powell和Newman(編輯)，Plenum Press，NY，N.Y.p.141)。由于佐劑在提高疫苗抗原免疫原性中的實質(zhì)性作用，在疫苗配制中使用佐劑實際上已是普遍的了(Nossal，1999，上文；Vogel和Powel，1995，上文；以及參見PCT公開WO97/18837，其教導在此引入作為參考)。本領域公知的常用佐劑，性質(zhì)上是多種多樣的。例如，它們可以由水不溶性無機鹽、脂質(zhì)體、膠束或乳液組成，即弗氏佐劑。其它佐劑可在Vogel和Powel，1995，提及的上文中找到。盡管不存在佐劑作用的單一機理，一個基本特征是與疫苗抗原單獨誘導的應答相比較，它們顯著提高對疫苗抗原的免疫應答的能力，(Nossal，1999，上文；Vogel和Powel，1995，上文)。在這點上，一些佐劑對增進體液免疫應答更有效；其它佐劑對提高細胞介導的免疫應答更有效(Vogel和Powel，1995，上文)；以及另一組佐劑同時提高了對抗疫苗抗原的體液和細胞介導的免疫應答(Vogel和Powel，1995，上文)。
通常，疫苗制劑中所用的乳液包括油、水溶液和表面活性劑的混合物。一些乳液摻入了親脂性表面活性劑如Span 80和親水性表面活性劑如吐溫80。這些乳液還可含有已知具有離子表面活性劑特性的化合物如卵磷脂或皂苷。
然而，觀察到乳液用作疫苗佐劑的穩(wěn)定性問題，尤其是在儲存或運輸過程中。當這些組合物含有濃縮的免疫原，尤其是非純化的濃縮免疫原時，這尤其真實。通常，這是將佐劑用于滅活(死)疫苗中的情況。多價疫苗組合物中這問題甚至更顯著，因為免疫原在相同體積的稀釋液中更濃縮。
使用佐劑的另一問題是與不良事件如毒性或注射部位局部炎癥的風險相關。例如，注射后可導致局部炎癥反應和/或肉芽腫。為了限制這樣的不良反應，可減少乳液中的表面活性劑和其它成分；然而，這種減少然后可能導致疫苗組合物穩(wěn)定性的下降。因此，存在對新的佐劑和含有該佐劑的安全性和穩(wěn)定性提高的疫苗組合物的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個實施方案中提供了新的水包油型(O/W)乳液，在細菌或病毒懸液尤其是那些濃縮的和非純化的或弱純化的細菌或病毒懸液存在下具有提高的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一實施方案提供了穩(wěn)定的、安全的和容易給藥的，尤其是可注射的O/W乳液，作為包括至少一種活性成分的藥物組合物的遞送載體，活性成分可更特別地是免疫原。
本發(fā)明的另一實施方案提供了穩(wěn)定的、安全的和可注射的O/W乳液，作為佐劑來提高免疫原誘導的免疫應答。特別地，本發(fā)明提供了新的佐劑，當其用于含有免疫原的疫苗組合物中時，提高了接種者對免疫原的細胞免疫應答、體液免疫應答，或優(yōu)選兩種應答。
本發(fā)明的另一實施方案提供了穩(wěn)定的、安全的并包括O/W乳液的免疫原性組合物或疫苗。
本發(fā)明的再一實施方案提供了使用本發(fā)明的佐劑制備疫苗組合物的方法；所獲得的疫苗組合物；及其使用方法。
本發(fā)明的再一實施方案提供了一種試劑盒，包括第一個小瓶中的免疫原或其它藥品，和第二個小瓶中的根據(jù)本發(fā)明制得的佐劑，將佐劑設計成在使用前與免疫原或其它疫苗產(chǎn)品混合。
一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了可注射的水包油型(O/W)乳液，包括(1)含有免疫原的水溶液；(2)礦物油；(3)非離子親脂性表面活性劑；(4)具有低HLB值的非離子親水性表面活性劑，其包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯(通常具有11至13的HLB值)。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了可注射的水包油型(O/W)乳液，包括(1)含有免疫原的水溶液；(2)具有大于13且低于40的高親水-親脂平衡(HLB)值的非離子親水性表面活性劑，尤其是HLB≥13.5，優(yōu)選HLB≥14；(3)礦物油；(4)非離子親脂性表面活性劑；(5)具有低HLB值(約9至約13的HLB值)的非離子親水性表面活性劑。
再一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包括新乳液的疫苗組合物，含有至少一種適于引發(fā)接種者免疫應答的免疫原。本發(fā)明進一步提供了這樣的組合物，其中乳液作為佐劑來提高由免疫原誘導的免疫應答，尤其是，提高細胞應答、體液應答，或優(yōu)選提高兩者。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了制備疫苗組合物的方法，其中將免疫原尤其是凍干形式的或水溶液中的免疫原與根據(jù)本發(fā)明的佐劑混合。免疫原可以選自滅活病原體、減毒病原體、亞單位抗原、包括質(zhì)粒的重組表達載體，等等。病原體可以是細菌、病毒、原生動物或真菌來源的或免疫原可以構(gòu)成抗毒素。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了誘導接種者對抗病原體的免疫應答的方法，包括將本發(fā)明的疫苗組合物給藥于接種者。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包括至少兩個小瓶的試劑盒，第一個小瓶中是免疫原，尤其是凍干形式的或含水介質(zhì)溶液中的免疫原，第二個小瓶中是根據(jù)本發(fā)明的佐劑或乳液。
注意到本說明書尤其是權(quán)利要求中，術語如包含(“comprises”、“comprised”、“comprising”)等等可具有美國專利法中歸屬于這樣術語的含意；例如，它們可以意思是“包括”(“includes”、“included”、“including”)，等等；以及術語如“基本上由……組成”(“consisting essentially of”和“consists essentiallyof”)具有美國專利法歸于它們的含意，例如，它們允許未明確引述的要素，但是排除現(xiàn)有技術中發(fā)現(xiàn)的要素或影響本發(fā)明基礎的或新的特征的要素。
公開了這些和其它實施方案或從以下的詳述這些和其他實施方案是顯而易見的且這些和其他實施方案包括于以下的詳述中。
附圖簡述對本領域技術人員，本發(fā)明的完整和使其能實施的公開，包括其最佳方式，更具體地列于說明書的剩余部分，包括對附圖的參照，其中

圖1說明了根據(jù)實施例3接種疫苗后28天攻擊小豬的肺損害分值。通過十字顯示平均值，通過方框表示下四分位數(shù)和上四分位數(shù)，通過方框中的水平線表示統(tǒng)計學中值，通過垂直線表示最小至最大的值。
圖2說明了根據(jù)實施例4接種疫苗后20周攻擊小豬的肺損害分值。通過十字顯示平均值，通過方框表示下四分位數(shù)和上四分位數(shù)，通過方框中的水平線表示統(tǒng)計學中值，通過垂直線表示最小至最大的值。
圖3提供了臨床疾病進展的圖示，通過根據(jù)實施例6攻擊后的臨床分值來示例。
圖4描繪了現(xiàn)場效力測試的結(jié)果，其中在生產(chǎn)前接種一次根據(jù)本發(fā)明制得的PCV-2疫苗組合物的母豬產(chǎn)下的小豬(n＝889只小豬)顯示了由于斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的死亡率顯著降低(降低75％)，與未接種疫苗的母豬產(chǎn)下的對照小豬相比較(n＝713)。
發(fā)明詳述本發(fā)明的其它目的、特征和方面描述于以下的詳述中或從以下的詳述變得顯而易見。本領域技術人員可以理解本討論是僅僅示例性實施方案的描述并不是來限制本發(fā)明的較寬方面，其較寬方面在實例構(gòu)建中體現(xiàn)。實際上，本領域技術人員清楚對本發(fā)明可以作出各種改進和改變而沒有脫離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一實施方案的一部分說明或描述的特征可以用于另一實施方案中來產(chǎn)生再一實施方案。預期的是本發(fā)明涵蓋這樣的改進和改變落在所附權(quán)利要求及其等同方案范圍之內(nèi)。貫穿本申請所引用的所有參考文獻、公開專利和專利的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。
為了方便，在此集中說明書、實施例和所附權(quán)利要求中所用的特定術語。
如在此所用的，術語“動物”包括所有脊椎動物，包括人。還包括所有發(fā)育階段中的個體動物，包括胚胎和胎兒階段。特別地，術語“脊椎動物”包括，但不限于，人、犬科動物(例如，狗)、貓科動物(例如，貓)；馬科動物(例如，馬)、牛族動物(例如，牛)、豬類動物(例如，豬)，以及鳥類。如在此所用的術語“鳥類”指的是分類學類別ava的任何物種或亞種，如，但不限于，雞(育種雞、烤子雞和產(chǎn)蛋雞)、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、小雀類、鷹、烏鴉和包括鴕鳥、鴯鹋和食火雞的平胸類鳥。
如在此所用的，術語“豬”或“小豬”意思是豬起源的動物，而“母豬”指的是生殖年齡和能力的雌性。
如在此所用的，術語“致病性強的”意思是保留其在動物宿主中感染能力的分離株。
如在此所用的，術語“滅活疫苗”意思是含有不再能夠復制或生長的感染性生物體或病原體的疫苗組合物。病原體可以是細菌、病毒、原生動物或真菌來源的?？赏ㄟ^各種方法包括凍融、化學處理(例如，用硫柳汞或福爾馬林處理)、聲處理、照射、熱或任何其它足以阻止生物體復制或生長的常用方法來實現(xiàn)滅活而維持其免疫原性。
如在此所用的，術語“免疫原性”意思是能夠在宿主動物中產(chǎn)生對抗抗原的免疫應答。該免疫應答形成由疫苗引發(fā)的對抗特定感染性生物體的保護性免疫的基礎。
如在此所用的，術語“免疫應答”指的是動物中引發(fā)的應答。免疫應答可以指細胞免疫(CMI)；體液免疫或可以包括兩者。本發(fā)明還涉及限于免疫系統(tǒng)一部分的應答。例如，本發(fā)明的疫苗組合物可以特異性地誘導提高的γ干擾素應答。
如在此所說的，術語“抗原”或“免疫原”意思是誘導宿主動物中特異性免疫應答的物質(zhì)。抗原可以包括整個生物體，殺滅的、減毒的或活的；生物體的亞單位或部分；含有具有免疫原性插入片段的重組載體；呈遞給宿主動物時能誘導免疫應答的DNA碎片或片段；蛋白質(zhì)、多肽、肽、表位、半抗原或其任意組合?；蛘?，免疫原或抗原可以包括毒素或抗毒素。
如在此所用的，術語“多價”意思是含有多于一種抗原的疫苗，不管是來自相同的物種(即，豬肺炎枝原體(Mycoplasmahyopneumoniae)的不同分離株)或來自不同的物種(即，來自溶血巴斯德氏菌(Pasteurella hemolytica)和多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)的分離株)，或含有來自不同屬的抗原組合的疫苗(例如，包括來自多殺巴斯德氏菌、沙門氏菌(Salmonella)、大腸桿菌(Escherichia coli)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)和梭菌(Clostridium)的抗原的疫苗)。
如在此所用的，術語“佐劑”意思是加入疫苗來提高疫苗免疫原性的物質(zhì)。佐劑怎樣運作的機理不是十分清楚。相信一些佐劑通過緩慢釋放抗原來提高免疫應答，而其它佐劑其自己是強免疫原性的并據(jù)信可協(xié)同作用。已知的疫苗佐劑包括，但不限于，油和水乳液(例如，完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)，卡介苗、氫氧化鋁、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、海藻酸鈉、Bacto-佐劑、特定合成聚合物如聚氨基酸和氨基酸的共聚物、皂苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga.)、“AVRIDINE”(N，N-二(十八烷基)-N’，N’-雙(2-羥乙基)-丙二胺)、石蠟油、胞壁酰二肽等等。
如在此所用的，術語“藥物學上可接受的載體(carrier)”和“藥物學上可接受的載體(vehicle)”可互換使用且指的是用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而無不良作用的流體載體。本領域已知的合適的藥物學上可接受的載體包括但不限于無菌水、鹽水、葡萄糖、右旋糖或緩沖溶液。載體還可以包括助劑，包括但不限于稀釋劑、穩(wěn)定劑(即，糖和氨基酸)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、pH緩沖劑、增粘添加劑、色素等等。
如在此所用的，術語“疫苗組合物”包括藥物學上可接受載體中的至少一種用于在宿主中誘導免疫應答的抗原或免疫原?？梢砸詣┝亢屯ㄟ^醫(yī)藥或獸醫(yī)領域技術人員公知的技術給藥疫苗組合物，考慮這樣的因素如年齡、性別、體重、物種和接受動物的狀況，以及給藥途徑。給藥途徑可以是經(jīng)皮的，通過粘膜給藥(例如，口腔、鼻、肛門、陰道)或通過非腸道途徑(皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))。疫苗組合物可以單獨給藥，或可以與其它治療劑或療法共同給藥或按次序給藥。給藥的形式可包括懸液、糖漿或酏劑，以及用于非腸道、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥(例如，可注射的給藥)的制劑如無菌懸液或乳液。疫苗組合物可以作為噴霧劑給藥或混合于食品和/或水中或與合適的載體、稀釋劑或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等等混合遞送。根據(jù)給藥的途徑和所需的制劑，組合物可以含有輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、膠凝或增粘添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、色素，等等。可以參考標準的藥物教科書，如“Remington’sPharmaceutical Science，”，1990來制備合適的制劑，而不需要過度的實驗。
本發(fā)明提供了新的水包油型(O/W)佐劑或乳液，包括(1)含有能夠誘導宿主中免疫應答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)具有高于13且低于40(HLB＞13，尤其是≥13.5，優(yōu)選HLB≥14)親水-親脂平衡(HLB)值的非離子親水性表面活性劑；(3)礦物油；(4)非離子親脂性表面活性劑；和(5)具有低HLB值(9至13的HLB值)的非離子親水性表面活性劑。
根據(jù)本發(fā)明所制得的乳液是基于選自三個不同組表面活性劑成員的至少3種表面活性劑的組合，且其可能使用屬于每組中的一種或多種表面活性劑。
優(yōu)選實施方案中，乳液(在本說明書中這意味著包括所有成分的最終乳液，除非另外指出)中非離子親水性表面活性劑(5)的濃度為1％至8％，尤其是1.5％至6％，優(yōu)選2％至5％，更優(yōu)選2.5％至4％，以乳液的重量體積百分比(w/v)表示。
這組表面活性劑包括具有低HLB值(9至13的HLB值)的非離子親水性表面活性劑。這組包括但不限于乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯(尤其是5個乙氧基)(例如，乙氧基化失水山梨醇單油酸酯如吐溫81)、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯(尤其是20個乙氧基)(例如，乙氧基化失水山梨醇三油酸酯如吐溫85、乙氧基化失水山梨醇三硬脂酸酯如吐溫65)、乙氧基化脂肪醇(尤其是5-10個乙氧基)(例如，Brij76、Brij56、Brij96)、乙氧基化脂肪酸(尤其是5-10個乙氧基)(例如，Simulsol 2599、Myrj45)、乙氧基化蓖麻油(尤其是25-35個乙氧基)(例如，Arlatone650、Arlatone G)及其組合。
優(yōu)選乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯和乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯，以及這兩種的組合。脂肪酸優(yōu)選選自油酸、棕櫚酸、硬脂酸、異硬脂酸、月桂酸及其組合。優(yōu)選的乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯包括乙氧基化失水山梨醇三油酸酯如吐溫85，或乙氧基化失水山梨醇三硬脂酸酯如吐溫65。
優(yōu)選的實施方案中，非離子親水性表面活性劑(2)的濃度通常為0.1％至1.5％，尤其是0.2％至1.4％，優(yōu)選0.3％至1.3％，更優(yōu)選0.4％至1.2％，以乳液的重量體積百分比(w/v)表示。
這第二組表面活性劑包括具有高親水-親脂平衡(HLB)值(HLB＞13，尤其是HLB≥13.5，和優(yōu)選HLB≥14)的非離子親水性表面活性劑。這組包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯(尤其是20個乙氧基)(例如，乙氧基化失水山梨醇單月桂酸酯如吐溫20、乙氧基化失水山梨醇單棕櫚酸酯如吐溫40、乙氧基化失水山梨醇單硬脂酸酯如吐溫60乙氧基化失水山梨醇單油酸酯如吐溫80)、乙氧基化脂肪醇(尤其是15-30個乙氧基)(例如，Brij78、Brij98、Brij721)、乙氧基化脂肪酸(尤其是15-30個乙氧基)(例如，Myrj49、Myrj51、Myrj52、Myrj53)、非離子嵌段共聚物(例如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(POE-POP)，如Lutrol F127、Lutrol F68)及其組合。
對于非離子嵌段共聚物，百分比可以較低，尤其是0.1至0.5％，更優(yōu)選0.2％至0.4％(乳液的重量體積比(w/v))。
優(yōu)選的表面活性劑(2)包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯，如上述的那些。
優(yōu)選的實施方案中，非離子親脂性表面活性劑(4)的濃度通常為0.1％至2.5％，尤其是0.2％至2％，優(yōu)選0.2％至1.5％，更優(yōu)選0.2％至1.2％，以乳液的重量體積百分比(w/v)表示。
這組的表面活性劑包括失水山梨醇的脂肪酸酯(例如，失水山梨醇單月桂酸酯如Span 20、失水山梨醇單棕櫚酸酯如Span 40、失水山梨醇單硬脂酸酯如Span 60、失水山梨醇三硬脂酸酯如Span 65、失水山梨醇單油酸酯如Span 80、失水山梨醇三油酸酯如Span 85、失水山梨醇單異硬脂酸酯如Arlacel 987、失水山梨醇異硬脂酸酯如Crill 6)、二縮甘露醇脂肪酸酯(例如，Montanide 80、二縮甘露醇單油酸酯(如Arlacel A)、二縮甘露醇二油酸酯、二縮甘露醇三油酸酯、二縮甘露醇四油酸酯)、二縮甘露醇乙氧基化脂肪酸酯(2、3或4個乙氧基)(例如，Montanide 888、Montanide 103、乙氧基化二縮甘露醇單油酸酯、乙氧基化二縮甘露醇二油酸酯、乙氧基化二縮甘露醇三油酸酯、乙氧基化二縮甘露醇四油酸酯)及其組合。
脂肪酸優(yōu)選選自油酸、棕櫚酸、硬脂酸、異硬脂酸、月桂酸及其組合。
優(yōu)選的表面活性劑(4)包括失水山梨醇脂肪酸酯，尤其是上述的那些，及其組合。
本發(fā)明的表面活性劑可以含有來自動物或植物來源的脂肪酸?？梢院唵芜M行一個來源至另一個的改變(例如動物吐溫80至植物吐溫80)，在乳液配制中只作較小調(diào)整。
根據(jù)本發(fā)明的乳液可以具有的表面活性劑總濃度為，1.2％至10％，尤其是2％至8％，優(yōu)選3％至7％，更優(yōu)選4％至6％，乳液的重量體積比。
通常，根據(jù)本發(fā)明的乳液可以具有≥33℃的相轉(zhuǎn)變溫度(PIT)，尤其是33℃至65℃，更特別是36℃至60℃，優(yōu)選37℃至55℃，更優(yōu)選38℃至50℃。
PIT是油包水型乳液變成水包油型乳液或脫相(de-phase)(乳液破壞且2個相分離)的溫度。可以通過各種方法測量PIT值，例如通過外觀(例如，參見實施例2)或通過電導率。將乳液放置于低于乳液PIT的溫度，例如約25℃的水浴中。逐漸提高溫度。與對照乳液相比較，觀察乳液外觀特征的改變，尤其是流動性、粘度、兩相的分離、由于油相至表面的遷移表面特征的改變。觀察到該外觀特征改變的溫度是乳液的PIT值。或者，通過放置于乳液中接近其表面的探針測得電導率值從約5-8毫西門子/厘米(mS/cm)(水包油型乳液)快速變成約0mS/cm的值(油包水型乳液)來測定PIT。觀察到轉(zhuǎn)變的溫度是乳液的PIT值。為了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳液，尤其是具有上述限定范圍內(nèi)PIT值的乳液，本領域技術人員能夠確定表面活性劑和油的組合，包括它們各自的濃度，而不需要過度的實驗。
本發(fā)明的特定實施方案中，在此所述的乳液不含有任何離子表面活性劑和任何已知具有離子表面活性劑特性的化合物，如卵磷脂或皂苷。通常，根據(jù)本發(fā)明的乳液，以乳液的體積體積比，可以含有3％至55％的油，尤其是5％至50％的油，優(yōu)選10％至40％的油，更優(yōu)選，20％至40％的油。根據(jù)定義，本說明書中值的范圍總是包括范圍的限值，除非另外指出。
所用的油可以是礦物油，包括但不限于，石蠟油如異構(gòu)烷烴油和/或naphtenic oil、角鯊烷、姥鮫烷、聚異丁烯油、氫化聚異丁烯油、聚癸烯油、聚異戊二烯油、聚異丙稀油等等。用于本發(fā)明中的一種有利礦物油可以包括這樣的油，該油含有碳原子數(shù)多于15個的直鏈或支鏈碳鏈，優(yōu)選15至32，且無芳族化合物。這樣的油例如是以名稱“MARCOL 52”或“MARCOL 82”(Esso生產(chǎn)，F(xiàn)rance)或“DRAKEOL6VR”(Penreco生產(chǎn)，USA)銷售的那些。
油還可以是含有至少兩種選自在此所述的油且以任何比例的油混合物。油混合物還可以包括至少一種選自上述的油和至少一種植物油，且該植物油占油相的約0.1％至約33％，優(yōu)選約10％至約25％v/v。這些植物油是富含油酸的生物可降解不飽和油且優(yōu)選在存放溫度(約+4℃)是液體或至少使乳液在該溫度是液體。例如植物油可以是花生油、堅果油、向日葵油、紅花油、大豆油、onager油等等。
優(yōu)選實施方案中，親水性表面活性劑(2)和(5)優(yōu)選包括具有相同分子親水部分的表面活性劑。例如，對于每種親水性表面活性劑(2)和(5)使用乙氧基化失水山梨醇脂肪酸酯。例如，如果選擇吐溫85作為具有低HLB值的非離子親水性表面活性劑，具有高HLB值的非離子親水性表面活性劑將有利地含有由乙氧基化失水山梨醇構(gòu)成的親水性部分，如吐溫80。
通常，本發(fā)明設想使用含有合適的獸醫(yī)或藥物學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的水溶液，包括但不限于，無菌水、生理鹽水、葡萄糖、緩沖液等等。載體、賦形劑或稀釋劑還可以包括多元醇、glucids或pH緩沖劑。例如載體、賦形劑或稀釋劑還可以包括氨基酸、肽、抗氧化劑、殺菌劑、抑菌化合物。將水溶液加入油和表面活性劑中來獲得100％體積的根據(jù)本發(fā)明的乳液。
乳液的親水-親脂平衡(HLB)可允許估計表面活性劑的親水或親脂力。兩性分子的HLB通常如下計算 HLB可以具有0(最親脂分子)至20(最親水分子)的值。根據(jù)表面活性劑的化學組成(特別地例如乙氧基或烯氧化物的加入)，這種估算可改變且HLB值的范圍可提高(例如，Lutrol F68具有29的HLB)。對于表面活性劑的混合物，混合物的HLB是每種表面活性劑HLB的相加，通過其重量比來平衡 根據(jù)本發(fā)明制得的乳液的一實施方案中，乳液的最終HLB為約9至約12，優(yōu)選約9.5至約11.5，更優(yōu)選約10至約11.5。
本發(fā)明設想一種乳液，包括石蠟油(特別地濃度為約10％至約40％，優(yōu)選約20％至約40％，以乳液的體積體積比表示(v/v))；失水山梨醇脂肪酸單酯(作為非離子親脂性表面活性劑)、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯(作為具有低HLB值的非離子親水性表面活性劑)；和乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯(作為具有高HLB值的非離子親水性表面活性劑)。特別地失水山梨醇脂肪酸單酯是失水山梨醇單油酸酯(特別地濃度為0.2％至1.5％，優(yōu)選0.2％至1.2％，以乳液的重量體積比表示(w/v))，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯是乙氧基化失水山梨醇三油酸酯(特別地濃度為2％至5％，優(yōu)選2.5％至4％w/v)，和乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯是乙氧基化失水山梨醇單油酸酯(特別地濃度為0.3％至1.3％，優(yōu)選0.4％至1.2％w/v)。例如，乳液包括約29.3％乳液體積體積比的石蠟油，0.6％乳液重量體積比的失水山梨醇單油酸酯，3.4％乳液重量體積比的乙氧基化失水山梨醇三油酸酯，和0.75％乳液重量體積比的乙氧基化失水山梨醇單油酸酯。
根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方案中，乳液包括石蠟油(特別地濃度為約10％至約40％，優(yōu)選20％至40％(v/v))，失水山梨醇脂肪酸單酯(作為非離子親脂性表面活性劑)，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯(作為具有低HLB值的非離子親水性表面活性劑)，和非離子嵌段共聚物(作為具有高HLB值的非離子親水性表面活性劑)。特別地失水山梨醇脂肪酸單酯是失水山梨醇單油酸酯(特別地濃度為0.2％至1.5％，優(yōu)選0.2％至1.2％w/v)，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯是乙氧基化失水山梨醇三油酸酯(特別地濃度為2％至5％，優(yōu)選2.5％至4％w/v)和非離子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(POE-POP)(特別地濃度為0.1％至0.5％，優(yōu)選0.2％至0.4％w/v)。例如，乳液包括約29.3％v/v的石蠟油，0.6％w/v的失水山梨醇單油酸酯，3.4％w/v的乙氧基化失水山梨醇三油酸酯，和0.25％w/v的乙氧基化失水山梨醇單油酸酯。
一特定實施方案中，本發(fā)明設想可注射的水包油型(O/W)乳液，包括(1)含有活性成分如藥物或免疫原優(yōu)選免疫原的水溶液；(2)礦物油(3)非離子親脂型表面活性劑；和(4)具有低HLB值的非離子親水型表面活性劑，其包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯(其可具有11至13的HLB值)。
根據(jù)該實施方案的乳液包括含有多至20個乙氧基的乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯。脂肪酸可以來自動物或植物來源且可以選自油酸、棕櫚酸、硬脂酸、異硬脂酸、月桂酸及其組合。一實施方案中，乙氧基化脂肪酸優(yōu)選為油酸。其他成分以及乳液的一般特性如PIT，可以具有與上述那些相同的特征。
優(yōu)選，表面活性劑(4)包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯，如乙氧基化失水山梨醇二油酸酯、乙氧基化失水山梨醇二硬脂酸酯或乙氧基化失水山梨醇二異硬脂酸酯、乙氧基失水山梨醇二棕櫚酸酯、乙氧基失水山梨醇二月桂酸酯，及其組合。
可以任選將其他化合物作為共佐劑加入乳液中，包括但不限于，明礬；CpG寡核苷酸(ODN)，尤其是ODN 2006，2007，2059或2135(Pontarollo R.A.等，Vet.Immunol.Immunopath，2002，8443-59；Wernette C.M.等，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84223-236；Mutwiri.G.等，Vet.Immunol.Immunopath，2003，9189-103)；多A-多聚U(“Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach”，Michael F.Powell和Mark J.Newman編輯，PharmaceuticalBiotechnology，603)；溴化二甲基二(十八烷基)銨(DDA)(“VaccineDesign The Subunit and Adjuvant Approach”，Michael F.Powell和Mark J.Newman編輯，Pharmaceutical Biotechnology，6157)，N，N-二(十八烷基)-N’，N’-雙(2-羥乙基)丙二胺(如Avridine)(Ibid，p.148)，卡波姆，殼聚糖(例如參見US專利系列No.5,980,912)。
本發(fā)明還提供了制備疫苗組合物或免疫組合物的方法，該疫苗組合物或免疫組合物包括至少一種抗原或免疫原和根據(jù)本發(fā)明制得的佐劑或乳液?？梢栽谌橐盒纬蛇^程中摻入免疫原，或者在可替換的實施方案中，可在之后向乳液中加入免疫原，例如，就在使用前。
所用水溶液的全部量可以存在于最初制得的乳液中?；蛑挥性撍芤旱囊徊糠钟糜谛纬扇橐海趽饺朊庖咴髮⑹Ｓ嗔康乃芤杭尤?。免疫原或抗原可以是凍干形式或以一些其他合適固體形式存在，然后與乳液混合，或者，抗原可以在溶液中，尤其是水溶液，并將該溶液與乳液混合。
根據(jù)溶解性優(yōu)選將表面活性劑加入油或水溶液中。例如，根據(jù)本發(fā)明將非離子親脂性表面活性劑加入油中，而將具有高HLB值的非離子親水性表面活性劑加入水溶液中。
可根據(jù)本領域技術人員已知的常規(guī)方法來進行乳化。例如，本發(fā)明一實施方案中，在低于乳液PIT的溫度尤其是室溫例如約25℃來制得乳液。通過機械攪拌將水相和油相混合在一起，例如，使用裝備有轉(zhuǎn)子-定子的能夠形成高剪切力的渦輪機。優(yōu)選攪拌開始時轉(zhuǎn)速較低并通常隨著油中水溶液的逐漸加入而緩慢提高轉(zhuǎn)速。優(yōu)選將水溶液逐漸加入油中。調(diào)整油/水溶液比例來獲得油包水型(W/O)乳液，例如，濃度為約40％至約55％的油(v/v)。當停止攪拌時，乳液逐漸變?yōu)镺/W乳液(相變)。相變后并如果需要，通過加入水溶液將乳液稀釋來獲得所需濃度的油進入最終乳液中?？梢詫⑷橐捍鎯τ诩s5℃。
另一實施方案中，可以在高于乳液PIT的溫度制得乳液。第一步中，在高于乳液PIT的溫度將水相和油相混合在一起。優(yōu)選將水溶液逐漸加入油中。調(diào)整油/水溶液的比例來獲得油包水型(W/O)乳液，例如，濃度為約40％至約55％的油(v/v)。通過低或無剪切力的攪拌來進行乳化，例如使用靜態(tài)混合機或船用螺旋或非常低轉(zhuǎn)速的渦輪機。獲得的乳液是油包水型(W/O)乳液。第二步中，將乳液逐漸冷卻至低于PIT。在該步驟的過程中，乳液變成O/W乳液(相變)。相變后并如果需要，通過加入水溶液將乳液稀釋來獲得所需濃度的油進入最終乳液中。可以將乳液存儲于約5℃。
乳液中液滴的大小可以為約100nm至約500nm。例如，可以將乳液用作配制疫苗組合物或藥物組合物的佐劑。乳液還可以用作溶劑來溶解干產(chǎn)品，尤其是凍干產(chǎn)品，例如含有減毒微生物或活重組載體的產(chǎn)品。
特定實施方案中，只用一部分水溶液制得預制-乳液。通過加入活性成分如藥物或免疫原優(yōu)選免疫原的懸液來稀釋這預制-乳液，來獲得最終的組合物。或者，預制-乳液用水溶液稀釋并用于溶解干產(chǎn)品如凍干產(chǎn)品。
適用于本發(fā)明中的免疫原或抗原可以選自滅活病原體、減毒病原體、免疫原性亞單位(例如，蛋白質(zhì)、多肽、肽、表位、半抗原)，或重組表達載體，包括具有免疫原性插入片段的質(zhì)粒。本發(fā)明一實施方案中，免疫原是滅活或死微生物。本發(fā)明的另一實施方案中，疫苗組合物包括選自鳥病原體的免疫原，包括但不限于，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、產(chǎn)蛋綜合征(egg drop Syndrome)病毒(EDS)或傳染性粘液囊疾病病毒(IBDV)、鳥流感病毒等等，及其組合。
或者，疫苗組合物包括選自貓科動物病原體的免疫原，如但不限于，貓皰疹病毒(FHV)、貓杯狀病毒(FCV)、貓白血病病毒(FeLV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒等等，及其組合。
再一實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包括選自犬病原體的免疫原，包括但不限于，狂犬病病毒、犬皰疹病毒(CHV)、犬細小病毒(CPV)、犬冠狀病毒、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorragiae)、流感傷寒鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)等等，及其組合。
本發(fā)明再一實施方案中，組合物包括選自馬病原體的免疫原，如馬皰疹病毒(1型或4型)、馬流感病毒、破傷風、西尼羅河病毒等等或其組合。
本發(fā)明再一實施方案中，組合物包括選自牛病原體的免疫原，如狂犬病病毒、牛輪狀病毒、牛副流感病毒3型(bPIV-3)、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、感染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)、大腸桿菌(Escherichia coli)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)等等及其組合。
本發(fā)明再一實施方案中，組合物包括選自豬病原體的免疫原，如但不限于，豬流感病毒(SIV)、豬環(huán)狀病毒2型(PCV-2)、豬再生性呼吸綜合征病毒(PRRS)、假性狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、FMDV、豬肺炎枝原體、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、大腸桿菌(Escherichia coli)等等及其組合。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案提供了疫苗組合物，包括藥物學上可接受載體中的至少一種免疫原和乳液。包括病毒、細菌、真菌等等的免疫原，可以通過使用合適培養(yǎng)基或宿主細胞系的體外培養(yǎng)方法和本領域技術人員公知的常規(guī)方法制得。例如，可以在合適的細胞系如MA-104細胞系中培養(yǎng)PRRS(特別參見US專利系列No.5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。同樣，可以使用PK-15細胞系來培養(yǎng)PCV-2(參見US專利系列No.6,391,314)；可以在蛋上培養(yǎng)SIV(US專利系列No.6,048,537)；和可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)豬肺炎枝原體(US系列No.5,968,525；US 5,338,543；Rose R.F.等，Am.J.Vet.Res.，1984，451899-1905)。
為了獲得滅活的免疫組合物或疫苗組合物，優(yōu)選將病原體在收集后滅活且任選地接受澄清凈化，通過化學處理使用例如福爾馬林或甲醛、β-丙內(nèi)酯、乙撐亞胺、二元乙撐亞胺(BEI)、硫柳汞等等，和/或物理處理(例如熱處理或聲處理)。滅活的方法是本領域技術人員公知的。例如，通過β-丙內(nèi)酯(Plana-Duran等，Vet.Microbiol.，1997，55361-370)或通過BEI處理(US專利系列No.5,587,164)將PRRS病毒滅活；使用乙撐亞胺處理或通過β-丙內(nèi)酯處理來實現(xiàn)PCV-2病毒的滅活(US專利系列No.6,391,314)；可以使用去污劑如Triton，或用甲醛處理(US專利系列No.6,048,573)來滅活豬流感病毒；可以通過甲醛處理(Ross R.F.上文)，通過乙撐亞胺或BEI處理(參見WO91/18627)，或通過硫柳汞處理(US專利系列No.5,968,525和5,338,543)滅活豬肺炎枝原體細菌。
通過常規(guī)濃縮技術尤其是通過超濾將滅活的病原體濃縮，和/或通過常規(guī)純化方法來純化，尤其是使用柱色譜技術，包括但不限于，凝膠過濾、蔗糖梯度超離心或選擇性沉淀，尤其是在聚乙二醇(PEG)存在下。
用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中的免疫原還包括表達載體。這樣的載體包括但不限于體內(nèi)重組表達載體如多核苷酸載體或質(zhì)粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P，Res.Vet.Sci，2001，70255-6)，病毒載體如但不限于腺病毒載體、痘病毒載體如禽痘(US專利系列No.5,174,993；5,505,941；和5,766,599)或金絲雀痘載體(US專利系列No.5,756,103)或細菌載體(大腸桿菌或沙門氏菌)。
本發(fā)明還包括多價免疫組合物或組合疫苗組合物的制劑。例如，用于根據(jù)本發(fā)明制得的組合牛菌苗中的抗原包括但不限于，牛枝原體，巴斯德氏菌，尤其是多殺巴斯德氏菌和溶血巴斯德氏菌，嗜血菌，尤其是睡眠嗜血菌，梭菌，沙門氏菌，棒桿菌，鏈球菌，葡萄球菌，莫拉氏菌，大腸桿菌等等。
本發(fā)明進一步提供了誘導宿主例如動物的免疫應答的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的免疫組合物或疫苗組合物給藥于宿主。以該方式引發(fā)的免疫應答特別地是抗體和/或細胞免疫應答，且尤其是γ-干擾素應答。
特別地，本發(fā)明提供了免疫對抗、或防止或減輕動物感染致病生物體(例如，病毒、細菌、真菌或原生動物寄生蟲感染)引起的癥狀的方法。本發(fā)明的方法可用于脊椎動物中，包括但不限于人、犬科動物(例如，狗)、貓科動物(例如，貓)；馬科動物(例如，馬)、牛族動物(例如，牛)和豬類動物(例如，豬)，以及鳥類包括但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、小雀類、鷹、烏鴉和平胸鳥(鴕鳥、鴯鹋、食火雞，等等)。
本發(fā)明的特定方面中，這些方法包括在分娩之前給懷孕的雌性接種疫苗，通過給藥根據(jù)本發(fā)明制得的疫苗組合物。這些方法進一步包括通過接種方案引發(fā)的保護性抗體的誘導，并將這些保護性抗體從接種疫苗的懷孕雌性轉(zhuǎn)移至它們的后代。這樣母體抗體的轉(zhuǎn)移隨后防止了后代患上疾病。
根據(jù)本發(fā)明制得的疫苗組合物的劑量將取決于待接種疫苗動物的物種、飼養(yǎng)、年齡、大小、接種史和健康狀況。其他因素如抗原濃度、其他的疫苗成分和給藥途徑(即，皮下、皮內(nèi)、口服、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥)也將影響有效劑量。基于疫苗的抗原濃度、給藥途徑和待接種疫苗動物的年齡和狀況，給藥的疫苗劑量是容易確定的。可以將每批抗原單獨標準化?；蛘?，可以使用不同劑量的方法免疫原性測試以及LD50研究和其他篩選方法來確定根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的有效劑量，而不需要過度實驗。從以下所示的實施例，使用在此所述疫苗組合物的合適的大致劑量和大致體積是顯而易見的。關鍵因素是劑量提供對抗天然感染的至少部分保護性效果，如通過死亡率降低和與天然感染相關發(fā)病率的降低來證明。本領域技術人員同樣容易確定合適的體積。例如，鳥物種的劑量體積為約0.1ml至約0.5ml，優(yōu)選，約0.3ml至約0.5ml。對于犬、貓和馬物種，劑量體積為約0.2ml至約3.0ml，優(yōu)選，約0.3ml至約2.0ml，更優(yōu)選，約0.5ml至約1.0ml。對于牛和豬物種，劑量體積為約0.2ml至約5.0ml，優(yōu)選約0.3ml至約3.0ml，更優(yōu)選0.5ml至約2.0ml。
優(yōu)選在定期的時間間隔重復疫苗接種來提高原始的免疫應答或從最后一劑已經(jīng)過去很長時間時。本發(fā)明一實施方案中，將疫苗組合物作為非腸道注射(即，皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi))給藥。可以以一個劑量給藥組合物，或在可替換的實施方案中，以約兩周至約六周優(yōu)選約兩周至約五周的給定間隔重復給藥約兩劑至約五劑。然而，本領域技術人員將認識到劑量的數(shù)目和接種疫苗之間的時間間隔取決于多種因素，包括但不限于，接種動物的年齡；動物的狀況；免疫的途徑；每劑可獲得的抗原量；等等。對于初次接種疫苗，時間段通常長于一周并優(yōu)選約兩周至約五周。對于之前接種過的動物，在懷孕之前或之中，加強接種約每年進行。
本發(fā)明還設想使用無針注射器如Pigjet、Avijet、Dermojet或Biojector(Biojiect，Oregon，USA)來給藥疫苗組合物。本領域技術人員能相對于因素根據(jù)需要來調(diào)整注射器的規(guī)格，如待接種疫苗的動物物種；動物的年齡和體重；等等，而不需要過度實驗。
本發(fā)明一實施方案中，該方法包括與根據(jù)本發(fā)明的乳液一起配制的疫苗組合物的單次給藥。例如，一實施方案中，疫苗組合物是滅活的豬肺炎枝原體疫苗，而可替換的實施方案提供了含有滅活PCV2病毒組合物的疫苗。適用于單劑給藥方案的其他免疫組合物或疫苗包括但不限于滅活PRRS和SIV。特別地，對于豬肺炎枝原體疫苗組合物，可以在豬出生和屠宰之間，尤其在約3至約56天的年齡，優(yōu)選約10天至約35天的年齡，更優(yōu)選約15至約30天的年齡，給藥單劑量。還可以在預先存在的抗體存在下給藥疫苗。
本發(fā)明進一步涉及治療宿主例如動物的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明制得的并包括至少一種免疫原的藥物組合物給藥于宿主，免疫原選自蛋白質(zhì)或肽、抗體、過敏原、CpG ODN、生長因子、細胞因子或抗體，尤其是CpG ODN或細胞因子。這些藥物組合物可以用于提高動物如雞、豬或牛的生長特性。
本發(fā)明進一步涉及一種試劑盒，包括含有成分如免疫原或藥物組合物的第一個小瓶，和含有根據(jù)本發(fā)明制得的乳液的第二個小瓶。免疫原可以是凍干形式、干型或在水溶液中，如在此所述的。
現(xiàn)在將通過以下非限制性實施例來進一步描述本發(fā)明。
實施例1乳液制造方法如下所述的在兩步中制得乳液第一步使用高剪切轉(zhuǎn)子-定子Silverson乳化器(具有10mm直徑粉碎頭的L4RT型)來生產(chǎn)制劑。為了生產(chǎn)乳液，將一體積油相和一體積水相#1在25℃乳化。在攪拌下將水相加入油相中，5000rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))1分鐘。隨著體積的增加逐漸將轉(zhuǎn)速在1分鐘內(nèi)提高至8300rpm。在該步驟的過程中，乳液是油包水型乳液。對于TS6乳液，相的組成如下油相(120ml)-失水山梨醇單油酸酯(Span 80) 1.8％w/v-失水山梨醇三油酸酯(20OE)(吐溫85)10.2％w/v-石蠟油(Marcol 82) 88％v/v水相#1(120ml)
-20％(w/v)失水山梨醇單油酸酯的溶液(20OE)(吐溫80)11.25％w/v-磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8) 85.75％v/v-水中1％的鄰乙汞硫基苯酸鈉(柳硫汞) 1.5％v/v將失水山梨醇單油酸酯(Span 80)和失水山梨醇三油酸酯(20OE)(吐溫85)引入油相中。失水山梨醇單油酸酯(20OE)(吐溫80)在石蠟油中不混溶。在與疫苗相同的緩沖液例如磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)中制得吐溫80的20％(w/v)溶液。鄰乙汞硫基苯酸鈉作為防腐劑且對于乳液不是必要的。
當停止攪拌時，乳液變成水包油型乳液。將乳液放入5℃的冷室中至少4小時。在這階段，乳液是含有50％油相的預制-乳液。
第二步用120ml磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)和免疫原(滅活豬肺炎枝原體免疫原，或PCV-2免疫原，如以下所述的)制得水相#2。將第一步中制得的預制-乳液冷卻至約5℃，通過加入相同溫度的一半體積的水相#2來稀釋，并通過磁棒攪拌來混合1分鐘。TS6乳液中最終的表面活性劑濃度為4.75％(w/v)。
如在此所制得的，TS6疫苗在5℃可穩(wěn)定至少一年。
使用相同的制備方法，可以獲得如下的其他乳液TS7乳液TS7乳液是含有33％油相的O/W乳液。油相(120ml)含有88％v/v的Marcol 82、1.8％w/v的Span 80和10.2％w/v的吐溫85。水相#1(120ml)含有97.75％v/v的磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)、1.5％v/v的水中1％的柳硫汞和0.75％w/v的Lutrol F127。水相#2(120ml)由磷酸鹽二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)構(gòu)成，任選地含有免疫原。TS7乳液中最終的表面活性劑濃度為4.25％w/v。
TS8乳液TS8乳液是含有50％油相的O/W乳液。油相(160ml)含有92％v/v的Marcol 82、1.8％w/v的Span 85和6.2％w/v的Brij 96。水相#1(160ml)含有98.5％v/v的磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)、1.0％v/v的水中1％的柳硫汞和0.5％w/v的Lutrol F127，任選地含有免疫原。TS8乳液中最終的表面活性劑濃度為4.25％w/v。
TS9乳液TS9乳液是含有10％油相的O/W乳液。油相(120ml)含有60％v/v的Marcol 82、17.2％w/v的Span 40和22.8％w/v的Arlatone 650。水相#1(120ml)含有97.5％v/v的磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)和2.5％v/v的吐溫20。水相#2(120ml)由400ml磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液pH7.8制得，任選地含有免疫原。用400ml水相#2稀釋100ml預制-乳液來獲得TS9乳液。TS9乳液中最終的表面活性劑濃度為4.25％w/v。
實施例2乳液相轉(zhuǎn)變溫度(PIT)的測定將10ml的TS6乳液放入約25℃水浴的玻璃管中。TS6乳液是白色均質(zhì)的乳液。逐漸提高水浴溫度。視覺上觀察到乳液的改變(由于黃-棕色油相移至表面，乳液變成兩個分離的相)。該改變是乳液破壞所特征性的。觀察到該改變的溫度是乳液的PIT值。對于TS6乳液，PIT是40-45℃，而對于TS7乳液，PIT是44-49℃。
實施例3豬肺炎枝原體疫苗組合物和異種攻擊材料與方法配制含有如實施例1中所述制得的TS6乳液和濃度為每ml疫苗8.7log10CCU(顏色改變單位)的滅活豬肺炎枝原體BQ14菌株(Kobisch M.等，Ann.Inst.Pasteur Immunol.，1987，138693-705)的疫苗組合物。二十二(22)只小豬，三周大并具有母體抗體(出生自對豬肺炎枝原體血清反應陽性的母豬)，隨機分成兩組。一組十(10)只小豬在0天通過肌內(nèi)注射2ml疫苗組合物來接種，而對照組十二(12)只小豬沒有接種疫苗。
在實驗過程中選定的時間間隔(第0、27、42和56天)，從兩組小豬中取鼻拭子并通過ELISA測定抗-BQ14分泌抗體。第27天，對小豬抽血并將獲得的外周血單核細胞(PBMN)來測定外周血中的IFNγ水平。第28天，用含有約6.6log10CCU/ml的豬肺炎枝原體Mp88c菌株(從丹麥病豬中分離的菌株并如Kobisch和Friis在Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.，1996，151569-1605中所述的來培養(yǎng))的溶液鼻內(nèi)攻擊所有小豬，每個鼻孔約用5mL。24小時后重復攻擊。處死小豬并在尸檢時收集肺。通過估計七個肺葉中每個的損害表面積(以整個肺葉表面的百分比來表示)來確定肺分值。如下指定分值
通過將每個肺各葉獲得的分值相加來計算總的分值，每只動物最大的分值為28。
結(jié)果接種TS6疫苗制劑的豬呈現(xiàn)強烈的細胞應答，且顯著高于對照組，如通過5×105P外周血單核細胞(PBMN)分泌IFNγ的點數(shù)所證明。接種組的豬平均為139個點(標準偏差25)，與未接種對照組的11點相比較(標準偏差5)。
接種者和對照的抗BQ14分泌抗體的含量總結(jié)于下表中，結(jié)果顯示了與未處理的對照相比較，接種的豬在攻擊后兩至三周具有顯著更高水平的分泌抗體
現(xiàn)在參照圖1，與具有7.8±4.1平均肺分值的未處理對照相比較，接種TS6疫苗組合物的動物呈現(xiàn)2.1±1.9(平均值±標準偏差)的平均肺分值。這些結(jié)果顯示與未接種的對照相比較，對于接種疫苗組合物的豬，肺損害顯著降低。
實施例4對抗豬肺炎枝原體異種攻擊的保護持續(xù)時間材料和方法三十八(38)只小豬，三周大并具有母體抗體(出生自對豬肺炎枝原體血清反應陽性的母豬)，隨機分成如下三組1組(12只小豬)在第0天通過肌內(nèi)途徑接種如實施例3中所述的2ml疫苗組合物。
2組(12只小豬)在第0天肌內(nèi)注射接種2ml商業(yè)豬肺炎枝原體滅活疫苗。
3組(14只小豬)作為未接種的對照。
所有小豬在接種后20周如上所述用約5ml/每鼻孔豬肺炎枝原體Mp88c攻擊菌株(6.6log10CCU/ml)鼻內(nèi)攻擊。24小時后重復攻擊。如上所述從所有組中采血并將所獲得的外周血單核細胞(PBMN)來測定IFNγ含量。在第138天測定每組的抗BQ14 IgA和IgG1血清抗體。尸檢后，如以上實施例3中所述的計算肺分值(平均值±標準偏差)。
結(jié)果現(xiàn)在參照圖2，接種TS6疫苗組合物的1組小豬證明平均肺分值為0.4±0.9，統(tǒng)計學上顯著低于接種商業(yè)疫苗的小豬(4.0±5.1)或未接種疫苗對照(6.1±5.8)的肺分值。
在第138天從每組收集的血清中抗-BQ14 IgA和IgG1循環(huán)抗體的平均結(jié)果(±標準偏差)總結(jié)如下
下表總結(jié)了外周血中5×105外周血單核細胞(PBMN)分泌干擾素(IFNγ)點數(shù)的平均結(jié)果(±標準偏差)
*如果排除表達異常高點數(shù)(109)的小豬，對照組平均值為4±1。
如使用滅活疫苗時所預期的，在接種疫苗后第138天可檢測到的抗BQ14 IFNγ分泌T-細胞的頻率比第28天的低得多。有趣的是，大多數(shù)接種TS6的小豬在第138天仍然是陽性的，表明該組中保持了細胞應答。在第152天循環(huán)的抗BQ14 IFNγ分泌T-細胞的頻率在三個組中非常不同。與其他組相反，接種TS6的組產(chǎn)生非常高的細胞應答。該結(jié)果表明攻擊有效地召回(recall)TS6疫苗誘導的免疫記憶。
實施例5給藥一劑TS6乳液作佐劑的PCV-2疫苗后的血清學結(jié)果材料和方法十只無特殊病原體(SPF)小豬，2-3個月大，隨機分成兩組。一組5只小豬通過肌內(nèi)途徑接種(在第0天)2ml含有6.8log10CCID50每劑的滅活PCV-2(imp1010菌株)的疫苗(接種組)。對照組5只小豬沒有接種疫苗。在接種后D0、D7、D14、D21和D28采血樣，通過ELISA滴定PCV-2 ORF2抗體。
結(jié)果如下表中所證明的，所有接種者從接種疫苗后7至40天顯示了顯著的抗PCV2 ORF2抗體應答
實施例6由TS6乳液作佐劑的PCV-2疫苗所引發(fā)的對抗攻擊的保護材料和方法十六(16)只SPF小豬，4-5天大，如下隨機分成2組一組8只小豬在第0天和第21天通過肌內(nèi)注射2ml含有7.55log10CCID50每劑的滅活PCV-2(imp1010菌株)的疫苗來接種兩次(接種組)，而對照組8只小豬沒有接種。所有小豬在第35天用約5mL的含有約5.5log10CCID50/ml PCV-2 Imp1011-48285菌株(保藏于ECACC，保藏號為V98011608)應用至每個鼻孔來鼻內(nèi)攻擊。進行ELISA和血清中和(SN)研究并如下確定每只小豬的臨床分值
*在死亡的情況中，所用的分值對應于死亡前一天的值。
尸檢后，如下計算損害分值
結(jié)果在第30天和63天通過ELISA和血清中和抗體滴度進行的血清學結(jié)果顯示接種疫苗小豬的含量比未處理對照中觀察到的高。下表總結(jié)了由糞便化驗樣本和神經(jīng)節(jié)組織的PCV-2病毒分離結(jié)果以及顯示了接種者和對照組的平均臨床和損害分值。結(jié)果表明與對照相比較，接種者中循環(huán)抗體和SN滴度這兩者的水平都較高。接種小豬的臨床分值和肺損害也顯著降低。攻擊后臨床分值的演變顯示于圖3中。
實施例7接種一劑TS6作佐劑的滅活PCV-2疫苗后的現(xiàn)場效力結(jié)果疫苗組合物如實施例1中所述的制得TS6佐劑。將PCV-2病毒生長于PK/15細胞上并如US專利系列No.6,517,843中所述的進行病毒繁殖(Ellis等；其內(nèi)容在此以其整體引入作為參考)。簡要地，在病毒培養(yǎng)的最后，收集感染的細胞，裂解，并用常規(guī)方法將病毒收集物滅活。例如，可以使用0.1％乙撐亞胺在+37℃ 18小時；用0.5％β-丙內(nèi)酯+28℃ 24小時；或用0.2％和0.1％β-丙內(nèi)酯+4℃ 24小時來實現(xiàn)滅活。如果在滅活前病毒滴度不足，使用150-300kDa截留膜通過超濾來濃縮病毒懸液。在配制疫苗前將滅活病毒懸液保存于+5℃。疫苗的抗原含量設定在2.1log10抗原單位每劑?；谠摵浚ㄟ^ELISA方法通過定量終產(chǎn)品中的活性成分測定的疫苗活性任意地設定在100ELISA單位每劑的最小值。
接種方案為了測試疫苗組合物在現(xiàn)場條件下的效力，選擇通常呈現(xiàn)小豬中由PCV-2感染引起的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)地方病爆發(fā)的農(nóng)場。將母豬分成兩組，接種者在產(chǎn)小豬前兩至三周接受一劑肌內(nèi)注射(2ml劑量)TS6作佐劑的PCV-2滅活疫苗。第二組沒有接種并作為對照。使母豬產(chǎn)下小豬，并監(jiān)測接種母豬(n＝889)和對照母豬(n＝713)產(chǎn)下的小豬至屠宰年齡的死亡率。
結(jié)果圖4顯示了直至屠宰時小豬中PMWS病例百分比的圖表。如從圖表中可看到的，與未接種對照產(chǎn)出的小豬中的病例數(shù)相比較，接種母豬產(chǎn)出的小豬中PMWS病例數(shù)目減少75％。這些結(jié)果表明與PCV-2感染相關的臨床疾病顯著降低并證明在產(chǎn)小豬之前不久母豬接種TS6作佐劑的滅活PCV2疫苗來防止小豬中與PCV2感染相關的死亡率和發(fā)病率的可行性。這些結(jié)果進一步證明只使用一劑根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物就可以獲得實際的現(xiàn)場條件下小豬中PMWS的顯著降低。
實施例8LF2乳液使用以上實施例1中的方法，制得含有10％油相乳液并稱為LF2的水包油型(O/W)乳液。油相(100ml)含有88％v/v的Marcol 82，1.8％w/v的Span 80和10.2％w/v的吐溫85。水相#1(100ml)含有88.5％v/v的磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)和11.55％w/v的20％(w/v)的吐溫80溶液。水相#2(400ml)由磷酸二鈉一鉀0.02M等滲緩沖液(pH7.8)構(gòu)成，任選地含有免疫原，用400ml水相#2稀釋100ml預制-乳液來獲得LF2乳液。LF2乳液中最終的表面活性劑濃度為1.43％w/v。LF2乳液的PIT＞45℃，通過電導率測定。
實施例9施用LF2乳液作佐劑的豬流感疫苗后的血清學分析材料和方法十五(15)只小豬，約10周大，隨機分成3組。第一組(接種)5只小豬(第0天和第28天)通過肌內(nèi)注射2ml 7.7log10CCID50每劑的重組豬流感疫苗來接種兩次(在第0天和第28天)。該重組表達載體疫苗含有編碼和表達H1N1豬流感病毒的核蛋白(NP)和血球凝集素(HA)的金絲雀痘載體。第二組5只小豬接種兩次(在第0天和第28天肌內(nèi)注射)用LF2乳液作佐劑的2ml重組豬流感疫苗(7.7log10CCID50每劑)(LF2接種組)。留下五只小豬沒有接種(對照組)。在接種后D0、D14、D28、D42和D56采血樣，用于測定血球凝集抑制(HI)滴度。
結(jié)果如下表所總結(jié)的，與未處理對照相比較，所有接種者顯示了從接種疫苗后42至56天顯著的抗豬流感抗體應答(ANOVA，p＜0.0001)。然而，與接受無佐劑重組疫苗的小豬相比較，接種LF2作佐劑的疫苗的小豬顯示在接種后42至56天抗體應答顯著提高(ANOVA，p＜0.0001)。
如這些結(jié)果所證明的，與無佐劑的疫苗相比較，LF2乳液的佐劑效應使得疫苗誘導了更高的對抗豬流感病毒的抗體應答。
實施例10LF2乳液作佐劑的Mannheimia haemolytica疫苗誘導的保護材料和方法二十(20)只小牛，五個月大，陰性或具有低的Mannheimia haemolytica白細胞毒素抗體滴度，隨機分成兩組，每組10只小牛。如以上實施例8中所述的制得LF2乳液并配制含有約60至70ELISA單位(對應于約0.34mL至1.1mL的粗制未濃縮細菌培養(yǎng)物)每劑疫苗的滅活Mannheimia haemolytica(A1菌株)的疫苗并用LF2乳液作佐劑。一組10只小牛在第0天通過皮下注射接種2ml LF2疫苗組合物，而對照組10只小牛沒有接種。從接種日(D0)至攻擊日(D20)，定期檢測所有接種小牛對接種的全身反應和局部反應。臨床檢查包括全身反應(如淡漠、厭食、呼吸急促、流涎、發(fā)抖)的評估、記錄直腸溫度和注射部位局部反應的測定。沒有小牛對接種呈現(xiàn)任何全身反應?？偨Y(jié)于下表中的直腸溫度(℃，平均值+/-標準偏差)顯示了接種組中觀察到短暫和輕微的體溫過高期，接種后24小時內(nèi)達到峰值。
接種小牛中的局部反應(以cm2表面積測量，平均值+/-標準偏差)顯示了所有接種動物在接種后約24至48小時出現(xiàn)了強烈的局部反應，然后到D14快速減小至約3cm2的大小。到D20這些反應幾乎消失。反應總結(jié)如下
在不同的時間間隔(D0、D7、D14、D20和D28)從所有動物獲得血樣并通過ELISA(以log10OD50表示的滴度)測定對抗Mannheimiahaemolytica A1白細胞毒素的抗體水平。結(jié)果顯示所有小牛在接種之前是陰性的。到D20，單次接種后，十只接種者中的八只發(fā)生了血清轉(zhuǎn)化，而所有對照小牛從D0至D20保持陰性。ELISA結(jié)果總結(jié)如下
攻擊實驗方案在第20天通過氣管內(nèi)給藥30ml含有約9.2log10CFU/ml(每ml的菌落形成單位)Mannheimia haemolytica A1菌株的攻擊劑來攻擊所有小牛。24小時后重復攻擊。從攻擊那天至研究結(jié)束，每日檢查所有小牛的總體臨床征象，包括呼吸窘迫。監(jiān)測的體征包括一般狀況、厭食、直腸溫度、流鼻涕、咳嗽、呼吸率和呼吸困難。
根據(jù)以下公式計算總體臨床分值且部分分值列于下表中總體臨床分值＝∑(部分分值×系數(shù))/14
對于死亡的動物，使用最大個體每日臨床分值2。
還使用以下公式測定了每只小牛的肺損害分值(以百分比表示)肺損害分值＝∑(肺葉上損害的表面積/整個肺葉的表面積×100×LRM)其中LRM是肺相對質(zhì)量，值為對于右前葉和右中前葉為0.11對于右中后葉為0.07
對于右后葉為0.35對于左前葉為0.05對于左中葉為0.06對于左后葉為0.32，和對于右肺尖葉為0.04攻擊的結(jié)果呈現(xiàn)于下表的每組總體臨床分值顯示與未處理的對照相比較，接種組證明了總體臨床分值顯著降低，(p＝0.046，ANOVA)。
所有死于攻擊的動物呈現(xiàn)其60％或更多的肺受影響。接種動物比對照組中的那些存在較低肺損害的統(tǒng)計學趨向(p＝0.08)。每組中具有多于三分之一肺受影響的動物數(shù)，對于接種者為2/10(20％)，對于對照動物為7/10(70％)。接種組中超過三分之一肺受影響的動物數(shù)顯著較低(p＝0.03，F(xiàn)ischer’s Exact檢驗，一尾)。肺損害分值的結(jié)果總結(jié)于下表
*死于攻擊的動物在總體臨床分值和肺損害百分比之間存在高度顯著(p＜0.001)和強的相關性(R2＝0.86)。盡管所有接種動物在接種后呈現(xiàn)輕微的高溫，但沒有觀察到對接種的其他全身反應。接種后觀察到強烈的局部反應，但是很快就減小至非?？山邮艿拇笮〔⒃谑瑱z中未觀察到顯著損害。這些結(jié)果證明LF2乳液作佐劑的疫苗的安全性。
該實驗的結(jié)果，顯示了與對照相比較，接種者的平均臨床分值和肺損害分值都顯著降低，證明單次注射LF2乳液作佐劑的Mannheimiahaemolytica疫苗保護自然(na ve)小牛來對抗Mannheimiahaemolytica攻擊。
由此已經(jīng)詳述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，應當理解通過上述段落定義的本發(fā)明不受上述說明中所列特定細節(jié)的限制，因為其各種明顯的改變是可能的，而沒有脫離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.疫苗組合物，包含可注射水包油型(O/W)乳液，其包括(i)含有至少一種免疫原的水溶液；(ii)礦物油；(iii)非離子親脂性表面活性劑；(iiii)具有13至40的高親水親脂平衡(HLB)值的非離子親水性表面活性劑；和；(iv)具有9至13的低親水親脂平衡(HLB)值的非離子親水性表面活性劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中高HLB非離子親水性表面活性劑以0.1-1.5％的濃度存在，以乳液的重量體積比(w/v)表示。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中表面活性劑的百分比為約4％至約6％重量/體積。
4，權(quán)利要求1的組合物，其中低HLB非離子親水性表面活性劑以1％至8％的濃度存在，以乳液的重量體積比(w/v)表示。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中非離子親脂性表面活性劑以0.1％至2.5％的濃度存在，以乳液的重量體積比(w/v)表示。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中礦物油以20％至40％(v/v)的濃度存在。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中乳液具有33-66℃的相轉(zhuǎn)變溫度(PIT)。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中低HLB非離子親水性表面活性劑選自乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化蓖麻油及其組合。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述乙氧基化脂肪酸酯的酯選自油酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、異硬脂酸酯、月桂酸酯及其組合。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中非離子親脂性表面活性劑選自失水山梨醇脂肪酸酯、二縮甘露醇脂肪酸酯、二乙氧基化二縮甘露醇脂肪酸酯、三乙氧基化二縮甘露醇脂肪酸酯、四乙氧基化二縮甘露醇脂肪酸酯及其組合。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中脂肪酸酯的酯選自油酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、異硬脂酸酯、月桂酸酯及其組合。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中高HLB非離子親水表面活性劑選自乙氧基化失水山梨醇脂肪酸單酯、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪酸、非離子嵌段共聚物及其組合。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中乙氧基化失水山梨醇單酯選自乙氧基化失水山梨醇單月桂酸酯、乙氧基化失水山梨醇單棕櫚酸酯、乙氧基化失水山梨醇單硬脂酸酯、乙氧基化失水山梨醇單油酸酯及其組合。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中礦物油選自石蠟油、角鯊烷、姥鮫烷、聚異丁烯油、氫化聚異丁烯油、聚癸烯油、聚異戊二烯油、聚異丙烯油及其組合。
15.權(quán)利要求1的組合物，其包括石蠟油、作為非離子親脂性表面活性劑的失水山梨醇脂肪酸單酯、作為低HLB非離子親水性表面活性劑的乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯和作為高HLB非離子親水性表面活性劑的非離子嵌段共聚物。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中失水山梨醇脂肪酸單酯是失水山梨醇單油酸酯，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯是乙氧基化失水山梨醇三油酸酯和非離子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(POE-POP)。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中石蠟油以10％至40％v/v的濃度存在，失水山梨醇單油酸酯以0.2％至1.5％w/v的濃度存在，乙氧基化失水山梨醇三油酸酯以2％至5％w/v的濃度存在和POE-POP以0.1％至0.5％w/v的濃度存在。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中石蠟油以29.3％v/v的濃度存在，失水山梨醇單油酸酯以0.6％w/v的濃度存在，乙氧基化失水山梨醇三油酸酯以3.4％w/v的濃度存在和POE-POP以0.25％w/v的濃度存在。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中免疫原選自滅活病原體、減毒病原體、亞單位、重組表達載體和質(zhì)粒或其組合。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中病原體選自病毒、細菌、真菌、原生動物寄生蟲或其組合。
21.權(quán)利要求19的組合物，其中免疫原是滅活病毒。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中免疫原是滅活的豬環(huán)狀病毒2型(PCV-2)病毒。
23.權(quán)利要求19的組合物，其中免疫原是滅活的豬肺炎枝原體(Mycoplasma hyopneumoniae)細菌。
24.誘導動物對抗病原體的免疫應答的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗組合物給藥于所述動物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中免疫原選自滅活病原體、減毒病原體、亞單位、重組表達載體和質(zhì)粒或其組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中免疫原選自滅活的豬肺炎枝原體細菌、滅活的豬環(huán)狀病毒2型(PCV-2)病毒或其組合。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中以一次完成的方案來給藥疫苗組合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中動物選自牛、豬、馬、狗、貓、雞、鴨和火雞。
29.權(quán)利要求27的方法，其中給藥是肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)或皮下(SC)注射。
30.權(quán)利要求29的方法，其中使用無針注射器進行給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了水包油型(O/W)乳液，在細菌或病毒懸液尤其是那些濃縮的和非純化的或弱純化的細菌或病毒懸液存在下具有提高的穩(wěn)定性。本發(fā)明的乳液可以作為遞送包括至少一種免疫原的藥物組合物的載體，特別地，免疫原選自滅活病原體、減毒病原體、亞單位、重組表達載體和質(zhì)粒或其組合。一實施方案中，本發(fā)明提供了可注射的水包油型(O/W)乳液，包括(1)含有免疫原的水溶液，所述免疫原選自滅活的豬肺炎枝原體(Mycoplasma hyopneumoniae)細菌、滅活的豬環(huán)狀病毒2型(PCV－2)病毒或其組合；(2)礦物油；(3)非離子親脂性表面活性劑；和(4)具有低HLB值的非離子親水性表面活性劑，其包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯(通常具有11至13的HLB值)；(5)具有13至40的高HLB值的非離子親水性表面活性劑。
文檔編號A61K39/12GK1852735SQ200480026569
公開日2006年10月25日 申請日期2004年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者A·G·A·帕里索特, S·M-C·德斯格勒斯-布勒徹特, R·M·諾德戈倫, C·查雷勒 申請人:梅瑞爾有限公司