專利名稱：：一種穩(wěn)定的液體益生組合物、其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及益生組合物，更特別地涉及一種制備液體益生組合物的方法，所述液體益生組合物包含可以以生物學活性形式長時間保存的非病原細菌菌株，還涉及組合物及其治療方法。
背景技術(shù)：
：益生細菌是對人類和/或動物有益的細菌。利用益生細菌是本領(lǐng)域已知的，用于改善哺乳動物的腸道中的微生物平衡，來預(yù)防或治療胃腸感染及其他疾病或失調(diào)，所述疾病或失調(diào)涉及和/或引起腸內(nèi)微生物區(qū)系組成方面的變化，和/或產(chǎn)生微生物區(qū)系組成方面的任何變化，和/或維持這種變化，以及主動引起或強化這種疾病或失調(diào)的微生物區(qū)系組成的變化。然而，迄今為止進行的研究的結(jié)果是不一致和/或不明確的。例如，在某些研究中，與安慰劑相比，在病人中單獨使用益生細菌來治療“旅行者腹瀉(traveler’sdiarrhea)”不足以提供顯著的效果，而益生治療與抗生素的組合被證明是高效的。其他的研究已經(jīng)顯示，單獨的益生治療具有有益效果，而這種效果通常需要3-6個月來察覺(還參見J.JAMA，1996，vol.275，No11，美國專利5433826，1995，美國專利5589168，1996等)。近來的研究已經(jīng)致力于研究各種類型的益生細菌的效果，單獨地或組合地；改善益生細菌的存活率和允許長期保存的方法；生物量積累，和在人和動物的防病和治療方面使用益生細菌。已知約400種不同種類的細菌和類菌體存在于人類和其他哺乳動物的消化道中，可以提供約30-40％的糞便量。這些已知種類中僅詳細地研究了約15種的特征和功能。這些種類的細菌的每一種都在消化道中占有自己的生態(tài)位，每種都具有最佳生存和增殖率的特定條件?？赡軐е赂鞣N疾病或失調(diào)的病原細菌也占有它們自己的特定環(huán)境生態(tài)位或生境。病原細菌和益生細菌之間的競爭可在各種條件下發(fā)生，但是，當病原細菌和益生細菌的最佳生存和增殖率的條件相似時，出現(xiàn)最大的競爭效果。在這種條件下，生存取決于對養(yǎng)分或生長因子的更嚴厲的競爭，以及協(xié)同的養(yǎng)分利用和對受體部位的競爭。一些因素，例如抗微生物物質(zhì)的產(chǎn)生、增殖的強度、限制性環(huán)境的創(chuàng)造，包括免疫學過程的誘導和對上皮細胞更新(turnover)的刺激，在這種條件下也具有很大的意義。已經(jīng)運用非病原E.coli與其他非病原細菌的培養(yǎng)物開發(fā)出益生組合物(美國專利No.5,340,577；美國專利No.5,443,826；美國專利No.5,478,557；美國專利No.5,604,127)。具有高度的對抗活性的乳糖陽性非病原E.coli菌株已經(jīng)作為凍干制品在德國和俄羅斯生產(chǎn)(例如，E.coliM17的凍干制品Colibacterinsiccum的使用，描述于VidalHandbookPharmaceuticalpreparationsinRussia，AstraPharmService，1997，Moscow)。近年來，出現(xiàn)了開發(fā)包含大量(多至30種)不同種類的細菌和類菌體的益生制品的趨勢(例如，美國專利No.5,443,826；美國專利No.5,478,557)。然而，使用這么多種不同細菌相對于僅包括一種或兩種類型的制品的優(yōu)點還未被證明。實際上，有些證據(jù)表明使用大量的種類可能發(fā)生效率降低。Behling等人研究了25種乳糖陽性E.coli，發(fā)現(xiàn)這些種類中的兩種(E.coli125A和E.coli128)在小雞中對S.enterids感染有抑制效果。然而，125A菌株的效果顯著地大于128菌株的效果，這兩種菌株的組合產(chǎn)生了比單獨用125A所獲得的更低的效果。研究顯示，使用295種盲腸分離物的混合物對Salmonella沒有保護作用(Gorenetal.，1984)，而使用僅4種分離物的混合物提供了保護作用(CA專利No.1,151,066)。由此看來，在使用的細菌菌株數(shù)和獲得的保護水平之間沒有清楚的關(guān)系。這主要是由于不同菌株之間的各種相互作用，其可能引起協(xié)同的或?qū)沟男?yīng)。已經(jīng)使用被干燥并摻入微囊中的乳細菌(Lactobacteria)進行了研究(美國專利Nos.5,501,857；5,614,209；和5,635,202)。作者聲稱這種微囊化的制品在通過胃的時候比常規(guī)的形式有更高的穩(wěn)定性?；罴毦谋４娣矫娴难芯恐饕杏趦龈傻闹破?，關(guān)于簡化它們的應(yīng)用的改進的生產(chǎn)方法和技術(shù)解決方案(美國專利Nos.5,139,792和5,401,501)。極少的現(xiàn)有技術(shù)專利涉及以懸浮形式，即，備用狀態(tài)的液體形式保存細菌的方法。美國專利no.4,999,301教導了一種將Lactobacillusplantrum或Bacillussubtilis微生物在含有10-30％之間養(yǎng)分固體的濃縮培養(yǎng)基中保存兩個月時間的方法。然而，它實際上描述了多階段的生長周期，必需多次額外的操作。至少0.5％的細菌仍然是活的。美國專利no.4,518,696教導了一種使用與葵花籽油的油-細胞混合物的Lactobacili液體懸浮物。然而，活細胞在與油組合之前被干燥，并進一步的以具有低的內(nèi)部水濃度為特征。
背景技術(shù)：
：的專利都沒有教導或暗示液體的益生培養(yǎng)基，在其中細菌細胞維持了高水平的生物學活性。這樣的培養(yǎng)基，例如對于如炎癥性腸病的疾病，是明顯需要的。炎癥性腸病或IBD，是集合性的術(shù)語，包括相關(guān)的、但又不同的、胃腸道的慢性炎癥性失調(diào)，例如克羅恩氏病(Crohn’sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、不確定性結(jié)腸炎(indeterminatecolitis)、顯微結(jié)腸炎(microscopiccolitis)和膠原結(jié)腸炎(collagenouscolitis)，克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎是最常見的疾病。胃腸道的另一種慢性失調(diào)是腸易激綜合征(IBS)。對于大多數(shù)病人，IBD和IBS是具有持續(xù)數(shù)月到數(shù)年的癥狀的慢性狀況。在年輕的成年人中是最常見的，但可以在任何年齡發(fā)生。它在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，但是在工業(yè)化國家，例如美國、英國和北歐最常見。例如，僅在美國IBD就影響了估計兩百萬人。還不了解IBD和IBS的確切原因。常見的假說包括，例如，免疫系統(tǒng)中的失調(diào)和前炎癥性cytolines的作用和淋巴細胞亞類的選擇性活化，它們保持了腸內(nèi)炎癥性反應(yīng)的無限制的活化。病原性和潛在病原性細菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能導致免疫系統(tǒng)的失調(diào)。由此，這些細菌可能與這種性質(zhì)的紊亂有牽連，與腸內(nèi)微生物平衡的紊亂有關(guān)。這種紊亂本身可能是病因，或作為選擇(或組合地)，據(jù)相信，這種紊亂可能反過來引起自身免疫反應(yīng)和/或免疫系統(tǒng)的其他反應(yīng)。例如，近來證明，在患有IBS的病人中，多至70％的病人在腸系統(tǒng)中有細菌的過度生長；在患有IBS的許多病人中治療這種過度生長引起癥狀的減小或甚至停止(來自加利福尼亞Cedars-Sinai醫(yī)療中心的Dr.MarkPimentel的研究)。對IBD和IBS還沒有治療法。被IBD或IBS折磨的病人當前一般用針對減少病人的炎性過程和減少炎性過程的影響的療法來治療。目前已知的IBD的醫(yī)學治療意圖降低炎癥性腸病急性惡化的次數(shù)、頻率和嚴重度，和預(yù)防次級并發(fā)癥，但在最佳的情況下，結(jié)果是令人失望的。目前已知的治療IBD或IBS的方法未能為至少某些IBD或IBS患者提供解決辦法，因為這些方法(i)未能提供對IBD的實質(zhì)性治療，而是提供對癥狀的治療；和(ii)包括伴有嚴重不良副作用的藥物治療或侵入性外科療法，都影響患者的生活質(zhì)量。發(fā)明概述
背景技術(shù)：
沒有教導或暗示一種穩(wěn)定的、有效的液體益生組合物。
背景技術(shù)：
：也沒有教導或暗示這種組合物用于治療各種腸道失調(diào)，包括但不限于，微生物感染、腸易激綜合征(IBS)和炎癥性腸病(IBD)。本發(fā)明通過提供一種制備液體益生組合物的方法克服了
背景技術(shù)：
的這種缺陷，所述液體益生組合物包含至少具有基本生物學活性的細菌，其中所述細菌已經(jīng)根據(jù)至少一種選擇壓力進行了選擇，和其中所述組合物基本上不含適合于細菌生長、但不類似地適合于哺乳動物、特別是不適合于人類的物質(zhì)，在下文中定義為“非適合物質(zhì)(non-suitablesubstances)”。例如蛋白胨和緩沖鹽，特別是磷酸鹽，在小劑量可能不是有害的，但它們特別地不適合于人類。任選的，所述選擇壓力可以包括溫度、時間(保存一段時間時的穩(wěn)定性)和滲透壓中的至少一種。本發(fā)明還提供了一種制備液體益生組合物的方法，包括根據(jù)選擇壓力選擇細菌；和將所述至少具有基本生物學活性的細菌保存維持一段時間。本發(fā)明還提供了一種治療受試者的方法，包括向需要這種治療的受試者施用所述液體益生組合物。液體制劑在口服施用后立即有治療活性，因此不需要在消化道中的生物量產(chǎn)生。優(yōu)選的，所述方法用于治療胃腸疾病或失調(diào)，所述胃腸疾病或失調(diào)期望或需要治療，任選的和更優(yōu)選的可包括微生物感染，例如細菌感染，和/或IBD和/或IBS。本發(fā)明對于治療AAD(抗生素相關(guān)的腹瀉，antibioticassociateddiarrhea)，以及任何形式的急性腹瀉，例如由微生物(包括但不限于，產(chǎn)腸毒素E.coli、Salmonella、Proteus、Pseudomonas、Closttidium、Staphylococcus、Shigellaflexneri等等)，或由未被檢出的病原體引起的急性腹瀉；旅行者腹瀉綜合癥；醫(yī)院環(huán)境中的急性腹瀉；以及對于治療與腹瀉相關(guān)的IBS(腸易激綜合征)的癥狀，不管是粘液性的還是炎癥性的，和治療由放療或化療引起的腹瀉，也是有用的。本發(fā)明對于治療與胃腸道中微生物區(qū)系的“異常(abnormal)”或“異?！狈植嫉拇嬖谟嘘P(guān)的各種疾病狀態(tài)；無論是粘液性的還是炎癥性的IBD(炎癥性腸病)、結(jié)腸痙攣、粘液性結(jié)腸炎、抗生素相關(guān)的結(jié)腸炎(antibiotic-associatedcolitis)、突發(fā)性或單純性便秘、和特定微生物例如Clostridiumdifficile、Campylobacterjejuni/coli等和Candida的慢性腸胃感染；由抗生素、放療或化療、腸感染、消化道手術(shù)、免疫缺陷、不利的生態(tài)學的狀況，包括更高的輻射和年齡變化所引起的消化道微生物平衡紊亂導致的慢性腹瀉，也是有用的。根據(jù)本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方式，所述組合物和方法任選的對于治療食物中毒、消化不良癥狀或急性腹瀉的發(fā)作、或由未被檢出的病原體或未知病因引起的腹瀉是有用的。本發(fā)明任選的對于治療消化道的疾病和失調(diào)也是有用的，所述疾病和失調(diào)由腸內(nèi)微生物區(qū)系的微生物平衡的紊亂，和/或由小腸中細菌的過度生長導致或維持。本發(fā)明任選的對于預(yù)防或降低消化道微生物區(qū)系的微生物平衡紊亂的水平也是有用的，所述紊亂由抗生素治療、放療或化療、消化道的疾病或失調(diào)，包括消化道手術(shù)所引起。根據(jù)本發(fā)明再其他的優(yōu)選實施方式，所述組合物和方法任選地對于預(yù)防或治療由消化道外的疾病、某些飲食和環(huán)境因素引起的消化道微生物區(qū)系的微生物平衡的紊亂是有用的。本發(fā)明對于改善或正?；夏耆撕褪芪：Σ∪说奈改c道的生理活動也是有用的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供一種包含具有至少基本生物學活性的細菌的液體益生組合物，其中所述細菌已經(jīng)根據(jù)至少一種選擇壓力進行了選擇，所述選擇壓力選自溫度、時間穩(wěn)定性(保存的穩(wěn)定性)和滲透壓，其中所述組合物基本上不含適合于細菌生長的物質(zhì)，包括細菌蛋白胨、鹽，并且也缺少細胞自身在生長期期間產(chǎn)生的抑制因子。優(yōu)選的，所述組合物包含在更早的制備階段期間從細菌自身制備的自溶物，其提供了適合于使細菌維持在具有最小生物學活性的生存狀態(tài)的必需養(yǎng)分，但其對于更低等的哺乳動物或人類是無害的。同樣優(yōu)選的，所述組合物的pH被調(diào)節(jié)到適合于維持細菌的生存力，更優(yōu)選的是pH約6到pH約7。由而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種在需要治療的受試者中治療炎癥性腸病/腸易激綜合征(IBD或IBS，等)的方法。該方法包括向受試者口服施用治療有效量的液體制劑形式的益生Escherichiacoli菌株。所述治療有效量優(yōu)選的在每次施用約106和約1012個活菌之間，每天施用1到10次，優(yōu)選的約2-4次。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種益生藥物組合物，所述益生藥物組合物包含液體制劑中的益生Escherichiacoli菌株作為活性成分。根據(jù)本發(fā)明的進一步的方面，提供了治療微生物感染的方法，所述方法包括向受試者口服施用治療有效量的液體制劑形式的益生菌株，優(yōu)選的是Escherichiacoli菌株。下面的表格顯示了根據(jù)本發(fā)明的組合物用于治療各種疾病和失調(diào)的建議的劑量，僅用于說明性的目的，無論如何不希望受到限制。示范性的疾病/失調(diào)和建議的劑量服用法的表格本發(fā)明對于改善或正常化受試者的免疫系統(tǒng)也是有用的，所述受試者患有免疫系統(tǒng)失調(diào)，包括作為由治療其他疾病引起的副作用的失調(diào)，以及對于治療家養(yǎng)動物是有用的。根據(jù)描述的優(yōu)選實施方式中更進一步的特征，益生非病原乳糖陽性菌株，例如Escherichiacoli菌株M-17，單獨地或任選地與一個或多個E.coli菌株和/或其他菌株。根據(jù)描述的優(yōu)選實施方式中更進一步的特征，所述液體制劑包含每ml約106到約1012CFU之間的益生Escherichiacoli菌株，更優(yōu)選的每ml約107到約1010CFU的益生Escherichiacoli菌株。本發(fā)明通過提供一種方法和一種益生藥物組合物來用益生E.coli菌株治療細菌性感染、炎癥性腸病/腸易激綜合征(IBD或IBS，或其他)，成功地解決了目前已知配置(configurations)的缺點。這種益生治療是高度有益的，與治療如上所述的這些疾病或失調(diào)，或其他疾病或失調(diào)的當前方法相比，它是有效的、安全的、非侵入性的和無副作用的。本發(fā)明的一個特征是，E.coli或其他細菌是以生物學活性形式保存的。本發(fā)明的優(yōu)點是，細菌的益生活動在到達胃腸道時立即開始。本發(fā)明的進一步的優(yōu)點是，該制品可以保存很長時間而沒有顯著的細菌生存力損失。本發(fā)明的其他優(yōu)點是，在通過胃時本發(fā)明的制品組合物顯示了比干燥的制品更高的穩(wěn)定性。本發(fā)明的其他優(yōu)點是，與已知的益生制品相比時，該制品在更大的劑量顯示了提高了多得多的效果。由于制備和保存的方式，本領(lǐng)域已知的益生組合物明顯較差；例如，如上所述，許多這樣的組合物依靠冷凍干燥，這引起生物學活性水平的嚴重降低。本發(fā)明還具有的優(yōu)點是，液體益生組合物效力的廣譜性容許不用先鑒定病原體和判定其對抗菌制品的敏感性而有效地治療腸內(nèi)感染。附圖的簡要說明參考附圖，在此僅以舉例的方式描述本發(fā)明附圖1顯示了取自根據(jù)本發(fā)明的液體組合物的細菌的生長速率與取自凍干的組合物的細菌的生長速率的比較；與后者相比，前者清楚地顯示了更高的生長速率。詳細說明本發(fā)明是關(guān)于制備包含非病原益生微生物的組合物的方法，和組合物，和其在治療胃腸道的微生物感染，以及IBS、IBD、抗生素相關(guān)的腹瀉(AAD)和任何其他類型的腹瀉或綜合癥方面的用途。本發(fā)明包括含有益生細菌的液體組合物的用途。一開始通過應(yīng)用選擇壓力因素選擇細菌細胞，以選擇在遭受不利于新陳代謝的條件時仍然存活的那些細胞。這些選擇壓力因素可以任選地和優(yōu)選地包括時間穩(wěn)定性(保存穩(wěn)定性)、溫度和滲透壓條件的至少一個。由此，選擇出具有最大生存能力的細菌。溫度選擇條件可以任選地和優(yōu)選地包括使細胞經(jīng)受超過活躍的重要細胞代謝的最適范圍的溫度，優(yōu)選的40℃的溫度，持續(xù)4到5天之間的時間。優(yōu)選的，可以通過使細胞經(jīng)受低于活躍的重要細胞代謝的最適溫度范圍的溫度，優(yōu)選的2到15℃之間的溫度，持續(xù)1-12個月之間，更優(yōu)選的3到12個月之間，來選擇細胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，選擇的細菌優(yōu)選的被用于接種生長培養(yǎng)基，用于生物量的產(chǎn)生以制備液體益生制劑，所述液體益生制劑含有選擇的、存活的非病原細菌，任選地和優(yōu)選地包含每ml約107到約108集落形成單位的選擇的益生Escherichiacoli。懸浮培養(yǎng)基基本上不含生長培養(yǎng)基。懸浮培養(yǎng)基可以進一步包含物質(zhì)的復(fù)合物，所述物質(zhì)可被用于細菌細胞來以最小能量消耗和合成性代謝(plasticmetabolism)維持它們的基本生物學活性，用這種物質(zhì)來補充所述懸浮培養(yǎng)基，所述物質(zhì)作為一定條件下自溶作用的結(jié)果來自細胞懸浮液本身，所述條件防止細菌細胞的生物降解成分的產(chǎn)生。任選的可以通過應(yīng)用機械作用和/或通過環(huán)境的組成來提高自溶作用。例如，可以通過在細菌細胞內(nèi)的滲透壓和懸浮培養(yǎng)基的滲透壓之間造成滲透不平衡來誘導自溶作用。例如，可以通過使用具有低滲透壓的適合的懸浮培養(yǎng)基，最優(yōu)選的是0.3％-0.4％的氯化鈉溶液，來誘導自溶作用。做為選擇，可以通過對細菌懸浮液密度的改變來誘導自溶作用，例如使得所述密度優(yōu)選的從約1011到約1012細菌數(shù)每ml(CFU；應(yīng)當注意的是在本申請中可互換地使用這兩個術(shù)語)。同樣做為選擇，可以使用另一個方法來防止細菌的生物降解成分的產(chǎn)生。例如，這樣的方法的實例包括但不限于超聲或其他方法。任選的和優(yōu)選的，使所述細菌懸浮液經(jīng)受有利于自溶作用的條件3-7天之間，以發(fā)生自溶物的積累，然后經(jīng)受細胞內(nèi)和適合的懸浮培養(yǎng)基之間的滲透平衡條件，優(yōu)選的在約0.6％到約0.7％的范圍內(nèi)，最優(yōu)選的約0.6％氯化鈉溶液。細胞成分，例如核酸成分，在有利于自溶作用的情況下積累，數(shù)量上優(yōu)選的達到90-110μg/ml，細胞濃度為1011-1012細菌數(shù)每ml。懸浮培養(yǎng)基將細胞維持在一定條件下，細胞不但存活，還將細胞維持在生物學活性狀態(tài)。所述培養(yǎng)基優(yōu)選的還包括用于維持細菌基本上不進一步生長或增殖(如上所述)的必需成分，并且所述培養(yǎng)基基本上不含通常由微生物在生長期間產(chǎn)生的抑制劑。所述制劑被保存在這樣的條件下，所述條件以基本的生物學活性率將細菌維持在存活的、生物學活性狀態(tài)下，持續(xù)最長的時期。這些條件包括約6.0到約7.0之間的pH值，優(yōu)選的約6.5到約6.8之間，和約2到約10℃的溫度。本發(fā)明的液體制劑可被用于治療人類和動物。優(yōu)選的，將10ml到20ml之間劑量的制劑施用給受試者，一天在2到4次之間。在下文中，術(shù)語“基本上不含”特定物質(zhì)，優(yōu)選的是指一種情況，其中所述物質(zhì)以微小的量或痕量存在，更優(yōu)選的低于約5％的重量比。如在此使用的，術(shù)語“方法”是指用于實現(xiàn)給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和步驟，包括但不限于，化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領(lǐng)域的從業(yè)者已知的，或易于從已知的方式、手段、技術(shù)和步驟發(fā)展出的那些方式、手段、技術(shù)和步驟。在此，術(shù)語“治療”包括消除、顯著抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病的進展，顯著改善疾病的臨床癥狀或?qū)嵸|(zhì)上預(yù)防疾病的臨床癥狀的出現(xiàn)。術(shù)語“預(yù)防”是指首先防止受試者患上失調(diào)或疾病。如在此使用的，術(shù)語“炎癥性腸病(IBD)”是指以胃腸道內(nèi)的炎癥性活動為特征的失調(diào)或疾病，可包括IBD的粘膜形式?？捎帽景l(fā)明的益生菌株治療的IBD的實例非限制地包括，克羅恩氏病(遠端的和近端的)、潰瘍性結(jié)腸炎、不確定性結(jié)腸炎、顯微結(jié)腸炎、膠原結(jié)腸炎、小腸和/或近端腸的突發(fā)性炎癥和與IBD有關(guān)的腹瀉。在此使用的術(shù)語“施用”是指將益生E.coli菌株或其他菌株帶入受疾病或失調(diào)影響的胃腸道中的區(qū)域或部位的方法。術(shù)語“治療有效量”是指施用的益生E.coli菌株或其他菌株的數(shù)量，這種數(shù)量將至少在一定程度上減輕被治療的疾病或失調(diào)的一種或多種癥狀。在下文中，術(shù)語“受試者”是指被施用治療劑的人或更低等的動物?？诜┯玫慕M合物包括在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液，或含有液體的膠囊劑。增稠劑、稀釋劑、調(diào)味劑、助分散劑、乳化劑或粘合劑是可取的。劑量取決于癥狀的嚴重度和受試者對治療劑的反應(yīng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。根據(jù)本發(fā)明的方法，治療有效量范圍優(yōu)選的在每次施用約106到約1012個活細菌之間，更優(yōu)選的在每次施用約107到約1010個活細菌之間，更優(yōu)選的在每次施用約108到約1010個活細菌之間，最優(yōu)選的在每次施用約5×109到約2×1010個活細菌之間。根據(jù)本發(fā)明的施用次數(shù)范圍優(yōu)選的在每天1到10次施用之間，更優(yōu)選的在每天1到5次施用之間，最優(yōu)選的在每天2到4次施用之間。每天施用的活細菌總數(shù)范圍優(yōu)選的在每天約109到約1011個活細菌之間，盡管其范圍任選的可以在每天約106到約1012個活細菌之間。本發(fā)明的益生菌株優(yōu)選的作為液體制劑被配制和施用，如在下文中詳細描述的和在以下實施例部分進一步舉例說明的。本發(fā)明的益生菌株的制劑以液體制劑的形式是高度有益的。在生物學活性狀況之下，該制劑還充當了存活細菌的支持性培養(yǎng)基，與凍干的制劑，例如商售的M17制品正相反，在凍干的制劑中的細菌處于休眠狀態(tài)。結(jié)果，本發(fā)明的液體制劑，例如，在口服施用后立即有治療活性，不需要在消化道中的生物量(biomass)產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，益生E.coli菌株的液體制劑一般地包含在水溶液中的細菌的懸浮物。所述水溶液一般地主要包含蒸餾水，優(yōu)選的包括來自細菌的自溶物，等滲數(shù)量的鹽，可進一步包含其他成分，如下文中進一步詳述的。優(yōu)選的，將溶液的pH值調(diào)整到有利于維持生存力。優(yōu)選的，所述溶液還包含氮源，但更優(yōu)選的是相對小的數(shù)量，最優(yōu)選的低于約0.3％，再更優(yōu)選的低于約0.03％。應(yīng)當注意的是，除非另有說明，在此給出的百分比是重量體積比。根據(jù)本發(fā)明，益生E.coli菌株的液體制劑一般地每ml包含約105到約1012CFU(集落形成單位)的益生Escherichiacoli菌株。優(yōu)選的，所述液體制劑每ml包含約106到約1010CFU之間，更優(yōu)選的每ml約107到約108CFU之間。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，每天將10ml到20ml之間的液體制劑施用給受試者，一天在2到4次之間。本發(fā)明的上下文中使用的液體制劑是口服施用的，因而其優(yōu)選的進一步包含一種或多種增味劑和/或一種或多種植物提取物。非病原乳糖陽性E.coli，例如菌株M17、菌株Nisle及其他菌株包含人和動物腸內(nèi)的健康需氧微生物區(qū)系的主要類群，提供了微生物學的平衡，在營養(yǎng)和免疫方面起到重要的作用。這種細菌菌株與大多數(shù)引起腹瀉的腸病原體屬于相同的系統(tǒng)發(fā)生群，因而它們的存活條件是很大程度上相似的，引起了菌株之間的高水平的競爭性排斥。這種競爭效應(yīng)包括在益生細菌的生長期間抗微生物物質(zhì)的產(chǎn)生、對營養(yǎng)和生長因子的競爭、協(xié)同的養(yǎng)分利用，和對受體部位的競爭。增殖的速度是競爭對抗中的主要因素，本發(fā)明的菌株的增殖速度要高于，例如，Lactobacillus或B.Bifidus，至少與許多腸內(nèi)病原體相當。此外，對于營養(yǎng)需求，本發(fā)明的菌株比例如Lactobacillus或B.Bifidus的菌株有低得多的選擇性。當前可獲得的益生制品使用干燥的細菌，使得細菌保持存活，但處于休眠(anabiotic)狀態(tài)。在施用這種制品時，在重新獲得生物學活性之前出現(xiàn)了停滯期。由于在腹瀉時腸的內(nèi)容物被快速地排出，施用的干燥的細菌制品僅一小部分被保留在結(jié)腸中以增殖和獲得生物學活性。本發(fā)明的液體益生組合物允許將細菌保存在生物學活性形式，從而在到達胃腸道時立即開始細菌的益生作用，不需要適應(yīng)時間。因而開始細菌生長所需的時間，本發(fā)明的液體組合物要比凍干的細菌的制品快得多。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的益生組合物對細菌性病原體的對抗效應(yīng)顯著地高于來自凍干制品的益生細菌的對抗效應(yīng)。應(yīng)當注意的是，“對抗”意思是特定細菌菌株對抗其他細菌或其他微生物的生長的能力。已知的是，胃液主要包含鹽酸，胃液的作用引起許多細菌的死亡。干燥形式的細菌比在液體培養(yǎng)基中含有的那些細菌更弱，因而對胃液的影響更加敏感。因此含在本發(fā)明的液體組合物中的細菌在通過胃時，比凍干制品中的那些細菌更加穩(wěn)定。進入結(jié)腸的細菌開始增殖并發(fā)揮它們的對抗性質(zhì)。然而，大多數(shù)腸病原體的主要作用的部位不是結(jié)腸，而是在胃腸道的上部。已知的益生制品不能將競爭性濃度的活細菌遞送到腸的上部，因而在消除由腸道上部的微生態(tài)平衡紊亂引起的急性細菌性腹瀉和狀況方面實際上是無效的。使用常規(guī)的益生制品生產(chǎn)方法，提高制品的細菌數(shù)量是成問題的。在這種方法中，細菌與培養(yǎng)基一同被干燥，添加了各種穩(wěn)定劑來提高細菌穩(wěn)定性。因此，提高施用的細菌數(shù)量引起在其他成分的消耗水平方面的增加，這可能引起嚴重的副作用。與此相反，本發(fā)明的組合物包含生物學純的細菌的液體懸浮物，從而在一定的體積，優(yōu)選的多至約150ml和如上所述的濃度下，每天施用的細菌數(shù)量可以從幾千萬直到約2千億個細菌之間變化。這允許提供一種在消化道的上部，即，在大多數(shù)腸病原體作用的部位就開始的細菌的功能性競爭濃度。目標部位決定了治療疾病或失調(diào)所需的濃度。由于可以按照確定的給藥頻率來施用，本發(fā)明的液體益生組合物的有效性也被提高了，所述給藥頻率根據(jù)待治療的疾病或失調(diào)被確定為提供最大的劑量依賴效力。例如，在治療急性腹瀉時，本發(fā)明的液體益生組合物可以按照用于治療便秘的有效量的10-100倍的量來施用。在制備本發(fā)明的液體益生組合物時，具有最高的對抗活性的E.coli細菌細胞(或其他細菌細胞)和在長時間保存時，優(yōu)選的多至約12個月，有最大持久性的細菌細胞，更優(yōu)選地首先從具有有益的益生性質(zhì)的乳糖陽性非病原E.coli物種中挑選。用于本發(fā)明的益生組合物的E.coli細胞或其他細菌通過對細胞施加選擇壓力來挑選，從而僅被選擇的細胞仍然存活。選擇壓力的應(yīng)用可以通過使用時間壓力(時間穩(wěn)定性)從而選擇具有長期生存能力的細胞；應(yīng)用滲透壓；降低基礎(chǔ)代謝；或提高溫度來實現(xiàn)。溫度選擇任選地和優(yōu)選地包括使細胞經(jīng)歷40℃的溫度至少4天，和/或經(jīng)歷更高的溫度更短的時間。用這種方法，僅從初始培養(yǎng)物中選擇出具有很高生存能力的細胞。選出的細菌細胞被用于接種生長培養(yǎng)基，如下文中更詳細描述的，參考實施例6和7。本發(fā)明的營養(yǎng)組合物可包含各種因子，例如參考實施例所描述的，例如來自酵母提取物和/或酵母自溶物的因子。本發(fā)明的生長培養(yǎng)基的營養(yǎng)組合物可以任選地包括生長因子，并由于添加這種生長因子，例如來自酵母提取物的生長因子，相對于用常規(guī)生長培養(yǎng)基所獲得的，提供了在積累的細菌生物量方面可觀的增加，其產(chǎn)生了經(jīng)濟效益。所述酵母提取物優(yōu)選的以約5克每升到約25克每升的數(shù)量存在，更優(yōu)選的從約15克每升到約20克每升。營養(yǎng)組合物的其他來源是可能的，但優(yōu)選地包括
背景技術(shù)：
中已知的所有必需營養(yǎng)、生長因子等，例如“ManualofMethodsforGeneralBacteriology”，P.Gerhardted.，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC，USA，1981中描述的。本發(fā)明的方法提供了生物學上純的細菌，不含培養(yǎng)基和通常由微生物在生長期間產(chǎn)生的抑制劑，所述培養(yǎng)基在大量施用時有與其相關(guān)的副作用，所述抑制劑延緩了細菌的活性和生長的開始。已知的是，在革蘭氏陰性細菌，特別是E.coli的細胞內(nèi)的滲透壓在生長的對數(shù)期可高達15個大氣壓，在生長停滯期可達2-3個大氣壓。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方式中，使用具有低滲透壓，優(yōu)選的低于1個大氣壓，更優(yōu)選的約0.3到約0.4個大氣壓的懸浮培養(yǎng)基。在本發(fā)明的液體益生組合物的第一個制備階段期間的滲透壓不平衡和高細菌密度，創(chuàng)造了最弱的和最低穩(wěn)定性的細菌細胞在對數(shù)生長期發(fā)生自溶作用的條件。這些裂解的細胞提供了懸浮培養(yǎng)基中來自細菌的細胞成分的積累，其提供了余下的細胞的營養(yǎng)需求。使用這種步驟，獲得從1011到約1012個細菌每ml(CFU)的細胞濃度，盡管細胞濃度可以任選地處于更廣的范圍。如實施例1中所示，用于最大細胞穩(wěn)定性的本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)基的pH任選的和優(yōu)選的在約6.0到約7.0的范圍內(nèi)。更優(yōu)選的，懸浮培養(yǎng)基的pH是約6.5。如實施例2所示，本發(fā)明的細菌細胞任選地和優(yōu)選地保存在約2到約20℃的溫度范圍內(nèi)。更優(yōu)選的，保存溫度在約20到約10℃的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的，保存溫度在約2到約4℃的范圍內(nèi)。在有利于細胞穩(wěn)定的條件下(例如，適合的pH值，每ml107-108個細菌的細胞濃度，細菌細胞用于以最小能量消耗和合成性代謝維持它們的結(jié)構(gòu)所用的物質(zhì)的復(fù)合物等等(自溶物))，本發(fā)明的液體益生組合物產(chǎn)生了因子的組合，其不僅將細菌保持在存活狀態(tài)，還保持在立即有活性的生物形式，持續(xù)至少12個月。應(yīng)當注意的是，這個階段的細菌濃度可以任選的在每ml約106到約1012個細菌的范圍。這種物質(zhì)的復(fù)合物優(yōu)選的包括核酸、核酸成分、細菌脂多糖、肽聚糖、磷脂和許多其他合乎需要的物質(zhì)。本發(fā)明的益生組合物可被用于治療人類和動物。實施例參考以下的非限制性實施例說明本發(fā)明的益生組合物的制劑、制備和使用。實例1液體益生組合物的制備過程首先制備選出的細菌進行生長以形成濃縮形式的生物物質(zhì)(biomass)，范圍1011-1012CFU每ml，在0.3％-0.4％NaCl溶液中，以產(chǎn)生自溶物。為了制備液體益生組合物，將細胞濃縮物在0.6％-0.8％NaCl溶液中稀釋到107個細胞/ml的細胞濃度(盡管任選的，所述細菌濃度可以在約106到約1012個細菌每ml的范圍內(nèi))。將液體益生組合物的pH調(diào)整到有利于細胞生存。優(yōu)選的pH是約6.5直到6.8。為了改善口味，可以添加一種或多種植物提取物、增味劑和/或其他添加劑，其不降低細菌長時間保存的生存力。以下在實施例15中提供了制備植物提取物的示范性方法的說明。液體益生組合物可以保存在冷藏條件下至少12個月而沒有顯著的生物學性質(zhì)的損失。實施例2溫度在+2～±8℃，細菌E.coliM-17*(CFU/ml)的生存力取決于懸浮培養(yǎng)基的pH值(0.7％的氯化鈉溶液和自溶物，一同提供了滲透平衡的溶液)。如上所示，在保存在具有8.5的pH的懸浮培養(yǎng)基中時，活細胞的數(shù)量在一個月內(nèi)大大地降低了。在低于5.5或大于7.5的pH值保存時，在2個月內(nèi)可見顯著的降低。在12個月的末尾，僅在具有6.0到7.0之間的pH值的那些培養(yǎng)基中保留了顯著數(shù)量的活細胞。實施例3在懸浮液中，根據(jù)本發(fā)明選擇抽樣后(1)和從商售凍干的制品中分離的(2)E.coliM-17細菌細胞的生存力，取決于貯存溫度。用0.7％氯化鈉溶液作為懸浮培養(yǎng)基。懸浮液pH＝6.7。如上所示，在2到10℃之間的溫度下經(jīng)過12個月的保存期在懸浮液中活細菌數(shù)量降低的非常少，而在18-20℃保存相同的時期有顯著的降低。在25-30℃的溫度下，12個月后幾乎沒有活細胞余下。實施例4將來自凍干的活細菌(商售制品Colibacterin)和來自液體益生組合物(以生物學活性形式存在的細菌)的相同數(shù)量的細菌E.coliM-17(每個樣品1ml108CFU)導入到營養(yǎng)肉湯樣品(200ml)中。在37℃將混合物孵化90分鐘。相對于它們最初的生長速率評估細菌性代謝活動的速率被降低的比率，即，它們對新環(huán)境介質(zhì)條件的適應(yīng)。為了獲得這個數(shù)值，在將細菌導入營養(yǎng)肉湯后立即測定細菌的數(shù)量(C.F.U.每1ml)，隨后在孵化過程期間每隔30分鐘進行測定。使用取自液體益生組合物的細胞的細菌生長(O)比來自凍干的益生組合物的細胞的細菌生長速率(Δ)顯著更快，如附圖1所示。實施例5將S.flxneri和S.sonnei的10-20小時培養(yǎng)物在鹽水中稀釋到105CFU/ml的濃度。然后將這些單獨地或與來自凍干的益生菌劑(Colibacterin)或來自液體益生菌劑(Bio-Co)的E.coliM17培養(yǎng)物(在鹽水中稀釋到1012CFU/ml的濃度)一同接種(1ml)到含有營養(yǎng)肉湯(5ml)的試管中。在37℃將試管孵化24小時。通過在營養(yǎng)瓊脂上的平板計數(shù)來測定病原體和來自兩種益生制品的E.coliM17的集落形成單位(CFU)數(shù)。這些數(shù)據(jù)在下表中示出。來自凍干的益生組合物和來自液體益生組合物的益生生物E.coliMl7對于各種Shigella菌株的對抗活性。實施例6用相同數(shù)量的細菌培養(yǎng)物E.coliM17接種培養(yǎng)基(固體和液體)，顯示為胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)。對于TSA和TSB的組成和制備，是本領(lǐng)域公知的，參見例如“CultureMediaforMicrobiology”，F(xiàn)EROSA/Scharlau，1996，通過引用將其合并，如同在此完全闡述了一樣。在最適溫度(36℃)在有氧條件下將微生物培養(yǎng)24小時(固體培養(yǎng)基)和18小時(液體培養(yǎng)基)。然后通過營養(yǎng)瓊脂上的平板計數(shù)測定每1ml的細菌濃度。在最佳生長培養(yǎng)基(T.S.A.和T.S.B.)上和根據(jù)本發(fā)明的生長培養(yǎng)基上非病原E.coli(E.coliM17)的生物量積累之間的對比在下表中說明。在不同培養(yǎng)基上生長的培養(yǎng)物實施例7在+2±4℃下保存樣品3天和30天后，對0.4％氯化鈉溶液中1011-1012CFU的細菌懸浮液樣品進行核酸成分分析。最初，用0.45μ微生物學過濾器過濾樣品來獲得無細胞濾液。檢查濾液中核酸成分(腺嘌呤和尿嘧啶)的存在。根據(jù)方法的敏感性，檢測極限是2μgr/ml。這些數(shù)據(jù)在下表中示出。實施例8使用液體培養(yǎng)基產(chǎn)生細菌生物物質(zhì)對于細菌生物物質(zhì)制備可以使用標準的通風發(fā)酵容器。分兩期添加細菌生長所需的營養(yǎng)。在典型的的發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基可以由10.0g/l的蛋白胨、18.0g/l的酵母提取物、2.5g/l的葡萄糖、3.0g/l的氯化鈉和足以提供中性或偏堿性pH(7.2±0.2)的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀的組合而組成。在細菌生長過程期間向營養(yǎng)培養(yǎng)基中自動地添加其他營養(yǎng)物。應(yīng)當隨著培養(yǎng)物的生長不斷地添加額外的葡萄糖，使得發(fā)酵肉湯中的葡萄糖濃度保持在2.5g/l的水平。在整個細菌生長期間進行額外的通風(0.5vvm.)。發(fā)酵肉湯的pH值通過不斷添4NNH4OH來保持中性。在約32到約36℃的溫度下孵化該肉湯直到生長周期到達靜止期。16-18小時后，通過離心或超濾收獲細胞，直到對于每ml懸浮液107-108個微生物細胞的細胞濃度殘余的總氮量不超過0.3％，優(yōu)選的不超過0.03％的水平，重懸浮在鹽水中并重沉淀。在冷卻到4-8℃的0.4％-0.6％NaCl溶液中制備1011-1012的細菌懸浮液，保存在冷藏條件下。應(yīng)當注意的是，這個階段(和/或用于向受試者施用)的細菌濃度可以任選的在每ml約106到約1012個細菌的范圍。實施例9使用固體培養(yǎng)基產(chǎn)生細菌生物物質(zhì)使用根據(jù)本發(fā)明的、提供最大細菌生物物質(zhì)積累的營養(yǎng)物組合物，在固體培養(yǎng)基上生長非病原E.coli。所述培養(yǎng)基的成分如下配方(g/l)大豆蛋白胨10.0酵母提取物18.0葡萄糖2.5氯化鈉4.0瓊脂12.0最終pH7.0(約0.2)將制備的培養(yǎng)基注入相應(yīng)的模具中，層厚5-7毫米。冷卻后，用細菌培養(yǎng)物E.coliM-17接種該培養(yǎng)基。將模具置于孵化器中，在有氧條件下在最適溫度(34-38℃)孵化約24-28小時。這個步驟產(chǎn)生了1010-1011個細胞/ml的培養(yǎng)基。在這期間，通過“干法”從平板上除下分離的純培養(yǎng)物，其中，用工具，例如刮鏟除去細菌，而不向平板上引入液體(或至少顯著量的液體)。為此目的已經(jīng)使用了對生物物質(zhì)收集的專門調(diào)整。在0.4％-0.6％NaCl溶液中制備1011-1012CFU的細菌懸浮液。將懸浮液保存在冷藏條件下。實施例10-腹瀉的治療顯示了取決于每天向病人施用的益生細菌數(shù)量，消除由Salmonella和病原不明的食物中毒引起的急性腹瀉(包括旅行者腹瀉)的發(fā)作的效果(依賴于劑量的效力)。用不同的治療有效量的本發(fā)明液體益生組合物治療了總共64位病人。這些數(shù)量在每天100-2000億活細菌的范圍內(nèi)，被分成4-6劑。第一組病人的處方是每天含1千萬細菌的治療有效量的本發(fā)明的液體益生組合物。這些病人的85％在3天后急性腹瀉的癥狀仍然存在。從第4天開始，這些病人的處方是每天2000億細菌的治療活性數(shù)量。在施用這個劑量的第一天內(nèi)，94％的病人腹瀉消失了或排便次數(shù)顯著地下降。第二組病人從觀察的第一天開始施用含2000億活細菌的治療有效量的本發(fā)明的液體益生組合物。甚至在施用所述液體益生組合物的第一天內(nèi)就注意到了明顯的效果(腹瀉的消失或排便次數(shù)方面的顯著下降)，主要是在第一個12-14小時期間。實施例11在用抗螺旋菌療法治療的病人中液體益生組合物對腸內(nèi)微生物區(qū)系變化的特性的影響。用抗螺旋菌療法治療的104位病人的組被隨機分為兩個亞組。除了包括抗生素治療的標準療法之外，第二組的病人被施用了本發(fā)明的液體益生組合物。在25天治療之后，在所有病人中測定被認為是健康微生物區(qū)系(需氧的和厭氧的)的主要代表的細菌的數(shù)量組成。結(jié)果在下表中示出。在腸中類型M17的非病原E.coli作為需氧微生物區(qū)系的主要代表。在施用本發(fā)明的液體益生組合物時，腸中的E.coli總數(shù)被標準化，它們的質(zhì)量被改善了(即，乳糖陽性細菌的水平被提高，乳糖陰性細菌和低發(fā)酵活力的E.coli的水平被降低)。此外，雙歧桿菌的數(shù)量提高了，雙歧桿菌是健康的厭氧腸微生物區(qū)系的最重要的代表。實施例12益生組合物的制備-示范性的方法根據(jù)本發(fā)明的組合物可以任選的根據(jù)以下示范性的方法制備。益生E.coli(108-109個細胞)，任選的來自種子儲備，使用標準的微生物發(fā)酵技術(shù)接種到液體或固體培養(yǎng)基成分中。生長條件優(yōu)選的包括連續(xù)的通風、維持中性的pH和補充葡萄糖。這種生物優(yōu)選的沒有進行任何的遺傳工程，而是從正常人胃腸道獲得的微生物區(qū)系中分離的。制造任選的和優(yōu)選的根據(jù)以下關(guān)鍵控制點進行控制●采取預(yù)防措施來接收和處理培養(yǎng)物●控制過程以確保適當?shù)呐囵B(yǎng)物狀況●無菌性的維持●控制過程以確保最終產(chǎn)品中益生菌的正確水平任選的和優(yōu)選的，種子儲備本身可以如下制備。從-80℃的保存處移出一瓶冷凍的E.coliM-17菌株，在室溫下解凍，然后無菌地轉(zhuǎn)移到含有滅菌的胰蛋白酶大豆肉湯(Difco)的無菌有擋板的搖瓶中。生長15-20小時之后，顯微檢查該培養(yǎng)物，在BactomEndoAgarLES平板上劃線來檢查純度。反應(yīng)器制備在有培養(yǎng)基的情況下將每個反應(yīng)器分批和滅菌。分別地將葡萄糖滅菌，在培養(yǎng)物接種前添加到2.5g/L的濃度。反應(yīng)器接種將種子培養(yǎng)物無菌地轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器，在設(shè)定的溫度條件、pH、攪動和溶解氧下使培養(yǎng)物生長。孵化后四小時開始3.5到3.9g/L的葡萄糖供給。生長18-22小時之后，顯微檢查該培養(yǎng)物，在BactomEndoAgarLES平板上劃線來檢查純度。然后將反應(yīng)器冷卻到＜10℃用于收獲。微濾通過使用0.2μm孔徑大小的切向流動微量過濾單元濃縮收獲生物反應(yīng)器內(nèi)容物。用5倍體積的無菌鹽水穿濾(diafilter)濃縮物，然后放入無菌瓶子中在4-6℃下保存。顯微檢查樣品，在BactomEndoAgarLES平板上劃線來檢查純度，通過平板接種到胰蛋白酶大豆瓊脂平板上來計數(shù)。實施例13使用E.coli治療IBD相關(guān)的腹瀉研究了一名23歲的男性，其患伴有腹瀉發(fā)作的腸蠕動緩慢(loosebowelmovements)兩年，沒有直腸流血或體重減輕。他的家族史對于腸疾病是不值得注意的。對該病人的實驗室測試顯示了血紅蛋白＝17.6(吸煙者)，ESR＝10，血小板＝219，白蛋白＝4.1，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶TTG＝29.8(正常＜20)此外，通過陽性H2呼吸測試發(fā)現(xiàn)病人具有乳糖不耐受性。然而，無乳制品的膳食沒能改善他的狀況。該病人的升高TTG值暗示了腹腔疾病的診斷結(jié)論。上部GI內(nèi)窺鏡檢查顯示了正常表觀的小腸。十二指腸第二部分的隨機活組織檢查證明了正常小腸粘膜的存在。進行膠囊內(nèi)窺鏡檢查研究，顯示了近端小腸中的炎性變化，包括少許糜爛、粘膜出血、水腫和絨毛損失。用如實施例12的描述制備的益生組合物治療病人，飯前約半小時每天兩次一湯匙的服法。2周后病人的狀況沒有改善。繼續(xù)進行病人的益生治療，而將日劑量提高到每天四湯匙。隨著這種治療，病人報告了顯著的改善，是兩年來的首次。對小腸的第二次膠囊內(nèi)窺鏡檢查表明了近端小腸的炎性過程的改善。實施例14用液體益生組合物治療的方法如上所述，已經(jīng)證明本發(fā)明的液體益生組合物能有效的治療胃腸的疾病和狀況，包括但不限于，微生物感染、IBS和IBD。以下實施例僅是治療這種胃腸疾病或失調(diào)(或需要治療的狀況)、和其他任何適合于本發(fā)明的液體益生組合物的狀況的方法的說明，并不意味著受到限制。該方法包括向待治療的受試者施用液體益生培養(yǎng)基。根據(jù)有效的劑量給藥方法學，按藥學上有效量施用所述液體益生組合物，優(yōu)選的直到達到預(yù)定的終點(endpoint)，例如胃腸疾病、失調(diào)或狀況，和受試者中任何其他適合的狀況的癥狀的消失，或在受試者中預(yù)防這種疾病、失調(diào)、狀況或癥狀的出現(xiàn)。實施例15植物提取物的制備可以從任何適合的水果、蔬菜、植物的葉、莖或根，或從草本植物制備生物學活性的可食用提取物。植物可以是甘藍、蒜、歐芹、蒔蘿、檸檬等，或草本植物例如薄荷等等。植物提取物可以任選的通過提供最多40℃的沸點溫度減壓蒸餾來制備。對于植物提取物的制備，可以使用市場上已有的設(shè)備，例如“Rotovapor”裝置。制備用于添加到本發(fā)明的組合物的植物提取物的過程優(yōu)選的包括1.研磨植物或植物部分來得到植物生物物質(zhì)。需要強調(diào)的是，對于植物提取物的生產(chǎn)，使用新鮮制備的生物物質(zhì)。優(yōu)選的在室溫下保存不超過1-2小時，因為在壓碎水果、蔬菜或其他植物之后，微生物開始生物量上的發(fā)展，發(fā)生不受控制的發(fā)酵和其他反應(yīng)。這顯著地降低了獲得的提取物的品質(zhì)。在必需延長保存的情況下，研磨的植物物質(zhì)應(yīng)當保存在冷柜中不超過12小時。2.在減壓情況下蒸汽蒸餾所述植物生物物質(zhì)。3.收集從所述蒸汽蒸餾獲得的揮發(fā)性餾分?？梢杂盟M一步稀釋這個餾分。該植物提取物可以任選地保存在冷藏條件下12個月而不失去其能力。這個餾分本身構(gòu)成了食物/飼料添加劑，也可任選的通過混合多于一種的植物提取物來制備。盡管已經(jīng)結(jié)合其具體實施方式描述了本發(fā)明，很明顯的是，多種替換、修改和變體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，意圖包括所有落在附加的權(quán)利要求的精神和寬廣范圍內(nèi)的這種替換、修改和變體。權(quán)利要求1.一種液體益生組合物，包括至少具有基本生物學活性的細菌和液體培養(yǎng)基，其中所述細菌已經(jīng)根據(jù)至少一種選擇壓力進行了選擇，和其中所述組合物基本上不含非適合物質(zhì)。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述細菌包括至少一種E.coli菌株。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述細菌包括具有對抗性質(zhì)的非病原乳糖陽性菌株。4.權(quán)利要求2的組合物，其中所述細菌包含多種Escherichiacoli菌株，或至少一種E.coli菌株和至少一種其他的細菌菌株。5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述選擇壓力包括溫度壓力。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述溫度壓力包括升高含有所述細菌的培養(yǎng)基的溫度。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述溫度壓力包括使所述細菌經(jīng)歷約36到約50℃的溫度，其中所述細菌是懸浮的。8.權(quán)利要求7的組合物，其中使所述細菌經(jīng)歷約40℃的所述溫度至少4天。9.權(quán)利要求5的組合物，其中所述溫度壓力包括降低含有所述細菌的培養(yǎng)基的溫度。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述降低包括將所述溫度降低到約1℃至約12℃至多12個月。11.權(quán)利要求10的組合物，其中降低所述溫度至少約3個月。12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述選擇壓力包括保存的時間，其中所述細菌被保存至少約一個月。13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述細菌被保存至多約12個月。14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述選擇壓力包括滲透壓。15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述選擇壓力包括低滲透壓。16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述滲透壓包括低于約1個大氣壓的壓力。17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述滲透壓包括約0.3到約0.4個大氣壓的壓力。18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述液體培養(yǎng)基包含水、自溶物和等滲數(shù)量的鹽，特征是氮源以低于約0.3％的水平存在，任選的低于約0.03％。19.權(quán)利要求7的組合物，進一步的包含用于維持細菌基本上不生長或分裂的多種物質(zhì)。20.權(quán)利要求1的組合物，包括每ml所述液體約107到約108集落形成單位的所述細菌。21.權(quán)利要求1的組合物，進一步的包含至少一種增味劑或來自植物的提取物。22.權(quán)利要求1的組合物，包含約6.0到約7.0的pH值。23.權(quán)利要求14的組合物，其中所述pH值是約6.5。24.權(quán)利要求1的組合物，包括一定劑型的該組合物，該劑型適合于每次施用約106到約1012個活細菌的施用。25.權(quán)利要求24的組合物，包括一定劑型的該組合物，該劑型適合于每天施用約1到約4次的施用。26.權(quán)利要求1的組合物，其中在與所述液體培養(yǎng)基結(jié)合之前使所述細菌經(jīng)歷自溶作用。27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述自溶作用通過一定機制誘導，所述機制選自由機械攪拌、低滲透壓和改變懸浮液中所述細菌的密度所構(gòu)成的組。28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述密度是每ml約1011到約1012個細菌。29.權(quán)利要求26的組合物，其中所述液體培養(yǎng)基包含由所述自溶作用形成的自溶物。30.一種制備液體益生組合物的方法，包括在生長培養(yǎng)基中使多數(shù)細菌生長以形成生物物質(zhì)；根據(jù)選擇壓力選擇細菌；和將所述至少具有基本生物學活性的細菌保存一段時間。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述選擇壓力包括溫度壓力。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述溫度壓力包括使所述細菌經(jīng)歷約36到約50℃的溫度，其中所述組合物是懸浮的。33.權(quán)利要求32的方法，其中使所述細菌經(jīng)歷約40℃的所述溫度至少4天。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述溫度壓力包括降低含有所述細菌的培養(yǎng)基的溫度。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述降低包括將所述溫度降低到約1℃至約12℃至多12個月。36.權(quán)利要求35的方法，其中降低所述溫度至少約3個月。37.權(quán)利要求30的方法，其中所述選擇壓力包括保存的時間，其中所述細菌被保存至少約一個月。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述細菌被保存至多約12個月。39.權(quán)利要求30的方法，其中所述選擇壓力包括滲透壓。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述選擇壓力包括低滲透壓。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述滲透壓力包括低于約1個大氣壓的壓力。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述滲透壓力包括約0.3到約0.4個大氣壓的壓力。43.權(quán)利要求30的方法，進一步包括將所述生長培養(yǎng)基和抑制物因子與所述生物物質(zhì)分離開；和使所述細菌經(jīng)歷自溶作用。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述自溶作用通過一定機制誘導，所述機制選自由機械攪拌、滲透壓改變、低滲透壓和改變懸浮液中所述細菌的密度所構(gòu)成的組。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述密度是每ml約1011到約1012個細菌。46.權(quán)利要求45的方法，進一步包括用液體培養(yǎng)基保存所述細菌，其中所述液體培養(yǎng)基包含從所述自溶作用形成的自溶物。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述保存包括調(diào)整所述液體培養(yǎng)基中所述細菌的濃度到約105至約1012CFU。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述濃度是約107到約108CFU。49.權(quán)利要求30的方法，其中所述生長培養(yǎng)基包括固體或液體生長培養(yǎng)基。50.權(quán)利要求30的方法，其中所述生長培養(yǎng)基包含酵母提取物。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述酵母提取物以約5到約25克每升的數(shù)量存在。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述酵母提取物以約15到約20克每升的數(shù)量存在。53.權(quán)利要求30的方法，進一步包括通過研磨植物材料和蒸汽蒸餾所述研磨的材料制備植物提取物；和將所述植物提取物添加到所述組合物中。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述蒸汽蒸餾在減壓情況下進行。55.一種治療受試者的方法，包括向需要治療的所述受試者施用一種液體益生組合物，所述液體益生組合物包含至少具有基本生物學活性的細菌，其中所述細菌已經(jīng)根據(jù)至少一種選擇壓力進行了選擇。56.權(quán)利要求55的方法，用于治療胃腸的疾病或失調(diào)。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述胃腸疾病或失調(diào)包括微生物感染。58.權(quán)利要求56的方法，其中所述胃腸疾病或失調(diào)包括炎癥性腸病。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述炎癥性腸病選自由克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、不確定性結(jié)腸炎、顯微結(jié)腸炎、膠原結(jié)腸炎、小腸的突發(fā)性的炎癥和與炎癥性腸病有關(guān)的腹瀉構(gòu)成的組。60.權(quán)利要求56的方法，其中所述胃腸疾病或失調(diào)包括由腸病原體引起的胃腸感染，所述腸病原體選自由Salmonella、Shigella、產(chǎn)腸毒素E.coli和C.difficile構(gòu)成的組。61.權(quán)利要求56的方法，其中所述胃腸疾病或失調(diào)包括食物中毒、消化不良癥狀或急性腹瀉的發(fā)作，或由未被檢出的病原體或未知的病因引起的腹瀉。62.權(quán)利要求61的方法，其中所述腹瀉包括旅行者腹瀉和醫(yī)院環(huán)境中的腹瀉。63.權(quán)利要求55的方法，包括治療消化道的疾病和失調(diào)，所述疾病和失調(diào)由腸內(nèi)微生物區(qū)系的微生物平衡的紊亂，和/或由小腸中細菌的過度生長導致或維持。64.權(quán)利要求55的方法，包括預(yù)防或降低消化道微生物區(qū)系的微生物平衡紊亂的水平，所述紊亂由抗生素治療、放療或化療、消化道的疾病或失調(diào)，包括消化道手術(shù)所引起。65.權(quán)利要求55的方法，包括預(yù)防或治療消化道微生物區(qū)系的微生物平衡方面的紊亂，所述紊亂由消化道外的疾病、某些飲食和環(huán)境因素引起。66.權(quán)利要求55的方法，包括改善或正常化老年人和受危害病人的胃腸道的生理活動。67.權(quán)利要求55的方法，其中所述組合物任選的包含每ml約106到1012集落形成單位之間的所述細菌，優(yōu)選的包含每ml約107到108集落形成單位之間的所述細菌。68.權(quán)利要求67的方法，其中每天向所述受試者施用約106到約1012個所述細菌。69.權(quán)利要求68的方法，其中每天向所述受試者施用約107到約109個所述細菌。70.權(quán)利要求69的方法，其中每天向所述受試者施用約107到約108個所述細菌。71.權(quán)利要求55的方法，其中所述組合物包含在等滲培養(yǎng)基中的自溶物。72.權(quán)利要求55的方法，其中所述組合物基本上不含非適合物質(zhì)。73.權(quán)利要求55的方法，用于改善或正?；茉囌叩拿庖呦到y(tǒng)，所述受試者患有免疫系統(tǒng)失調(diào)，包括作為由治療其他疾病引起的副作用的失調(diào)。74.權(quán)利要求55的方法，用于治療家養(yǎng)動物。全文摘要一種制備液體益生組合物的方法，所述液體益生組合物包含至少具有基本生物活性的細菌，其中所述細菌已經(jīng)根據(jù)至少一種選擇壓力進行了選擇，其中所述組合物優(yōu)選的包括自溶物(用于維持細菌的完整物質(zhì))和其中所述組合物基本上不含適合于細菌生長、但不類似地適合于哺乳動物、特別地不適合于人類的物質(zhì)。蛋白胨和緩沖鹽，特別是磷酸鹽，在小劑量可能不是有害的，但它們特別地不適合于人類，在由細菌產(chǎn)生的物質(zhì)中不含這些物質(zhì)。文檔編號A61K45/00GK1867258SQ200480030642公開日2006年11月22日申請日期2004年8月16日優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日發(fā)明者N·克納帕達卡申請人:生物平衡公司