專利名稱:包含磷酸鈣材料、膠原蛋白和糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的人工骨、牙科材料和再生支架(scaff1d)領(lǐng)域,尤其涉及包含膠原蛋白、磷酸鈣材料和一種或多種糖胺聚糖的人工骨、牙科材料和再生支架及其前體。
背景技術(shù):
天然骨是膠原蛋白、包括糖胺聚糖的非膠原蛋白有機(jī)相和磷酸鈣的生物復(fù)合體。其復(fù)雜的層級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了出色的機(jī)械性能,包括高的硬度、強(qiáng)度和斷裂韌度,從而使骨能夠承受日?;顒?dòng)所產(chǎn)生的生理應(yīng)力。本領(lǐng)域的研究人員面臨的挑戰(zhàn)是,如何使合成材料的組成和結(jié)構(gòu)允許天然骨可以生長在人體或動(dòng)物體中的合成材料里面和周圍。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn),骨通過人體環(huán)境中形成的骨狀磷灰石層直接連接到人體中的磷酸鈣上(稱為生物活性的性能)。另一方面,已知膠原蛋白和包含膠原蛋白和例如糖胺聚糖等其它生物有機(jī)物質(zhì)的共聚物是多種細(xì)胞附著和增殖的最佳基質(zhì),所述細(xì)胞包括人體中負(fù)責(zé)骨的生成和修復(fù)的那些細(xì)胞。
羥磷灰石是最通常用作骨替代材料的成分的磷酸鈣。但是,與例如透鈣磷石、磷酸三鈣和磷酸八鈣等其它形式的磷酸鈣材料相比,羥磷灰石是較難溶的材料。由于該材料在人體中的再吸收速率特別低,所以當(dāng)制備生物材料時(shí),磷灰石的較低的溶解度是不利的。
例如羥磷灰石等磷酸鈣是機(jī)械硬度高的材料。但是,與天然骨相比,它們較脆。膠原蛋白是機(jī)械韌性高的材料,但是與天然骨相比,它具有較低的硬度。包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比單獨(dú)的膠原蛋白具有更高的韌性和硬度,但是,與天然骨相比,仍然具有較低的硬度。
在現(xiàn)有技術(shù)中,在制備機(jī)械韌性超過羥磷灰石且硬度超過膠原蛋白和膠原蛋白與糖胺聚糖的共聚物的人工骨替代材料時(shí),先前的嘗試包括通過機(jī)械混合合并膠原蛋白和磷灰石。這樣的機(jī)械方法描述在EP-A-0164484中。
該技術(shù)的最新進(jìn)展包括,通過機(jī)械混合羥磷灰石、膠原蛋白和軟骨素-4-硫酸酯來制備包含這些組分的骨替代材料。該技術(shù)描述在EP-A-0214070中。該文獻(xiàn)還描述了軟骨素-4-硫酸酯與膠原蛋白的脫水熱交聯(lián)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),包含磷灰石、膠原蛋白和軟骨素-4-硫酸酯的材料具有良好的生物相容性。將磷灰石與膠原蛋白和需要時(shí)的軟骨素-4-硫酸酯機(jī)械混合,實(shí)際上形成被膠原蛋白/軟骨素-4-硫酸酯包覆的磷灰石顆粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),盡管該材料是生物相容性的,但是在人體或動(dòng)物體內(nèi),天然骨在內(nèi)部的生長極為有限,而且不能重新形成合成材料的磷酸鈣相。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決至少一部分與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。
第一方面,本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、鈣源和磷源以及一種或多種糖胺聚糖的酸性水溶液;和從該水溶液中一起沉淀出膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖以形成三元共沉淀物。
術(shù)語三元共沉淀物包涵三種化合物的沉淀物,其中,從相同溶液/分散液中基本上同時(shí)沉淀出所述化合物。這應(yīng)與機(jī)械混合這些組分形成的材料不同,特別是與例如在不同溶液中單獨(dú)沉淀出的這些組分不同。共沉淀物的微結(jié)構(gòu)基本上不同于機(jī)械混合其組分形成的材料。
在第一方面中,所述溶液優(yōu)選具有2.5~6.5的pH,更優(yōu)選2.5~5.5。更優(yōu)選地,所述溶液具有3.0~4.5的pH。進(jìn)而更優(yōu)選地,所述溶液具有3.8~4.2的pH。最優(yōu)選地,所述溶液具有約為4的pH。
所述鈣源優(yōu)選選自硝酸鈣、醋酸鈣、氯化鈣、碳酸鈣、烷氧基鈣、氫氧化鈣、硅酸鈣、硫酸鈣、葡萄糖酸鈣和肝素的鈣鹽中的一種或多種。肝素的鈣鹽可以得自豬的腸粘膜。合適的鈣鹽可購自Sigma-Aldrich Inc.。
所述磷源優(yōu)選選自磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O,有時(shí)稱為GPR Sorensen鹽)和磷酸三甲酯、磷酸的堿金屬(例如Na或K)鹽、磷酸的堿土金屬(例如Mg或Ca)鹽中的一種或多種。
糖胺聚糖是含有長的無支鏈多糖的大分子族,所述多糖含有重復(fù)的二糖單元。優(yōu)選地,所述一種或多種糖胺聚糖選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatin sulfate)、肝素、硫酸肝素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸。硫酸軟骨素可以是軟骨素-4-硫酸酯或軟骨素-6-硫酸酯,它們都可以從Sigma-Aldrich Inc.得到。軟骨素-6-硫酸酯可以得自鯊魚軟骨。透明質(zhì)酸可以得自人的臍帶,肝素得自豬的腸粘膜。
優(yōu)選地,在三元共沉淀物的沉淀時(shí),所述溶液具有4.0~50℃的溫度。更優(yōu)選地,所述溶液具有15~40℃的溫度。所述溶液可以是室溫,即20~30℃,優(yōu)選20~27℃的溫度。最優(yōu)選地,該溫度為約25℃。
所述水溶液中鈣離子的濃度通常為0.00025~1摩爾/升,優(yōu)選0.001~1摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的附加步驟時(shí),所述水溶液中鈣離子的濃度更優(yōu)選為0.05~0.5摩爾/升(例如0.08~0.25摩爾/升),最優(yōu)選0.1~0.5摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時(shí),所述水溶液中鈣離子的濃度更優(yōu)選為0.01~0.3摩爾/升,最優(yōu)選0.05~0.18摩爾/升。
優(yōu)選地,所述溶液包含磷酸根離子,溶液中磷酸根離子的濃度通常為0.00025~1摩爾/升,優(yōu)選0.001~1摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的附加步驟時(shí),溶液中磷酸根離子的濃度更優(yōu)選為0.05~0.5摩爾/升,進(jìn)而更優(yōu)選0.1~0.5摩爾/升,例如0.1~0.35摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時(shí),溶液中磷酸根離子的濃度更優(yōu)選為0.01~0.3摩爾/升,進(jìn)而更優(yōu)選0.05~0.18摩爾/升。
優(yōu)選地,在沉淀之前,溶液中膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖的總量的重量比為8∶1~30∶1。更優(yōu)選地,膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖總量的重量比為10∶1~12∶1,最優(yōu)選該比例為11∶1~23∶2。
優(yōu)選地,三元共沉淀物中膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為10∶1~1∶100,更優(yōu)選5∶1~1∶20,進(jìn)而更優(yōu)選3∶2~1∶10,最優(yōu)選3∶2~1∶4。
在沉淀之前,所述溶液中膠原蛋白的濃度通常為1~20g/L,更優(yōu)選1~10g/L。當(dāng)所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的步驟時(shí),所述溶液中膠原蛋白的濃度更優(yōu)選為1~10g/L,進(jìn)而更優(yōu)選1.5~2.5g/L,最優(yōu)選1.5~2.0g/L。當(dāng)所述方法包括冷凍干燥和可選的注塑成型時(shí),在沉淀之前,所述溶液中膠原蛋白的濃度優(yōu)選為5~20g/L,更優(yōu)選5~12g/L,最優(yōu)選9~10.5g/L。
在沉淀之前,所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度通常為0.01~1.5g/L,更優(yōu)選0.01~1g/L。當(dāng)所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的附加步驟時(shí),所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度更優(yōu)選為0.03~1.25g/L,進(jìn)而更優(yōu)選0.125~0.25g/L,最優(yōu)選0.13~0.182g/L。當(dāng)所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時(shí),所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度更優(yōu)選為0.15~1.5g/L,進(jìn)而更優(yōu)選0.41~1.2g/L,最優(yōu)選0.78~0.96g/L。
優(yōu)選所述溶液包含鈣離子,膠原蛋白與鈣離子的重量比通常為1∶40~500∶1。當(dāng)所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的附加步驟時(shí),膠原蛋白與鈣離子的比更優(yōu)選為1∶40~250∶1,進(jìn)而更優(yōu)選1∶13~5∶4,最優(yōu)選1∶13~1∶2。當(dāng)所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時(shí),膠原蛋白與鈣離子的比更優(yōu)選為1∶8~500∶1,進(jìn)而更優(yōu)選5∶12~30∶1,最優(yōu)選5∶5~5∶1。
沉淀可以通過下列方式實(shí)現(xiàn)在酸性水溶液中混合膠原蛋白、鈣源、磷源和一種或多種糖胺聚糖;或使溶液靜止直到沉淀發(fā)生,攪動(dòng)溶液,使用例如氨水等堿性滴定劑滴定,加入例如預(yù)制透鈣磷石等成核劑;改變鈣源的加入速率;或者采用這些方法的任意組合。
第二方面,本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料,和通過水解將復(fù)合材料中的至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣。
術(shù)語生物材料包涵與人體或動(dòng)物體可生物相容的材料。
在第二方面中,所述復(fù)合材料優(yōu)選包含或基本上由以下物質(zhì)組成含有膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共沉淀物可以用這里所述的與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法形成。
優(yōu)選地,透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟包括使所述三元共沉淀物與水溶液接觸,所述水溶液的pH等于或大于磷酸八鈣比透鈣磷石在熱力學(xué)上更穩(wěn)定時(shí)的pH。優(yōu)選地,該水溶液具有6~8的pH。更優(yōu)選地,該水溶液具有6.3~7的pH。最優(yōu)選地,該水溶液具有約6.65的pH。所述水溶液可以包括,例如用滴定劑、緩沖液、被另一種含鈣化合物和/或含磷化合物所飽和的溶液控制pH的去離子水。優(yōu)選的水溶液包含使用氨水滴定到所需pH的醋酸。
優(yōu)選地,透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟在20~50℃的溫度下進(jìn)行,更優(yōu)選30~40℃,進(jìn)而更優(yōu)選36~38℃,最優(yōu)選約37℃。
優(yōu)選地,透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟進(jìn)行12~144小時(shí),更優(yōu)選18~72小時(shí),最優(yōu)選24~48小時(shí)。
第三方面,本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料,和通過水解將復(fù)合材料中的至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石。
磷灰石是一類包含鈣和磷酸根的礦物質(zhì),它具有通式Ca5(PO4)3(X),其中X可以是離子,通常為OH-、F-和Cl-以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它離子。磷灰石也包括取代的磷灰石,例如硅取代的磷灰石。磷灰石包括羥磷灰石,羥磷灰石是磷灰石的具體例子。羥磷灰石也可以用硅取代。
在第三方面中,復(fù)合材料優(yōu)選包含或基本由以下物質(zhì)組成包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或一種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共沉淀物可以按照這里所述的與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法形成。
優(yōu)選地,透鈣磷石水解為磷灰石的步驟包括使所述三元共沉淀物與水溶液接觸,所述水溶液的pH等于或大于為磷灰石比透鈣磷石在熱力學(xué)上更穩(wěn)定時(shí)的pH。優(yōu)選地,為了將透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石,該水溶液具有6.65~9,更優(yōu)選7~8.5,進(jìn)而更優(yōu)選7.2~8.5的pH。所述水溶液可以包括,例如用滴定劑、緩沖液、被另一種含鈣化合物和/或含磷化合物所飽和的溶液控制pH的去離子水。
優(yōu)選地,透鈣磷石水解為磷灰石的步驟在20~50℃的溫度下進(jìn)行,更優(yōu)選30~40℃,進(jìn)而更優(yōu)選36~38℃,最優(yōu)選約37℃。
優(yōu)選地,透鈣磷石水解為磷灰石的步驟進(jìn)行12~288小時(shí),更優(yōu)選18~72小時(shí),最優(yōu)選24~48小時(shí)的時(shí)間。
增加透鈣磷石向磷酸八鈣和/或磷灰石轉(zhuǎn)化的速率的方法包括提高(i)溫度,(ii)溶液中透鈣磷石的濃度和或(iii)攪拌速度。
需制備同時(shí)包含磷灰石和磷酸八鈣的本發(fā)明的生物材料。可以同時(shí)采用本發(fā)明第二和第三方面的方法,制備既包含磷酸八鈣又包含磷灰石的材料。三元共沉淀物中的透鈣磷石可以先轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣,然后磷酸八鈣可以部分地轉(zhuǎn)化為磷灰石。通常在8.0或8.0以上的pH下水解約12小時(shí),從而將透鈣磷石或磷酸八鈣全部或接近全部(即至少98%)轉(zhuǎn)化為磷灰石。因此,材料中透鈣磷石和/或磷灰石的部分轉(zhuǎn)化可以通過水解小于12小時(shí)的時(shí)間來實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選地,磷酸八鈣水解為磷灰石的步驟在6.65~10,更優(yōu)選7.2~10,進(jìn)而更優(yōu)選8~9的pH下進(jìn)行。
優(yōu)選地,磷酸八鈣水解為磷灰石的步驟在20~50℃的溫度下進(jìn)行,更優(yōu)選30~40℃,進(jìn)而更優(yōu)選36~38℃,最優(yōu)選約37℃。
優(yōu)選地,磷酸八鈣水解為磷灰石的步驟進(jìn)行2~144小時(shí)的時(shí)間,更優(yōu)選12~96小時(shí),最優(yōu)選24~72小時(shí)。
在本發(fā)明的第二和第三方面中,透鈣磷石向磷酸八鈣和/或磷灰石的轉(zhuǎn)化優(yōu)選在30~40℃的溫度下進(jìn)行。更優(yōu)選地,該轉(zhuǎn)化在36~38℃的溫度下進(jìn)行。最優(yōu)選地,該轉(zhuǎn)化在約37℃的溫度下進(jìn)行。
優(yōu)選地,本發(fā)明的方法還包括以下步驟使三元共沉淀物中的一種或多種糖胺聚糖和膠原蛋白交聯(lián)。關(guān)于三元共沉淀物,它包括包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物和該共沉淀物的衍生物。該衍生物包括至少一部分透鈣磷石已轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石的共沉淀物,和已經(jīng)定形或成型或進(jìn)行了任何化學(xué)或機(jī)械處理的共沉淀物。使用任何常規(guī)技術(shù)均可以實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。
優(yōu)選地,至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石,在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前使糖胺聚糖與膠原蛋白交聯(lián)。該交聯(lián)可以通過下列方式實(shí)現(xiàn)對三元共沉淀物進(jìn)行γ射線照射、紫外線照射、脫水加熱處理、用例如葡萄糖、甘露糖、核糖等單糖和蔗糖進(jìn)行非酶糖基化、使該三元共沉淀物與戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺和/或去甲二氫愈創(chuàng)木酸中的一種或多種接觸,或上述方法的任意組合。在本領(lǐng)域中這些都是常規(guī)方法。
優(yōu)選地,如果至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石,則在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之后使糖胺聚糖和膠原蛋白交聯(lián)。透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石和/或磷酸八鈣之后的交聯(lián)可以通過上述的一種或多種方法,或通過脫水加熱處理,或這些方法的任意組合來實(shí)現(xiàn)。脫水加熱處理包括使基材在升高的溫度下經(jīng)歷低壓環(huán)境。脫水加熱處理的溫度可以為95~135℃。如果要使脫水加熱處理通常在18~36小時(shí)完成,則該溫度優(yōu)選為100~110℃,最優(yōu)選105~110℃。如果要使脫水加熱處理通常在4~8小時(shí)完成,則該溫度優(yōu)選為120℃~135℃,最優(yōu)選125℃~135℃。
優(yōu)選地,在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前和之后都使膠原蛋白和糖胺聚糖交聯(lián)。
本發(fā)明的方法可以包括以下步驟使復(fù)合生物材料成形為適合用作骨或牙科替代物的結(jié)構(gòu)??梢栽谌渤恋砦镄纬芍螅窃谕糕}磷石的任何轉(zhuǎn)化或膠原蛋白與糖胺聚糖交聯(lián)發(fā)生之前進(jìn)行該步驟。
備選地,使生物材料成形的步驟可以在透鈣磷石轉(zhuǎn)化磷灰石和/或磷酸八鈣或膠原蛋白與糖胺聚糖交聯(lián)之后進(jìn)行。
優(yōu)選地,使用選自下列技術(shù)的技術(shù)使復(fù)合材料成形(i)過濾和/或低溫干燥,(ii)冷凍干燥,(iii)注塑成型和(iv)冷壓。溫度為15~40℃,最優(yōu)選35~40℃的過濾和/或低溫干燥通常產(chǎn)生致密顆粒形式的材料。冷凍干燥通常產(chǎn)生開孔形式。根據(jù)所用染料的形狀,注塑成型可以產(chǎn)生多種形狀/形態(tài)的材料。冷壓通常產(chǎn)生致密丸狀形式。
本發(fā)明還提供一種適合轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣缮锊牧系那绑w材料,所述前體材料包含復(fù)合材料,所述復(fù)合材料包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖。優(yōu)選地,所述復(fù)合材料包含或基本上由以下物質(zhì)組成包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共沉淀物可以根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料,該生物材料可以用這里描述的本發(fā)明的方法得到。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料,該生物材料可以用本發(fā)明第二方面的方法得到。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料,該生物材料可以用本發(fā)明第三方面的方法得到。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、糖胺聚糖和透鈣磷石的三元共沉淀物的復(fù)合生物材料。
本發(fā)明還提供一種包含一種和多種磷酸鈣材料的顆粒、膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖的生物材料,其中所述膠原蛋白和所述一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)并形成母體,所述磷酸鈣材料的顆粒分散在所述母體中,所述磷酸鈣材料選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。
如果沒有其他說明,下面的描述與本發(fā)明的復(fù)合生物材料的所有方面都相關(guān)。
優(yōu)選使膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)。
膠原蛋白優(yōu)選以5(干)重量%~90(干)重量%的量存在在所述材料中,更優(yōu)選15重量%~60(干)重量%,更優(yōu)選20(干)重量%~40(干)重量%。
優(yōu)選地,一種或多種糖胺聚糖以0.01(干)重量%~12(干)重量%的量存在在所述材料中,更優(yōu)選1(干)重量%~5.5(干)重量%,最優(yōu)選1.8(干)重量%~2.3(干)重量%。
優(yōu)選地,如果所述材料包含透鈣磷石,則膠原蛋白與透鈣磷石的重量(干)比為10∶1~1∶100,更優(yōu)選5∶1~1∶20,最優(yōu)選3∶2~1∶10,例如3∶2~1∶4。
優(yōu)選地,如果所述材料包含磷酸八鈣,則膠原蛋白與磷酸八鈣的重量(干)比為10∶1~1∶100,更優(yōu)選5∶1~1∶20,最優(yōu)選3∶2~1∶10。
優(yōu)選地,膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖的總量的重量(干)比為8∶1~30∶1,更優(yōu)選10∶1~30∶1,進(jìn)而更優(yōu)選10∶1~12∶1,最優(yōu)選11∶1~23∶2。
本發(fā)明的復(fù)合生物材料可以用作骨或牙科的替代材料。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的復(fù)合生物材料的人工骨材料、骨移植物、骨嫁接物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固劑。術(shù)語涂料包括任何包含本發(fā)明的生物材料或前體的涂料。涂料可以施用于修復(fù)件、骨或任何欲用在人體或動(dòng)物體中的基材的外表面或內(nèi)表面上,該涂料中包含顆粒材料。本發(fā)明的復(fù)合物可以用于礦化生物材料的體內(nèi)和體外修復(fù),包括但不局限于骨和牙科材料。本發(fā)明的生物材料可以用于同種異體移植物和自身移植物的生長。
本發(fā)明的包含磷酸八鈣的生物材料可以不含有或基本不含有任意前體透鈣磷石相。在該生物材料的磷酸鈣材料的總量中,該生物材料可以包含小于2重量%的透鈣磷石。
磷酸鈣材料可以包含或基本上由相純(phase pure)的磷酸八鈣或磷灰石組成。相純是指優(yōu)選含有至少98%,更優(yōu)選至少99%和最優(yōu)選至少99.5%的所需要的相(用X射線衍射測定)。備選地,根據(jù)生物材料所需要的性能,該生物材料可以包含磷酸八鈣和磷灰石的混合物。
本發(fā)明的包含透鈣磷石的材料可以用作制備生物材料的前體材料,或本身適合用作生物材料。
本發(fā)明的方法可以使用遵從下列順序的方法來進(jìn)行,可以整體地或部分地應(yīng)用該方法來制備膠原蛋白、一種或多種糖胺聚糖和一種或多種磷酸鈣組分的生物復(fù)合物。下列說明是以舉例的方式提供,適用于本發(fā)明的方法的任何方面。
I在酸性pH下膠原蛋白、糖胺聚糖(GAG)和磷酸鈣透鈣磷石的三元共沉淀進(jìn)行該步驟,以通過溶液沉淀同時(shí)形成復(fù)合物的三種(或三種以上)組分,和控制三種(或三種以上)各個(gè)相的比例。通過改變pH、溫度、老化時(shí)間、鈣離子濃度、磷離子濃度、膠原蛋白濃度和糖胺聚糖濃度中的一個(gè)或一個(gè)以上來實(shí)現(xiàn)對復(fù)合物的組成性能(具體是膠原蛋白∶糖胺聚糖∶CaP(磷酸鈣)的比例)的控制。pH可以維持恒定(例如使用緩沖液、pH電位滴定或其它方法)或使其變化??赡艿拇渭?污染物)相包括其它酸性磷酸鈣(例如三斜磷鈣石、磷酸氫鈣)和包括滴定的副產(chǎn)物和其它反應(yīng)物(例如磷酸銨、硝酸銨)的混合物。在該步驟中也可以加入輔助交聯(lián)(例如葡萄糖、核糖)或增加體內(nèi)響應(yīng)(例如生長因子、基因轉(zhuǎn)錄因子、硅、促尿鈉排泄肽)的添加劑。
II凈形狀的形成進(jìn)行該步驟以制備最終復(fù)合物形式的所需構(gòu)造,特別強(qiáng)調(diào)對孔結(jié)構(gòu)的控制。該技術(shù)的例子包括過濾和低溫干燥(產(chǎn)生致密顆粒形式)、冷凍干燥(產(chǎn)生開孔形式)、注塑成型(根據(jù)染料類型產(chǎn)生多種形狀)和冷壓(產(chǎn)生致密的丸狀形式)。
III初級交聯(lián)進(jìn)行該步驟優(yōu)選可以確保當(dāng)放在pH升高的溶液中時(shí),復(fù)合物的糖胺聚糖含量不會迅速流失,而且可以提高復(fù)合物的機(jī)械和降解性能。該技術(shù)的例子包括低溫物理技術(shù)(例如γ射線照射、紫外線照射、脫水加熱處理)、化學(xué)技術(shù)(例如用單糖的非酶糖基化、戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺、去甲二氫愈創(chuàng)木酸)或組合方法(例如同時(shí)非酶糖基化和γ射線照射)。在需要轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣時(shí)(即步驟IV中),在低于約37℃的溫度下有利地進(jìn)行初級交聯(lián),以防止透鈣磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式三斜磷鈣石,三斜磷鈣石是不易水解為磷酸八鈣的磷酸鈣。
IV水解可以進(jìn)行該步驟,以便從透鈣磷石將CaP相(在生理pH下具有高溶解度的相)部分地或完全地水解為磷酸八鈣和/或磷灰石(在生理pH下具有較低溶解度的相)和基本上除去任何可溶性污染相(例如硝酸銨、磷酸氫鈣)。在水解為磷酸八鈣(OCP)的情況中,在約6.65和約37℃溫度下將選定的pH有利地維持恒定約24~48小時(shí)(使用緩沖液、pH電位滴定或其它方法)。如步驟I的情況,在水解步驟(步驟IV)中也可以加入輔助交聯(lián)(例如葡萄糖、核糖)或增加體內(nèi)響應(yīng)(例如生長因子、基因轉(zhuǎn)錄因子、硅、促尿鈉排泄肽)的添加劑。
V次級交聯(lián)進(jìn)行該步驟以進(jìn)一步調(diào)整復(fù)合物的機(jī)械和降解性能??梢允褂蒙鲜霾襟EIII中列出的任何或全部交聯(lián)程序以實(shí)現(xiàn)次級交聯(lián)。
提供下列實(shí)施例和附圖以幫助進(jìn)一步理解本發(fā)明。不應(yīng)認(rèn)為實(shí)施例和附圖限定了本發(fā)明的范圍。實(shí)施例或附圖中描述的任何特征適用于以上說明的任何方面。
圖1是共沉淀后的復(fù)合物的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖2是三元共沉淀物的掃描電子顯微鏡(SEM)顯微照片;圖3是三元共沉淀物的透射電子顯微鏡(TEM)顯微照片;圖4表示在105℃和50毫托脫水加熱處理48小時(shí)后的復(fù)合物的X射線衍射譜圖,表明透鈣磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式三斜磷鈣石;圖5是設(shè)定離子濃度和硝酸鈣∶氫氧化鈣的比的組合,以維持pH=4.0;圖6表示確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為1∶1的三元共沉淀物漿體的pH 4.0下的合成條件;圖7是除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖8是CaP∶膠原蛋白+糖胺聚糖=1∶1的三元共沉淀物表面的二次電子(SE)和反向散射電子(BSE)照片;圖9表示EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖10表示EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37℃和pH 6.67下向磷酸八鈣轉(zhuǎn)化72小時(shí)后,形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷酸八鈣生物復(fù)合物后的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖11是設(shè)定離子濃度和硝酸鈣∶氫氧化鈣的比的組合,以維持pH=4.5;圖12表示確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為3∶1的三元共沉淀物漿體的pH 4.5下的合成條件;圖13表示除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖14表示EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖15表示EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37℃和8.50的pH下向磷灰石轉(zhuǎn)化72小時(shí)后,形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷灰石生物復(fù)合物的X射線衍射譜圖(Cu-Kα照射);圖16表示經(jīng)γ射線照射次級交聯(lián)后的EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/Ap三元共沉淀物的X射線衍射譜圖;圖17表示剛剛進(jìn)行三元共沉淀和干燥(步驟I和II)后的復(fù)合物的X射線衍射譜圖;圖18表示初級交聯(lián)(步驟III)后的共沉淀物顆粒的結(jié)構(gòu)的SEM顯微照片;圖19表示水解為磷酸八鈣的過程(步驟IV)的XRD譜圖;和圖20表示復(fù)合物的TEM圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1實(shí)施例1是上述合成方法的例子,僅僅進(jìn)行步驟I~I(xiàn)II。在室溫(20~25℃)和約3.2的pH(用氨水滴定來維持)下進(jìn)行三元共沉淀。在本實(shí)施例中,共沉淀物在37℃下干燥,通過脫水加熱處理進(jìn)行交聯(lián)。在本實(shí)施例中既不進(jìn)行CaP的水解轉(zhuǎn)化,也不進(jìn)行次級交聯(lián)。
材料膠原蛋白復(fù)原(reconstituted)的提取了胃蛋白酶的豬皮膠原蛋白(端膠原(atelocollagen));85%I型,15%III型;Japan Meat Packers(日本大阪)。
糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯;鈉鹽;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯)鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)2;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);(ii)硝酸鈣;Ca(NO3)2·4H2O;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);磷源磷酸H3PO4;BDH Laboratory Supplies(英國普爾(Poole))滴定劑氨水;NH3;BDH Laboratory Supplies(英國普爾)程序步驟I溶液A-在室溫下將Ca(OH)2溶解在0.48摩爾/升的H3PO4中至0.12摩爾/升的濃度,使用氨水將得到的溶液滴定至pH=3.2。
懸浮液B-將軟骨素-6-硫酸酯溶解在去離子水中至3.2g/L的濃度。然后在恒定攪拌下,以1.5的硝酸根∶氫氧根的摩爾比將Ca(NO3)2·4H2O和Ca(OH)2加到軟骨素硫酸酯溶液中,制備出總鈣濃度為2.4摩爾/升的懸浮液。-將0.144g的膠原蛋白加到20ml的溶液A中,使用均質(zhì)器混合至溶解。然后在恒定攪拌下將4ml的懸浮液B加到溶液A中。
-持續(xù)攪拌60分鐘,監(jiān)測pH以確保pH維持在3.15<pH<3.30的范圍中。然后使得到的漿體在室溫下老化24小時(shí)。
步驟II-使所述漿體在37℃下風(fēng)干5天,用去離子水洗滌剩余的三元共沉淀物,接著在37℃下再干燥24小時(shí)。
-所得到的三元共沉淀物的X射線衍射譜圖表示在圖1(Cu-K(α)照射)中,SEM照片表示在圖2中。
步驟III在105℃和50毫托的真空下脫水加熱處理(DHT)48小時(shí)使三元共沉淀物交聯(lián)。脫水加熱處理后的三元共沉淀物的TEM照片表示在圖3中。圖4表示脫水加熱處理后的三元共沉淀物的X射線衍射譜圖,表明透鈣磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式三斜磷鈣石。
實(shí)施例2實(shí)施例2是上述合成方法的例子,僅僅進(jìn)行步驟I~I(xiàn)V。在室溫和pH 4.0下進(jìn)行三元共沉淀。在本實(shí)施例中,通過仔細(xì)控制氫氧化鈣和硝酸鈣的濃度實(shí)現(xiàn)pH的控制,該方法也能控制三元共沉淀物中透鈣磷石與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比。然后將得到的三元共沉淀物冷凍至-20℃,放置在真空下,然后加熱使游離水(即冰)升華。使用1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺處理進(jìn)行初級交聯(lián)。然后通過在約37℃和6.67的pH下水解將得到的干燥的三元共沉淀物轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣。在本實(shí)施例中,不進(jìn)行次級交聯(lián)。
材料I型由牛腱溶解的酸,Integra Life Sciences Plainsboro,美國新澤西州糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯;鈉鹽;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯)鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)2;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);(ii)硝酸鈣;Ca(NO3)2·4H2O;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);磷源磷酸H3PO4;BDH Laboratory Supplies(英國普爾)滴定劑無交聯(lián)劑(i)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC);Sigma-AldrichInc(美國密蘇里州圣路易斯);(ii)N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS);Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯)程序步驟I-選擇透鈣磷石與膠原蛋白+糖胺聚糖的目標(biāo)質(zhì)量比為1∶1。
-在200ml的總反應(yīng)體積中,膠原蛋白+糖胺聚糖的濃度設(shè)定為21mg/ml。
-使用pH變量的經(jīng)驗(yàn)三維圖(在恒定的[Ca2+]與[P]反應(yīng)物離子比為1.0下制作),改變(i)離子濃度(即[Ca2+]=[H3PO4])和(ii)硝酸鈣∶氫氧化鈣的比,確認(rèn)pH恒定為4.0的點(diǎn)的軌跡。這表示在圖5中(設(shè)定離子濃度和硝酸鈣∶氫氧化鈣的比的組合,以維持pH=4.0)。
-將該點(diǎn)的軌跡疊加在具有相同的坐標(biāo)軸的透鈣磷石質(zhì)量產(chǎn)率的圖上,確認(rèn)它與21mg/ml的曲線的交點(diǎn),使得可以設(shè)定反應(yīng)物濃度,在該反應(yīng)物濃度下,在pH為4.0([Ca2+]=[H3PO4]=0.1383摩爾/升;Ca(NO3)2·4H2O∶Ca(OH)2=0.1356)時(shí),可以制備含有磷酸鈣(21mg/ml)與膠原蛋白+糖胺聚糖(21mg/ml)的質(zhì)量比為1∶1的三元共沉淀物漿體。見圖6確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為1∶1的三元共沉淀物漿體的pH 4.0下的合成條件。
-將3.8644g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4ml的0.1383摩爾/升的H3PO4中,使用配備直徑19mm的定子的均質(zhì)器在15000轉(zhuǎn)/分鐘下混合90分鐘,制備高粘度的膠原蛋白分散液。
-通過周期地振蕩來分散溶解糖胺聚糖,使0.3436g軟骨素-6-硫酸酯溶解在室溫下的14.3ml的0.1383摩爾/升的磷酸中,制備糖胺聚糖溶液。
-90分鐘后,在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的連續(xù)均質(zhì)下,將14.3ml糖胺聚糖溶液以約0.5ml/分鐘的速率加到攪拌中的膠原蛋白分散液中,所得到的高粘度膠原蛋白/糖胺聚糖分散液總共混合90分鐘。
-在混合90分鐘后,在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的恒定攪拌下,用30分鐘將1.804g的Ca(OH)2和0.780g的Ca(NO3)2·4H2O加到高粘度膠原蛋白/糖胺聚糖分散液中,制備膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物漿體,此后再向漿體中混入14.3ml的0.1383摩爾/升的磷酸。
-三元共沉淀物漿體的pH約為4.0。
-使三元共沉淀物漿體在25℃下停留48小時(shí)。
步驟II-將三元共沉淀物漿體放在-20℃的冷凍機(jī)中,使其固化過夜。
-然后從冷凍機(jī)中取出冷凍的漿體,放在約80毫托的真空中,使溫度升至室溫,這樣使冰從漿體中升華,使其進(jìn)行48小時(shí)。
-除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(α)照射)表示在圖7中,共沉淀物表面的SEM照片表示在圖8中(CaP∶膠原蛋白+糖胺聚糖=1∶1的三元共沉淀物表面的二次電子(SE)和反向散射電子(BSE)照片)。
步驟III-在完全除去游離水之后,使得到的1.25g的干三元共沉淀物在40ml的去離子水中水合20分鐘。
-將20ml的0.035摩爾/升的EDAC和0.014摩爾/升的NHS的溶液加到含有三元共沉淀物和去離子水的容器中,在緩和攪拌和室溫下使三元共沉淀物交聯(lián)2小時(shí)。
-除去EDAC溶液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三元共沉淀物,在溫和攪拌下在新鮮的PBS中,在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。
-在PBS中2小時(shí)后,用去離子水洗滌三元共沉淀物,在溫和攪拌下在37℃下培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘的間隔。
-然后將三元共沉淀物在37℃下干燥72小時(shí)。圖9表示EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(α)照射)。
步驟IV-將交聯(lián)的三元共沉淀物顆粒放在50ml 37℃的去離子水中,使用氨水將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.67。
-溫度和pH維持恒定48小時(shí),此后過濾出共沉淀物,在去離子水中洗滌,在37℃下風(fēng)干。
-轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣后的共沉淀物的X射線衍射譜圖表示在圖10中(EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37℃和pH 6.67下向磷酸八鈣轉(zhuǎn)化72小時(shí)后,形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷酸八鈣生物復(fù)合物,Cu-K(α)照射)。
實(shí)施例3實(shí)施例3是上述合成方法的例子,進(jìn)行步驟I~V。在室溫和約4.5的pH下進(jìn)行三元共沉淀。如在實(shí)施例2中,通過仔細(xì)控制氫氧化鈣和硝酸鈣濃度實(shí)現(xiàn)pH控制,不使用滴定劑。然后將得到的三元共沉淀物冷凍至-20℃,放置在真空下,然后加熱使游離水(即冰)升華。使用1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺處理進(jìn)行初級交聯(lián)。然后將得到的干燥的共沉淀物在pH 8.50和37℃下轉(zhuǎn)化為磷灰石。使用γ射線照射進(jìn)行次級交聯(lián)。
材料I型由牛腱溶解的酸,Integra Life Sciences Plainsboro,美國新澤西州糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯;鈉鹽;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯)鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)2;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);(ii)硝酸鈣;Ca(NO3)2·4H2O;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);磷源磷酸H3PO4;BDH Laboratory Supplies(英國普爾)滴定劑無交聯(lián)劑(i)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC);Sigma-AldrichInc(美國密蘇里州圣路易斯);(ii)N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS);Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯)程序步驟I-選擇透鈣磷石與膠原蛋白+糖胺聚糖的目標(biāo)質(zhì)量比為3∶1。
-在200ml的總反應(yīng)體積中,使膠原蛋白+糖胺聚糖的濃度為10mg/ml。
-使用pH變量的經(jīng)驗(yàn)三維圖(在恒定的[Ca2+]與[P]反應(yīng)物離子比為1.0下),改變(i)離子濃度(即[Ca2+]=[H3PO4])和(ii)硝酸鈣∶氫氧化鈣的比,確認(rèn)pH恒定為4.5的點(diǎn)的軌跡。這表示在圖11中(設(shè)定離子濃度和硝酸鈣∶氫氧化鈣的比的組合,以維持pH=4.5)。
-將該點(diǎn)的軌跡疊加在透鈣磷石質(zhì)量產(chǎn)率的圖上(具有相同的坐標(biāo)軸),確認(rèn)它與30mg/ml(即3倍于膠原蛋白+糖胺聚糖的濃度)的曲線的交點(diǎn),使得可以設(shè)定反應(yīng)物濃度,在該反應(yīng)物濃度下,在pH為4.5([Ca2+]=[H3PO4]=0.1768摩爾/升;Ca(NO3)2·4H2O∶Ca(OH)2=0.049)下,可以制備含有磷酸鈣(30mg/ml)與膠原蛋白+糖胺聚糖(10mg/ml)的質(zhì)量比為3∶1的三元共沉淀物漿體。這表示在圖12中確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為3∶1的三元共沉淀物漿體的pH 4.5下的合成條件。
-將1.837g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4ml的0.1768摩爾/升的H3PO4中,使用配備直徑19mm的定子的均質(zhì)器在15000轉(zhuǎn)/分鐘下混合90分鐘,制備膠原蛋白分散液。
-通過周期地振蕩分散溶解糖胺聚糖,使0.163g軟骨素-6-硫酸酯在室溫下溶解在14.3ml的0.1768摩爾/升的磷酸中,制備糖胺聚糖溶液。
-90分鐘后,在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的連續(xù)均質(zhì)下,將14.3ml糖胺聚糖溶液以約0.5ml/分鐘的速率加到混合的膠原蛋白分散液中,所得到的膠原蛋白/糖胺聚糖分散液總共混合90分鐘。
-在90分鐘的混合后,在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的恒定攪拌下,用30分鐘將2.498g的Ca(OH)2和0.380g的Ca(NO3)2·4H2O加到膠原蛋白/糖胺聚糖分散液中,制備膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物漿體,此后再向混合漿體中加入14.3ml的0.1768摩爾/升的磷酸。
-三元共沉淀物漿體的pH約為4.5。
-使三元共沉淀物漿體在25℃下停留48小時(shí)。
步驟II-將三元共沉淀物漿體放在-20℃的冷凍機(jī)中,使其冷凍過夜。
-然后從冷凍機(jī)取出冷凍的漿體,放在約80毫托的真空中,使溫度升至室溫,這樣使冰從漿體中升華,使其進(jìn)行48小時(shí)。除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(α)照射)表示在圖13中。
步驟III-在完全除去游離水之后,使得到的1.25g的干三元共沉淀物在40ml的去離子水中水合20分鐘。
-將20ml的0.018摩爾/升EDAC和0.007摩爾/升NHS的溶液加到含有三元共沉淀物和去離子水的容器中,在緩和攪拌和室溫下使三元共沉淀物交聯(lián)2小時(shí)。
-除去EDAC溶液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三元共沉淀物,在溫和攪拌下在新鮮的PBS中,在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。
-在PBS中2小時(shí)后,用去離子水洗滌三元共沉淀物,在溫和攪拌和37℃下培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘的間隔。
-然后將三元共沉淀物在37℃下干燥72小時(shí)。EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(α)照射)表示在圖14中。
步驟IV-將交聯(lián)的三元共沉淀物顆粒放在37℃的50ml的預(yù)先用透鈣磷石飽和的去離子水中,使用氨水將溶液的pH調(diào)節(jié)為8.50。
-維持溫度和pH恒定72小時(shí),此后過濾出共沉淀物,在去離子水中洗滌,在37℃下風(fēng)干。轉(zhuǎn)化為磷灰石后的共沉淀物的X射線衍射譜圖表示在圖15中(EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37℃和8.50的pH下向磷灰石轉(zhuǎn)化72小時(shí)后,形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷灰石生物復(fù)合物,Cu-K(α)照射)。
步驟V-將干燥的膠原蛋白/糖胺聚糖/Ap三元共沉淀物進(jìn)行32.1kGy劑量的γ射線照射。圖16表示γ射線照射后的X射線衍射譜圖(經(jīng)γ射線照射的次級交聯(lián)后的EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/Ap三元共沉淀物)。
實(shí)施例4材料膠原蛋白復(fù)原的提取了胃蛋白酶的豬皮膠原蛋白(端膠原);85%I型,15%III型;Japan Meat Packers(日本大阪)。
糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯;鈉鹽;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯)鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)2;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);(ii)硝酸鈣;Ca(NO3)2·4H2O;Sigma-Aldrich Inc(美國密蘇里州圣路易斯);磷源磷酸H3PO4;BDH Laboratory Supplies(英國普爾)滴定劑氨水;NH3;BDH Laboratory Supplies(英國普爾)程序步驟I-在室溫下將Ca(OH)2溶解在0.48摩爾/升的H3PO4中至0.12摩爾/升的濃度,制備出溶液A,將所得到的溶液滴定至pH為3.2。
-將軟骨素-6-硫酸酯溶解在去離子水中至3.2g/L的濃度,制備出懸浮液B。在恒定攪拌下,以1.5的硝酸根∶氫氧根的摩爾比將Ca(NO3)2·4H2O和Ca(OH)2加到軟骨素硫酸酯溶液中,制備總鈣濃度為2.4摩爾/升的懸浮液。
-將0.144g的膠原蛋白加到20ml的溶液A中,使用均質(zhì)器混合至溶解。然后在恒定攪拌下將4ml的懸浮液B加到溶液A中。持續(xù)攪拌60分鐘,監(jiān)測pH以確保pH維持在3.15<pH<3.30的范圍中。然后使所得到的漿體在室溫下老化24小時(shí)。
步驟II-使所述漿體在37℃下風(fēng)干5天,用去離子水洗滌剩余的三元共沉淀物,接著在37℃下再干燥24小時(shí)。
步驟III-將共沉淀物放在稀醋酸(pH=3.2)中,用30kGy的γ射線照射劑量照射。然后從溶液中除去交聯(lián)的沉淀物,洗滌,在37℃下風(fēng)干。
步驟IV-將交聯(lián)的共沉淀物顆粒放在37℃的50ml去離子水中,使用氨水將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.65。維持恒定溫度和pH 48小時(shí),此后過濾出共沉淀物,在去離子水中洗滌,在37℃下風(fēng)干。
步驟V-將交聯(lián)的水解的共沉淀物顆粒放在室溫的真空箱中,施加50毫托的真空度,然后將溫度升高至105℃。24小時(shí)后,將溫度降至室溫,釋放真空。
圖17表示剛剛進(jìn)行三元共沉淀和干燥(步驟I和II)后的復(fù)合物的X射線衍射譜圖。該譜圖證實(shí)主要存在的相是透鈣磷石。
圖18表示初級交聯(lián)(步驟III)后的共沉淀物顆粒的結(jié)構(gòu)的SEM顯微照片。值得注意的是顆粒在微觀結(jié)構(gòu)的均一性質(zhì)。
水解為磷酸八鈣的過程(步驟IV)表示在圖19的XRD譜圖中。在12.5°透鈣磷石峰強(qiáng)度逐漸減弱,在4.5°磷酸八鈣(OCP)的主峰增強(qiáng),這表明無機(jī)相用48小時(shí)轉(zhuǎn)化為OCP。
復(fù)合物的TEM圖表示在圖20中??梢钥闯?,分散在膠原蛋白/糖胺聚糖母體中的10~20nm的低縱橫比的磷酸鈣晶體呈無規(guī)分布。
本發(fā)明的復(fù)合生物材料可以用作可生物吸收的材料??梢灶A(yù)期,移植后,由該材料制備的構(gòu)件將完全吸收,僅僅留下健康的再生的組織,絲毫不留下移植物本身。
權(quán)利要求
1.一種制備包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、鈣源和磷源以及一種或多種糖胺聚糖的酸性水溶液;和從所述水溶液中一起沉淀出膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖以形成三元共沉淀物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述溶液具有2.5~6.5,更優(yōu)選2.5~5.5的pH。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其中所述溶液具有3~4.5的pH。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其中所述溶液具有3.8~4.2的pH。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述鈣源選自硝酸鈣、醋酸鈣、氯化鈣、碳酸鈣、烷氧基鈣、氫氧化鈣、硅酸鈣、硫酸鈣、葡萄糖酸鈣和肝素的鈣鹽中的一種或多種。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述磷源選自磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、二水合磷酸氫二鈉和磷酸三甲酯中的一種或多種。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述一種或多種糖胺聚糖選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸肝素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶液具有4~50℃的溫度。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶液具有15~40℃的溫度。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中在所述溶液中膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖總量的重量比為8∶1~30∶1。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶液包含鈣離子,膠原蛋白與鈣離子的重量比為1∶40~500∶1,優(yōu)選1∶40~250∶1,更優(yōu)選1∶13~5∶4。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中在所述共沉淀物中膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為10∶1~1∶100,優(yōu)選5∶1~1∶20。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶液包含鈣離子,在所述溶液中鈣離子的濃度為0.00025~1摩爾/升,優(yōu)選0.001~1摩爾/升。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶液包含磷酸根離子,在所述溶液中磷酸根離子的濃度為0.00025~1摩爾/升,優(yōu)選0.001~1摩爾/升。
15.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中在所述溶液中膠原蛋白的濃度為1.0~20g/L,更優(yōu)選1.0~10g/L。
16.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中在所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度為0.01~1.5g/L,更優(yōu)選0.01~1g/L。
17.一種制備包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料;和通過水解將復(fù)合材料中的至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣。
18.如權(quán)利要求17所述的方法,其中所述復(fù)合材料包含或基本上由以下物質(zhì)組成包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法,其中所述三元共沉淀物按照權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述的方法形成。
20.如權(quán)利要求17~19中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟包括使所述復(fù)合材料與水溶液接觸,所述水溶液的pH等于或大于磷酸八鈣比透鈣磷石在熱力學(xué)上更穩(wěn)定時(shí)的pH。
21.如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述水溶液具有6~8的pH。
22.如權(quán)利要求21所述的方法,其中所述水溶液具有6.3~7的pH。
23.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述水溶液具有約6.65的pH。
24.一種制備包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料;和通過水解將復(fù)合材料中的至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石。
25.如權(quán)利要求24所述的方法,其中所述復(fù)合材料包含或基本上由以下物質(zhì)組成包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。
26.如權(quán)利要求25所述的方法,其中所述三元共沉淀物按照權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述的方法形成。
27.如權(quán)利要求24~26中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述透鈣磷石水解為磷灰石的步驟包括使所述復(fù)合材料與水溶液接觸,所述水溶液的pH等于或大于磷灰石比透鈣磷石在熱力學(xué)上更穩(wěn)定時(shí)的pH。
28.如權(quán)利要求27所述的方法,其中所述水溶液具有6.65~9,優(yōu)選7~8.5的pH。
29.如權(quán)利要求17~28中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述透鈣磷石向磷酸八鈣和/或磷灰石的轉(zhuǎn)化在20~50℃的溫度下進(jìn)行,優(yōu)選30~40℃。
30.如權(quán)利要求29所述的方法,所述溫度為36~38℃。
31.如權(quán)利要求30所述的方法,所述溫度為約37℃。
32.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法進(jìn)一步包括以下步驟使復(fù)合材料或三元共沉淀物中的膠原蛋白和所述一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法,其中,如果至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石,則在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前使糖胺聚糖交聯(lián)。
34.如權(quán)利要求33所述的方法,其中,所述交聯(lián)通過下列方式中的一種或多種實(shí)現(xiàn)對三元共沉淀物進(jìn)行γ射線照射和/或紫外線照射;用例如葡萄糖、甘露糖、核糖等單糖和蔗糖進(jìn)行非酶糖基化;使該三元共沉淀物與戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺和/或去甲二氫愈創(chuàng)木酸接觸;和對三元共沉淀物進(jìn)行脫水加熱處理。
35.如權(quán)利要求32~34中任一項(xiàng)所述的方法,其中,如果至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石,則在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之后使膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)。
36.如權(quán)利要求35所述的方法,其中所述交聯(lián)通過下列方式中的一種或多種實(shí)現(xiàn)對三元共沉淀物進(jìn)行γ射線照射、紫外線照射或脫水處理;用例如葡萄糖、甘露糖、核糖等單糖和蔗糖進(jìn)行非酶糖基化;使該三元共沉淀物與戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺和/或去甲二氫愈創(chuàng)木酸中的一種或多種接觸。
37.如權(quán)利要求32~36中任一項(xiàng)所述的方法,其中在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前和之后,使膠原蛋白與所述一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)。
38.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法還包括以下步驟使所述復(fù)合生物材料成形為適合用作骨或牙科替代物的結(jié)構(gòu)。
39.如權(quán)利要求38所述的方法,其中所述復(fù)合材料使用選自過濾和低溫干燥、冷凍干燥、注塑成型和冷壓中的技術(shù)來成形。
40.一種用來轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣缮锊牧系那绑w材料,所述前體材料包含復(fù)合材料,所述復(fù)合材料包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖。
41.如權(quán)利要求40所述的前體材料,其中所述復(fù)合材料包含或基本上由以下物質(zhì)組成包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。
42.如權(quán)利要求41所述的前體材料,其中所述三元共沉淀物按照權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述的方法制備。
43.一種包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料,所述生物材料用權(quán)利要求1~39中任一項(xiàng)所述的方法得到。
44.一種包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料,所述生物材料用權(quán)利要求17~39中任一項(xiàng)所述的方法得到。
45.一種包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料,所述生物材料用權(quán)利要求24~39中任一項(xiàng)所述的方法得到。
46.一種包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料。
47.一種包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料。
48.一種如權(quán)利要求43~47中任一項(xiàng)所述的用作骨或牙科替代材料的復(fù)合生物材料。
49.一種包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物的復(fù)合生物材料。
50.如權(quán)利要求40~49中任一項(xiàng)所述的材料,其中所述膠原蛋白與所述一種或多種糖胺聚糖已被交聯(lián)。
51.如權(quán)利要求40~50中任一項(xiàng)所述的材料,其中所述膠原蛋白以5重量%~90重量%的量存在在所述材料中,優(yōu)選15重量%~60重量%。
52.如權(quán)利要求40~51中任一項(xiàng)所述的材料,其中所述一種或多種糖胺聚糖以0.01重量%~12重量%的量存在在所述材料中,優(yōu)選1重量%~5.5重量%。
53.如權(quán)利要求40~52中任一項(xiàng)所述的材料,其中,如果所述材料包含透鈣磷石,則膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為10∶1~1∶100,優(yōu)選5∶1~1∶20。
54.如權(quán)利要求40~52中任一項(xiàng)所述的材料,其中,如果所述材料包含磷酸八鈣,則膠原蛋白與磷酸八鈣的重量比為10∶1~1∶100,優(yōu)選5∶1~1∶20。
55.如權(quán)利要求40~54中任一項(xiàng)所述的材料,其中膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖總量的重量比為8∶1~30∶1。
56.一種包含一種或多種磷酸鈣材料的顆粒、膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖的生物材料,其中所述膠原蛋白和所述一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)形成母體,將所述磷酸鈣材料的顆粒分散在所述母體中,和所述磷酸鈣材料選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。
57.一種包含權(quán)利要求43~56中任一項(xiàng)所述材料的人工骨材料、骨移植物、骨嫁接物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固劑。
全文摘要
一種制備包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料的方法,所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、鈣源和磷源以及一種或多種糖胺聚糖的酸性水溶液;和從所述水溶液中一起沉淀出膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖以形成三元共沉淀物。
文檔編號A61L24/00GK1874797SQ200480032126
公開日2006年12月6日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者安德魯·林恩, 魯思·卡梅倫, 塞麗娜·貝斯特, 威廉·邦菲爾德 申請人:劍橋大學(xué)技術(shù)服務(wù)有限公司