專利名稱：：Kit突變形式的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及特征為KIT突變形式的依賴KIT的疾病的治療，其中鑒定了所述突變KIT和施用了所述突變KIT的適當(dāng)抑制劑。c-kit基因編碼受體蛋白酪氨酸激酶，其在本文中稱作KIT，但也稱為肥大/干細胞生長因子受體。KIT的氨基酸序列和c-kit基因的核苷酸序列是已知的。參見SwissProt.P10721。與它的配體干細胞因子結(jié)合后，KIT形成二聚體，所述二聚體自磷酸化并活化導(dǎo)致細胞生長的信號級聯(lián)。導(dǎo)致KIT經(jīng)活化形式，特別是獨立于它的配體的活化的形式的突變是已知的并且認為在某些增生性疾病中起作用，所述疾病為諸如肥大細胞疾病，如肥大細胞增生癥，特別是全身性肥大細胞增生癥、急性骨髓性白血病、胃腸道間質(zhì)瘤、sinonasalNK/T-細胞淋巴瘤、精原細胞瘤和無性細胞瘤。已知作為甲磺酸鹽以商品名GLIVEC或GLEEVEC上市的伊馬替尼(Imatinib)抑制野生型KIT和某些KIT突變，例如通常在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)中發(fā)現(xiàn)的外顯子中的KIT突變。然而，它對某些其它的KIT突變形式，例如通常在全身性肥大細胞增生癥中發(fā)現(xiàn)的D816V突變也是無活性的或顯著較低的活性。本發(fā)明基于如下研究該研究將特征為KIT突變形式的疾病的治療與適當(dāng)?shù)膫溥x藥物治療基于該備選藥物治療能夠抑制突變KIT而聯(lián)系起來。因此，本發(fā)明涉及治療患者中依賴KIT的疾病的方法，所述方法包括(a)鑒定與依賴KIT的疾病相關(guān)的KIT突變形式；和(b)向所述患者施用有效抑制突變KIT量的抑制劑，所述抑制劑選自米哚妥林(midostaurin)、vatalanib和化合物A。依賴KIT的疾病一般為增生性疾病，其特征是由于KIT中的活化突變導(dǎo)致的過度KIT激酶活性。此種活化突變是本領(lǐng)域已知的并且通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)鑒定。依賴KIT的疾病包括特征為以下已知的KIT突變的疾病D816F、D816H、D816N、D816Y、D816V、K642E、Y823D、Del550-558、Del557-561、N822K、V654A、N822H、Del550-558+V654A、Del557-561+V654A、Ins503AY、V560G、558NP、Del557-558、DelVV559-560、F522C、Del579、R634W、K642E、T801I、C809G、D820Y、N822K、N822H、Y823D、Y823C和T670I。在本發(fā)明的重要實施方案中，依賴KIT的疾病對伊馬替尼的治療有抗藥性。對伊馬替尼的治療有抗藥性的依賴KIT的疾病通常為如以上描述的依賴KIT的疾病，其中以400-1000mg/天的劑量施用的伊馬替尼不提供對突變KIT的足夠抑制以實現(xiàn)顯著的治療益處。一般地，對伊馬替尼有抗藥性的突變KIT具有突變KIT的體外IC50大于約3微摩爾/升。伊馬替尼抗藥性KIT突變包括D816F、D816H、D816N、D816Y、D816V、T670I和包括V654A的突變形式。抑制KIT突變形式的化合物的選擇基于檢測此種化合物或許多化合物抑制突變KIT的能力。此種檢測通過本領(lǐng)域已知的或本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)的標準抑制測定法實施。根據(jù)本發(fā)明的方法利用的KIT抑制劑包括米哚妥林、vatalanib和化合物A。米哚妥林(US5;093,330)和vatalanib(WO98/35958)是本領(lǐng)域已知的?；衔顰是式化合物A的化合物并且可以根據(jù)WO04/005281制備。通過常規(guī)方法確定米哚妥林、vatanalib和化合物A的適當(dāng)劑量。施用適當(dāng)劑量的米哚妥林例如，每天一次、兩次或三次，每天的總劑量為25-300，優(yōu)選50-300更優(yōu)選50-100，最優(yōu)選100-300mg，例如每天施用兩次或三次，每天的總劑量為150-250mg，優(yōu)選225mg。Vatanalib的適當(dāng)?shù)娜談┝繛?00-4000mg，例如300-2000mg/天或300-1500mg/天，特別地，300、500、750、1000、1250、1500或2000mg/天，特別是1250mg/天。對于70kg/人，化合物A的日劑量為大約0.05-5g，優(yōu)選大約0.25-1.5g。實施例將編碼aa544-976的人KIT基因克隆到桿狀病毒供體質(zhì)粒pFB-GST-01。用限制性內(nèi)切酶BamH1和EcoR1切割該編碼序列并連接到具有相容末端的Bac-to-Bac供體載體pFB-GEX-P1。隨后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將所希望的突變導(dǎo)入到KIT基因中。由于在用于產(chǎn)生突變編碼序列的最初質(zhì)粒中的移碼，因此對于如圖1顯示的每種突變體用限制酶BamH1-EcoR1將突變的質(zhì)粒插入片段切除并插入到Bac-to-Bac供體載體pFB-GST-01中。自動測序證明每種突變質(zhì)粒都存在正確的序列。從用如在材料和方法中描述的pFB-GO1-KIT-突變質(zhì)?？寺∞D(zhuǎn)化每個DH10Bac細胞的10個菌落產(chǎn)生桿粒DNA，將此種桿粒DNA轉(zhuǎn)染到Sf9細胞中。將轉(zhuǎn)染的細胞沉淀，將培養(yǎng)基上清液中存在的所得重組桿狀病毒擴大。使用用于免疫檢測的抗KIT和抗GST抗體對經(jīng)裂解的細胞沉淀物應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡以證實病毒克隆表達GST-c-KIT融合蛋白。圖1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="618">Kit突變VatalanibIC50(μM)(avg)化合物AIC50(μM)(avg)D816F＞10＞10D816H＞10＞10D816N＞10＜10D816Y＞10＞10D816V＞10＞10K642E＜1＜10Y823D＜1＜1Del550-558＜1＜2Del557-561＜1＜2N822K＜2＜10V654A＞10＞10N822H＜2＜10Del550-558+V654A＜10＜10Del557-561+V654A＞10＞10</table></tables><tablesid="table2"num="002"><tablewidth="589">米哚妥林</table></tables>測定條件1μMATP，5μg/mlPoly-EY，室溫孵育10分鐘。從經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物中收集包含病毒的培養(yǎng)基用于感染以增加它的滴度。兩輪感染后獲得的包含病毒的培養(yǎng)基用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)表達。對于大規(guī)模的蛋白質(zhì)表達，用5×107個細胞/板接種100cm2圓形組織培養(yǎng)板，并用1mL包含病毒的培養(yǎng)基(大約5MOI)感染。3天后，將細胞從培養(yǎng)板刮下，以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。來自10-20個100cm2培養(yǎng)板的細胞沉淀物在50mL用冰預(yù)冷的裂解緩沖液(25mMTris-HCl，pH7.5，2mMEDTA，1％NP-40，1mMDTT，1mMPMSF)中重新懸浮。將細胞在冰上攪拌15分鐘，然后以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。將經(jīng)離心的細胞裂解物加到2mL谷胱甘肽-瓊脂糖(sepharose)柱(Pharmacia)上，用10mL的25mMTris-HCl，pH7.5，2mMEDTA，1mMDTT，200mMNaCl清洗3次。然后通過10次應(yīng)用(每次1mL)25mMTris-HCl，pH7.5，10mM還原型谷胱甘肽，100mMNaCl，1mMDTT，10％甘油洗脫GST-標記的蛋白質(zhì)，-70℃保存。在存在或不存在抑制劑的20mMTris-HCl，pH7.6，3mMMnCl2，3mMMgCl2，1mMDTT，10μMNa3VO4，3μg/mLpoly(Glu，Tyr)4∶1，1％DMSO，1.5μMATP(γ-[33P]-ATP0.1μCi)中測定200-500ng多種Kit突變體的蛋白激酶活性。該測定(30μL)在96孔板中室溫進行30分鐘，加入20μL的125mMEDTA終止反應(yīng)。隨后，將30μL的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到事先用甲醇浸泡5分鐘的Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，美國)上，用水清洗，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘，按照到與真空源分離的多頭真空裝置上。點上所有樣品后，連接真空，每個孔用200μL0.5％H3PO4清洗。將膜除去并在振動器上用1.0％H3PO4清洗4次，用甲醇清洗一次。在室溫干燥，固定到PackardTopCount96孔框架并加入10uL/孔的Microscint(Packard)后，對膜進行計數(shù)。通過對4種濃度(通常0.01、0.1、1和10μM)一式兩份的每種化合物抑制百分率的線性回歸分析計算IC50值。蛋白激酶活性的一個單位定義為在室溫每mg蛋白質(zhì)每分鐘將1納摩爾33P從[γ33P]ATP轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)。權(quán)利要求1.治療患者中依賴KIT的疾病的方法，所述方法包括(a)鑒定與依賴KIT的疾病相關(guān)的KIT的突變形式；和(b)向所述患者施用有效抑制突變KIT量的抑制劑，所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述KIT的突變形式選自D816F、D816H、D816N、D816Y、D816V、K642E、Y823D、Del550-558、Del557-561、N822K、V654A、N822H、Del550-558+V654A、Del557-561+V654A、Ins503AY、V560G、558NP、Del557-558、DelVV559-560、F522C、Del579、R634W、K642E、T801I、C809G、D820Y、N822K、N822H、Y823D、Y823C和T670I。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述KIT的突變形式選自D816F、D816H、D816N、D816Y、D816V、K642E、Y823D、Del550-558、Del557-561、N822K、V654A、N822H、Del550-558+V654A、Del557-561+V654A。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述依賴KIT的疾病對伊馬替尼治療有抗藥性。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為D816F并且所述抑制劑選自米哚妥林。6.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為D816H并且所述抑制劑選自米哚妥林。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為D816N并且所述抑制劑選自米哚妥林和化合物A。8.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為D816Y并且所述抑制劑選自米哚妥林。9.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為D816V并且所述抑制劑選自米哚妥林。10.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為K642E并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。11.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為Y823D并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。12.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為Del550-558并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。13.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為Del557-561并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。14.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為N822K并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。15.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為V654A并且所述抑制劑選自米哚妥林。16.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為N822H并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。17.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為Del550-558+V654A并且所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。18.權(quán)利要求3的方法，其中所述KIT的突變形式為Del557-561+V654A并且所述抑制劑選自米哚妥林。19.權(quán)利要求2的方法，其中所述KIT的突變形式選自D816H、D816F、D816N和D816Y并且所述抑制劑為米哚妥林。20.權(quán)利要求2的方法，其中所述KIT的突變形式選自D816V、K642E、Y823D、Del550-558、Del557-561、N822K、V654A、N822H、Del550-558+V654A和Del557-561+V654A并且所述抑制劑為米哚妥林。21.權(quán)利要求2的方法，其中所述KIT的突變形式選自K642E、Y823D、Del550-558、Del557-561、N822K和N822H并且所述抑制劑為vatalanib。22.權(quán)利要求2的方法，其中所述KIT的突變形式選自D816H、D816N、K642E、Y823D、Del550-558、Del557-561、N822K和N822H并且所述抑制劑為化合物A。23.根據(jù)權(quán)利要求1-22任意一項的方法，其中依賴KIT的疾病選自肥大細胞疾病、急性骨髓性白血病、胃腸道間質(zhì)瘤、精原細胞瘤和無性細胞瘤。24.權(quán)利要求4的方法，其中所述抑制劑為米哚妥林。25.權(quán)利要求4的方法，其中所述抑制劑為vatalanib。26.權(quán)利要求4的方法，其中所述抑制劑為化合物A。全文摘要本發(fā)明涉及治療特征為KIT的突變形式的依賴KIT的疾病，其中鑒定了突變KIT并施用了突變KIT的適當(dāng)抑制劑，所述抑制劑選自米哚妥林、vatalanib和化合物A。文檔編號A61P35/00GK1882344SQ200480033858公開日2006年12月20日申請日期2004年11月17日優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日發(fā)明者E·布赫東格爾,D·法布羅申請人:諾瓦提斯公司