專利名稱：糖肽膦酸酯衍生物的鹽酸鹽的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及糖肽抗生素的膦酸酯衍生物的鹽酸鹽，該鹽適用于配制含有抗生素藥劑的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于制備這類鹽的方法。
背景糖肽(例如，dalbaheptides)是一類熟知的由不同微生物產(chǎn)生的抗生素(見Glycopeptide Antibiotics，由R.Nagarajan編輯，Marcel Dekker，Inc.New York(1994))。這些復(fù)雜的多-環(huán)肽化合物是非常有效的抗大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌的抗細(xì)菌劑。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利No.6,635,618(通過參考以整體將其引入本文)公開了一類新的糖肽膦酸酯衍生物，它們是強(qiáng)效的抗生素藥劑，對廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌具有有效的抗細(xì)菌活性。
具體而言，該申請公開了式1的化合物
該化合物在本領(lǐng)域被稱作telavancin(本申請將其譯為特拉萬霉素)。
為了在制備藥物組合物和制劑中有效使用特拉萬霉素，具有在室溫貯存過程中具有提高的穩(wěn)定性的鹽形式將是非常理想的。先前沒有公開過這類鹽形式。
發(fā)明概述本發(fā)明提供具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子(chlorideion)含量的特拉萬霉素鹽酸鹽。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)這類鹽酸鹽與特拉萬霉素的其它鹽酸鹽相比，在室溫貯存過程中具有提高的穩(wěn)定性。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽。
另一方面，本發(fā)明涉及一種制備具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽的方法；該方法包括下列步驟
(a)提供包含具有大于約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽和含水溶劑系統(tǒng)的組合物，其中該組合物具有低于或等于約2.0的pH；(b)將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約2.5至約5.0，形成具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽；并(c)分離步驟(b)中產(chǎn)生的特拉萬霉素鹽酸鹽。
在還另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含特拉萬霉素鹽酸鹽和含水溶劑系統(tǒng)的組合物，其中該組合物的pH為約2.5至約5.0。
附圖簡述

圖1是顯示在25℃下貯存樣品時，存在于8種特拉萬霉素鹽酸鹽中的假糖苷配基的HPLC面積百分比對時間的圖。
圖2是顯示在25℃下貯存樣品時，存在于8種特拉萬霉素鹽酸鹽中的糖苷配基的HPLC面積百分比對時間的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在室溫貯存時具有提高的穩(wěn)定性的特拉萬霉素的特定鹽酸鹽。這類鹽適用于制備藥物組合物和制劑。
在描述本發(fā)明中，除非另有說明，下列術(shù)語具有下列含義。
本文所用的術(shù)語“鹽酸鹽”或“氫氯化物”是指由鹽酸與目標(biāo)化合物，即特拉萬霉素反應(yīng)制備的鹽。除非明確說明，該術(shù)語的使用不包含特定的化學(xué)計量。
術(shù)語“氯離子含量”是指存在于呈其鹽酸鹽形式的目標(biāo)化合物樣品中的氯離子的重量百分比(重量％)。該術(shù)語不包括存在于目標(biāo)化合物中的任何共價結(jié)合氯取代基，即特拉萬霉素芳香環(huán)(環(huán)C和E)上的氯取代基的重量。因此，術(shù)語“氯離子含量”是指樣品的非共價結(jié)合的氯離子含量。當(dāng)用于描述本發(fā)明化合物時，氯離子含量是以基本無水的樣品重量為基礎(chǔ)計算的，即，從樣品總重量中減去樣品的水含量。
本文所用的術(shù)語“惰性溶劑”和“惰性稀釋劑”是指在其被用作溶劑或稀釋劑的反應(yīng)的條件下，基本上是惰性的溶劑或稀釋劑。
術(shù)語“含水溶劑系統(tǒng)”是指包含水和至少一種惰性有機(jī)溶劑或惰性有機(jī)稀釋劑的溶液。
當(dāng)提供數(shù)值的范圍時，應(yīng)理解，除非含量另外清楚地標(biāo)明，該范圍上限和下限之間的各中間值，直到下限單位的十分之一，以及所述范圍中的任何其它所述或中間值包括在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立包括在較小范圍內(nèi)，且也包含在本發(fā)明之內(nèi)，受限于該規(guī)定范圍中的任何特定排除的極限。當(dāng)規(guī)定范圍包括所述極限的一個或兩個時，排除了那些所包括極限中的任何一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
一方面，本發(fā)明涉及一種具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的telavacin鹽酸鹽。
另一方面，本發(fā)明涉及一種具有約2.4重量％至約4.7重量％；包括約2.4重量％至約4.6重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽。
另一方面，本發(fā)明涉及一種具有約3.7重量％至約4.6重量％；包括約3.7重量％至約4.4重量％；如約3.9重量％至約4.4重量％或約3.7重量％至約3.9重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽。
存在于樣品中的氯離子重量百分比，例如，可通過美國藥典(USP)23，221部分，1726頁(1995)中所概述方法，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其它技術(shù)測定。例如，一種常用的技術(shù)是用硝酸銀的電位滴定。另一種技術(shù)是基于加入硝酸銀后，從樣品中沉淀出來的氯化銀的量的重量測定。可替代地，可使用測定存在于樣品中的氯離子重量百分比的任何其它適宜方法。
因為存在于特拉萬霉素鹽酸鹽樣品中的水的量可顯著變化，因此在計算樣品的氯離子含量之前，減去存在于樣品中的任何水的重量。
此外，用于計算氯離子含量的樣品重量包括存在于特拉萬霉素鹽酸鹽中的任何雜質(zhì)。存在于特拉萬霉素鹽酸鹽樣品中的雜質(zhì)的量通常低于約15％，例如，低于12％。
因此，樣品的氯離子含量測定如下
水含量通常是使用美國藥典(USP)25，921部分，2085-2088頁(2002)所概括的電位Karl Fischer方法測定的，也可使用本領(lǐng)域人員已知的其它技術(shù)測定。
作為參考，特拉萬霉素的一鹽酸鹽(分子量1792.06)(0％H2O)具有1.98重量％的氯離子含量。相應(yīng)地，特拉萬霉素的二鹽酸鹽(摩爾分子量1828.52)和特拉萬霉素的三鹽酸鹽(摩爾分子量1864.98)分別具有3.88重量％和5.70重量％的氯離子含量。
因此，本發(fā)明具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的鹽酸鹽相當(dāng)于每摩爾當(dāng)量的特拉萬霉素具有多于1摩爾當(dāng)量且少于3摩爾當(dāng)量的氫氯化物。一方面，本發(fā)明涉及每摩爾當(dāng)量的特拉萬霉素具有約1.5至約2.5摩爾當(dāng)量的氫氯化物的特拉萬霉素鹽酸鹽。本發(fā)明鹽酸鹽的優(yōu)選化學(xué)計量是每摩爾當(dāng)量的特拉萬霉素具有約2摩爾當(dāng)量的氫氯化物。
關(guān)注藥物化合物如糖肽的降解產(chǎn)物是因為這種降解產(chǎn)物的生物學(xué)活性或治療作用與其母分子相比可能不同。見，例如，J.Diana等人，Journal of Chromatography A，996115-131(2003)，其討論了萬古霉素雜質(zhì)。
在室溫貯存時，發(fā)現(xiàn)特拉萬霉素的某些鹽酸鹽產(chǎn)生少量不良的降解產(chǎn)物和雜質(zhì)。兩個主要的降解產(chǎn)物是(1)特拉萬霉素的假糖苷配基雜質(zhì)；和(2)特拉萬霉素的糖苷配基雜質(zhì)(其結(jié)構(gòu)在下面顯示)。假糖苷配基雜質(zhì)來源于特拉萬霉素的脂化vancosamine部分的水解，并且糖苷配基雜質(zhì)來源于特拉萬霉素的葡萄糖部分的水解。

先前公開的制備特拉萬霉素的方法從具有低于約2的pH的溶液中分離出特拉萬霉素的鹽酸鹽，由此得到具有大于約5重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽，即，提供一種近似特拉萬霉素三鹽酸鹽的特拉萬霉素鹽酸鹽。許多這類鹽的樣品，在20-30℃下干燥2天后，含有總共約8％的假糖苷配基和糖苷配基副產(chǎn)物。在控制條件下，將具有大于約5重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽在25℃下貯存2周后，觀察到增加了超過0.6％的假糖苷配基和0.4％的糖苷配基。
形成鮮明對比的是，在相似條件下，具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽證實增加了低于0.2％的假糖苷配基和低于0.07％的糖苷配基雜質(zhì)。因此，本發(fā)明的鹽在室溫貯存后所產(chǎn)生的假糖苷配基和糖苷配基雜質(zhì)的量顯著低于先前公開的鹽酸鹽所產(chǎn)生的那些。
在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于制備具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽的方法。該方法包括在第一步(a)中提供包含具有大于約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽的組合物并在第二步(b)中調(diào)節(jié)該組合物的pH。
本發(fā)明的方法可使用特拉萬霉素鹽酸鹽的根據(jù)本文所述一般合成方案直接獲得的溶液，或該組合物可通過再次溶解分離出來的特拉萬霉素鹽酸鹽而形成。因此，在本發(fā)明的一個方面，步驟(a)的組合物是從特拉萬霉素鹽酸鹽的合成方法直接獲得的。在本發(fā)明的另一方面，將分離出來的、具有大于4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽再次溶解，以包含步驟(a)的組合物。例如，可將具有大于4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素的凍干鹽酸鹽再次溶解，以包含步驟(a)的組合物。
在上述方法的步驟(a)中，該組合物包含特拉萬霉素的鹽酸鹽和含水溶劑系統(tǒng)，其中該組合物具有低于或等于約2.0的pH。步驟(a)中所用的含水溶劑系統(tǒng)通常包含水和至少一種有機(jī)稀釋劑。適合和水結(jié)合使用的有機(jī)稀釋劑是(1)可與水混溶；(2)對特拉萬霉素鹽酸鹽而言是化學(xué)惰性的那些。適用的有機(jī)稀釋劑包括乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、叔-丁醇、二噁烷等。例如，該有機(jī)稀釋劑可選自乙腈、甲醇和乙醇。在具體實施例中，步驟(a)的組合物包含乙腈和水。其中特別感興趣的是，步驟(a)的含水溶劑系統(tǒng)是約40％∶約60％(v/v)的乙腈比水。
步驟(a)的組合物中特拉萬霉素鹽酸鹽的優(yōu)選濃度為約5mg/mL至約30mg/mL。例如，步驟(a)的初始組合物中的特拉萬霉素鹽酸鹽濃度可以為約20mg/mL至約30mg/mL。
在本發(fā)明的步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約2.5至約5.0。一方面，在方法的步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.0至約5.0。例如，在步驟(b)中，可將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.0至約4.5，如約3.0至約4.0。在步驟(b)中，可將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.5至約4.5。例如，可將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.5至約4.0。一方面，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約4.0至約4.5。
在步驟(b)中，通常通過向步驟(a)的組合物中滴加堿氫氧化物而調(diào)節(jié)該組合物的pH。可使用任何適宜的堿氫氧化物，包括如，氫氧化鋇、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰等。優(yōu)選使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)該組合物的pH。
最后，在第三步(c)中，通過本領(lǐng)域已知的許多方法中的任意方法從步驟(b)的組合物中分離出特拉萬霉素的鹽酸鹽。例如，可沉淀并離心或過濾特拉萬霉素的鹽酸鹽。
在本發(fā)明的一個方面，在步驟(c)中，通過沉淀和過濾從組合物中分離出特拉萬霉素的鹽酸鹽。例如，過量有機(jī)稀釋劑可用于使特拉萬霉素的鹽酸鹽從組合物中沉淀出來。用于步驟(c)中使特拉萬霉素的鹽酸鹽從步驟(b)的組合物中沉淀出來的適宜有機(jī)稀釋劑是(1)可與水混溶的；(2)對特拉萬霉素鹽酸鹽而言是化學(xué)惰性的；和(3)當(dāng)加入到步驟(b)的組合物中時，產(chǎn)生特拉萬霉素鹽酸鹽沉淀的那些。作為舉例說明，適用的有機(jī)稀釋劑包括乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等。在本發(fā)明的一個方面，在步驟(c)中，向步驟(b)的組合物中加入乙腈使特拉萬霉素的鹽酸鹽沉淀。在本發(fā)明另一方面，向步驟(b)的組合物中加入丙酮使特拉萬霉素的鹽酸鹽沉淀。
如果需要，可任選用適宜的有機(jī)稀釋劑洗滌在步驟(c)中分離出來的沉淀。例如，當(dāng)向步驟(b)的組合物中加入乙腈使特拉萬霉素的鹽酸鹽沉淀時，任選用乙腈，接著用甲基叔-丁基醚(MTBE)洗滌所得沉淀。可替代地，當(dāng)丙酮用于使特拉萬霉素的鹽酸鹽沉淀時，任選用丙酮，接著用MTBE洗滌所得沉淀。
本文所述本發(fā)明方法的步驟(a)、(b)和(c)通常在約15℃至約30℃，優(yōu)選約20℃至約25℃的內(nèi)部溫度下進(jìn)行。
通常，在進(jìn)行本發(fā)明的方法時，所有過濾、洗滌、干燥和過篩都是在惰性氣氛，如氮氣、氬氣等中進(jìn)行的。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含特拉萬霉素鹽酸鹽和含水溶劑系統(tǒng)的組合物，其中該組合物的pH值為約2.5至約5.0。在本發(fā)明又一方面，本發(fā)明涉及所述組合物，其中該組合物具有本文所述任何一個特定pH值。
通過本文所述用于制備具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量或本文所述任何特定氯離子含量范圍的特拉萬霉素鹽酸鹽的任何一種方法所制備的產(chǎn)物也包括在本發(fā)明中。
一般合成步驟特拉萬霉素或其鹽可使用下列一般方法和步驟從很容易得到的原料制備。將要認(rèn)識到除非另有說明，當(dāng)給出典型或優(yōu)選的工藝條件(即，反應(yīng)溫度、時間、反應(yīng)物的摩爾比、溶劑、壓力等)時，也可使用其它方法條件。最佳的反應(yīng)條件可以隨所用的具體反應(yīng)物或溶劑而變化，但這種條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)的最佳化步驟確定。此外，如對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，可能需要常規(guī)的保護(hù)基團(tuán)來防止某些官能團(tuán)經(jīng)歷不期望的反應(yīng)。
用于制備特拉萬霉素或其鹽的詳細(xì)步驟在2002年8月23日提交的美國專利申請系列號10/226,988；2002年8月23日提交的10/226,676；和2002年8月23日提交的10/226,428中描述，其公開的內(nèi)容整體引入本文作為參考。這些公開出版物中公開的任何步驟均可用于制備特拉萬霉素或其鹽。
作為舉例說明，首先使用N-保護(hù)的-癸氨基乙醛在vancosamine氨基末端將萬古霉素或其鹽還原烷基化。例如，一摩爾當(dāng)量的萬古霉素或其鹽與1摩爾當(dāng)量或更多摩爾當(dāng)量的N-保護(hù)的-癸氨基乙醛，如N-Fmoc-癸氨基乙醛，和過量的適宜堿在惰性稀釋劑中結(jié)合形成組合物。優(yōu)選，約1至約2摩爾當(dāng)量的醛用于方法的該步驟中。在該組合物中，據(jù)信在醛和萬古霉素的堿性氮原子之間，即vancosamine氮原子和N-末端(leucinyl)氮原子之間形成亞胺和/或半縮醛胺的混合物。
通常，萬古霉素或其鹽與醛在有過量適宜堿存在的條件下，在惰性稀釋劑中結(jié)合形成混合物。適宜的惰性溶劑或溶劑組合包括，例如，N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙腈/水等或其混合物。
可在該步驟中使用任何適宜的堿從而中和萬古霉素鹽并促進(jìn)亞胺和/或半縮醛胺的形成，包括有機(jī)堿，如胺、堿金屬羧酸鹽(即，乙酸鈉等)和無機(jī)堿，如堿金屬碳酸鹽(即，碳酸鋰、碳酸鉀等)。通常，該步驟中使用的堿是叔胺如，作為舉例說明，三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉等。
該方法的第一步通常在約0℃至約75℃的溫度，優(yōu)選室溫(即，約20-25℃)下進(jìn)行約1至約24小時，優(yōu)選約6-12小時，或直到亞胺和/或半縮醛胺的形成基本上完成。
當(dāng)亞胺和/或半縮醛胺混合物的形成基本上完成時，用過量酸酸化該混合物。任何適宜的酸均可用于方法的該步驟中，包括，作為舉例說明，羧酸(例如，乙酸、三氯乙酸、檸檬酸、甲酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸等)、無機(jī)酸(例如，鹽酸、硫酸或磷酸)等。通常用于該步驟中的酸是三氟乙酸或乙酸。通常以相對于萬古霉素(和堿)摩爾過量加入酸。
該酸化步驟通常在約0℃至約30℃，優(yōu)選約25℃的溫度下進(jìn)行約0.25-2.0小時，優(yōu)選約0.25至約1.5小時。
通常，在該步驟過程中加入極性、質(zhì)子溶劑，如，甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇等?？商娲?，可使用混合的極性質(zhì)子/非-質(zhì)子溶劑，如甲醇/四氫呋喃、甲醇/1，2-二甲氧基乙烷等。
酸化步驟后，使該混合物與還原劑接觸，從而還原亞胺和/或半縮醛胺。在方法的該步驟中可使用任何適宜的還原劑，其與存在于糖肽中的官能度相容。例如，適宜的還原劑包括胺/硼烷絡(luò)合物，如硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋅、三乙酰氧基硼氫化鈉、吡啶/硼烷、叔-丁胺/硼烷、N-甲基嗎啉/硼烷、氨/硼烷、二甲胺/硼烷、三乙胺/硼烷、三甲胺/硼烷等。
通常，還原(即用還原劑處理)是在有質(zhì)子溶劑，如醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、或丁醇)、水等存在的條件下進(jìn)行的。通常，在該還原步驟過程中存在極性、質(zhì)子溶劑。在上述酸化步驟過程中，可加入極性、質(zhì)子溶劑。
該方法的還原步驟通常在約0℃至約30℃，優(yōu)選約25℃的溫度下進(jìn)行約0.5至約24小時，優(yōu)選約1至約6小時，或直到還原基本完成。
如果需要，可在合成的下一步之前，除去存在于還原烷基化產(chǎn)物的正-癸氨基乙基側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)。例如，如果使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)，則通常通過用胺，如叔-丁胺處理而除去該基團(tuán)。該反應(yīng)通常在與還原烷基化相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，提供N3″-[2-(癸氨基)乙基]萬古霉素。
然后使來源于還原烷基化的糖肽衍生物與氨甲基膦酸和間苯二酚部分上的甲醛在堿性條件下偶聯(lián)，得到特拉萬霉素或其鹽。該步驟通常通過使過量，如約2至約10摩爾當(dāng)量的氨甲基膦酸與約1摩爾當(dāng)量，如約0.9至約1.1摩爾當(dāng)量的甲醛，和約1摩爾當(dāng)量的來源于還原烷基化的糖肽衍生物或其鹽在有堿存在的條件下接觸而進(jìn)行。
通常以水溶液的形式加入在方法該步驟中使用的甲醛，例如，任選含約5至約15重量％甲醇的37重量％水溶液(即，福爾馬林)。
任何適宜的堿均可用于該反應(yīng)中，包括，例如，有機(jī)堿如叔胺，和無機(jī)堿，如堿金屬氫氧化物(即，氫氧化鈉)。通常，該堿為叔胺，如，三乙胺、二異丙基乙胺等。堿與含膦?；陌返哪柋葹榧s3∶1至約5∶1。通常，該混合物的pH為約10至約11。該反應(yīng)在惰性稀釋劑中進(jìn)行，如水、乙腈/水等。例如，方法的該步驟可在乙腈/水或具有約3∶2 v/v比的水，直到完全的水中進(jìn)行。
方法的該步驟通常在約-20℃至約30℃，例如，約-10℃至約-5℃的溫度下進(jìn)行約6至約48小時，或直到反應(yīng)基本上完成。
所得化合物或其鹽是通過常規(guī)步驟，包括沉淀、過濾等分離的。在典型的分離步驟中，通過加入適宜的酸，如鹽酸水溶液將混合物的pH調(diào)節(jié)至約2至約3。通常，在酸化過程中，維持混合物的溫度低于約5℃。然后加入有機(jī)稀釋劑，如乙腈促進(jìn)反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀，通過過濾收集所得沉淀，并任選用其它稀釋劑洗滌。可替代地，可直接使用該溶液形成本發(fā)明的鹽酸鹽。
如果需要，可使用反相HPLC或其它色譜方法，如，樹脂色譜法進(jìn)一步純化上面形成的沉淀。用于樹脂色譜法中的許多適宜的聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂可商業(yè)得到，例如，從TosoHaas(Montgomery，PA)、Rohm & Haas(Philadelphia，PA)、Mitsubishi Chemical IndustriesLTD.(Tokyo，Japan)；和Dow Chemical Co.(Midland，MI)得到。
該樹脂是通過在過量水中濕潤并用酸化水和/或酸化極性有機(jī)溶劑的水溶液洗滌而制備的。將要純化的特拉萬霉素樣品溶于任選含極性有機(jī)溶劑的酸化水中。
適宜的極性有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈等。用于酸化第一和第二水溶液的適宜酸包括乙酸、三氟乙酸、鹽酸、硫酸、磷酸等酸。樣品溶液的pH優(yōu)選在約2至約5之間。取出小部分樣品溶液并將其用作進(jìn)行分析的標(biāo)準(zhǔn)品。
將樣品溶液裝到柱上并用酸化極性有機(jī)溶劑的第二溶液洗脫，其是從柱上分級收集的。通常，第二酸化水溶液的濃度為約10mM酸且極性有機(jī)溶劑∶水的比例相應(yīng)地為約1∶3至約1∶15。
監(jiān)測各級分的樣品的存在、濃度和純度，例如，通過薄層色譜法或HPLC。收集所含樣品的純度高于規(guī)定閾值的級分，如，作為舉例說明，約85％純的特拉萬霉素(或其鹽)。通常，要收集的級分中的化合物1的濃度為約0.5-5.0mg/mL。
為了增加特拉萬霉素的濃度，將上面收集的混合級分裝載到第二聚苯乙烯樹脂柱上。該步驟還可起鹽交換過程的作用，將任何二代鹽(通過在上述純化步驟過程中，使酸與特拉萬霉素相互反應(yīng)而形成的)轉(zhuǎn)化成鹽酸鹽。通常，將特拉萬霉素制備成鹽酸鹽。然而，在上述純化步驟過程中，可形成微量不同的鹽。
用水稀釋在早期純化步驟過程中收集的混合級分，例如，可將該級分稀釋約2倍，然后裝載到第二樹脂色譜柱上。體積比為例如10∶90∶0.5的乙腈∶水∶鹽酸的溶液用于洗滌柱子。體積比為～40-60∶60-40的乙腈-水的溶液用于從柱上洗脫目標(biāo)化合物，同時監(jiān)測該級分。收集含樣品濃度高于期望閾值，如，5mg/mL的級分。為進(jìn)一步純化或濃縮，該樹脂色譜純化步驟可重復(fù)多次。可替代地，可通過沉淀和過濾，或通過本領(lǐng)域人員已知的其它方法從洗脫液中分離純化產(chǎn)物。
通常，所得混合級分是在具有低于或等于約2.0的pH的乙腈水溶液中，具有大于5.0重量％氯離子含量的特拉萬霉素的三鹽酸鹽。
就本文所述本發(fā)明的方法而言，步驟(a)的組合物可以是在上述濃縮和鹽交換步驟中收集的混合級分或進(jìn)一步加工級分，如干燥或冷凍干燥，然后再次溶于含水溶劑系統(tǒng)中，從而包含步驟(a)的組合物。
上述反應(yīng)所用的方法是本領(lǐng)域熟知的。適宜的試劑或者商業(yè)獲得，或者可使用商業(yè)可獲得的原料和常規(guī)試劑，通過常規(guī)步驟制備。見，例如，Advanced Organic Chemistry，Jerry March，4th ed.，1992，JohnWiley and Sons，New York，page 959；和Frank R.Hartley(ed.)TheChemistry of Organophosphorous Compounds，vol.1-4，John Wileyand Sons，New York(1996)，以及其中引用的參考文獻(xiàn)。
用于制備本發(fā)明化合物的其它詳細(xì)描述和方法在下面的實施例中描述。
提供下列實施例用于舉例說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本實施例在下面的實施例中，下列縮寫詞具有下列含義。沒有定義的任何縮寫詞具有它們通常被接受的含義。除非另有說明，所有溫度以攝氏度(℃)表示。
ACN＝乙腈BV/h＝柱床體積/小時DMF＝N，N-二甲基甲酰胺eq.＝摩爾當(dāng)量Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基MTBE＝甲基叔-丁基醚TLC＝薄層色譜法TFA＝三氟乙酸在下述實施例中，HPLC樣品分析是使用配備有ZorbaxRP-Bonus 4.6mm×250mm柱的Agilent(Palo Alto，CA)Series 1100儀器進(jìn)行的，其具有5微米孔徑，裝C14二氧化硅。檢測是在254nm的UV吸光度下進(jìn)行的。流動相A為2％-98％-0.1％ACN-H2O-TFA；流動相B為90％-10％-0.1％ACN-H2O-TFA。使用流速1.0mL/分，其中使用含有如下梯度流動相B的流動相A10-43％B 30分鐘；43％B 5分鐘；43-100％B 5分鐘；100-10％B 1分鐘和10％B 14分鐘。
在下列實施例中，萬古霉素鹽酸鹽半-水合物從Alpharma，Inc.Fort Lee，NJ 07024(Alpharma AS，Oslo Norway)購買。其它試劑和反應(yīng)物可從Aldrich Chemical Co.，(Milwaukee，WI)獲得。而且，除非另有說明，試劑、原料和溶劑從商業(yè)供應(yīng)商處(如Aldrich、Fluka、Sigma等)購買且在沒有進(jìn)一步純化的情況下使用。
具有703型泵/攪拌器的Brinkmann Metrohm Karl Fischer Model831庫侖計用于測定試驗樣品的水含量。試驗樣品中的氯離子重量百分比是通過電位滴定測定的，其中使用0.1N硝酸銀和736 GP Titrino電位滴定儀，Metrohm Ltd.(Herisau，Switzerland)。相對于已知樣品定期校準(zhǔn)設(shè)備，從而校驗準(zhǔn)確度。
實施例1具有大于約4.8氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽的合成a.Nvan-2-(正-癸氨基)乙基萬古霉素鹽酸鹽的制備向配備有機(jī)械攪拌器、溫度計和氮起泡器的5L三-頸燒瓶中加入DMF(760g，800mL)，并溫?zé)嶂?0-35℃。邊攪拌邊連續(xù)加入24mL二異丙基乙胺(18.1g，0.14mol，2eq)和萬古霉素鹽酸鹽(100g，0.067mol，1eq)(分次)。用DMF(114g，120mL)清洗添加漏斗。30-35℃下攪拌該混合物0.5小時，然后冷卻至20-25℃。向混合物中加入N-Fmoc-癸氨基乙醛(29.7g，0.07mol，1.05eq)，20-25℃下攪拌6-8小時。加入甲醇(220g，280mL)，接著加入三氟乙酸(31.2g，21mL，0.272mol，4eq)。攪拌該混合物約15分鐘后，加入硼烷叔-丁胺絡(luò)合物(5.7g，0.067mol，1eq)，并攪拌該混合物約2小時。加入叔-丁胺(29.8g，0.403mol，6eq)并將所得混合物溫?zé)嶂良s55℃并攪拌2-3小時。將該混合物冷卻至約20-25℃并在約20-25℃下加入0.5N HCl(540mL)，以調(diào)節(jié)溶液至pH7.25-7.35。在約4小時內(nèi)加入10％鹽水溶液(2400g)，同時維持溫度在約20-25℃，將混懸液冷卻至0-5℃后，攪拌3-4小時。通過Whatman#2濾紙(18.5cm直徑，8微米)過濾所得漿液。用水(2×200g)和甲基叔-丁基醚(2×200g)連續(xù)洗滌濕餅。用乙酸乙酯(600g)將濕餅再次漿液化8-12小時。過濾該混合物，然后用乙酸乙酯(2×100g)洗滌。在真空室(40-50mm Hg)40℃干燥該濕餅，直到水含量達(dá)到低于約10％的檢測限(LOD)。獲得灰白色粉末的標(biāo)題化合物(102g，-85％純度)，并在沒有純化的情況下用于下一反應(yīng)。
b.粗特拉萬霉素鹽酸鹽的制備向配備有機(jī)械攪拌器、溫度計和氮起泡器的12L三-頸燒瓶中加入氨甲基膦酸(47.7g，0.43mol，5eq)。加入乙腈(786g，1L)和水(1000g，1L)并在20-25℃下攪拌混合物至溶解。加入二異丙基乙胺(222g，0.3L，20eq)并在20-25℃下攪拌該混合物20分鐘。加入上述制備(a)的產(chǎn)物，NVan-2-(正-癸氨基)乙基萬古霉素鹽酸鹽(200g，測定0.086mol，1eq)，并在20-25℃下攪拌該混合物1小時。在加入37重量％甲醛水溶液(9.08g，0.111mol，1.3eq)之前，將混合物冷卻至-5℃。氮氣下攪拌該混合物12-24小時。向反應(yīng)混合物中滴加3N HCl(615mL)，從而將混合物的pH從10.8調(diào)節(jié)至2.8。將混合物溫?zé)嶂?0-25℃。在～2.5小時的時間內(nèi)向混合物中加入乙醇(95％，8L)。5-10℃下攪拌所得混懸液16小時。通過Whatman #2濾紙(24cm直徑，8微米)過濾該混懸液。用乙酸乙酯(2×200mL)洗滌該濕餅，得到細(xì)灰白色粉末。將該餅在25℃下干燥，得到特拉萬霉素鹽酸鹽并通過HPLC分析證實為標(biāo)題化合物(184g，76.5％純度)。
c.純化步驟將HP20SS聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂(Agilent)裝載在2″×25cm柱上，其配有回壓調(diào)節(jié)閥、蠕動泵、UV檢測器和級分收集器。
以約2-3BV/h的流速通過柱泵送3個柱床體積(BV)的100％乙醇而預(yù)先處理該柱子。上樣前，以2-3BV/h的流速，用流動相A{15％乙醇(190標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度，用5％甲醇變性)、85％水、1％乙酸}平衡該柱子3-5BV。
將上述制備(b)的產(chǎn)物的溶液與80∶10∶10(v/v/v)水∶乙醇∶乙酸混合，濃度為20-25mg/mL，并攪拌1-2小時。將該溶液與C鹽混合(5g/L溶液)15分鐘，通過1微米濾器過濾并以1.5BV/h裝在柱上。使用流動相A，以20mL/分鐘洗滌該柱30分鐘(～1BV)。在～5小時內(nèi)，以～1BV/h的流速(13.5mL/分鐘，Biotage 75M柱體)使用流動相B(26％乙醇、72％水、1％乙酸乙酯、1％乙酸)洗脫具有約27mL體積的各單獨級分。
通過薄層色譜法分析各級分是否存在特拉萬霉素。然后通過HPLC分析含特拉萬霉素的級分，以測定該級分中特拉萬霉素的濃度和純度?；旌暇哂兄辽?5％純度的那些級分。具有可接受純度的混合級分的總體積為～5BV。
d.濃縮和鹽交換用90％去離子水、10％乙醇和0.1％乙酸(v/v/v)的混合物洗滌Amberlite XAD-1600聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂(Rohm & Haas)3天。將該樹脂裝到柱上，然后以約2BV/h的流速通過柱泵送3個柱床體積(BV)的100％乙醇而預(yù)先處理該柱子。上樣前，以～2BV/h的流速，用流動相A{15％乙醇(190標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度，用5％甲醇變性)、85％水、0.6％乙酸}平衡該柱子3-5BV。
用水(2×混合級分體積)稀釋上述純化步驟(c)中收集的混合級分，并通過加水將溶劑組合物從～25％含水乙醇調(diào)節(jié)至85％水、15％乙醇。然后以～1BV/h的流速將該溶液泵送到柱上。測定，通過UV檢測器監(jiān)測，捕集效率為＞98％。
制備體積比為10∶90∶0.5的乙腈-水-濃鹽酸水溶液的溶液，并以～1BV/h的流速泵送到柱上2BV。
然后以～1BV/h的流速將用濃HCl調(diào)節(jié)至pH 2.0的50∶50體積比的乙腈-水溶液泵送到柱上，從柱上洗脫特拉萬霉素鹽酸鹽。
收集各級分并測試特拉萬霉素鹽酸鹽的存在。收集這些級分，直到不再檢測出特拉萬霉素鹽酸鹽。混合含約20-30％特拉萬霉素鹽酸鹽的級分。2-3BV的釋放溶液足以回收＞95％的捕獲樣品?；旌系募壏只蛘咧苯釉谙旅婷枋龅膶嵤├?中使用，或冷凍干燥，然后再次溶解用于實施例2所述的方法中。
實施例2具有4.1重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽的制備和分離將特拉萬霉素鹽酸鹽(1.14L)(按照實施例1所述制備的)溶于1∶1(v/v)乙腈和水(pH 1.93，濃度～30mg/mL)中。在22℃下，用10NNaOH(～3mL)水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至pH 3.78。在22℃下，3.5小時內(nèi)，向該溶液中滴加乙腈(3.42L)，得到乳狀混懸液沉淀。攪拌該混合物1.5小時，并在不攪拌的情況下靜置約14小時。然后過濾沉淀的混合物，用乙腈和MTBE(各200mL)連續(xù)洗滌所得濕餅。在氮氣下干燥該濕餅1小時，然后過篩(500微米)。在22℃、45-50mm Hg真空下干燥所得粉末96小時，得到32.5g(～40％)灰白色粉末的標(biāo)題化合物(HPLC純度91.3％，3.84重量％氯化物，5.84重量％水)。在調(diào)節(jié)水含量后，該物質(zhì)具有4.1重量％氯離子含量。
使用上述方法并改變所加入NaOH的量，分別從具有1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 pH的溶液中分離出具有5.74、5.60、4.69、4.59、4.41、3.94、3.68和2.42重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽。
實施例3氯離子含量對穩(wěn)定性的影響測定氯離子含量對在-20℃、5℃和25℃下貯存的特拉萬霉素鹽酸鹽的穩(wěn)定性的影響。
將按照實施例2所述制備的8個批次特拉萬霉素鹽酸鹽放在相同的玻璃小瓶中，并在其它相同的條件下，在-20℃、5℃和25℃下貯存2周。假糖苷配基和糖苷配基雜質(zhì)的HPLC面積％的變化用于評價相對穩(wěn)定性。
在最高溫度25℃下貯存的樣品的結(jié)果在下面表1中給出。在更低溫度下貯存的樣品的假糖苷配基和糖苷配基雜質(zhì)的增加幅度更小，但證實了相同的趨勢。
表1在25℃下貯存2周的特拉萬霉素鹽酸鹽的實驗數(shù)據(jù)
*沒有測出。
表1中給出的氯離子含量是在減去樣品水含量的情況下計算的。就各樣品而言，顯示了從中分離出它的混合物的pH。名為“2周變化”的欄是指在兩周后觀察到的值與初始值之間的HPLC面積％差異，且在圖1和2中以曲線圖說明。
如圖1和2所示，具有大于4.8重量％(5.74重量％和5.60重量％)氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽，即，在低pH條件(pH1.8和2.0)下沉淀的那些鹽在25℃下，在2周的時間內(nèi)，水解的副產(chǎn)物水平增加。具體而言，2周后，在低pH下沉淀的特拉萬霉素鹽酸鹽的假糖苷配基雜質(zhì)的HPLC面積％增加了0.6或更大；糖苷配基雜質(zhì)的HPLC面積％增加了0.3或更大。
令人吃驚的是，具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽在相同條件下明顯更穩(wěn)定。就這類鹽而言，假糖苷配基雜質(zhì)的HPLC面積％的2周變化在0.1-0.2之間。相似地，糖苷配基雜質(zhì)的HPLC面積％變化低于0.1。因此，本發(fā)明的鹽酸鹽與先前公開的鹽相比，顯示穩(wěn)定性明顯提高。
盡管已參考其具體實施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可進(jìn)行各種改變并替換等價物。此外，可對本發(fā)明的主題、精神和范圍進(jìn)行許多改進(jìn)以適應(yīng)特定的情況、物質(zhì)、物質(zhì)的組成、方法、方法的步驟。所有這種改進(jìn)均落在其權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。此外，本文上面引證的所有出版物、專利和專利文獻(xiàn)均全部引入本文作為參考，就好像單獨引入本文作為參考一樣。
權(quán)利要求
1.一種具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素的鹽酸鹽。
2.權(quán)利要求1的鹽酸鹽，其中氯離子含量為約2.4重量％至約4.7重量％。
3.權(quán)利要求1的鹽酸鹽，其中氯離子含量為約2.4重量％至約4.6重量％。
4.權(quán)利要求1的鹽酸鹽，其中氯離子含量為約3.7重量％至約4.6重量％。
5.權(quán)利要求1的鹽酸鹽，其中氯離子含量為約3.7重量％至約4.4重量％。
6.權(quán)利要求1的鹽酸鹽，其中氯離子含量為約3.9重量％至約4.4重量％。
7.權(quán)利要求1的鹽酸鹽，其中氯離子含量為約3.7重量％至約3.9重量％。
8.一種制備具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽的方法；該方法包括下列步驟(a)提供包含具有大于約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽和含水溶劑系統(tǒng)的組合物，其中該組合物具有低于或等于約2.0的pH；(b)將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約2.5至約5.0，形成具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素鹽酸鹽；并(c)分離步驟(b)中產(chǎn)生的特拉萬霉素鹽酸鹽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.0至約5.0。
10.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.0至約4.0。
11.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.5至約4.5。
12.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約3.5至約4.0。
13.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(b)中，將該組合物的pH調(diào)節(jié)至約4.0至約4.5。
14.權(quán)利要求8的方法，其中步驟(a)的含水溶劑系統(tǒng)包含乙腈和水。
15.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(b)中，使用堿氫氧化物調(diào)節(jié)pH。
16.權(quán)利要求8的方法，其中在步驟(c)中，通過沉淀和過濾分離特拉萬霉素的鹽酸鹽。
17.通過權(quán)利要求8-16任何一項的方法制備的產(chǎn)物。
18.一種包含特拉萬霉素鹽酸鹽和含水溶劑系統(tǒng)的組合物，其中該組合物的pH為約2.5至約5.0。
19.一種特拉萬霉素的鹽酸鹽，其每摩爾當(dāng)量的特拉萬霉素具有多于約1摩爾當(dāng)量且少于約3摩爾當(dāng)量的氫氯化物。
20.權(quán)利要求19的鹽酸鹽，其中每摩爾當(dāng)量的特拉萬霉素具有約1.5至約2.5摩爾當(dāng)量的氫氯化物。
全文摘要
公開了具有約2.4重量％至約4.8重量％氯離子含量的特拉萬霉素的鹽酸鹽。與其它鹽酸鹽相比，所公開的鹽在室溫貯存的過程中具有提高的穩(wěn)定性。還公開了用于制備這類鹽的方法。
文檔編號A61K38/14GK1871253SQ200480031220
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月22日
發(fā)明者劉健偉, 李軍寧 申請人:施萬制藥