專利名稱：甲狀腺激素類似物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物和衍生物，及其它的聚合物形式。同時還公開了這些化合物以及包含該化合物的藥用組合物的使用方法。本發(fā)明還涉及所述化合物的制備方法。
背景技術(shù)：
甲狀腺激素，L-甲狀腺素(T4)和L-三碘甲狀腺原氨酸(T3)，在脊椎動物體內(nèi)不同的組織當(dāng)中調(diào)節(jié)不同的生理過程。甲狀腺激素大多數(shù)的作用是通過它的受體(“TR”)介導(dǎo)的，該受體是活性配體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的核受體總科的組成之一。這個總科還包括類固醇激素，類維生素A和1，25-二羥維生素D3的受體。這些受體是調(diào)節(jié)特殊基因在不同組織中的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，也是應(yīng)用廣泛藥物的靶點，例如，他莫昔芬，一種部分雌激素受體拮抗劑。兩種不同的基因編碼有兩種不同的受體，受體α和受體β。這兩種受體經(jīng)常在不同組織中在不同程度上共同作用。但是許多甲狀腺激素并沒有區(qū)分這兩種受體，同時兩者具有類似的結(jié)合性。
基因替換的小鼠試驗表明受體β在聽覺系統(tǒng)的發(fā)展和腦下垂體中通過T3對甲狀腺激素刺激的負(fù)反饋中起到了一定作用，而受體α則調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)并產(chǎn)生熱量。受體拮抗劑的辨別將在未來的甲狀腺功能減退的治療方面起到重要作用。這些原子將會在甲狀腺激素受體水平上通過直接的拮抗迅速起效，使得患有甲狀腺功能減退需要手術(shù)的患者，心臟病患者，或者患有威脅生命的甲狀腺危象的患者都將有名顯的好轉(zhuǎn)。
因此，需要改進(jìn)對藥物治療有用的化合物，這些化合物通過作為甲狀腺激素受體的對碘氧基苯甲醚激動劑或拮抗劑起到選擇性地調(diào)節(jié)甲狀腺激素的作用。近期的研究集中在甲狀腺激素(T3/T4)拮抗劑作為具有潛力的治療劑和化學(xué)探針的設(shè)計和合成方面。同時，對擬甲狀腺化合物也需要進(jìn)一步改進(jìn)，這類化合物比自然存在的激素更容易獲得并且具有潛在的有用受體結(jié)合及活性。
估計美國有五百萬人倍受慢性頑癥心絞痛的折磨，每年有二十萬65歲以下的人死于“早發(fā)性缺血性心臟病”。盡管采用了藥物治療，許多人還是持續(xù)受到心肌梗塞和冠狀血管衰弱的折磨，這進(jìn)一步使透血管壁冠狀血管形成術(shù)或者冠狀動脈分流術(shù)成為需要。如果有一種方式能夠緩解心肌缺血就將加強冠狀側(cè)支的循環(huán)。
目前已經(jīng)建立了在心肌梗塞的急性階段冠狀支脈的可見冠狀動脈內(nèi)凝血質(zhì)治療的解剖學(xué)顯示和肌酸激酶活性曲線，梗塞的大小和動脈瘤的形成之間的聯(lián)系。這些研究體現(xiàn)出了與側(cè)支不可見的病人相比，對于冠狀梗阻的心臟側(cè)支保護(hù)的地位，表示出更小的梗塞，更少的動脈瘤的形成，以及改善的心室的作用。當(dāng)心臟肌細(xì)胞局部缺血，側(cè)支就會通過內(nèi)皮和光滑肌肉細(xì)胞的基因復(fù)制和分裂積極地生長。一旦局部缺血的情況發(fā)生，這些因素就會變得有活性并使受體有效的占據(jù)，在與外生的肝素接觸后就會刺激血管的形成。不幸的是，這樣的血管形成的“自然”過程對于所有患者的冠狀動脈疾病的局部缺血的治療是不利的。
在局部缺血的情況下，腺苷通過三磷酸腺苷的分解而被釋放。腺苷參與許多心臟防護(hù)的生物性為。腺苷在諸如心動過緩和血管舒張的血液動力的變化中起到一定的作用，并且腺苷還對于諸如預(yù)先調(diào)節(jié)和再灌注損傷的減少等無關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象起到一定作用(Ely and Beme，Circulation，85893(1992))。
血管的形成是新的血管從已存在的血管中的進(jìn)一步發(fā)展(Mousa，S.A.，In Angiogenesis Inhibitors and StimulatorsPotentialTherapeutic Implications，Landes Bioscience，Georgetown，Texas；Chapter 1，(2000))。從生理學(xué)方面講，血管的形成確保了成熟器官的正常生長，為子宮對卵細(xì)胞的培育做好準(zhǔn)備，并且在傷口的愈合方面也起到重要作用。在胚胎形成時或者正常的和病理的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成依賴于生長因子以及細(xì)胞和細(xì)胞外部基質(zhì)的相互作用(Breier et al.，Trends in Cell Biology 6454-456(1996)；Folkman，Nature Medicine 127-31(1995)；Risau，Nature 386671-674(1997).血管在胚胎形成時的出現(xiàn)是通過兩個過程血管的發(fā)生和血管的形成(Blood et al.，Bioch.Biopys.Acta 103289-118(1990).血管的形成是一個通過促/抗血管形成因素平衡作用控制下的多步驟過程。后一過程涉及內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的增殖和組織與管狀結(jié)構(gòu)。生長因子，諸如纖維生長因子-2和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子是促內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的關(guān)鍵因素。
血管的形成控制是一個復(fù)雜過程，涉及血管生長因素的局部釋放(P Carmeliet，Ann NY Acad Sci 902249-260，2000)，外部細(xì)胞劑質(zhì)，分子的接合以及代謝因子(RJ Tomanek，GC SchattemanAnat Rnat Rec 261126-135，2000)。血管中的代謝力也是作用因素之一(O Hudicka，Molec Cell Biochem 14757-68，1995)。涉及在新的血管生長中的內(nèi)源性生長因子的主要物質(zhì)是纖維生長因子(FGF)類和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)(G Page，Ann NY Acad Sci 902187-200，2000)。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK；ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)串連與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的基因表達(dá)和控制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)。
內(nèi)在腺苷可以促進(jìn)冠狀血流量來回應(yīng)增加的心肌耗氧并且以此來調(diào)節(jié)冠狀血流量的儲存(Ethier et al.，Am.J.Physiol.，H131(1993))表明對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增加腺苷的生理的濃度很可能經(jīng)過表面受體刺激了增殖。腺苷可能成為人類內(nèi)皮細(xì)胞的生長和形成的因素。腺苷呈現(xiàn)出對于血流梗阻-諸如冠狀血管疾病(“CAD”)-的病人的保護(hù)性，但是血管的然生長率對于疾病的治療是不利的。因此，加強和加快身體自然的血管形成的潛力對患有冠狀血管疾病的病人是有好處的。
同樣地，隨著增加的各種環(huán)氧化酶2(CoX2)抑止劑的使用，傷口的愈合在許多發(fā)展中國家成為一個重要的問題，糖尿病人的傷口愈合能力受損并產(chǎn)生了長期的紊亂性炎癥。血管的形成對于傷口的愈合是必要的，因為新的組織要提供營養(yǎng)給活性細(xì)胞，促進(jìn)肉芽組織的形成和對殘屑的清理。大約60％的肉芽組織是由血管形成的，它同時提供所需要的養(yǎng)分以刺激修復(fù)和組織生長。已有文獻(xiàn)記載，當(dāng)抑止血管形成的因子抑止傷口愈合時，血管形成的因子出現(xiàn)在傷口的分泌液當(dāng)中并促進(jìn)傷口的愈合。傷口血管的形成是一個復(fù)雜的多步驟的過程。盡管已經(jīng)有關(guān)于血管形成因子的詳細(xì)的記載，但是對于這些因子的來源的解釋并沒有取得多少進(jìn)展，這些調(diào)節(jié)活動涉及傷口的血管形成以及血管形成刺激對于促進(jìn)愈合在診斷中的應(yīng)用。關(guān)于傷口血管的形成和愈合更難以理解的是所涉及的愈合的機理和介質(zhì)，這可能據(jù)傷口的深度，類型(燒傷，創(chuàng)傷，等)，以及傷口的部位(肌肉，皮膚，骨頭，等)的不同而不同。傷者的狀態(tài)和年齡(糖尿病患者，半身麻痹患者，用類固醇藥物治療的患者，老年人或者嬰兒，等)同樣可以決定愈合率和血管形成因子的反應(yīng)。患者的性別和激素水平(絕經(jīng)前后，等)也會影響愈合的機制和反應(yīng)。對于受損傷口的治療尤其影響老年人和美國14,000,00糖尿病患者當(dāng)中的許多人。因為血管形成能力的下降經(jīng)常是這些患病人群傷口愈合問題的成因，因此，對于血管形成因子在傷口愈合當(dāng)中重要性的認(rèn)識以及促進(jìn)它在對阻止和/或采用適當(dāng)?shù)姆绞綄κ軗p傷口進(jìn)行治療的診斷中的應(yīng)用是很重要的。
因此，就需要一種有效的治療方式，它通過血管生成因子作為主要的或者輔助的因素促進(jìn)傷口的治療，冠狀血管的形成，或者其他與血管形成有關(guān)的障礙，同時具有較小的副作用。這種治療方式對于患有血管障礙，如心肌梗塞，中風(fēng)或者動脈末梢血管疾病的患者尤其有效，并且可以預(yù)防性的用于冠狀循環(huán)較弱的患者，因為(冠狀循環(huán)較弱)使者些患者置于局部缺血和心肌梗塞的高風(fēng)險之中。
有趣的是血管的形成同樣發(fā)生在其他的情況當(dāng)中，但是這些情況都是不被希望的，包括固體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；硬皮癥；和三種通常會致盲的疾病——糖尿病性視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織增生癥和新生血管性青光眼。事實上，眼部疾病通常由于血管化的并發(fā)癥引起。傷口血管和腫瘤血管的形成過程在許多特征上是共同的。因此，在諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病或最初的發(fā)生或者腫瘤的轉(zhuǎn)移的情況下，血管的形成就是不被希望的。所以，這些情況下就需要采取方式抑止血管形成因子的影響。
發(fā)明簡述本發(fā)明部分基于甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，和它的聚合物形式的發(fā)現(xiàn)，它們具有作用于細(xì)胞膜而不受核的影響并且促血管形成特性。同時，這些甲狀腺激素類似物和聚合物形式(即血管形成因子)能夠用于治療多種障礙。同樣地，本發(fā)明還基于對于甲狀腺激素類似物具有抑止促血管形成作用的發(fā)現(xiàn)，這種作用也能夠用于治療各種障礙。
由此，一方面本發(fā)明的特征在于通過促進(jìn)血管形成治療可接受狀況的方法，通過給予病患一定量的對于促進(jìn)血管形成有效的甲狀腺激素的聚合物形式，或者它的類似物。這種通過促血管形成來治療的可接受狀況的例子包括血管閉塞疾病，冠狀動脈疾病，勃起機能障礙，心肌梗塞，局部缺血，中風(fēng)，外周動脈末梢血管障礙以及創(chuàng)傷。
甲狀腺激素類似物的例子包括L-三碘甲狀腺原氨酸(T3)，L-甲狀腺素(T4)，3，5-二甲基-4-(4’-羥基-3’-異丙基苯甲基)-苯氧基乙酸(GC-1)，或者二碘甲狀腺丙酸(DITPA)，四碘甲腺乙酸(TETRAC)，以及三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)。另外的類似物見圖20，表A-D。這些類似物可以與聚乙烯醇，丙烯酸乙烯共聚物，聚乳酸，或者瓊脂糖結(jié)合。這種結(jié)合是通過共價鍵或者非共價鍵實現(xiàn)的。
在一種具體實施中，甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式可以通過注射，口服，腸道給藥，或者局部方式，或者聯(lián)合方式給藥。注射給藥包括例如，皮下注射，腹膜內(nèi)注射，肌肉注射，或者通過導(dǎo)管靜脈注射的方式。局部的給藥方式可以包括如，繃帶。
在另一種具體實施中，甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式可以被包裹或者混合在微粒，脂質(zhì)體，或者聚合物當(dāng)中。聚合物包括例如，聚乙醇酸交酯，多乳酸化合物，或者它的共聚物。微?；蛘咧|(zhì)體的尺寸小于200納米，并且可以通過一種或多種注射途徑給藥，或者其他的給藥方式。在另一種具體實施當(dāng)中，這種微粒或脂質(zhì)體可以被置于周圍局部缺血的毛細(xì)血管床中，或者通過導(dǎo)管運用于血管內(nèi)部。
本發(fā)明的甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式還可以與一種或多種具有生物活性的成分聯(lián)合給藥，包括例如，生長因子，血管擴張劑，抗凝劑，抗病毒劑，抗菌劑，抗炎劑，免疫抑制劑，鎮(zhèn)痛藥，血管化因子，或者細(xì)胞黏附分子，或者它的混合物。在一種具體的實施中，甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式以先于或者后于一種或多種具有生物活性成分的彈丸注射的方式給藥。
生長因子可以包括，例如，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)，基本成纖維細(xì)胞生長因子，血管內(nèi)皮生長因子，上皮細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子，血小板衍生的生長因子，以及血管滲透因子。血管擴張劑包括，例如，腺苷，腺苷衍生物，或者它們的混合物?？鼓齽┌ǖ幌抻?，肝素，肝素衍生物，抑止因子Xa，抗凝血酶，阿斯匹林，氯吡格雷，或者它們的混合物。
本發(fā)明的另一個方面，提供了促血管形成的方式，這種方式沿著一種藥物裝置或者在該裝置周圍用甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式對裝置包衣，然后將裝置插入病人體內(nèi)。包衣的過程可進(jìn)一步包括用一種或多種具有生物活性的成分對裝置的包衣，例如，但不限于，一種生長因子，一種血管舒張劑，一種抗凝劑，或者它們的混合物。能夠用甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式包衣的藥物裝置的例子包括支架，導(dǎo)管，插管或者電極。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過給予病患一定量的對于抑止血管形成有效的抑止血管形成因子來治療可接受狀況的方法。
通過抑止血管形成來治療的可接受狀況包括，但并不限于，初期的或者轉(zhuǎn)移的腫瘤，糖尿病性視網(wǎng)膜病，以及與此有關(guān)的狀況。本發(fā)明還提供了用血管形成抑止劑來抑止血管形成的例子，包括，但不限于，四碘甲腺乙酸(TETRAC)，三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)，單克隆抗體LM609，XT199或者它們的混合物。這種血管形成抑止劑能夠作用于細(xì)胞表面來抑止促血管形成因子。
在一個具體的實施中，血管形成抑止劑通過注射，口服，腸道，或者局部的方式，或者聯(lián)合的方式給藥。在另一個具體的實施當(dāng)中，血管形成抑止劑能與一種或多種血管形成抑止劑或者化學(xué)治療藥物聯(lián)合給藥。
本發(fā)明還提供了包括甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物的連接體組成的混合物(即血管形成因子)。根據(jù)聚合物的不同，可以通過共價鍵或非共價鍵形成連接。例如，共價鍵可以是酯鍵或者酐鍵。本發(fā)明提供的甲狀腺激素類似物的例子包括L-甲狀腺素(T4)，L-三碘甲狀腺原氨酸(T3)，，3，5-二甲基-4-(4’-羥基-3’-異丙基苯甲基)-苯氧基乙酸(GC-1)，或者二碘甲狀腺丙酸(DITPA)。在一個具體的實施中，聚合物可以包括，但并不受此限制，聚乙烯醇，丙烯酸乙烯共聚物，聚乳酸，或者瓊脂糖。
另一方面，根據(jù)在藥學(xué)可接受的載體方面的當(dāng)前發(fā)明，本發(fā)明提供了包括血管形成因子在內(nèi)的藥物制劑。在一個具體實施當(dāng)中，藥物制劑還包括一種或多種藥學(xué)可接受的輔料。
根據(jù)現(xiàn)有發(fā)明，本發(fā)明的藥物制劑可以被包囊在脂質(zhì)體，微囊或者聚合物當(dāng)中。脂質(zhì)體或者微囊的尺寸小于200納米。根據(jù)本發(fā)明的任何藥物制劑都可以通過注射，口服，腸道，局部的或者聯(lián)合的方式給藥。在另一個具體的實施當(dāng)中，可以采用一種或多種生物活性成分聯(lián)合給藥，活性成分包括但不限于，生長因子，血管擴張劑，抗凝劑，或者它們的混合物。
關(guān)于本發(fā)明具體實施的內(nèi)容將在下面詳細(xì)描述。通過任何相似或相同描述的方法和物質(zhì)均可以被本發(fā)明實施或使用，優(yōu)選的方法和物質(zhì)也會被描述。其他的特征，客體，和本發(fā)明的益處將在權(quán)利要求和具體的描述當(dāng)中體現(xiàn)。在說明書和權(quán)利要求當(dāng)中，除非上下文明確指明，否則單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)含義。除非另有限定，所有的技術(shù)和科學(xué)名詞具有與作為通常的理解相同的含義。說明書中引用的全部的專利和出版物均在整體作為參考。
附圖簡述

圖1，L-T4和L-T3在雞細(xì)胞粘著分子試驗中血管生成的結(jié)果。
A，對照樣品加入PBS同時附加的樣品加入1nMT3或0.1μmol/L三天。兩種激素在3個試驗的典型的影像中都引起血液分支的增加。B，列表顯示標(biāo)準(zhǔn)誤的新的分支在3個試驗期間從現(xiàn)有血液中的形成，每一單位包括9個CAM測定。集中顯示T3和T4引起了相似的效果(在分支的形成中1.9-折層和2.5-折層分別增加)。**P＜0.001通過方差分析激素治療與采用PBS治療的CAM樣本比較。
圖2，通過T4和瓊脂糖-T4(T4-ag)的血管形成的四碘甲腺乙酸抑止刺激。A，具有代表性的0.1μmol/LT4三天的CAM樣本中顯示A2.5折層在血液分支結(jié)構(gòu)中增加。在3個類似的試驗中顯示2.3折層增加。激素的作用被四碘甲腺乙酸(0.1μmol/L)抑止，一種T4的類似物顯示出了抑止T4細(xì)胞膜的作用。13四碘甲腺乙酸的單獨使用不能夠刺激血管的形成(C)。B，T4-ag(0.1μmol/L)刺激血管形成的2.3-折層(在試驗3中的2.9-折層)的作用同樣被四碘甲腺乙酸阻斷。C，簡述試驗3trtrac，T4-ag和T4在CAM試驗結(jié)果中的作用測定。數(shù)據(jù)(標(biāo)準(zhǔn)誤)來源于10個對映于3個試驗的試驗條件的影像。**P＜0.001通過方差分析T4治療和瓊脂糖-T4治療樣本與采用PBS對照組樣本的比較。
圖3，比較FGF2和T4的促血管形成作用。A，前后排列的次于最大濃度的T4(0.05μmol/L)和FGF2(0.5μmol/L)的CAM分析，以及相等水平血管形成的FGF2(1μmol/L不含T4)。B，3個試驗，同A，測定FGF2和T4在CAM分析(標(biāo)準(zhǔn)誤)中作用的結(jié)果簡述。*P＜0.05；**P＜0.001，治療樣本結(jié)果與3個試驗中PBS對照組樣本的結(jié)果比較。
圖4，抗-FGF2在由T4或外生性FGF2引起的血管形成中的作用。A，F(xiàn)GF2引起了一個在試驗3的CAM模型中血管形成的2-折層的增加，一種通過FGF2(8μg)抗體(ab)的抑止作用。T4同樣刺激血管形成的1.5-折層，這一作用同樣通過FGF2抗體被阻斷，顯示出在CAM模型中甲狀腺激素的作用是通過FGF2的一個自分泌/旁分泌作用作為介導(dǎo)，因為T4和T3引起了在CAM模型(表1)中FGF2從細(xì)胞中的釋放。之前已顯示非特異性的免疫球蛋白G抗體在CAM分析當(dāng)中并無血管形成的作用。B，CAM試驗3的結(jié)果簡述，其研究FGF2-抗體在FGF2或者T4的出現(xiàn)中的作用。*P＜0.01；**P＜0.001，在3個試驗的甲狀腺激素和FGF2在血管形成中的作用以及FGF2在抗體出現(xiàn)作用中的消耗的研究當(dāng)中顯示出的顯著影響。
圖5，PD 98059，一種促分裂原活化蛋白激酶(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2)信號傳導(dǎo)串連抑止劑，關(guān)于血管形成包括T4，T3，和FGF2。A，T4(0.1μmol/L)和T3(1nmol/L)共同的血管形成刺激被PD 98059(3μmol/L)完全抑止。B，通過FGF2(0.1μmol/L)誘導(dǎo)的血管形成也被PD 98059抑止，結(jié)果表明生長因子的作用也是依靠ERK1/2途徑的激活作用。上下文的試驗涉及T4-瓊脂糖(T4-ag)和四碘甲腺乙酸(圖2)顯示T4的促血管形成作用始于細(xì)胞膜，顯示于A和B中的MARK在甲狀腺激素的促血管形成作用結(jié)果有兩種ERK1/2傳導(dǎo)激素的早期信號，其導(dǎo)致FGF2的產(chǎn)生并且傳導(dǎo)FGF2隨后的血管形成方面的作用。C，簡述3個試驗的結(jié)果，以A和B為代表，顯示了PD 98059對于T4的作用以及FGF2在CAM模型中的的影響。
*P＜0.01；**P＜0.001，表明3個試驗的方差分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
圖6，在細(xì)胞體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞中，T4和FGF2激活促分裂原活化蛋白激酶。細(xì)胞于M199的0.25％激素-衰竭的血清制備，同時給予T4(0.1μmol/L)15分鐘到6個小時。細(xì)胞被采集同時核的部分按照前述方法制備。核蛋白質(zhì)，通過凝膠電泳(法)分離，被磷酸化作用的MAPK(分別為pERK1和pERK2，44和42kDa)抗體免疫印跡，隨后通過第二抗體連接到一個發(fā)光探測系統(tǒng)。核部分的Aβ-肌纖蛋白免疫印跡在本圖的各個部分作為一種凝膠填充物對照。每個免疫印跡代表3個試驗。A，T4引起增加的磷酸化以及ERK1/2在ECV304細(xì)胞中的易位。這一作用在30分鐘內(nèi)發(fā)生，雖然該作用可以維持≥6小時。B，ECV304細(xì)胞經(jīng)ERK1/2活性抑止劑PD 98059(PD；30μmol/L)或者給予PCK抑止劑CGP41251(CGP；30μmol/L)30分鐘，之后在細(xì)胞樣本中加入10-7M T4到15分鐘。細(xì)胞核被收集，這一典型的試驗顯示增加的ERK1/2通過T4(電泳泳道4)的磷酸化(活化的)，它被兩種抑止劑(電泳泳道5和6)阻塞，該結(jié)果表明PKC的活性是一種通過內(nèi)皮細(xì)胞對MAPK活性的必需品。C，ECV304細(xì)胞經(jīng)T4(10-7mol/L)，F(xiàn)GF2(10ng/mL)，或者共同給予此兩種試劑15分鐘。圖表顯示pERK1/2在核中與甲狀腺激素或者生長因子累積，該兩種試劑作用并加強了核pERK1/2的累積。
圖7，T4在ECV304表皮細(xì)胞中增加FGF2互補DNA的累積。對細(xì)胞給予細(xì)胞隔離的T4(10-7mol/L)和FGF2和GAPDHcDNAs6到48小時。頂點顯示FGF2cDNA的水平對于GAPDHcDNA的含量變化是適當(dāng)?shù)?，最低點所示的，以及合適的FGF2水平在曲線圖(平均標(biāo)準(zhǔn)誤；n＝2試驗)的下面被說明。在所有時間點上，由細(xì)胞提取給予T4的RNA FGF2轉(zhuǎn)錄物都有較大增加。*P＜0.05；**P＜0.01，顯示在每個時間點的值與對照組值的方差分析比較。
圖8，7日雞胚胎腫瘤生長模型。說明腫瘤移植的雞絨(毛)膜尿囊膜模型。
圖9，T4刺激3D創(chuàng)傷愈合。根據(jù)3D創(chuàng)傷愈合分析的描述，人類皮膚成纖維細(xì)胞的T4和對照組的圖片。
圖10，T4劑量依存性增加創(chuàng)傷愈合，三天。圖表顯示，T4在劑量依存性方法中增加創(chuàng)傷的愈合(通過遷出細(xì)胞測量)，其濃度在0.1μM和1.0μM之間。相同的增加在T4濃度在1.0μM和3.0μM之間時并沒有出現(xiàn)。
圖11，未標(biāo)記的T4和T3I-125-T4結(jié)合對純化的抗抑郁藥的影響。未標(biāo)記的T4(10-4M至10-11M)或者T3(10-4M至10-18M)被加入純化的αVβ3抗抑郁藥當(dāng)中(2μg/樣本)并在室溫下培育30分鐘。2微居里I-125標(biāo)記的T4被加入每一個樣本當(dāng)中。該樣本在室溫下培育20分鐘，與干填充物混合，在4℃，45Ma，5％天然凝膠中混合24小時。下列的電泳，凝膠被包裹在塑料包裝當(dāng)中并且包薄膜。未標(biāo)記的T4在10-11M至10-7M范圍內(nèi)，I-125-T4結(jié)合對純化的αVβ3無影響，但是未標(biāo)記的T4在濃度為10-6M在一種劑量依賴性的方法中產(chǎn)生競合。與integrin結(jié)合的熱的T4幾乎完全被10-4M未標(biāo)記的T4替換。T3對于與T4競合結(jié)合αVβ3的作用較小，T3在10-6M，10-5M，10-4M濃度下本別減少11％，16％和28％。
圖12，含肽四碘甲腺乙酸和RGD，但非含肽RGE與T4競合結(jié)合純化的αVβ3。A)加入到純化的αVβ3中的TETRAC在劑量依賴性方法中減小了與integrin結(jié)合的I-125-標(biāo)記的T4。10-8M四碘甲腺乙酸對于與熱的T4競合結(jié)合intergrin是無效的。T4和αVβ3的聯(lián)合由于10-7M四碘甲腺乙酸的出現(xiàn)減小38％，由于10-5M四碘甲腺乙酸的出現(xiàn)減小90％。加入10-5MRGD肽與T4競合結(jié)合αVβ3。采用10-5M和10-4M RGE肽，作為RGD肽的對照組，不能較小熱的T4與純化的αVβ3的結(jié)合。B)代表四碘甲腺乙酸和RGD的數(shù)據(jù)的圖形表示來自于組A。數(shù)據(jù)點代表3個分離試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖13，單克隆抗體LM609在T4與αVβ3結(jié)合方面的作用。A)LM609在指示濃度下加入αVβ3。每個樣本1μg LM609減小52％的與integrin結(jié)合的I-125-標(biāo)記的T4。與integrin結(jié)合的T4的最大抑止作用是當(dāng)每個樣本2μg濃度LM609時達(dá)到的，并且抗體濃度達(dá)到8μg時這種作用將被維持。作為抗體特異性的對照組，8μg/樣本Cox-2mAB和10μg/樣本IgG先于T4被加入αVβ3。B)數(shù)據(jù)的圖形表示來自于組A。數(shù)據(jù)點代表3個分離試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖14，RGD，RGE，TETRAC和mAB LM609在T4減小MAPK活性方面的作用。A)對CV-1細(xì)胞(50-70％融合)給予10-7M T4(10-7M總濃度，10-10M游離濃度)30分鐘。被選取的樣本在加入T4之前給予指示濃度的含肽RGD，含肽RGE，tetrac，或LM609。核蛋白質(zhì)被SDS-PAGE分離出來并且通過抗磷酸基-MAPK(pERK1/2)a抗體免疫印記。pERK1/2的核累積在給予10-6M或更高RGD肽的樣本中減小，但是在給予10-4M RGD的樣本中并沒有明顯改變。pERK1/2的累積在給予10-6Mtetrac的CV1細(xì)胞中減小76％，但是10-5M或更高濃度的tetrac減少的pERK1/2的核累積與未處理的對照樣品相似。αVβ3的單克隆抗體減小了具有活性的MAPK在核中的累積，當(dāng)它被用于1μg/ml濃度的CV1培養(yǎng)時。B)RGD，RGE和tetrac的數(shù)據(jù)的圖形表示在組A中顯示。數(shù)據(jù)點代表3個分離試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖15，siRNA在αV和β3在T4減小MAPK活性方面的作用。CV1細(xì)胞同siRNA(終濃度100nM)被轉(zhuǎn)染到αV，β3或αV和β3。轉(zhuǎn)染兩天后，對細(xì)胞給予10-7MT4。A)RT-PCR來自于用于證明每一個siRNA特異性和官能團(tuán)的轉(zhuǎn)染組分離出來的RNA。B)來自于每一個轉(zhuǎn)染的核蛋白質(zhì)被分離并且屬于SDS-PAGE。
圖16，在CAM模型中，αVβ3mAB(LM609)在T4-刺激血管形成方面的抑止作用。A)在樣本中加入PBS，T4(0.1μM)，或T4與10mg/mlLM609三天。T4的血管形成刺激實際上通過αVβ3單克隆抗體LM609的加入受到抑止。B)列表顯示在試驗階段形成于現(xiàn)有血液的新的分支形式的平均標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)來源于3個分離的試驗，每一個包含9個樣本。C，D)通過T4或FGF2的血管形成刺激同樣通過αVβ3單克隆抗體LM609或XT199的加入受到抑止。
圖17，甲狀腺激素類似物的聚合物連接-通過使用聚乙烯醇酯鍵連接。在這一制備當(dāng)中商業(yè)可獲得的乙烯醇(或相關(guān)的共聚物)能夠通過給予甲狀腺激素類似物的?；缺货セ?，即酰基氯形式。鹽酸鹽通過加入的三乙胺被中和，其中在甲狀腺激素酯聚合物的不同類似物形式的沉淀物上的三乙胺鹽酸化物可以被水沖掉。酯鍵與聚合物的連接可以經(jīng)活體內(nèi)的水解釋放具有活性的促血管形成的甲狀腺激素類似物。
圖18，甲狀腺激素類似物的聚合組分-通過使用丙烯酸乙烯共聚物酐鍵的連接體。與之前的聚合物的共價連接相似，但是此時是通過一個衍生于乳酸共聚物作用的酐鍵連接。這一酐的連接同樣易于在活體中水解從而釋放出甲狀腺激素類似物。水解的酸的中和作用通過三乙胺的作用完成，之后用水對沉淀的聚酐聚合物的沖洗去除了三乙胺鹽酸化物的副產(chǎn)品。這一作用將導(dǎo)致甲狀腺激素類似物乳酸共聚物+三乙胺的形成。在活體的水解作用下，甲狀腺激素類似物將被隨時間釋放，使得乳酸乙烯共聚物能夠被控制。
圖19，甲狀腺激素類似物的聚合組分-形成于聚乳酸聚合體中。多聚乳酸經(jīng)過活體中的水解作用成為乳酸單體同時作為藥物在人體遞送體系中的工具被利用。與前兩種共價方式-甲狀腺激素類似物通過化學(xué)鍵與聚合物連接-不同的是，它是通過非共價的方式連接甲狀腺激素類似物與PLA聚合物串。這種作用將致使包含PLA串的甲狀腺激素類似物在水中的形式。過濾和水沖將使包含PLA串的甲狀腺激素類似物在活體中的水解作用下產(chǎn)生甲狀腺激素正型乳酸的受控的水平。
圖20，甲狀腺激素類似物能夠與不同的聚合物連接。A-D顯示替換需要獲得不同的甲狀腺激素類似物，這些類似物可以連接以形成本發(fā)明的甲狀腺激素類似物的聚合形式。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征和其他詳情將通過參考附圖和被權(quán)利要求指出的部分被進(jìn)一步描述。方便起見，在這里列出說明書、實施例和權(quán)利要求書所使用的術(shù)語。如無其他定義，在此使用的技術(shù)和科技術(shù)語具有與所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常的理解相同的含義。
術(shù)語“血管形成因子”包括任何單獨或者與其他物質(zhì)結(jié)合加速或促進(jìn)血管形成的化合物或物質(zhì)。包括但不限于，T3，T4，或者T4-瓊脂糖，聚合形式的T3，T4的類似物，3，5-二甲基-4-(4’-羥基-3’-異丙基苯甲基)-苯氧基乙酸(GC-1)，或者二碘甲狀腺丙酸(DITPA)。與此相對，術(shù)語“血管形成抑止劑”或“抗血管形成的抑止劑”包括任何單獨或者與其他物質(zhì)結(jié)合抑止或阻礙血管形成的化合物或物質(zhì)。包括但不限于，四碘甲腺乙酸(TETRAC)，三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)，XT199和單克隆抗體LM609。
術(shù)語“心肌缺血”是指由于心臟血管能力減弱引起的對心臟肌肉的供血不足。術(shù)語“冠狀疾病”是指由于心肌功能和冠狀血管供血能力之間失衡引起的心臟疾病或障礙?；加刑厥獾墓跔罴膊?障礙，包括心肌缺血，心絞痛，冠狀動脈瘤，冠狀血栓癥，冠狀血管痙攣，冠狀動脈疾病，冠狀心臟病，冠狀閉塞和冠狀狹窄的病人可以用本發(fā)明所述的組合物和方法來治療。
術(shù)語“外周血管閉塞癥”(也稱作外周動脈閉塞癥)是一種動脈疾病-涉及頸動脈或者股動脈的阻塞，包括髂動脈。股動脈的阻塞引起疼痛和行動受限。一種特殊的外周血管閉塞癥是糖尿病足，它影響了糖尿病患者，經(jīng)常會導(dǎo)致足部截肢。
術(shù)語“血管再生”，“血管形成”，“血管形成術(shù)”和“增加的側(cè)支循環(huán)”(或者能達(dá)此效果的用語)被認(rèn)為具有相同含義。術(shù)語“藥學(xué)可接受的”當(dāng)指一個自然的或者合成的成分，考慮到它具有更大的有益效果的同時具有可接受的毒性效應(yīng)，與此相關(guān)的術(shù)語“生理可接受的”，是指成分具有相對較低的毒性。術(shù)語“聯(lián)合給藥”是指將兩種或更多的藥物在同一時間或者連續(xù)地給予患者，使藥物同時起效或者實質(zhì)上作用重疊。該術(shù)語包括連續(xù)以及同時給藥。
“藥學(xué)可接受的鹽”是指甲狀腺激素類似物，聚合形式和衍生物的可接受的鹽，這些鹽衍生自各種有機和無機平衡離子，如鈉，鉀，鈣，鎂，銨，四烷基銨等，當(dāng)該分子包含一個基礎(chǔ)的功能團(tuán)，有機或者無機酸鹽，如鹽酸化物，氫溴化物，酒石酸鹽，去鐵胺，醋酸鹽，馬來酸鹽，草酸鹽之類可用作藥學(xué)可接受的鹽。
“受試者”包括來自活體，如人，猴子，牛，綿羊，馬，豬，山羊，狗，貓，鼠的培養(yǎng)細(xì)胞，以及它們的轉(zhuǎn)基因物種。優(yōu)選的受試者是人。將本發(fā)明的藥物組合物用于治療受試者可以采用已知的步驟，劑量和有效的療程。達(dá)到療效所需的組合物的有效量據(jù)受試者的年齡，體重，以及組合物的性能的不同而變化。給藥方案可以根據(jù)最佳治療效果而調(diào)整。例如，數(shù)個分開的劑量可以每日給藥或者根據(jù)治療情況中的突發(fā)情況而相應(yīng)地減少。
“給藥方式”包括能使本發(fā)明的組分起到它的預(yù)期作用-如促進(jìn)血管形成-的途徑。各種給藥方式都可能被包括，不限于注射(例如，靜脈注射，內(nèi)部動脈注射，肌肉注射，皮下注射)，口服的(例如，飲食)，局部的，鼻的，直腸的方式，或者根據(jù)疾病或者治療狀況通過微囊緩釋的方式給藥。優(yōu)選口服，注射和靜脈注射的給藥方式。給藥組合物的制劑形式根據(jù)選擇的給藥方式而變化(例如，溶解劑，乳劑，凝膠劑，氣溶劑，膠囊)。藥物組合物連同輔劑和防腐劑可以在生理可接受的賦形劑或者載體當(dāng)中。對溶解劑或者乳劑來講，適合的載體包括，水或者醇/水溶液，乳劑或者懸浮液，包括鹽和緩沖介質(zhì)，無菌水，乳膏，軟膏，洗液，油脂，糊和固體載體。注射液可以包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖(注射液)，葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格(氏)(注射液)或者不揮發(fā)性油。靜脈注射液可以包括各種添加劑，防腐劑，或者液體，營養(yǎng)素或電解質(zhì)補充劑(See，generally，Remington’sPharmaceutical Science，16thEdition，Mack，Ed.(1980))。
“有效量”包括使那些促血管形成或者抗血管形成組合物起到它的預(yù)期作用的用量，例如，在前所述的與血管形成有關(guān)的疾病中促進(jìn)或者抑止血管形成的作用。有效量依據(jù)一定的因素，包括生物的活性，年齡，體重，性別，健康狀況，被治療的嚴(yán)重狀況，與此相當(dāng)?shù)乃幋鷦恿W(xué)特征。例如，活性成分的劑量可以從每日約0.01mg/kg到約每日約500mg/kg，優(yōu)選從每日約0.1mg/kg到約每日約100mg/kg?；钚猿煞值挠行е委焺┝靠梢酝ㄟ^一種合適的單劑量或者多劑量方式給藥。此外，活性成分的劑量可以由緊急治療或者預(yù)防狀況所顯示的適當(dāng)增加或減少。
“藥學(xué)可接受的載體”包括任何和所有的溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗菌劑，滲透劑和緩釋劑以及類似的適合于化合物活性和受試者生理可接受的物質(zhì)。一個藥學(xué)可接受的載體的例子使緩沖生理鹽水(0.15M NaCL)。適合于藥學(xué)活性成分使用的介質(zhì)和劑量是本領(lǐng)域公知的。任何不適合治療的介質(zhì)和劑量除外，對于它們的使用要慎重。增加的活性成分也可以摻合到組合物當(dāng)中。
“添加的成分”包括但不限于，輔料；表面活性劑；分散劑；稀釋劑；?；头至褎徽澈蟿?；潤滑劑；甜味劑；調(diào)味劑；著色劑；防腐劑；生物可降解的成分如明膠；水載體和溶液；油載體和溶液，懸浮劑；分散劑；乳化劑；濕潤劑；緩沖劑；鹽；增稠劑；充填劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩(wěn)定劑；以及藥學(xué)可接受的聚合物或者疏水物質(zhì)。其他的“添加的成分”可以包括本發(fā)明所述的以及本領(lǐng)域所使用的物質(zhì)，例如Remington’sPharmaceutical Sciences所記載的。
組合物本發(fā)明所述的血管形成因子由甲狀腺激素，它的類似物，以及該激素和它的類似物連接成的聚合物組成。本發(fā)明的組分可以通過促進(jìn)血管形成來治療疾病。此外，這些甲狀腺激素，類似物和聚合物的抑止劑可被用于治療不利的血管形成的疾病。本申請使用的術(shù)語“血管形成因子”包括任何無論單獨或與其他成分聯(lián)合能夠促進(jìn)血管形成的化合物或成分。包括但不限于，T3，T4，T3或T4的瓊脂糖，聚合形式的T3，T4的類似物，3，5-二甲基-4-(4’-羥基-3’-異丙基苯甲基)-苯氧基乙酸(GC-1)，或者二碘甲狀腺丙酸(DITPA)連接體用于改善藥物的活性。由于許多新舊療法產(chǎn)生了耐受，許多化合物需要先進(jìn)的藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)來減小毒性，增加循環(huán)時間，或者改變生物分布。一種改善藥物活性的策略就是利用水溶性的聚合物。各種水溶性聚合物已經(jīng)顯示出了改變的生物分布，促進(jìn)細(xì)胞吸收的方式，改變通過生物載體的滲透性，改變通過身體的清除率。為了獲得靶向性或者緩釋的效果，水溶性聚合物已經(jīng)被合成，它包含藥物部分作為末端基團(tuán)，作為部分主鏈，或者作為聚合鏈上的結(jié)構(gòu)集團(tuán)。
本發(fā)明代表性的組合物包括甲狀腺激素或者它的類似物連接的聚合物。聚合物的連接可以通過共價鍵或非共價鍵。在優(yōu)選的實施當(dāng)中，聚合物的連接通過酯鍵或酐鍵。聚合物通過使用聚乙烯醇酯鍵連接的例子見圖17。在這個制備過程當(dāng)中商業(yè)可獲得的聚乙烯醇(或者相關(guān)的共聚物)可以被甲狀腺激素類似物酯化。鹽酸鹽被加入的三乙胺中和成為三乙胺鹽酸化物，它在甲狀腺激素不同的類似物的酯的聚合物沉淀的時候可以被水沖走。與聚合物連接的酯鍵在活體中經(jīng)水解釋放出促血管形成甲狀腺激素類似物。
聚合物通過使用丙烯酸乙烯共聚物酐鍵連接的例子見圖18。它與前述的聚合物共價連接相似，但是它是通過衍生自丙烯酸共聚物反應(yīng)的酐來連接。酐鍵在活體中同樣易于水解而釋放甲狀腺激素類似物。鹽酸被三乙胺中和，隨后用水沖沉淀的聚酐就可以沖掉三乙胺鹽酸化物副產(chǎn)品。這一反應(yīng)致使甲狀腺激素類似物丙烯酸共聚物+三乙胺的形成。在活體中的水解作用下，加入丙烯酸乙烯共聚物的甲狀腺激素類似物將隨時間可控地釋放。
另一個具有代表性的連接體包括甲狀腺激素或者它的類似物與聚乙二醇(PEG)的連接。在各種藥物中加入聚乙二醇，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體能夠改善停留時間和減小毒性。聚乙二醇可以與活性劑通過在鏈末端的羥基配對，也可以通過其他方式。但是每分子的聚乙二醇僅限兩分子活性劑。通過一各不同的途徑，聚乙二醇和氨基酸共聚物經(jīng)研究是具有新穎性的生物材料，它保留了聚乙二醇生物相溶性的特征，但同時它還具有增加的優(yōu)點，即每分子具有多個附著點同時能被設(shè)計合成為適合多種應(yīng)用。
另一個具有代表性的連接體包括甲狀腺激素或者它的類似物以非共價鍵連接成的聚合物。具體見圖19。優(yōu)選的非共價連接為甲狀腺激素或它的類似物在聚乳酸聚合物當(dāng)中所形成的。多聚乳酸在體內(nèi)經(jīng)水解成為乳酸單體同時這已經(jīng)作為藥物在人體內(nèi)的遞送系統(tǒng)被應(yīng)用。與前兩種共價方式不同的是甲狀腺激素類似物是通過化學(xué)鍵與聚合物連接，這是一種非共價的連接方式，它使得甲狀腺激素類似物成為多聚乳酸聚合物串。這一反應(yīng)致使在水中甲狀腺激素類似物包含聚乳酸串的形成。過濾和水洗將導(dǎo)致包含聚乳酸串的甲狀腺激素類似物的形成，在體內(nèi)水解時致使甲狀腺激素和乳酸被控制在一定水平。
此外，毫微技術(shù)的應(yīng)用可以使得有用的物質(zhì)和成分達(dá)到納米尺寸。生物活性成分主要缺點是它的脆性。納米尺寸的物質(zhì)與具有生物活性的成分結(jié)合能夠顯著改善成分的耐久性，產(chǎn)生局部高濃度并通過較小的損失來降低成本。因此，添加的聚合的連接包括甲狀腺激素和它的類似物的納米顆粒形式。在這個具體實施當(dāng)中，納米聚合物和納米顆?？梢员挥米骷谞钕偌に睾退念愃莆锏木植窟f送基質(zhì)。它有助于及時可控地遞送到細(xì)胞和靶細(xì)胞當(dāng)中。
本發(fā)明的組合物包括甲狀腺激素，類似物，和衍生物單獨或者經(jīng)共價鍵或非共價鍵與聚合物連接。代表性的類似物和衍生物的例子見圖20，表A-D，表A顯示了T2，T3，T4和溴代衍生物。表B顯示內(nèi)氨酰側(cè)鏈的修飾體。表C顯示羥基，聯(lián)苯酯鏈，和D-配體。表D顯示酪氨酸類似物。
術(shù)語“血管形成抑止劑”或者血管形成抑止劑是指任何化合物和成分單獨或與其他成分結(jié)合抑止或者阻礙血管的形成。包括但不限于，四碘甲腺乙酸(TETRAC)，三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)，XT199和單克隆抗體LM609。
甲狀腺激素，類似物和聚合的連接在血管形成中的作用甲狀腺激素類似物或聚合形式對促血管形成的影響在于一個非基因的始端，經(jīng)試驗激素容易通過促分裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑藥理學(xué)的禁制因素而減少。這一結(jié)果顯示通過甲狀腺激素促分裂原活化蛋白激酶激活作用的另一結(jié)果是新的血液的生成。后者起源于非基因的開始，但是需要一個復(fù)合體基因轉(zhuǎn)錄程序結(jié)果。甲狀腺激素的環(huán)境濃度相對穩(wěn)定。在我們試驗時，絨毛膜尿囊膜模型是甲狀腺缺乏的，因此被認(rèn)為是一個無法再生完整機體的系統(tǒng)。
對于血管形成的雞胚絨膜尿囊膜的有效性分析提供了一個量化血管形成和研究通過甲狀腺激素在新血液生成誘導(dǎo)作用中的可能機制模型。本發(fā)明公開了T4的促血管形成的效果，近似于它在纖維生長因子-2的絨毛膜尿囊膜模型中的效果，它可以增強纖維生長因子-2在適度劑量以下的作用。它進(jìn)一步公開了激素的促血管形成的作用始于細(xì)胞膜，并且依賴于促分裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的甲狀腺素活性。如上所述，治療外周血管閉合疾病和冠狀疾病，尤其是外周冠狀血管疾病，以及伴隨外周脈管系統(tǒng)閉合和/或冠狀血管疾病所發(fā)生的疾病的方式也被公開。還公開了在病人體內(nèi)促血管形成和/或恢復(fù)側(cè)支血管的組合物和方法。組合物包括有效量的甲狀腺激素類似物，聚合物和衍生物。方法涉及聯(lián)合給予有效量的甲狀腺激素類似物，聚合物和衍生物，與其他促血管形成因子，血管舒張劑，抗凝血劑，血栓溶解劑或者其他與血管有關(guān)的治療，以低劑量，每日給藥持續(xù)一周或更久。
絨毛膜尿囊膜測定法已經(jīng)被用于確定各種被認(rèn)為能夠促血管形成的生長因子和化合物的活性。例如，T4在生理學(xué)的濃度下在體外試驗中顯示出了促血管形成性質(zhì)并且具有FGF2的活性。PTU(甲狀腺抑制劑)的存在并未降低T4的作用，結(jié)果顯示T4經(jīng)脫碘(作用)產(chǎn)生T3在此模型中并不是必要條件。各種甲狀腺激素類似物的促血管形成效果在表1中列出。
表1，各種甲狀腺激素類似物在絨毛膜尿囊膜模型中的促血管形成效果

在這個模型中新血管生長的出現(xiàn)需要七天，說明甲狀腺激素的作用完全依賴于甲狀腺激素原子核的受體和激素(TR)的相互作用。碘化甲(狀)腺氨酸需要細(xì)胞核內(nèi)的TR和它的自然配位體T3的絡(luò)合，經(jīng)定義，這一作用是基因組和基因表達(dá)的終點。另一方面，這個模型系統(tǒng)對于T4的選擇性反應(yīng)優(yōu)于T3，TR的自然配體提高了一種可能性，那就是血管形成的開始有可能是通過T4在細(xì)胞膜上的非基因作用，而事實上它的結(jié)束才需要基因的轉(zhuǎn)錄。T4的非基因作用已經(jīng)被全面的描述，通常是開始于細(xì)胞膜并且有可能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來介導(dǎo)。它們不需要碘化甲(狀)腺氨酸和Tr的細(xì)胞核內(nèi)配體，但是可以對接或者調(diào)整基因的轉(zhuǎn)錄。類固醇的非基因作用已經(jīng)被清楚地描述，并且已經(jīng)被獲知它能夠與類固醇或其他化合物的基因作用對接。甲狀腺素和四碘甲腺乙酸或者瓊脂糖-甲狀腺激素的試驗顯示甲狀腺素促血管形成的效果事實上非常有可能開始于細(xì)胞膜。四碘甲腺乙酸阻斷了甲狀腺素的膜的開始作用。但是并非他本身使信號的轉(zhuǎn)錄活化。因此它是甲狀腺激素非基因作用的探針。瓊脂糖-甲狀腺激素被認(rèn)為不是完全獲得于細(xì)胞內(nèi)部，同時它已經(jīng)被用于激素可能的細(xì)胞表面發(fā)生作用的檢驗?zāi)Ｐ汀?br> 本發(fā)明提供了促血管形成的組合物和方式。通過促血管形成治療可接受條件的疾病包括，例如，外周血管閉塞和冠狀疾病，尤其是，冠狀血管閉塞，以及伴隨冠狀血管和/或冠狀血管閉塞發(fā)生的疾病，勃起機能障礙，中風(fēng)和創(chuàng)傷。同時還公開了促患者的血管形成和/或修復(fù)患者的側(cè)支血管的組合物和方法。組合物包括有效量的甲狀腺激素類似物和衍生物的聚合物以及有效量的腺苷和/或氧化亞氮。組合物可以是無菌注射劑，以及包含血管形成有效量的甲狀腺類激素成分和腺苷衍生物的藥學(xué)形式——它們在生理學(xué)和藥學(xué)可接受的載體當(dāng)中，同時還具有一種或多種賦形劑。
心肌梗塞伴隨急性心肌梗塞而來的心臟衰竭的主要原因是新的血管形式，如血管形成的反應(yīng)缺乏。甲狀腺激素和它的類似物有利于心臟衰竭的治療和刺激冠狀血管的形成。本發(fā)明的方法包括，一種在梗塞發(fā)生時甲狀腺激素類似物的單純治療方法，它或者通過直接注射到心肌部位，或者通過間斷的主動脈結(jié)扎的冠狀動脈注射刺激來產(chǎn)生暫時的等容收縮，以獲得血管形成和/或心室的重塑。
因此，本發(fā)明的特征的一個方面在于通過給予患者所需量的甲狀腺激素聚合形式，或它的類似物，通過有效地促進(jìn)血管形成治療血管閉塞，冠狀疾病，心肌梗塞，局部缺血，中風(fēng)和/或外周動脈血管疾病的治療的方法。
甲狀腺激素類似物的聚和物包括T3，T4，GC-1或者DITPA與聚乙烯醇，丙烯酸乙烯共聚物，聚乳酸，或者瓊脂糖的連接體。
該方法還涉及有效量的甲狀腺類激素成分和有效量的腺苷和/或氧化亞氮的聯(lián)合給藥，以低劑量每天給藥持續(xù)一周或更長。一種或兩種組分可以通過導(dǎo)管局部遞送。甲狀腺激素類似物和衍生物在體內(nèi)通過將組合摻和到適當(dāng)大小的脂質(zhì)體或微粒當(dāng)中的方式被遞送到局部缺血的毛細(xì)血管床。甲狀腺激素類似物，聚合物和衍生物可以通過共價鍵與合適的抗體連接被送到局部缺血的組織。
該方法可以被用于在心肌梗塞后的心臟功能恢復(fù)的治療。該方法還可以被用于促進(jìn)患有冠狀動脈疾病病人的血液流動，這些病人由于心肌梗塞或血流不足進(jìn)而產(chǎn)生了其他的疾病，如，外周血管閉塞癥(外周動脈閉塞癥)，或者勃起機能障礙。
傷口愈合另一方面，本發(fā)明也提供，抑制血管形成的組合物和方法給需要者甲狀腺激素、其類似物和聚合物在抑制血管形成中的作用另一方面，本發(fā)明也提供，抑制血管形成的組合物和方法給需要者。需要通過抑制血管形成來治療的情況包括，例如，原發(fā)性或者腎上腺轉(zhuǎn)移瘤和基底性糖尿病視網(wǎng)病變。該組合物包括有效劑量的四碘甲腺乙酸，三碘甲狀腺乙酸或mAb LM609。該組合物可以為無菌可注射的藥劑形式，包括包含在生理上或藥學(xué)上可接受的載體中的有效量的可抗血管形成的物質(zhì)，還可包括一種或多種賦形劑。
此外，本發(fā)明還提供對需要通過抑制血管形成來治療的情況的治療方法，該方法是通過給需要的患者以足以抑制血管形成的有效量的抑制血管形成的藥劑，以抑制血管形成。
本發(fā)明同樣也提供用于抑制血管形成的抗血管形成藥劑的例子，包括，但不局限于，四碘甲腺乙酸(TETRAC)，三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)，單克隆抗體LM609，或它們的組合物。這樣的抗血管形成劑可以在細(xì)胞表面作為抑制血管形成前期的制劑。
與癌癥相關(guān)的新血管生長需要用抑制血管來治療的這種情況的例子包括，但不限于原發(fā)性或者腎上腺轉(zhuǎn)移瘤。在此種治療方法中，用能抑制甲狀腺激素誘導(dǎo)的血管增生的化合物來抑制血管形成。實施例12闡明了這種方法的細(xì)節(jié)。
基底性糖尿病視網(wǎng)病變需要用抑制血管來治療的這種情況的例子包括，但不限于基底性糖尿病視網(wǎng)病變，和相關(guān)的情況。在此種治療方法中，用能抑制甲狀腺激素誘導(dǎo)的血管增生的化合物來抑制血管形成。實施例8A和8B闡明了這種方法的細(xì)節(jié)。
已經(jīng)公知的是，由組織缺氧引起的增殖性視網(wǎng)膜病變(相對于糖尿病引起的)依賴于阿爾發(fā)V(αV)整聯(lián)蛋白表達(dá)(EChavakis et al.Diabetologia 45262-267，2002)。此處引用的是，甲狀腺激素在一個具體的整聯(lián)蛋白αVβ3上所起的作用是允許糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。整聯(lián)蛋白αVβ3已確定在此處的作用是作為甲狀腺激素的細(xì)胞表面受體。甲狀腺激素，其類似物，和聚合物，通過該受體誘導(dǎo)血管形成。
治療的方法甲狀腺激素的類似物，聚合形式，和衍生物，可以用于刺激血管形成的治療方法中，該方法用于需要這種治療的患者。這種方法包括，有效量的甲狀腺激素的類似物、聚合形式和衍生物的組合給藥，按每日劑量持續(xù)一周或更長時間。這種方法可作為心肌梗塞后的心臟功能恢復(fù)的治療方法。該方法同樣可用于提高冠狀動脈栓塞患者的血液流動，這些患者受著心肌缺血或者除心臟外的其他部分供血不足的折磨，比如末梢血管疾病，例如下肢周邊血管阻，這種疾病的問題在于過低的血流。
該化合物可以任何醫(yī)藥上可接受的并適合該化合物方式給藥，包括，口腔、直腸、局部或者注射(包括皮下、肌肉和靜脈)給藥。比如，腺苷的半衰期非常短。因此，最好以靜脈注射的方式給藥。然而，2取代的腺嘌呤核苷拮抗劑被開發(fā)出來后，由于其具有較長的半衰期，因此可以其他方式給藥。甲狀腺激素的類似物和聚合形式，以及衍生物，可通過例如靜脈注射、口服、局部、鼻內(nèi)方式的給藥。
在不同的情況下，甲狀腺激素的類似物和聚合形式及其衍生物以不同的方式給藥。
所需甲狀腺激素類似物和其聚合形式及衍生物的有效量，根據(jù)接受治療者的情況確定并最終取決于醫(yī)師。需要考慮的因素包括接受治療的患者的情況，具體被使用的2取代的腺嘌呤核苷受體拮抗劑的效力，制劑的性質(zhì)，以及患者的體重。用來治療阻塞的甲狀腺激素類似物或其聚合形式及衍生物的劑量可以是任何能提供預(yù)期效果的劑量。
制劑上述化合物，可以以藥劑形式給藥，該藥劑包含甲狀腺激素類似物或聚合形式或衍生物和與特定給藥方式相適應(yīng)的載體。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，適合所希望用途活性成分的給藥和施藥系統(tǒng)，都可以被采用。針對口腔、直腸、局部或者注射(包括皮下、肌肉和靜脈)方式給藥的，適合的藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。該載體是藥學(xué)上可接受的，意味著與制劑中的其他成分可配伍并且對受體沒有毒副作用。
適合注射給藥的制劑包括以無菌水溶液制備活性組合物，最好配制成與受體血液等張濃度。因此，該制劑可包含蒸餾水，5％的葡萄糖和鹽的蒸餾水溶液。有用的制劑還要包含含有式(I)化合物的固體或者濃縮液，該固體或濃縮液被合適的溶劑稀釋形成上述便于注射使用的溶液。
為腸道給藥，該化合物可被混入惰性載體中置于單獨單元中，比如膠囊、扁膠囊、片狀或塊狀，每個單元包含預(yù)先設(shè)定好的一定量的該活性化合物；也可作為粉末或小顆粒；或，溶劑為水或非水的懸濁液或溶液，例如糖漿劑，甘香灑劑，乳劑或飲劑。適宜的載體可為淀粉或糖，包括潤滑劑，調(diào)味劑，粘合劑，和其他同類性質(zhì)的物質(zhì)。
片劑可通過擠壓或者鑄型制得，可包含其他一種或多種可接受的組分。壓制成的片劑，可通過在一個合適的機器中壓縮可自由流動形態(tài)的該化合物來制備，該種形態(tài)的例子有，粉末或小顆粒，并可包含其他可接受的成分，例如粘合劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，表面活性劑或分散劑。鑄型制得的片劑可通過在一個合適的機器中，將粉末狀的該活性化合物和其他合適的載體進(jìn)行鑄型，來制備。
可以通過將該活性化合物加入糖，例如，蔗糖，的濃縮的水溶液中，來制備糖漿劑或者懸濁液，其中也可加入任何可接受的其他組分。所述的可接受的其他組分包括調(diào)味劑，延遲糖結(jié)晶的試劑或者提高其他組分溶解度的試劑，例如，多元醇類，比如丙三醇或山梨醇。
作為腸道給藥的制劑，可和常規(guī)載體一起做成栓劑，例如，可可油或者Witepsol S55(德國Dynamite Nobel化學(xué)公司的商標(biāo))，可以作為栓劑的基質(zhì)。
此外，本化合物還可做成脂質(zhì)體和微球體(微粒)給藥?？捎脕硐蚧颊呓o藥的脂質(zhì)體和微球體(微粒)的制備方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知常識，通過在此引述，將美國專利4,789,734的內(nèi)容都合并于本文，該專利中描述了將脂質(zhì)體中的生物材料制成膠囊的方法。主要是，將材料溶解在水溶液中，加入合適的磷脂和脂質(zhì)，如果需要的話同時加入表面活性劑，如果有必要，可將該材料透析或聲波降解。G.Gregoriadis撰寫了已知的此類方法的綜述，Chapter 14，“Liposomes，”Drug Carriers inBiology and Medicine，pp287-341(Academic Press，1979)。
由聚合體或蛋白質(zhì)形成微球體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且可被制作以經(jīng)過胃腸道直接進(jìn)入血液系統(tǒng)?；蛘?，本化合物可以加入微球體，或這些微球體的合成物中，并被做成在幾天到幾個月的時間段內(nèi)緩慢釋放。參見，例如，美國專利4,096,474，4,925,673和3,625,214，和Jein，TIPS 19155-157(1998)，此處引入該內(nèi)容作為參考。
在一個實施方案中，這種甲狀腺激素類似物或聚合形式及其腺苷衍生物可被制成脂質(zhì)體或微粒體的制劑形式，在靜脈給藥后其大小適合置于在毛細(xì)血管床內(nèi)。當(dāng)該脂質(zhì)體或微粒體置于萎縮的組織附近的毛細(xì)血管床內(nèi)之后，該制劑就可在該位置直接給藥，在這個位置上該制劑更能有效發(fā)揮作用。針對作為目標(biāo)的萎縮組織，合適的脂質(zhì)體通常要小于200毫微米，并且通常為單層微脂粒，就像，比如，美國專利5,593,688，以及Baldeschweiler，題目為“Liposomal targeting of ischemic tissue”中所公開的，這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都通過在此引述而合并于本文。
優(yōu)選的微粒體是那些由可生物降解的聚合物，例如，聚乙醇酸，聚乳酸和它們的共聚物，制備的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地依照不同的因素，包括所希望的藥物的釋放速率以及所希望的劑量，來確定合適的載體體系。
在一個實施方案中，該制劑可通過導(dǎo)管直接給藥至血管內(nèi)部。這種給藥方式，比如，可以通過導(dǎo)管的中空實現(xiàn)。在上述情況中的活性化合物具有相對較長的半衰期(從一天到一周或者更長)。該制劑可被包含在可生物降解的聚合物水凝膠之中，例如美國專利5,410,016中公開的那些。這些聚合物水凝膠可被送入一個組織的內(nèi)腔之中，該活性化合物可隨著聚合物的降解而釋放。如果希望的話，這種聚合物水凝膠中可包含其中分散著活性化合物的微粒體或脂質(zhì)體，這種方式提供了另一種控制活性化合物釋放的機理。
該制劑可采用制藥領(lǐng)域公知的方法來制備成單元劑量的形式。所有的這些方法都包含了將該活性化合物放入載體之中的步驟，該載體包含了一種或更多的可接受的組分。通常，該制劑的制備是通過統(tǒng)一且密閉的過程將活性化合物混入液體載體或者粉碎的固體載體中，如果需要的話，把這樣的產(chǎn)品按所需劑量的分成一個個單元形式。
該制劑還可包括其他輔助成分，比如多種生物活性物質(zhì)，例如生長因子(包括TGF-β，堿性成纖維生長因子(FGF2)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子α/β(TGFα/β)，血小板源生長因子(PDGF)，和血管內(nèi)皮生長因子/血管滲透因子(VEGF/VPF))，抗病毒，抗病菌，抗炎，免疫抑制，止痛，血管化試劑，和細(xì)胞粘附分子。
除了上述提到的組分外，該制劑還可進(jìn)一步包含在藥劑領(lǐng)域中常用的一種或多種其他可接受的組分，例如，稀釋劑，緩沖劑，調(diào)味劑，粘合劑，表面活性劑，稠化劑，潤滑劑，牢度增進(jìn)劑，防腐劑(包括抗氧化劑)和類似物質(zhì)。
材料和方法試劑所有的試劑均為化學(xué)純，購買自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)或VWR Scientific(Bridgeport，NJ)。醋酸可的松，小牛血清白蛋白(BSA)和凝膠溶液(2％來自B型bovine skin)購買自Sigma Chemical Co.受精的雞卵細(xì)胞購買自Charles RiverLaboratories，SPAFAS Avian Products&Services(North Franklin，CT).T4，3，5，3，’-三碘代-L-甲狀腺素(T3)四碘甲腺乙酸，T4-瓊脂糖，和6-N-丙基-2-硫脲嘧啶(PTU)來自Sigma；PD98059來自Calbiochem；CGP41251來自Novartis Pharma(Basel，Switzerland)。多克隆抗體-FGF2和單克隆抗體-β-肌纖蛋白來自Santa Cruz Biotechnology，人重組FGF2來自Invitrogen。磷酸化的ERK1/2DE多克隆抗體來自New England Biolabs，羊抗兔IgG(goat anti-rabbit IgG)來自DAKO。
血管形成的絨毛尿囊膜(CAM)模型活的有機體內(nèi)的血管新生通過前文描述的方法檢測。9-12個10天的小雞晶胚購買自SPAFAS(Preston，CT)，在溫度37℃和相對濕度55％的條件下孵化。用一個皮下注射針頭在隱藏于蛋殼下的氣囊處戳一個小孔，在雞蛋的寬的一側(cè)戳第二個小孔，通過對光檢查以確定該孔位于胚膜上無血管的部分。通過給第一個孔施以內(nèi)壓的方式在所述的第二個的下面制造一個假的氣囊，使得絨毛尿囊膜(CAM)與蛋殼相分離。在絨毛尿囊膜的上方的蛋殼上用手工研磨輪(Dremel，division of Emerson Electric Co.)開一個大約1.0cm的窗口，從而使得可以直接接觸到絨毛尿囊膜的底部。使用FGF2(1μg/ml)作為標(biāo)準(zhǔn)前血管生成試劑來誘導(dǎo)10天大的晶胚的絨毛尿囊膜上面的血管部分。消毒的1號圓形濾紙(Whatmaninternational)預(yù)先用3mg/ml醋酸可的松以及1mmol/L的PTU處理，并在無菌條件下烘干。然后將甲狀腺激素，激素類似物，F(xiàn)GF2或控制溶劑，和抑制劑施加至該濾紙上，并將濾紙干燥。然后將該濾紙懸浮在PBS中并置于尚在生長中的絨毛尿囊膜上。在這個持續(xù)3天的孵化過程中，第一天以T4或FGF2處理的濾紙置于其上，30分鐘后在選定的樣品上施加FGF2抗體。在第24小時，MAPK級聯(lián)抑制劑PD98059也通過用濾紙的方式局部施加在絨毛尿囊膜上。
顯微鏡下分析絨毛尿囊膜部分在溫度37℃和相對濕度55％的條件下孵化3天后，直接位于每個圓形濾紙下的絨毛尿囊膜組織從被控制和處理過的絨毛尿囊膜樣品上切除下來。切下來的組織用PBS潤洗3次，置于35-mm的皮氏培養(yǎng)皿(Nalge Nunc)中，在SV6立體顯微鏡(Zeiss)的50倍率下進(jìn)行觀測。用帶3電荷耦合組件的彩色數(shù)碼相機(Toshiba)獲得暴露于濾紙的絨毛尿囊膜部分的數(shù)碼相片，用Image-Pro圖像處理分析軟件(MediaCybernetics)進(jìn)行分析。每一個圓形區(qū)域中的血管分支點的數(shù)目等于每一個相應(yīng)圓形濾紙上數(shù)出的數(shù)目。每一個絨毛尿囊膜計算一次，相同的試驗條件(甲狀腺激素或類似物，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF2抗體，PD98059)分析8到10個絨毛尿囊膜樣品。此外，每個試驗重復(fù)3次。每個樣品的新增的支脈點數(shù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)誤差分析后就是結(jié)果的血管形成指數(shù)。
FGF2分析在M199培養(yǎng)基上培育ECV304內(nèi)皮細(xì)胞并用10％的牛胚胎血清輔助處理。這些ECV304內(nèi)皮細(xì)胞(106個)被置于24層的凝膠盤上在培養(yǎng)基中放置整夜，然后在血清中清洗，并按前面所述的方式用T4或T3處理。72小時之后，收集上層清液并分析未經(jīng)商品ELISA系統(tǒng)(R&D Systems)稀釋的FGF。
MAPK活化在含有0.25％的去荷爾蒙血清13的培養(yǎng)基中培育ECV304內(nèi)皮細(xì)胞2天。然后將該細(xì)胞用T4(10-7mol/L)處理15分鐘至6小時。在進(jìn)一步的試驗中，用T4或FGF2或存在于PD98059或CGP41251中的T4處理這些細(xì)胞。以本文前述的方法預(yù)先處理所有樣品的原子核部分，這些蛋白質(zhì)被聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，遷移至與磷酸化ERK1/2的抗體免疫雜交的膜的一側(cè)。磷酸化ERK1/2的原子核的存在標(biāo)示出了被T4活化的那些MAPK變體。
逆反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)將至于10cm凝膠盤上的EVC304細(xì)胞匯合用T4(10-7mol/L)處理6至48小時。用異硫氰酸胍(Biotecx Laboratories)提取整個RNA。RNA(1μg)為逆反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的受試對象，該反應(yīng)使用Access RT-PCR系統(tǒng)(Promega)。在45℃下反應(yīng)45分鐘，整條RNA全部逆反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在94℃下2分鐘就會變性。第二鏈合成和PCR擴增循環(huán)40次并在94℃下變性30秒，在60℃下退火60秒，在68℃延伸120秒，在整個循環(huán)完成后最后在68℃延伸7分鐘。FGF2的PCR起始物如下FGF2義鏈5’-TGGTATGTGGCACTGAAACG-3’(序列ID編號1)，反義鏈5’-CTCAATGACCTGGCGAAGAC-3’(序列ID編號2)；PCR產(chǎn)物的長度為734bp。GAPDH的起始物包括，義鏈5’-AAGGTCATCCCTGAGCTGAACG-3’(序列ID編號3)，和反義鏈5’-GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3’(序列ID編號4)；PCR產(chǎn)物的長度為218bp。RT-PCR的產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離并用溴化乙錠純化。該凝膠的目標(biāo)區(qū)域用LabImage軟件(Kaoelan)，對[FGF2/GAPDH]X10每個取樣時間計算一次。
統(tǒng)計分析采用單向方差分析比較試驗值和對照試樣。
植入老鼠體內(nèi)的基底膜基質(zhì)FGF2和癌細(xì)胞系中的活的有機體內(nèi)的血管形成活的老鼠血管形成模型按照前文所描述的方法試驗老鼠基底膜基質(zhì)模型(Grant et al.1991；Okada et al 1995)，在我們的實驗室中采用(Powel et al.，2000)。簡要地說，生長因子自由基底膜基質(zhì)(Becton Dickinson，Bedford MA)在4℃解凍整夜，并被至于冰塊之上?；啄せ|(zhì)的等量樣本將被至于冷凍聚丙烯的試管中，并在其中加入FGF2，甲狀腺激素類似物或癌細(xì)胞(1×106個細(xì)胞)?；啄せ|(zhì)和鹽水，F(xiàn)GF2，甲狀腺激素類似物或癌細(xì)胞用皮下注射至小鼠腹側(cè)中線。在第14天，該小鼠將被解剖，固體凝膠被割除出來對新生血管進(jìn)行分析。不同劑量的化合物A-D經(jīng)由皮下注射。等量和試驗的植入凝膠樣本被置于一個含有0.5ml的細(xì)胞裂解液(Sigma，St.Louis.MO)的微離心分離試管并用槌杵壓碎。接下來，該試管允許在4℃的條件下經(jīng)過整夜培育，然后在第二天在1,500xg的條件下離心分離15分鐘。每個樣本的200μl細(xì)胞液等量樣本被加入1.3ml Drabkin’s試劑溶液中。該溶液以500nm的分光光度計進(jìn)行分析。吸收光的比例相應(yīng)于樣本中血色素的含量。
腫瘤生長與轉(zhuǎn)移-腫瘤移植的雞胚尿囊膜模型步驟如前所述(Kim et al.，2001)。簡要地說，1×107腫瘤細(xì)胞置于每一個CAM的表面(7天大的胚胎)并培育一周。腫瘤的結(jié)果被檢測并切成50mg的碎片。這些碎片每組將被置于另外10個CAM上，并在第二天用25μl溶解于PBS的A-D化合物局部處理。7天后，來自于每一個雞蛋的腫瘤將被檢測每個CAM上的腫瘤的重量也被確定。圖表8顯示了CAM中的活有機體內(nèi)的腫瘤生長模型的步驟。
四碘甲腺乙酸，三碘甲狀腺乙酸，以及甲狀腺激素拮抗體，對腫瘤生長率，腫瘤血管生成，和癌細(xì)胞系的腫瘤遷移，的作用，也可被確定。
腫瘤生長與遷移-小鼠中的腫瘤異種移植模型這個模型在我們2000已發(fā)表的作者為Kerr et al.的文章中已有描述，；Van Waeset al.，2000；Ali et al.2001；和Ali et al.2001，每一篇在此都全文引用)。不同劑量的四碘甲腺乙酸，三碘甲狀腺乙酸，以及甲狀腺激素拮抗體對對不同類型的腫瘤的抗癌效果可被確定和比較。
腫瘤生長與遷移-遷移的試驗?zāi)Ｐ捅灸Ｐ驮谖覀冏罱l(fā)表的文章中(Mousa，2002；Amirkhosravi et al.，2003a and 2003b，每一個都在此全文引用作為參考)。簡要地說，B16小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞(ATCC，Rockville，MD)和其他癌細(xì)胞系在RPMI1640中(Invitrogen，Carlsbad，CA)培育，補充處理用10％牛血清，盤尼西林和鏈霉素(Sigma St.Louis MO).這些細(xì)胞被培育到70％克隆率并用胰島素-EDTA切割下來，然后用磷酸鹽緩沖鹽液(PBS)沖洗兩次。為遷移試驗，這些細(xì)胞將再次浸在PBS中，該PBS的濃度為2.0×105細(xì)胞或毫升之一。動物C57/BL6小鼠(Harlan，Indianapolis，Indiana)重18-21克，用于本研究。所有的程序都在IACUC和實驗室守則的指導(dǎo)下進(jìn)行。不同劑量的四碘甲腺乙酸，三碘甲狀腺乙酸，以及其他甲狀腺激素拮抗體對對不同類型的腫瘤的抗癌效果可被確定和比較。
甲狀腺激素類似物對血管形成的作用T4誘導(dǎo)的CAM模型中的血管形成指數(shù)(在基數(shù)之上增加了1倍)顯著升高。0.001-1.0μM的T3或0.1-1.0μM的T4能獲得最大的效果使血管形成指數(shù)增加2-2.5倍，比1μg的FGF2的血管形成指數(shù)高2-3倍(表格1和圖表1a和1b)。T4在刺激血管形成中的作用是在PTU存在或不存在的情況下獲得的，這種情況抑制了T4轉(zhuǎn)變?yōu)門3。91-100nM的T3單獨能有效的誘導(dǎo)CAM模型中的前血管形成效果。T4瓊脂糖也有與T4相似的前血管形成作用。T4或T4瓊脂糖的前血管形成效果可被四碘甲腺乙酸或三碘甲狀腺乙酸100％阻滯。
FGF2的前血管形成活性被次最大濃度的T4加強T4和FGF2的組合物在次最大濃度導(dǎo)致了血管形成指數(shù)的升高達(dá)到T4和FGF2任一在最大濃度時的前血管形成效果的水平。(圖2)MAPK級聯(lián)因子對CAM模型中T4和FGF2在前血管形成作用中的影響T4或FGF2的前血管形成作用被0.8-8μg的PD98059完全阻滯(圖3)。
特異整聯(lián)蛋白ανβ3血管形成對CAM模型中T4和FGF2在前血管形成作用中的影響T4或FGF2的前血管形成作用被10μg的特異單克隆抗體LM609完全阻滯(圖4a和4b)。
對大量的生長因子和其他促進(jìn)因子或者血管生成抑制因子(2-9)進(jìn)行了CAM評估。在目前的研究中，與FGF2相比，生理濃度的T4顯示出了前血管形成的性質(zhì)。PTU的存在沒有減低T4的作用，說明T4的脫碘化轉(zhuǎn)變到T3在這個模型中不是必不可少的。由于本模型中新血管生長的出現(xiàn)需要好幾天的時間，我們推測甲狀腺激素的作用完全依賴于甲狀腺激素(TR)原子核受體之間的交互作用。依賴于TR和它的自然配體之間核內(nèi)配位的，碘甲狀腺原氨酸的作用，T3，通過表征基因組，在基因表達(dá)中達(dá)到頂峰。另一方面，這個模型系統(tǒng)對T4比T3優(yōu)先反應(yīng)，TR的自然配體提高了T4引起的細(xì)胞質(zhì)膜上的血管形成的可能，并且使需要基因轉(zhuǎn)錄的這一作用達(dá)到頂峰。T4的非基因組作用已被廣泛描述，這一作用通常在細(xì)胞質(zhì)膜開始并可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)停。這不需要碘甲狀腺原氨酸和TR在核內(nèi)的配體束縛，但是可以協(xié)調(diào)或調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄。類固醇的非基因組作用也已經(jīng)被廣泛描述，已知可被用于協(xié)調(diào)類固醇或其他化合物的非基因組作用。已經(jīng)對T4和四碘甲腺乙酸以及T4瓊脂糖進(jìn)行了試驗，結(jié)果顯示T4的前血管形成作用實際上很有可能開始于細(xì)胞質(zhì)膜。我們已經(jīng)證明，四碘甲腺乙酸阻滯T4的起始于細(xì)胞質(zhì)膜作用，但是本身并不能激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這樣，它可以作為甲狀腺激素非基因組作用的探針。瓊脂糖T4被認(rèn)為是不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，被我們和其他人用作檢測模型來激素可能具體有的細(xì)胞表面起始作用。
這些結(jié)果表明甲狀腺激素活化MAPK的另一結(jié)果是新血管形成。后者是以非基因組的方式起始，但是當(dāng)然需要隨之而來的復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄過程。
甲狀腺激素的環(huán)境濃度相對穩(wěn)定。在我們進(jìn)行測試的時候，CAM模型是甲狀腺激素缺乏的，并因此被看作一個不能產(chǎn)生完整生物體的系統(tǒng)。我們用大量的其他調(diào)節(jié)劑提供T4的循環(huán)水平，這樣來調(diào)節(jié)血管對內(nèi)生血管因子，比如VEGF和FGF2，的敏感性。
本發(fā)明將進(jìn)一步由以下實施例證明，但不限于以下實施例。
實施例實施例1.甲狀腺激素對血管生成的作用如圖1A所顯示和圖1B中總結(jié)的，在CAM評估中L-T4和L-T3都加強了血管形成?？倽舛葹樯項l件0.1μmol/L的T4在培養(yǎng)基中，將血管分支形成提高了2.5倍(P＜0.001)。T3(1nmol/L)也能2倍地刺激血管形成。由于T4在細(xì)胞5’-單位膜的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)門3所以才使得T4表現(xiàn)出活性作用，這樣的可能性被排除，因為發(fā)現(xiàn)脫碘酶抑制劑PTU對T4帶來的血管形成作用沒有抑制作用。PTU被應(yīng)用于本CAM模型中的所有濾盤上這樣，為評估生長因子，T4和T3在CAM模型中的刺激新血管形成的作用被預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)化。
實施例2.T4瓊脂糖和四碘甲腺乙酸的作用我們已在前面公開，T4瓊脂糖，以與T4同樣的方式，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)起始于細(xì)胞質(zhì)膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且，T4和T4瓊脂糖的這種作用能被，脫氨基碘甲狀腺原氨酸類似物，四碘甲腺乙酸，所阻滯，后兩者都已知可抑制T4對細(xì)胞質(zhì)膜的粘附。在CAM模型中，加入四碘甲腺乙酸(0.1μmol/L)能抑制T4的作用(圖2A)，但是，四碘甲腺乙酸單獨卻對血管形成沒有效果(圖2C)。T4瓊脂糖的作用，以0.1μmol/L的激素濃度加入，與T4在CAM模型中的作用類似(圖2B)，并且，T4瓊脂糖的作用同樣被四碘甲腺乙酸的作用所抑制(圖2B；圖2C進(jìn)行了總結(jié))。
實施例3.次最大濃度的T4對FGF2前血管形成作用的加強血管形成事一個復(fù)雜的過程需要多種多肽生長因子的參與。CAM評估需要至少48小時使血管生長被顯示出來；這樣，這個模型中甲狀腺激素的明顯的細(xì)胞質(zhì)膜作用，會帶來對該激素的復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。因此，我們確定了FGF2是否參與了何在各激素反應(yīng)，以及該激素是否加強了次生理水平的這一生長因子的作用。T4(0.05μmol/L)和FGF2(0.5μg/L)各自都能普通水平地刺激血管形成(圖3)。次最大濃度的FGF2的血管形成作用可被次生理濃度的T4加強到FGF2單獨時1.0μg/L的水平。由此，次最大濃度激素的作用和生長因子的濃度表現(xiàn)出協(xié)同作用。為了更精確地確定FGF2在甲狀腺激素對血管形成的刺激過程中的作用，一個FGF2的多克隆抗體被加入以FGF2或T4處理過的濾紙上，然后72小時后測量血管形成。圖4證明了FGF2抗體抑制了在外源FGF2不存在的情況下由FGF2或T4激發(fā)的血管形成，暗示了CAM評估中的T4作用可被加強的FGF2表達(dá)所調(diào)節(jié)?？刂艻gG抗體就對CAM評估中沒有刺激或抑制的作用。
實施例4.甲狀腺激素激發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞釋放FGF2檢測用T4(0.1μmol/L)或T3(0.01μmol/L)處理3天的ECV304內(nèi)皮細(xì)胞中膜上的FGF2水平。如表格2所示，T3使得培養(yǎng)基中的FGF2濃度升高了3.6倍，而T4使其升高了1.6倍。這一發(fā)現(xiàn)說明，甲狀腺激素可以加強FGF2的血管形成作用，至少部分由于，是通過提高內(nèi)皮細(xì)胞可用的生長因子的濃度。
表2.T4和T3對ECV304內(nèi)皮細(xì)胞的FGF2釋放的作用。

“*P＜0.001，比較T3處理的試樣和ANVOA控制試樣；*P＜0.05，比較T3處理的試樣和ANVOA控制試樣。”實施例5.ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在甲狀腺激素和FGF2激發(fā)的血管形成中的作用T4對細(xì)胞施加非基因組作用的途徑是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)層，特別是ERK1/2活化。我們知道T4通過表皮生長因子加強ERK1/2活化。MAPK途徑在甲狀腺激素FGF2表達(dá)引起的刺激中的作用用過使用PD98059(2至20μmol/L)來檢測，PD98059是通過酪氨酸-蘇氨酸激酶MAPK激酶-1(MEK1)和MEK2來作為ERK1/2活化的抑制劑。表格中的數(shù)據(jù)說明PD98059有效地阻滯了，用T4或T3處理過的ECV304內(nèi)皮細(xì)胞釋放的FGF2的升高。CAM評估中也進(jìn)行了對ERK1/2抑制作用的平行研究，結(jié)果分別顯示在圖5中。T4和T3的組合，兩者各自都在生理濃度，能使血管分支提高2.4倍，該作用可以被3μmol/L的PD98059完全阻滯(圖5A)。FGF2對血管分支形成的刺激(2.2倍)同樣也能被ERK1/2活化抑制子有效阻滯(圖5B)。因此，甲狀腺激素的前血管形成作用起始于細(xì)胞質(zhì)膜的，并且牽涉了刺激釋放自細(xì)胞膜內(nèi)皮的FGF2的ERK1/2途徑。轉(zhuǎn)換FGF2信號需要ERK1/2活化并且?guī)硇难苄纬伞?br> 實施例6.甲狀腺激素和FGF2對MAPK活化的作用ECV304細(xì)胞中磷酸化的激發(fā)和ERK1/2MAPKs的原子核易位被研究，該ECV304細(xì)胞被T4(10-7mol/L)處理15分鐘到6個小時(圖6A)。細(xì)胞原子核中在T4處理后15分鐘內(nèi)出現(xiàn)的磷酸化的ERK1/2，在處理30分鐘后達(dá)到最大水平，在6小時后仍能很明顯(圖6A)。該激素的這種作用被PD98059抑制(圖6B)，這種結(jié)果是預(yù)期希望的，因為這種化合物阻滯了由于MAPK激酶帶來的ERK1/2的磷酸化。這傳統(tǒng)蛋白質(zhì)激酶C(PKC)-α，PKC-β，PKC-γ抑制子CGP41251也阻滯了這些細(xì)胞中該激素在MAPK活化中的作用，就像我們在其他細(xì)胞系中對T4的作用。甲狀腺激素加強了這些細(xì)胞因子和生長因子的作用，比如干擾素-γ13和表皮生長因子。在ECV304細(xì)胞中，T4加強了由FGF2共同孵化15分鐘而引起的MAPK活化。將在ECV304細(xì)胞中的觀察應(yīng)用到CAM模型，我們猜測，該基因誘導(dǎo)的血管生成的復(fù)雜機理包括ECV304內(nèi)皮細(xì)胞釋放FGF2和釋放出來的FGF2在血管形成中的自分泌作用的加強。
實施例7.甲狀腺激素處理的ECV304細(xì)胞中的RT-PCR在對T4的前血管形成作用的機理研究中提出的最后一個問題是，該基因是否可以誘導(dǎo)FGF2基因表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞以T4(10-7mol/L)處理6到48小時，然后進(jìn)行以RT-PCR為基礎(chǔ)的FGF2評估和GAPDH RNA(來自cDNA測序；圖7)。FGF2cDNA豐度的提高和對GAPDH內(nèi)容的校正，在用該激素處理6小時后明顯可見，并且在處理48小時后加強。
實施例8.老鼠的視網(wǎng)膜新血管形成模型(糖尿病或非糖尿病引起的)為評估受試客體在視網(wǎng)膜新血管模型中的藥理活性，幼鼠被暴露于高氧環(huán)境中7天，然后使其恢復(fù)，這樣刺激視網(wǎng)膜上的新血管形成。評估受試客體是否抑制了視網(wǎng)膜上的新血管形成。這些視網(wǎng)膜用蘇木素-伊紅染色后檢測，并且至少有一種染色，這樣表明了新血管形成(通常是由選擇素染色劑)。其他染色劑(比如，PCNA，PAS，GFA P，血管形成標(biāo)記，等等)都可以使用。這個模型的總結(jié)如下動物模型·幼鼠(P7)和它們的dams被置于高氧環(huán)境中(含氧量70％-80％)7天。
·在P12，這些小鼠從這些氧化環(huán)境移出，并被轉(zhuǎn)入正常的環(huán)境。
·這些小鼠被允許恢復(fù)5-7天。
·將這些小鼠殺死并收集眼器官·這些眼器官被冷凍或用其他合適的方式保持不變。
·這些眼器官被合適的組織化學(xué)染色劑染色。
·這些眼器官被合適的免疫組織化學(xué)染色劑染色。
·收集血液，血清，或其他組織。
·這些有微血管變化的眼器官，對其任何和所有的結(jié)果進(jìn)行檢測。新血管的生長用半定量方法記錄。圖象分析也可被使用。
實施例8.甲狀腺激素和糖尿病視網(wǎng)膜病變在此使用J de la Cruz et al.，J Pharmacol Exp Ther280454-459，1997公開的一種方案，將四碘甲腺乙酸施藥給老鼠，這些老鼠具有被鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的實驗性糖尿病和糖尿病視網(wǎng)膜病變。終結(jié)點是增生型視網(wǎng)膜病變(血管形成)被四碘甲腺乙酸抑制。
實施例9.試管中人類上皮和纖維原細(xì)胞的傷口愈合試管中2維傷口的愈合方法記載于Mohamed S，Nadijcka D，Hanson，V。試管中有傷口愈合物質(zhì)甲氰咪胍。Drug Intell ClinPharm 20973-975；1986，在此處全文引用作為參考。此外，一個3維傷口的愈合方法也已在我們的實驗室中開發(fā)并被應(yīng)用于這個研究中(見下文)。數(shù)據(jù)顯示了甲狀腺激素對傷口愈合的有效刺激。
試管中人類真皮纖維原細(xì)胞的3D傷口愈合評估第一步制備收縮膠原蛋白凝膠1)用350μl 2％的BSA覆蓋24孔培養(yǎng)板在RT條件下2小時，2)80％融合性NHDF(正常人類真皮纖維原細(xì)胞，Passage5-9)在生長培養(yǎng)基上被胰蛋白酶化和中和，離心分離并用PBS洗一次。
3)制備膠原蛋白凝膠混合物，在冰塊上輕輕混和原液最終濃度5×DMEC 1×DMEC3mg/ml牛皮膠原(vitrogen)2mg/ml去離子水合適的NHDF2×10-5cells/mlFBS 1％
4)從24孔培養(yǎng)板加入2％BSA，加上膠原質(zhì)細(xì)胞混合物350ul/孔，并且在CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)該培養(yǎng)板。
5)1小時之后，按0.5ml/孔加入DMEM+5％FBS培養(yǎng)基，用一個10ul的探針分離每一個孔邊緣的膠原質(zhì)凝膠，然后將其培養(yǎng)2天。這些纖維原細(xì)胞將使膠原質(zhì)凝膠收縮。
第二步制備3D血纖維蛋白傷口處凝塊和嵌入傷口的膠原質(zhì)培養(yǎng)1)制備纖維蛋白原溶液(1mg/ml)含有或不含待測試劑。對微量離心管中的每個孔施350ul纖維蛋白原溶液。
原液最終濃度5×DMEC 1×DMEC纖維原蛋白 1mg/ml去離子水合適的待測試劑合適濃度FBS 1％或5％2)將每一個收縮的膠原質(zhì)凝膠用剪刀從中間切開。用PBS沖洗這些凝膠并將其移至24孔培養(yǎng)板的每個孔的中間。
3)將1.5ul人類凝血酶(0.25U/ul)加入每個試管中，混和均勻然后在膠原質(zhì)凝膠四周加上該溶液，該溶液將在10分鐘內(nèi)聚合。
20分鐘后，加入含有或不含待測試劑的DMEM+1％(或5％)FBS，450ul/孔，然后在CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)該培養(yǎng)板5天。每天都對其照相。
糖尿病鼠內(nèi)的活有機體的傷口愈合對糖尿病鼠使用尖銳切口創(chuàng)傷，測試了甲狀腺激素類似物和它的二聚形式的作用。傷口的愈合率，斷裂強度和組織學(xué)分析，在3-21天內(nèi)周期性檢測。
實施例10.心肌梗塞形成的嚙齒動物模型心肌梗塞形成的冠狀動脈的結(jié)扎模型被用于觀察小鼠的心臟功能。該老鼠開始用甲苯噻嗪和克他命麻醉，在其失去知覺后，在氣管插入導(dǎo)管并施加一定壓力的氣流。將該老鼠仰臥放置四肢松散地捆綁，對其沿中線施以胸骨起開術(shù)。將心臟輕輕取出，用6-O縫合牢固地固定左前下方的冠狀動脈。該心臟迅速被重新放入胸腔，胸廓切開術(shù)的切口用3-O荷包縫合，隨后用間斷縫合或外科手術(shù)夾將皮膚閉合。該動物被置于一個溫度可控制的墊子上并且在恢復(fù)期間密切觀察。需要的時候補充氧氣和進(jìn)行心臟復(fù)蘇?；謴?fù)之后，將該老鼠送回原來的動物養(yǎng)育裝置。這樣的冠狀動脈結(jié)扎帶來大量的前室壁心肌梗死。該程序后48小時的死亡率可能高達(dá)50％，并且由該程序后帶來的梗塞面積是可變的?；谶@些考慮，和以前的經(jīng)驗，為了得到16-20個具有大面積梗塞的老鼠，這樣可以比較下面討論的兩種甲狀腺激素給藥模型，大約需要400只老鼠。
這些試驗的設(shè)計是為了顯示，在冠狀動脈結(jié)扎之前或之后的甲狀腺激素的系統(tǒng)給藥，能給在完整的動物體內(nèi)帶來有益的效果，包括，用心回波描記術(shù)評估的血液動力方面的異常程度和血液動力測量，和降低梗塞面積。檢測結(jié)果在梗塞發(fā)生3周后提出。盡管有些老鼠不會發(fā)生梗塞，或者梗塞面積小，這些老鼠可通過心回波描記術(shù)檢測正常和血液動力正常來確定(LV舒張壓＜8mm Hg)甲狀腺激素給藥有兩種給藥方式。第一種，甲狀腺激素直接注射于梗塞周圍的心肌。由于，在直接開胸梗塞的過程中，正常的和缺血的心肌很容易區(qū)分，所以，這種方式提供充足的激素給藥以探測血管形成效果。
盡管第一種給藥方式對于采用了冠狀動脈替代管手術(shù)的患者有用，也有關(guān)于一次注射能誘導(dǎo)血管形成的規(guī)律的證據(jù)，使用第二種模型的應(yīng)用更寬的方式也可被使用。在第二種模式中，一個導(dǎo)管逆行地通過頸外動脈置入麻醉的未經(jīng)誘導(dǎo)心肌梗塞的小鼠的左心室中。此外，在主動脈瓣上用針將主動脈刺破一個小孔。甲狀腺激素的體內(nèi)注射被突然閉合幾秒鐘的位于冠狀動脈上的動脈所刺激，這樣就帶來等容收縮。在動脈收縮之后，甲狀腺激素立即被注射入左心室或動脈中。接下來的等容收縮推動血液沿著冠狀動脈將甲狀腺激素灌注整個心肌。為取得有效結(jié)果，整個過程可被重復(fù)多次。該注射次數(shù)取決于每次的劑量和新血管形成的情況。
超聲波心動描記圖取得未麻醉老鼠的二維和M型超聲心動圖的方法被研究出來。左心室收縮內(nèi)徑，功能，壁厚和局部室壁運動。這些測量是在無法看到的條件下進(jìn)行的以防止甲狀腺激素給藥誤差。
血液動力學(xué)血液動力學(xué)的測試用于確定左心室的損傷程度。用異氟烷麻醉老鼠。盡管切口是在右頸前部，右頸動脈和頸外靜脈同樣被隔開并插入壓力轉(zhuǎn)導(dǎo)管(Millar，SPR-612，1.2Fr)。接下來進(jìn)行以下測量心率，心臟收縮和舒張BP，平均動脈壓，左心室舒張壓和舒張末期壓，和+和-dp/dt。其中最有用的是左心室舒張末期壓，其升高與心肌損傷程度相關(guān)連。
心梗面積為用TTC方法測量梗塞面積將老鼠麻醉。
形態(tài)分析測量，梗塞區(qū)域，梗塞區(qū)域附近，通常是后壁的梗塞區(qū)域相對的另一側(cè)心肌，的微血管密度[微血管數(shù)/mm2]。對每只老鼠，7-10高倍率顯微鏡[×400]下以圖象分析軟件數(shù)字式存儲肌細(xì)胞橫截面。微血管數(shù)目可用盲性探測器來確定。微循環(huán)可被定義為第三層外的直徑為150微米或更小的細(xì)動脈，將組織液提供給小動脈和細(xì)動脈。為了糾正左心室增生帶來的差異，微血管的密度將根據(jù)體重校正用LV重量區(qū)分。來自假手術(shù)老鼠的心肌也如此操作。
實施例11.αγβ3拮抗劑對T4或FGF2的前血管形成效果的作用10微克的αγβ3抑制子LM609完全抑制了CAM模型中的FGF2和T4誘導(dǎo)的前血管形成作用(圖16)。
實施例12與癌癥相關(guān)的新血管生長抑制。
在此使用J.Bennett，Proc Natl Acad Sci USA992211-2215，2002所公開的一種方案，將四碘甲腺乙酸給藥于SCID老鼠，該老鼠接受了從移植的人類乳癌細(xì)胞(MCF-7)。四碘甲腺乙酸置于飲水中將老鼠模型中的激素類似物的循環(huán)水平提高至10-6M。終點是四碘甲腺乙酸對該移植組織引起的血管形成起了抑制作用。
其他實施方案盡管本發(fā)明已經(jīng)被上述細(xì)節(jié)所描述，上述描述只是證明本發(fā)明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將在下面的權(quán)利要求書中限定。其他方面，優(yōu)點和修正，均包含在下述權(quán)利要求之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療需要以促進(jìn)血管形成來治療的情況的方法，所述方法包括向受體施以需要量的甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式，所施的這些化合物足以在所述的受體中促進(jìn)血管形成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的需要以促進(jìn)血管形成來治療的情況選自以下血管閉塞病，冠狀動脈病，冠狀動脈疾病，勃起機能障礙，心肌梗塞，局部缺血，中風(fēng)，外周動脈末梢血管障礙和創(chuàng)傷。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的甲狀腺激素或類似物與選自下述的物質(zhì)結(jié)合聚乙烯醇，丙烯酸乙烯共聚物，聚乳酸，或者瓊脂糖。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的甲狀腺類似物是甲狀腺素(T4)，三碘甲狀腺原氨酸(T3)，3，5-二甲基-4-(4’-羥基-3’-異丙基苯甲基)-苯氧基乙酸(GC-1)，或者3，5-三磷酸脫氧肌苷酸(DITPA)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式的給藥方式為注射，口服，腸道，或者局部，或者幾種方式聯(lián)合。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，所述的注射給藥方式為皮下注射，腹膜內(nèi)注射，肌肉注射，或者靜脈注射，或上述幾種的聯(lián)合。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，所述甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式被包裹或者混合在微粒，脂質(zhì)體，或者聚合物中。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，所述聚合物為聚乙醇酸交酯，多乳酸化合物，或者它的共聚物。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，所述脂質(zhì)體或微粒的尺寸小于200納米。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，所述脂質(zhì)體或微粒以靜脈注射的方式給藥。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，所述脂質(zhì)體或微粒被置于周圍局部缺血的毛細(xì)血管床中。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，所述甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式，通過導(dǎo)管給藥。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，所述甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式，在一個聚合體系中通過導(dǎo)管應(yīng)用于血液組織內(nèi)部。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，所述甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式，與選自下述的一種或多種化合物聯(lián)合給藥生長因子，血管擴張劑，抗凝劑，或者它們的混合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，所述的生長因子選自下述轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)，基本成纖維細(xì)胞生長因子，血管內(nèi)皮生長因子，上皮細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子，血小板衍生的生長因子，以及血管滲透因子。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，所述的血管擴張劑選自下述腺苷，腺苷衍生物，或它們的混合物。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，所述的抗凝劑選自下述肝素，肝素衍生物，抑止因子Xa，抗凝血酶，阿斯匹林，氯吡格雷，或它們的混合物。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，所述甲狀腺激素，甲狀腺激素類似物，或其聚合形式，以彈丸注射的方式給藥，先于或者后于所述生長因子，血管擴張劑，抗凝劑，或者它們的混合物。
19.一種用一個藥物裝置促血管形成的方法，所述方法包括將裝置插入病人體內(nèi)之前，在用甲狀腺激素類似物，或者它的聚合物形式對該裝置或在該裝置周圍包衣。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，所述的包衣步驟進(jìn)一步包括用生長因子，血管舒張劑，抗凝劑，或者它們的混合物，對該裝置的包衣。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，所述的裝置為支架，導(dǎo)管，插管或電極。
22.一種治療可通過抑制血管形成來治療的狀況的方法，所述方法包括給予病患需要量的對抑止血管形成有效的血管形成抑制劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，所述可通過抑制血管形成來治療的狀況選自，初期的或者轉(zhuǎn)移的腫瘤，糖尿病性視網(wǎng)膜病。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，所述的血管形成抑制劑為四碘甲腺乙酸(TETRAC)，三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)，單克隆抗體LM609，XT199或者它們的混合物。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，所述的血管形成抑制劑給藥方式為注射，口服，腸道，或者局部，或者這幾種方式結(jié)合。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，所述的血管形成抑制劑與一種或多種抑制血管形成藥物或者化學(xué)治療藥物聯(lián)合給藥。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，所述的血管形成抑制劑作用于細(xì)胞表面。
28.一種血管形成劑，包括一種甲狀腺激素或其類似物。
29.一種血管形成劑，包括一種甲狀腺激素或其類似物或它們結(jié)合于聚合物上。
30.如權(quán)利要求29所述的血管形成劑，所述的類似物選自附圖20，表A-D，中的化合物。
31.如權(quán)利要求29所述的血管形成劑，所述的甲狀腺激素類似物為甲狀腺素(T4)，三碘甲狀腺原氨酸(T3)，3，5-二甲基-4-(4’-羥基-3’-異丙基苯甲基)-苯氧基乙酸(GC-1)，或者三磷酸脫氧肌苷酸(DITPA)。
32.如權(quán)利要求29所述的血管形成劑，所述聚合物為聚乙烯醇，丙烯酸乙烯共聚物，聚乙二醇(PEG)聚乳酸，或瓊脂糖。
33.如權(quán)利要求29所述的血管形成劑，所述結(jié)合是通過共價或非共價鍵。
34.如權(quán)利要求33所述的血管形成劑，所述共價鍵是一個酯鍵或一個酐鍵。
35.一個藥物制劑，包括包含于藥學(xué)上可接受的載體中的權(quán)利要求29所述的血管形成劑。
36.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，進(jìn)一步包括一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
37.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，所述的制劑被被包囊或者包含于脂質(zhì)體，微囊或者聚合物中。
38.如權(quán)利要求37所述的藥物制劑，所述脂質(zhì)體或微粒的尺寸小于200納米。
39.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，所述混合物可以通過注射，口服，腸道，局部的或上述幾種聯(lián)合的方式給藥。
40.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，所述混合物與選自下述的一種或多種化合物向需要的患者聯(lián)合給藥生長因子，血管擴張劑，抗凝劑，和它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了與血管形成條件有關(guān)的患者的治療方法，包括給予有效量的聚合形式的甲狀腺激素，或者它的拮抗劑，用以促進(jìn)或抑止患者的血管的形成。同時還公開了聚合形式的甲狀腺激素或者它的類似物的組合物。
文檔編號A61P9/10GK1878545SQ200480033184
公開日2006年12月13日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者莎克爾·A·莫薩, 費思·B·戴維斯, 保羅·J·戴維斯 申請人:奧德威研究院