專利名稱：使用新的鏈霉菌菌種生產(chǎn)他克莫司(fk－506)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的微生物淡青鏈霉菌(Streptomyces glaucescens)MTCC5115和使用該新的微生物淡青鏈霉菌MTCC 5115制備免疫抑制劑他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K-506)的方法。本發(fā)明還涉及包含他克莫司(FK-506)的藥物組合物，以及使用該組合物治療或預(yù)防器官或組織如心臟、腎、肝、骨髓、皮膚等的移植排斥。
背景技術(shù)：
最近已使用各種大環(huán)內(nèi)酯化合物作為免疫抑制劑，用于預(yù)防骨髓和器官移植中的移植排斥，以及用于治療各種自身免疫疾病。廣泛接受的一種用于預(yù)防移植排斥的免疫抑制劑是環(huán)孢霉素。雖然環(huán)孢霉素被廣泛用于免疫抑制治療，但是其使用(尤其是較高濃度)常常伴隨著副作用，如腎中毒性、肝中毒和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
考慮到這些，人們在不斷尋找較新的更安全的具有較少副作用和更有效的藥物。結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)新的化合物如雷帕霉素及其衍生物子囊霉素或合成性類似物(總稱為子囊霉素類(ascomycin))可用作免疫抑制劑。在子囊霉素類中，F(xiàn)K-506，通常稱為式I的他克莫司被證明是有效的免疫抑制劑。
式I此外，已顯示他克莫司及其衍生物能有效治療大量的疾病，如哮喘(PCT專利申請WO 90/14826)、炎癥和高增殖性皮膚病和免疫誘導(dǎo)疾病的皮膚表現(xiàn)(歐洲專利315978)。盡管其在預(yù)防移植排斥方法的極大用途和較高有效性，他克莫司的生產(chǎn)仍存在自身的缺陷，如由于在生產(chǎn)過程中存在幾種相關(guān)化合物而導(dǎo)致的低產(chǎn)率。
在如美國專利4894366、5116756、5264355、5496727和5624842中已報(bào)道了幾種生產(chǎn)他克莫司的方法。通常，這些方法涉及使用鏈霉菌物種的各種菌株來生產(chǎn)他克莫司。
由這些報(bào)道的方法獲得的產(chǎn)物中仍存在幾種不需要的相關(guān)化合物。為了增加他克莫司的產(chǎn)率，同時(shí)減少發(fā)酵過程中產(chǎn)生的幾種相關(guān)的雜質(zhì)，我們著手分離了鏈霉菌菌種的一種新的能生產(chǎn)他克莫司的菌株。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，該新菌株在生物轉(zhuǎn)化過程中僅僅產(chǎn)生少量的相關(guān)化合物。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)總的方面提供一種新的微生物，淡青鏈霉菌MTCC 5115，為生物純形式。
在另一總的方面提供一種新的微生物，淡青鏈霉菌MTCC 5115，它能通過發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司。所制得的化合物具有并顯示出EPO出版物0184162所述的他克莫司(FK-506)的所有物理和化學(xué)性質(zhì)。
在另一總的方面提供一種生產(chǎn)免疫抑制劑他克莫司的方法。該方法包括使用常規(guī)方法在浸沒的需氧發(fā)酵環(huán)境下、在含有氮營養(yǎng)物的含水碳水化合物培養(yǎng)基中培育淡青鏈霉菌MTCC 5115株足夠長的時(shí)間、以產(chǎn)生產(chǎn)物他克莫司的步驟。
在另一方面提供一種藥物組合物，該組合物包含治療有效量的他克莫司，和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
下文將詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式?；谡f明書和權(quán)利要求書，本發(fā)明其它的特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。
發(fā)明詳述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種新的微生物，淡青鏈霉菌MTCC 5115，它從收集自印度的Narnaul(Haryana)的土壤樣品中分離得到。
從收集自印度的Narnaul，Haryana的土壤樣品中分離得到的淡青鏈霉菌已依布達(dá)佩斯條約保藏在印度Chandigarh的微生物典型培養(yǎng)物保藏中心(MTCC)，保藏號是MTCC 5115。
本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，該新微生物淡青鏈霉菌MTCC 5115能在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下高度生產(chǎn)他克莫司，而在生物轉(zhuǎn)化過程中僅獲得少量的不需要的相關(guān)化合物。
淡青鏈霉菌MTCC 5115具有下述形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)、生物學(xué)和生理學(xué)特征。
(A)淡青鏈霉菌MTCC 5115的形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征采用Becker等的方法進(jìn)行細(xì)胞壁分析。對菌株的全部全部水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，顯示存在LL-二氨基庚二酸。因此，據(jù)信該菌株的細(xì)胞壁為I-型(Becker，B.等，應(yīng)用微生物學(xué)，12，421-423，1964)。
根據(jù)Shirling & Gottlieb(Shirling E.B.和D.Gottlieb，International Journalof Systemic Bacteriology，16，313-340，1966)描述的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。使培養(yǎng)物在28℃在酵母抽提物麥芽汁瓊脂(YMA)上生長11天。發(fā)現(xiàn)孢子鏈形態(tài)是螺旋形/視網(wǎng)膜型，基內(nèi)菌絲體為灰白色，氣生菌絲體為灰橙色。集落不透明，中間凸起，邊緣不規(guī)則，粗糙且稠度高。
菌株的顯微鏡研究和細(xì)胞壁分析揭示，該菌株屬于鏈霉菌屬。但是，結(jié)果顯示新的分離物和已知的他克莫司(FK-506)生產(chǎn)者之間完全不同(表1和2)。
在幾種固體培養(yǎng)基上(如燕麥粉瓊脂、YMA、自來水瓊脂、基礎(chǔ)礦物質(zhì)瓊脂、無機(jī)鹽淀粉礦物質(zhì)瓊脂、甘油天冬酰胺瓊脂和Czapek瓊脂)觀察培養(yǎng)特征。在28℃培育培養(yǎng)物11天。在Czapek瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯右旋糖瓊脂和葡萄糖天冬酰胺瓊脂上該培養(yǎng)物顯示出非常好的生長。在基礎(chǔ)礦物質(zhì)瓊脂、自來水瓊脂和燕麥粉瓊脂上，其生長不足。在YMA上觀察到可溶的色素的產(chǎn)生，這與他克莫司(FK-506)的已知生產(chǎn)者M(jìn)erck ATCC 55098的情況不同。淡青鏈霉菌MTCC 5115的營養(yǎng)菌絲體的顏色從白色到灰白色，而FK-506的另一生產(chǎn)菌株津島鏈霉菌9993(Streptomyces tsukubaensis 9993)的顏色則從淺桃紅色到紅橙色到淺褐色(表1和2)。
表1淡青鏈霉菌MTCC 5115與已知的FK-506生產(chǎn)者的比較形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征

表2淡青鏈霉菌MTCC 5115的生物學(xué)和生理學(xué)特征

室溫/1天，隨后160℃/4小時(shí)(NPUH1-1-160-4)NPUH2室溫/1天，隨后120℃/4小時(shí)(NPUH2-1-120-4)為期60天的固化制劑NPU、NPUH1和NPUH2膠凝時(shí)間(Micheler測試)和等溫吸水率測定列于表8中。
表8

通過對比表5和8，可以看出與不含納米顆粒的相應(yīng)基準(zhǔn)樣品RPU、RPUH1和RPUH2相比，NPU、NPUH1和NPUH2中納米粘土的存在減少了膠凝時(shí)間并降低了吸水率。下表9總結(jié)了本發(fā)明的納米顆粒組合物的某些性能。
表9

a采用DSC測定，b采用DMA測定。
通過對比表9中含納米顆粒的固化樹脂的結(jié)果和表6中不含納米顆粒的基準(zhǔn)固化樹脂(RPU)的結(jié)果，可以看出含納米顆粒的樹脂一般具有較好的物理性能。與不含納米粘土的基準(zhǔn)RPU制劑相比，納米粘土的存在將膠凝時(shí)間減少13％，納米粘土的應(yīng)用也●提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，●提高剪切強(qiáng)度，這與粘合性能直接相關(guān)，和各種形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和生理學(xué)特征的比較顯示，淡青鏈霉菌MTCC 5115與較早的已知的FK-506生產(chǎn)者不同。淡青鏈霉菌MTCC 5115的16s rDNA的限制片段分析與已知的FK-506生產(chǎn)者(津島鏈霉菌9993)比較顯示出清楚的剪切不同，從而進(jìn)一步證實(shí)前者是一種不同的菌株。
因此，根據(jù)公開的描述(Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology，第8版，1974)將此菌株與各種鏈霉菌菌種相比。比較的結(jié)果是，淡青鏈霉菌MTCC5115被認(rèn)為與淡青鏈霉菌更相似。
本發(fā)明者還開發(fā)了使用這種新的微生物淡青鏈霉菌MTCC 5115來生產(chǎn)他克莫司的方法。該方法還包括使用該菌株的能夠生產(chǎn)他克莫司物質(zhì)的任一突變體/變體，包括天然的以及人工培養(yǎng)的突變體，后者可通過采用常規(guī)的方法如輻照UV、X光、γ射線和用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等處理或進(jìn)行遺傳操作從已描述的生物獲得。
該方法涉及在浸沒的需氧條件下、在含有可同化的碳源和氮源的含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(發(fā)酵)淡青鏈霉菌MTCC 5115；和從所述培養(yǎng)基中分離他克莫司。
營養(yǎng)培養(yǎng)基中碳源的例子包括碳水化合物，如葡萄糖、木糖、半乳糖、右旋糖、甘油、淀粉、糊精、麥芽糖、聚乙二醇、大豆油等。其它來源可包括鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、甘露糖、水楊苷、琥珀酸鈉等。
氮源的例子包括酵母抽提物、大豆蛋白胨、大豆粉、棉籽粉、玉米漿、小麥蛋白胨、玉米麩、奶粉、麥芽等。
碳源和氮源并不需要以它們的純形式使用，雖然可有利地混合使用。
此外，也可將鈣、鎂、鈉、鈷、銅和鉀的礦物鹽加到營養(yǎng)培養(yǎng)基中。如果需要，尤其是在培育培養(yǎng)基嚴(yán)重起泡時(shí)，可加入消泡劑，如液體石蠟、脂肪油、植物油、礦物油或硅氧烷。
此外，當(dāng)在大的槽中進(jìn)行生長時(shí)，可使用營養(yǎng)體型微生物，以避免他克莫司生產(chǎn)中的停滯階段?？赏ㄟ^將從斜面培養(yǎng)得到的生物的孢子或菌絲體接種到培養(yǎng)基中，培育所述接種的培養(yǎng)基(也稱為種子培養(yǎng)基(I階段))，然后將該I階段種子轉(zhuǎn)移到II階段種子培養(yǎng)基(II階段)，從而產(chǎn)生營養(yǎng)體型的生物。這種種子可用于接種生產(chǎn)培養(yǎng)基。
在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)物以小球形式生長，因此，它需要低的攪拌，以滿足培養(yǎng)物的氧需求。與以絲狀生長的其它鏈霉菌相比，這提供了一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。絲狀生長通常導(dǎo)致培養(yǎng)基中氧不足。為了增加氧供應(yīng)，需要提高攪拌速率，這進(jìn)一步導(dǎo)致大量菌絲受到剪切，而且微生物活性往往會下降。
營養(yǎng)培養(yǎng)基最初和結(jié)束時(shí)(收獲)的pH可維持為約6-8。具體是，pH可維持在約6.8-7.5。
可在浸沒的需氧條件下在約20-40℃(如約24℃-約35℃)的溫度中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間可以是約120小時(shí)到約400小時(shí)，發(fā)酵時(shí)間可根據(jù)發(fā)酵條件和生產(chǎn)規(guī)模而變化。尤其是，可在27℃、約6.8-7.5的pH條件下培育生產(chǎn)培養(yǎng)基約240小時(shí)到約310小時(shí)。
用于培育和進(jìn)行發(fā)酵的培養(yǎng)基包含下述成分

這種培養(yǎng)基提供了一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橛糜谠撆囵B(yǎng)基中的所有原料均衍生自植物，因此，它不含有任何可傳播的海綿狀腦炎(Transmissible SpongiformEncephalitis，TSE)/牛海綿狀腦炎(Bovine Spongiform Encephalitis，BSE)組織。
可采用常規(guī)的方法從培養(yǎng)基中回收所獲得的產(chǎn)物他克莫司，如采用高壓液相色譜法(HPLC)。他克莫司物質(zhì)發(fā)現(xiàn)存在于培養(yǎng)基和濾液中，并可從菌絲體和濾液中分離和純化。
從培養(yǎng)基中分離他克莫司包括過濾、離心、濃縮、減壓濃縮、凍干、酸化、用適當(dāng)溶劑抽提、用吸附劑處理、用樹脂處理、純化和結(jié)晶中的一個(gè)或多個(gè)處理。
術(shù)語“適當(dāng)溶劑”包括任何溶劑或溶劑混合物，在該溶劑或溶劑混合物中，他克莫司可被增溶，該溶劑包括如乙酸乙酯、甲醇、甲苯等?？捎梦絼┤缁钚蕴俊⒐枘z、氧化鋁等進(jìn)行處理。樹脂的例子包括陰離子和陽離子交換樹脂。
可將獲得的產(chǎn)物再結(jié)晶一次或多次，以獲得較高的純度。
可給予他克莫司，用于預(yù)防和治療溫血動物的器官或組織如心臟、腎、肝、骨髓、皮膚等的移植排斥。
為公開的目的，溫血動物指具有穩(wěn)態(tài)機(jī)制的動物王國的成員，包括哺乳動物和鳥類。
在下面的具體實(shí)施方式
部分，將以實(shí)施例的方式進(jìn)行描述，以產(chǎn)生本發(fā)明的方法。但是，這些內(nèi)容并不限制本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，這些實(shí)施例的各種變化是顯而易見的。
實(shí)施例1淡青鏈霉菌MTCC 5115的分離采用如下所述的稀釋平板技術(shù)從土壤中分離淡青鏈霉菌MTCC 5115。
從印度的不同地區(qū)采集土壤樣品，以分離生產(chǎn)他克莫司的新微生物。將樣品風(fēng)干，在90℃加熱1小時(shí)，進(jìn)行預(yù)處理。將1克預(yù)處理樣品放到無菌試管中，加入無菌蒸餾水使體積為10毫升?；旌匣旌衔?0秒鐘，放置1小時(shí)。用預(yù)先無菌處理的蒸餾水進(jìn)行系列稀釋，將系列稀釋物平板接種到含有各為50μg/ml的氯霉素和制霉菌素/放線菌酮的天冬酰胺-甘油培養(yǎng)基上。使用1毫升的懸浮液來平板接種。在28℃培育平板7-10天。
將分離的集落挑到新鮮的YMA平板上。在28℃培育該平板10天。將平板上的生長物挑到Y(jié)MA斜面上，在28℃培育10-11天。保存這些斜面?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2篩選分離物用2.5毫升0.85％氯化鈉溶液制備從培育了11天的YMA斜面上獲得的各分離物的孢子/菌絲體懸浮液。將該懸浮液接種到35毫升如美國專利5194378所述的無菌KE種子培養(yǎng)基中。
滅菌前先將種子培養(yǎng)基的pH調(diào)整為6.9。在旋轉(zhuǎn)搖動器中在28℃培育該培養(yǎng)物44-48小時(shí)，然后將2毫升的種子培養(yǎng)基接種到25毫升的FKA生產(chǎn)培養(yǎng)基中，根據(jù)美國專利5194378所述的條件進(jìn)行發(fā)酵。
測試發(fā)酵肉湯的甲醇提取物針對土曲霉(Aspergillus terreus)變體株的抗真菌活性，以FK-506作為標(biāo)準(zhǔn)。22株顯示出清除區(qū)域(clearing zone)，從而證明了抗土曲霉的抗真菌活性。采用HPLC來證實(shí)這些菌株的抽提物中存在FK-506。其中一個(gè)菌株，即淡青鏈霉菌MTCC 5115，在與標(biāo)準(zhǔn)FK-506相同的滯留時(shí)間處出現(xiàn)了非常小的峰。
實(shí)施例316s rDNA的限制片段分析用不同的限制性內(nèi)切核酸酶(BamH1、Bgl1、Nco1、Sma1、EcoR1、HindIII、EcoRV、Stul&Psn AI)對淡青鏈霉菌MTCC 5115與津島鏈霉菌9993之間的16s rDNA的限制片段模型進(jìn)行比較。這些試驗(yàn)揭示淡青鏈霉菌MTCC 5115具有不同的原型。
實(shí)施例4方法優(yōu)化用2.5毫升0.85％氯化鈉溶液制備從培育了11天的YMA斜面上獲得的淡青鏈霉菌MTCC 5115的孢子/菌絲體懸浮液。使種子在28℃生長過I階段/II階段44-48小時(shí)。種子培養(yǎng)基的組成如下

用2毫升種子培養(yǎng)物接種到具有下述組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基中

無菌化前先將營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH調(diào)整為7.0-7.2，然后將培養(yǎng)基在121℃無菌處理25分鐘。
發(fā)酵在240rpm、24℃條件下進(jìn)行290-310小時(shí)，采用HPLC分析他克莫司。他克莫司(FK-506)的峰非常明顯和清楚。
使用FK-506工作標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)化此HPLC峰，證實(shí)肉湯中存在他克莫司(FK-506)。從約300小時(shí)后的上述生產(chǎn)培養(yǎng)基中獲得的FK-506的最高滴度是5-10μg/ml。
實(shí)施例5FK-506的分離和純化將6升發(fā)酵肉湯酸化至pH為4.0，用等體積的乙酸乙酯抽提2次。合并乙酸乙酯層(6升)，40℃、真空條件下濃縮到100毫升。采用已知的柱層析技術(shù)進(jìn)一步純化，用LCMS測試分離產(chǎn)物的質(zhì)量(MASS)。
分析結(jié)果證明，所分析的化合物與歐洲專利184162和美國專利4894366中所述的他克莫司(FK-506)類似。
雖然已以具體實(shí)施例的方式描述了本發(fā)明，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，某些改動及等價(jià)形式是顯而易見的，這些改動及等價(jià)形式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.分離的微生物淡青鏈霉菌MTCC 5115(Streptomyces glaucescens MTCC5115)。
2.用于生產(chǎn)式I的他克莫司(FK-506)的發(fā)酵方法 式I該方法包括使用分離的淡青鏈霉菌MTCC 5115。
3.生產(chǎn)他克莫司的方法，該方法包括在浸沒的需氧發(fā)酵條件下在含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育淡青鏈霉菌MTCC 5115菌株或其變體，和從所述培養(yǎng)基分離他克莫司的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源、氮源和礦物鹽中的一種或多種。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源是碳水化合物培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物源包括葡萄糖、木糖、半乳糖、甘油、右旋糖、淀粉、糊精、麥芽糖、聚乙二醇、大豆油、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、甘露糖、水楊苷和琥珀酸鈉中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述氮源包括酵母抽提物、大豆蛋白胨、大豆粉、棉籽粉、玉米漿、小麥蛋白胨、玉米麩、奶粉、麥芽中的一種或多種。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述礦物鹽包括鈣鹽、鎂鹽、鈉鹽、鈷鹽、銅鹽和鉀鹽中的一種或多種。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有消泡劑。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵期間，溫度維持為約20℃到約40℃。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述溫度維持在約24℃到約35℃。
12.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，發(fā)酵期間，pH維持為約6.0-8.0。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，pH維持為約6.8-7.5。
14.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)肉湯。
15.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述他克莫司的分離包括過濾、離心、濃縮、減壓下濃縮、凍干、酸化、用適當(dāng)溶劑抽提、用吸附劑處理、用樹脂處理、純化和結(jié)晶中的一種或多種。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法還包括再結(jié)晶所分離的他克莫司。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，還包括將所獲得的產(chǎn)物制成完成的劑型形式。
18.一種治療或預(yù)防溫血動物中器官或組織的移植排斥的方法，該方法包括，向該溫血動物提供含有采用權(quán)利要求3所述的方法獲得的他克莫司的劑型。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述器官或組織是心臟、腎、肝、骨髓和皮膚。
20.一種藥物組合物，其特征在于，該組合物含有治療有效量的采用權(quán)利要求3所述的方法獲得的他克莫司(FK-506)和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的微生物淡青鏈霉菌MTCC5115和一種利用該新微生物淡青鏈霉菌MTCC 5115生產(chǎn)免疫抑制劑他克莫司(FK－506)的方法。本發(fā)明還涉及含有他克莫司(FK－506)的藥物組合物和該組合物治療或預(yù)防器官或組織如心臟、腎、肝、骨髓、皮膚等的移植排斥的用途。
文檔編號A61K31/535GK1867664SQ200480030382
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者P·庫馬, S·沙爾瑪, A·舒克拉, S·庫馬, R·K·莫瑞艾, V·卡蒂爾, A·米特拉, P·吉格拉斯 申請人:蘭貝克賽實(shí)驗(yàn)室有限公司