專(zhuān)利名稱(chēng)：用作葡糖激酶(glk)激活劑的苯甲?；被拎せ人嵫苌锏闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組苯甲?；被拎せ人峄衔铮龌衔锟捎糜谥委熁蝾A(yù)防通過(guò)葡糖激酶(GLK)介導(dǎo)的疾病或病癥，并且導(dǎo)致胰島素分泌的葡萄糖閾值降低。此外，預(yù)計(jì)所述化合物通過(guò)增加肝臟葡萄糖攝取來(lái)降低血液葡萄糖。這些化合物可用于治療2型糖尿病和肥胖癥。本發(fā)明還涉及含有所述化合物的藥物組合物，和使用所述化合物來(lái)治療由GLK介導(dǎo)的疾病的方法。
在胰腺β-細(xì)胞和肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中主要的血漿膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT2。在生理葡萄糖濃度下，GLUT2轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖穿過(guò)膜的速率不是葡萄糖攝取進(jìn)入這些細(xì)胞的總速率的限制速率。葡萄糖攝取的速率是由葡萄糖成為葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)的磷酸化作用的速率限制的，該作用經(jīng)葡糖激酶(GLK)催化[1]。GLK對(duì)于葡萄糖具有高(6-10mM)的Km且不被生理濃度的G-6-P抑制。GLK表達(dá)局限在少數(shù)組織和細(xì)胞類(lèi)型，最常見(jiàn)的是胰腺β-細(xì)胞和肝臟細(xì)胞(肝細(xì)胞)[1]。在這些細(xì)胞中GLK活性是葡萄糖利用的限速作用且由此調(diào)控葡萄糖引起的胰島素分泌的程度和肝糖原合成。這些過(guò)程在整體葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持中十分關(guān)鍵且兩者在糖尿病中均功能不全[2]。
在一種亞型糖尿病，青年的2型發(fā)育期發(fā)作糖尿病(MODY-2)中，該糖尿病是由功能突變的GLK損失引起的[3，4]。在MODY-2患者中，高血糖源自胰腺和肝臟兩者中的缺損性葡萄糖利用[5]。MODY-2患者的胰腺中缺損性葡萄糖利用導(dǎo)致葡萄糖刺激胰島素分泌的閾值升高。相反，稀有的GLK的激活突變作用降低該閾值導(dǎo)致家族性胰島素分泌過(guò)多[6，7]。除了在MODY-2糖尿病中觀察到降低的GLK活性以外，肝臟葡糖激酶活性在2型糖尿病中也降低[8]。重要的是，GLK的全面或肝臟選擇性過(guò)度表達(dá)阻止或逆轉(zhuǎn)該疾病的飲食和遺傳模型兩者中糖尿病表型的惡化[9-12]。此外，用果糖對(duì)2型糖尿病的快速治療通過(guò)刺激肝臟葡萄糖利用來(lái)提高葡萄糖耐受性[13]。據(jù)信這種效應(yīng)是通過(guò)下列機(jī)理由[13]果糖誘發(fā)的肝細(xì)胞中胞質(zhì)GLK活性增高來(lái)介導(dǎo)的。
通過(guò)與GLK調(diào)節(jié)蛋白(GLKRP)締合可抑制肝臟GLK活性。GLK/GLKRP復(fù)合物通過(guò)果糖-6-磷酸(F6P)結(jié)合GLKRP穩(wěn)定化且通過(guò)果糖-1-磷酸(F1P)置換這種糖磷酸去穩(wěn)定化。在果糖激酶介導(dǎo)的食物果糖的磷酸化作用介導(dǎo)下生成F1P。所以，GLK/GLKRP復(fù)合物的完整性和肝臟GLK活性以營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)方式受到調(diào)節(jié)，因?yàn)镕6P在吸收后狀態(tài)升高而F1P在進(jìn)餐后狀態(tài)占優(yōu)勢(shì)。與肝細(xì)胞形成對(duì)照，胰腺β-細(xì)胞在GLKRP不存在的條件下表達(dá)GLK。所以，β-細(xì)胞GLK活性僅僅由其底物葡萄糖的可利用性來(lái)調(diào)節(jié)。小分子可以直接或者通過(guò)使GLK/GLKRP復(fù)合物去穩(wěn)定化來(lái)激活GLK。前者種類(lèi)的化合物預(yù)計(jì)可刺激肝臟和胰腺兩者中的葡萄糖利用而后者預(yù)計(jì)僅僅在肝臟中起作用。然而，具有一種性能的化合物預(yù)計(jì)具有治療2型糖尿病的治療效益，因?yàn)檫@種疾病特征在于在上述兩種組織中的缺損性葡萄糖利用。
GLK和GLKRP和KATP通道在下丘腦的神經(jīng)元中表達(dá)，下丘腦是調(diào)節(jié)能量平衡和控制食物攝取非常重要的腦區(qū)域[14-18]。已經(jīng)證實(shí)這些神經(jīng)元表達(dá)開(kāi)胃和厭食神經(jīng)肽[15，19，20]，且被推斷是下丘腦內(nèi)的葡萄糖傳感神經(jīng)元，它們通過(guò)環(huán)境葡萄糖濃度的改變來(lái)抑制或興奮[17，19，21，22]。這些神經(jīng)元感覺(jué)葡萄糖水平變化的能力在多種遺傳和試驗(yàn)誘導(dǎo)的肥胖模型中是缺損的[23-28]。葡萄糖類(lèi)似物，也就是葡糖激酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的腦室內(nèi)(icv)輸注，刺激瘦弱大鼠的食物攝取[29，30]。相反，葡萄糖的icv輸注抑制進(jìn)食[31]。所以，GLK的小分子激活劑可以通過(guò)對(duì)GLK的中樞作用減少食物攝取和體重增加。所以，GLK激活劑可以治療性應(yīng)用于治療除糖尿病以外的飲食性疾病，包括肥胖。下丘腦的作用將與這些化合物的作用加合或協(xié)同地在肝臟和/或胰腺中發(fā)揮使葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)正?；淖饔?，例如治療2型糖尿病。所以GLK/GLKRP系統(tǒng)可以描述成為潛在“糖尿病肥胖”靶向(在糖尿病和肥胖中都有益)。
在WO0058293和WO 01/44216(Roche)中，描述了一系列作為葡糖激酶激活劑的芐基氨基甲?；衔铩４祟?lèi)化合物激活GLK的機(jī)理是通過(guò)測(cè)量這些化合物在其中GLK活性與NADH生成有關(guān)的試驗(yàn)中的直接作用來(lái)評(píng)估的，而NADH生成是通過(guò)光學(xué)方法測(cè)定的-參見(jiàn)實(shí)施例A中描述的體外試驗(yàn)詳情。本發(fā)明化合物可直接激活GLK或者可以通過(guò)抑制GLKRP與GLK的相互作用來(lái)激活GLK。與GLK的直接激活劑相比，后一機(jī)制具有重要優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)引起在直接刺激之后所預(yù)測(cè)的嚴(yán)重的低血糖發(fā)作。與已知的GLK激活劑相比，很多本發(fā)明化合物可表現(xiàn)出有利的選擇性。
WO9622282、WO9622293、WO9622294、WO9622295、WO9749707和WO9749708公開(kāi)了多種用于制備可用作加壓素劑的化合物的中間體，這些中間體與本發(fā)明公開(kāi)的化合物在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似。結(jié)構(gòu)上類(lèi)似的化合物還公開(kāi)在WO9641795和JP8143565(加壓素拮抗作用)以及JP8301760(預(yù)防皮膚損害)和EP619116(骨病)中。
WO01/12621描述了用作c-JUN N-末端激酶抑制劑的異惡唑基嘧啶以及相關(guān)化合物的制備，以及含有這樣的化合物的藥物組合物。
Cushman等人[Bioorg Med Chem Lett(1991)1(4)，211-14]描述了含有吡啶的均二苯代乙烯和酰胺化合物及其作為蛋白-酪氨酸激酶抑制劑的評(píng)估。Rogers等人[J Med Chem(1981)24(11)1284-7]描述了作為環(huán)-AMP磷酸二酯酶抑制劑的介離子6-羥基嘌呤類(lèi)似物。
WO00/26202描述了用作抗腫瘤劑的2-氨基噻唑衍生物的制備。GB 2331748描述了具有殺蟲(chóng)作用的噻唑衍生物的制備。WO96/36619描述了用作消化道運(yùn)動(dòng)改善劑的氨基噻唑衍生物的制備。US 5466715和US 5258407描述了3，4-二取代的苯酚免疫刺激劑的制備。JP58069812描述了含有苯甲酰胺衍生物的降血壓藥物。US 3950351描述了2-苯甲酰氨基-5-硝基噻唑化合物，Cavier等人[Eur J Med Chem-Chim Ther(1978)13(6)，539-43]討論了這些化合物的生物益處。
WO03/000262公開(kāi)了用作GLK激活劑的乙烯基苯基衍生物，WO03/015774公開(kāi)了用作GLK激活劑的苯甲酰胺化合物，WO03/066613公開(kāi)了用作GLK激活劑的N-苯基-2-嘧啶胺衍生物。
未決國(guó)際申請(qǐng)PCT/GB02/02873(WO03/000267)描述了一組苯甲?；被拎せ人峄衔?，所述化合物是葡糖激酶(GLK)的激活劑。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)了一些從這些化合物當(dāng)中選擇的一小部分化合物，這些選擇的一小部分化合物在口服給藥后具有優(yōu)良的血漿藥物水平，這是由于提高的水溶解度以及降低的血漿結(jié)合水平的緣故，同時(shí)保持了對(duì)GLK酶的高效力。這使得該亞組化合物特別適于用來(lái)治療或預(yù)防通過(guò)GLK介導(dǎo)的疾病或病癥。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑化物
式(I)其中R1選自氟、氯、C1-3烷基和C1-3烷氧基；R2-X-選自甲基、甲氧基甲基和 n是0、1或2。
式(I)化合物可以形成鹽，其屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選可藥用鹽，雖然其他鹽可以用于例如分離或提純化合物。
應(yīng)當(dāng)理解，由于一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子，在某些如上所定義的式(I)化合物的范圍內(nèi)可以存在旋光或外消旋形式，本發(fā)明在其定義中包括任何這樣的具有直接刺激GLK或抑制GLK/GLKRP相互作用的性質(zhì)的任何這樣的旋光或外消旋形式。旋光形式的合成可以通過(guò)所屬領(lǐng)域眾所周知的有機(jī)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)由旋光原料合成或通過(guò)外消旋形式的拆分來(lái)進(jìn)行。應(yīng)當(dāng)理解，一些化合物可以以互變異構(gòu)形式存在，并且本發(fā)明還涉及能夠激活GLK的本發(fā)明化合物的任何以及所有互變異構(gòu)形式。
優(yōu)選的式(I)化合物是其中適用任何一個(gè)或多個(gè)以下限定的那些(1)在式(I)的苯甲酰基氨基的3-位的基團(tuán)優(yōu)選為 (2)R1選自氯、氟、甲基、乙基、甲氧基和乙氧基；(3)R1選自氯、氟、甲基和乙基；(4)R1選自氯、氟和甲基；
(5)(R1)n選自甲基、氟、二氟和氟-氯；(6)(R1)n選自甲基、氟、二-氟、氟-氯和氟-甲基；(7)(R1)n選自3-甲基、3-氟、3，5-二氟和3-氟-5-氯；(8)n是1；(9)n是2；(10)n是2，且R1獨(dú)立地選自氯和氟。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，本發(fā)明提供了下列優(yōu)選組的本發(fā)明化合物(I)式(Ia)化合物 式(Ia)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
(II)式(Ib)化合物 式(Ib)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
(III)式(Ic)化合物
式(Ic)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
(IV)式(Id)化合物 式(Id)其中R1和b如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物包括一種或多種下列化合物6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-甲基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-苯氧基苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3，5-二氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-氟苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-氯-5-氟苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；
6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-乙氧基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{4-甲氧基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-異丙氧基-5-{3，5-二氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-異丙氧基-5-{苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-異丙氧基-5-{3-氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；和6-[3-{4-氟苯氧基}-5-{(1S)-1-甲基丙-2-炔-1-基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸或其鹽、溶劑化物或前藥。
本發(fā)明化合物可以以前藥的形式給藥。前藥是在機(jī)體內(nèi)可降解以生成本發(fā)明化合物的生物前體或可藥用化合物(例如本發(fā)明化合物的酯或酰胺，特別是體內(nèi)可水解的酯)。多種不同形式的前藥是本領(lǐng)域已知的。這樣的前藥衍生物的實(shí)例可參見(jiàn)a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard編寫(xiě)，(Elsevier，1985)andMethods in Enzymology，Vol.42，p.309-396，K.Widder，等人編寫(xiě)(Academic Press，1985)；b)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen編寫(xiě)；c)H.Bundgaard，Chapter 5“Design and Application of Prodrugs”，H.Bundgaard p.113-191(1991)；d)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；e)H.Bundgaard，等人，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；和f)N.Kakeya，等人，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
上述文件的內(nèi)容引入本文以供參考。
前藥的實(shí)例如下。含有羧基或羥基的本發(fā)明化合物的體內(nèi)可水解酯，例如，在人或動(dòng)物體內(nèi)水解以生成母體酸或醇的可藥用酯。對(duì)于羧基，適當(dāng)可藥用酯包括C1-C6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基酯，C1-6烷酰氧基甲基酯，例如新戊酰氧基甲基酯，2-苯并[c]呋喃酮基酯，C3-C8環(huán)烷氧基羰基氧基C1-C6烷基酯，例如1-環(huán)己基羰氧基乙基酯；1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲基酯，例如5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲基酯；和C1-6烷氧基羰基氧基乙基酯。
含有羥基的本發(fā)明化合物的體內(nèi)可水解酯包括無(wú)機(jī)酯例如磷酸酯(包括磷酰胺環(huán)酯(phosphoramidic cyclic esters))和α-酰氧基烷基醚和有關(guān)化合物，作為酯在體內(nèi)水解的結(jié)果，它們斷裂以產(chǎn)生母體羥基。α-酰氧基烷基醚的實(shí)例包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基。用于與羥基形成體內(nèi)可水解的酯的基團(tuán)的選擇包括烷?；⒈郊柞；⒈交阴；腿〈谋郊柞；捅交阴；⑼檠趸驶?以生成碳酸烷基酯)、二烷基氨基甲?；蚇-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(以生成氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙?；?br> 本發(fā)明化合物的適當(dāng)可藥用鹽是，例如，具有足夠堿性的本發(fā)明化合物的酸加成鹽，例如，與例如無(wú)機(jī)或有機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述酸是例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、檸檬酸或馬來(lái)酸。此外，本發(fā)明的具有足夠酸性的苯并嗪酮衍生物的適當(dāng)可藥用鹽是堿金屬鹽，例如鈉或鉀鹽，堿土金屬鹽，例如鈣或鎂鹽，銨鹽或與提供生理可接受陽(yáng)離子的有機(jī)堿形成的鹽，例如與甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、嗎啉或三-(2-羥基乙基)胺形成的鹽。
本發(fā)明的另一個(gè)特征是包含如上所定義的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥與可藥用稀釋劑或載體的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用作藥物的如上所定義的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物。
本發(fā)明還提供了用于制備用來(lái)治療通過(guò)GLK介導(dǎo)的疾病，特別是2型糖尿病的藥物的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物。
將本發(fā)明化合物適當(dāng)?shù)嘏渲瞥捎糜谝栽摲绞绞褂玫乃幬锝M合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療GLK介導(dǎo)的疾病，尤其是糖尿病的方法，包括給需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
可以用本發(fā)明化合物或組合物治療的具體疾病包括在沒(méi)有嚴(yán)重低血糖危險(xiǎn)的情況下降低2型糖尿病中的血糖(并有效治療1型)；異常脂血癥；肥胖；胰島素抗性；代謝綜合征X；葡萄糖耐量減低。
如上所述，GLK/GLKRP系統(tǒng)可因此描述成為潛在的“糖尿病肥胖”靶向(在糖尿病和肥胖中都有益)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥在制備用于聯(lián)合治療或預(yù)防糖尿病和肥胖的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥在制備用于治療或預(yù)防肥胖的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于肥胖和糖尿病的聯(lián)合治療的方法，包括給需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療肥胖的方法，包括給需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
本發(fā)明的組合物可以是適合口服使用的形式(例如片劑、錠劑、硬或軟膠囊、水或油懸浮液、乳劑、可分散散劑或顆粒劑、糖漿劑或酏劑)，局部使用的形式(例如霜?jiǎng)?、膏劑、凝膠劑或水或油溶液或懸浮液)，吸入給藥的形式(例如微粉散劑或液體氣霧劑)，通過(guò)吹入給藥的形式(例如微粉散劑)或非腸道給藥的形式(例如用于靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥的滅菌水或油溶液或用于直腸給藥的栓劑)。
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)常規(guī)方法利用該領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)藥物賦形劑來(lái)獲得。所以，用于口服使用的組合物可以含有，例如，一種或多種著色劑、甜味劑、矯味劑和/或防腐劑。
用于片劑制劑的合適的可藥用賦形劑包括，例如，惰性稀釋劑例如乳糖、碳酸鈉、磷酸鈣或碳酸鈣，制粒劑和崩解劑例如玉米淀粉或藻酸；粘合劑例如淀粉；潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉；防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧劑例如抗壞血酸。片劑制劑可以無(wú)包衣或有包衣來(lái)改變其崩解作用和隨后活性成分在胃腸道內(nèi)的吸收作用，或改進(jìn)其穩(wěn)定性和/或表觀，在任意情況中，使用該領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)包衣劑和方法。
口服使用的組合物可以是硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或成為軟明膠膠囊，其中活性成分與水或油例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水懸浮液一般含有微粉形式的活性成分和一種或多種懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠和阿拉伯膠；分散劑或濕潤(rùn)劑例如卵磷脂或氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七氧化乙烯鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七氧化乙烯鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。水懸浮液還可以含有一種或多種防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧化劑(例如抗壞血酸)、著色劑、矯味劑和/或甜味劑(例如蔗糖、糖精和天冬甜素)。
油懸浮液可以通過(guò)將活性成分懸浮在植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如液體石蠟)中來(lái)配制。油懸浮液也可以含有增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢约尤胩鹞秳├缟鲜瞿切?，和矯味劑來(lái)提供可口的口服制劑。這些組合物可以通過(guò)加入抗氧劑例如抗壞血酸來(lái)防腐。
適合通過(guò)加入水制成水懸浮液的可分散散劑和顆粒劑一般含有活性成分和分散劑或濕潤(rùn)劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑。適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶?rùn)劑和懸浮劑例如上述那些。附加的賦形劑例如甜味劑、矯味劑和著色劑，也可以存在。
本發(fā)明的藥物組合物也可以以水包油乳劑的形式存在。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或礦物油，例如液體石蠟或任何這些的混合物。適當(dāng)?shù)娜榛瘎┛梢允牵?，天然?shù)膠例如阿拉伯膠或黃芪膠，天然磷脂例如大豆卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脫水山梨糖醇一油酸酯)和所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。乳劑也可以含有甜味劑、矯味劑和防腐劑。
糖漿劑和酏劑可以與甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、天冬甜素或蔗糖配制，并且也可以含有緩和劑、防腐劑、矯味劑和/或著色劑。
所述的藥物組合物還可以是滅菌可注射水或油懸浮液的形式，其可以按照已知方法利用一種或多種適當(dāng)?shù)姆稚⒒驖駶?rùn)劑和懸浮劑來(lái)配制，這些物質(zhì)如上所述。滅菌可注射制劑也可以是存在于無(wú)毒胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的滅菌可注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。
用于吸入給藥的組合物可以是設(shè)計(jì)為分配活性成分的常規(guī)加壓氣霧劑，其是含有微粉固體或液滴的氣霧劑的形式?？梢允褂贸Ｒ?guī)氣霧劑推進(jìn)劑例如揮發(fā)性氟化烴或烴，且氣霧劑裝置通常裝配為分配計(jì)量量的活性成分。
有關(guān)制劑的其他信息可參見(jiàn)Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷，25.2章(Corwin Hanschl；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press 1990。
與一種或多種賦形劑合并以制備為單一劑型的活性成分的量必須根據(jù)被治療宿主和具體給藥途徑來(lái)變化。例如，用于對(duì)人體口服給藥的制劑一般含有，例如，0.5mg-2g的與適當(dāng)和常規(guī)量的賦形劑混合的活性劑，其可以占該組合物總重量的約5-約98％。單位劑型一般含有約1mg-約500mg活性成分。有關(guān)給藥途徑和給藥方案的進(jìn)一步信息可參見(jiàn)Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷，25.3章(Corwin Hanschl；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press1990。
式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物出于治療或預(yù)防目的的給藥劑量自然應(yīng)根據(jù)病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性、動(dòng)物或患者的年齡和性別以及給藥途徑、按照藥物的眾所周知原則來(lái)改變。
在出于治療或預(yù)防目的而使用式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物時(shí)一般是以日劑量在例如0.5mg-75mg/kg體重的范圍內(nèi)給藥，如果需要可以分次給藥。通常當(dāng)采用非腸道途徑時(shí)采用較低劑量。所以，例如，為了靜脈內(nèi)給藥，一般采用例如0.5mg-30mg/kg體重范圍內(nèi)的劑量。同樣地，為了吸入給藥，采用例如0.5mg-25mg/kg體重范圍內(nèi)的劑量。然而優(yōu)選口服給藥。
本發(fā)明所述GLK活性的升高可以用作單獨(dú)療法或者可以與一種或多種用于所治療的適應(yīng)癥的其它物質(zhì)和/或治療聯(lián)合使用。這樣的聯(lián)合治療可以通過(guò)各個(gè)治療組分的同時(shí)、順序或分開(kāi)施用的方式來(lái)達(dá)到。同時(shí)治療可以在單一片劑或在分開(kāi)的片劑中。例如在糖尿病的治療中，化療可以包括下列主要類(lèi)型的治療1)胰島素和胰島素類(lèi)似物；2)胰島素促分泌劑，包括磺酰脲類(lèi)(例如格列本脲，格列吡嗪)，飲食葡萄糖調(diào)節(jié)劑(例如瑞格列奈、那格列奈)；3)改善腸降血糖素作用的活性劑(例如二肽基肽酶IV抑制劑和GLP-1激動(dòng)劑)；4)胰島素敏化劑，包括PPARγ激動(dòng)劑(例如吡格列酮和羅格列酮)，和具有組合的PPARα和γ活性的活性劑；5)調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖平衡的活性劑(例如二甲雙胍、果糖-1，6-二磷酸酶抑制劑、糖原磷酸化酶抑制劑、糖原合成酶激酶抑制劑)；6)減少?gòu)哪c內(nèi)吸收葡萄糖的活性劑(例如阿卡波糖)；7)阻止腎對(duì)葡萄糖的再吸收的活性劑(SGLT抑制劑)；8)治療長(zhǎng)期高血糖的并發(fā)癥的活性劑(例如醛糖還原酶抑制劑)；9)抗肥胖劑(例如西布茶明和奧利司他)；10)抗異常脂血癥，例如HMG-CoA還原酶抑制劑(他汀類(lèi)(statins)，例如帕伐他汀)；PPARα激動(dòng)劑(貝特類(lèi)(fibrates)，例如吉非貝齊)；膽酸螯合劑(考來(lái)烯胺)；膽固醇吸收抑制劑(植物谷甾醇(stanol)，合成抑制劑)；膽酸吸收抑制劑(IBATi)和煙酸以及類(lèi)似物(煙酸和緩釋制劑)；11)抗高血壓劑，例如β阻滯劑(例如阿替洛爾，普萘洛爾)；ACE抑制劑(例如賴(lài)諾普利)；鈣拮抗劑(例如尼非地平)；血管緊張素受體拮抗劑(例如坎地沙坦)，α拮抗劑和利尿劑(例如呋塞米、芐噻嗪)；12)止血調(diào)節(jié)劑，例如抗血栓形成劑，纖維蛋白溶解的激活劑和抗血小板劑；凝血酶拮抗劑；Xa因子抑制劑；VIIa因子抑制劑)；抗血小板劑(例如阿司匹林、氯吡格雷)；抗凝血?jiǎng)?肝素和低分子量類(lèi)似物，水蛭素)和華法令；13)拮抗胰高血糖素的作用的活性劑；和14)抗炎劑，例如非甾族抗炎藥(例如阿司匹林)和甾族抗炎藥(例如可的松)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在下面的實(shí)施例中作為終產(chǎn)物制得的各種化合物及其鹽/溶劑化物和前藥。
本發(fā)明化合物或其鹽、前藥或溶劑化物可以通過(guò)任何用于制備此類(lèi)化合物或結(jié)構(gòu)上相關(guān)化合物的已知方法來(lái)制備。官能團(tuán)可以利用常規(guī)方法保護(hù)和脫保護(hù)。例如，保護(hù)基例如氨基和羧酸保護(hù)基(以及形成的方式和最后的脫保護(hù))可參見(jiàn)T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有機(jī)合成中的保護(hù)基”，第2版，John Wiley & Sons，New York，1991。
合成式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物的方法作為本發(fā)明另外的特征而提供。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)化合物的方法，所述方法包括(a)將式(IIIa)的酸或其活化衍生物與式(IIIb)化合物反應(yīng) 式(IIIa) 式(IIIb)；其中P1是氫或保護(hù)基；或者(b)將式(IIIc)化合物脫保護(hù)， 式(IIIc)其中P2是保護(hù)基；或者(c)將式(IIId)化合物與式(IIIe)化合物反應(yīng)，
式(IIId) 式(IIIe)其中X1是離去基團(tuán)，且X2是羥基，或者X1是羥基，且X2是離去基團(tuán)，并且P1是氫或保護(hù)基；或者(d)將式(IIIf)化合物與式(IIIg)化合物反應(yīng) 式(IIIf)式(IIIg)其中X3是離去基團(tuán)或有機(jī)金屬試劑，并且X4是羥基，或者X3是羥基，并且X4是離去基團(tuán)或有機(jī)金屬試劑，并且其中P1是氫或保護(hù)基；或者(e)將式(IIIh)化合物與式(IIIi)化合物反應(yīng)， 式(IIIh) 式(IIIi)；其中X5是離去基團(tuán)，并且其中P1是氫或保護(hù)基；并且之后如果需要的話i)將一種式(I)化合物轉(zhuǎn)化成另一種式(I)化合物；ii)除去任何保護(hù)基；iii)形成其鹽、前藥或溶劑化物。
對(duì)于方法a)-e)，合適的離去基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括例如活化的羥基離去基團(tuán)(例如甲磺酸酯和甲苯磺酸酯基團(tuán))，以及鹵素離去基團(tuán)例如氟、氯或溴。
式(IIIa)-(IIIi)化合物可商購(gòu)獲得，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方便方法知道和/或如本發(fā)明實(shí)施例所述而知道。通常應(yīng)該理解，任何芳基-O或烷基-O鍵可以任選在合適的堿存在下通過(guò)親核取代或金屬催化的方法來(lái)形成。
對(duì)于上述反應(yīng)，具體的反應(yīng)條件如下，其中當(dāng)P1是保護(hù)基時(shí)，P1優(yōu)選為C1-4烷基例如甲基或乙基方法a)-氨基與羧酸的偶聯(lián)反應(yīng)以形成酰胺是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，(i)使用合適的偶聯(lián)反應(yīng)，例如，于室溫，在合適的溶劑例如DCM、氯仿或DMF中，在DMAP存在下，使用EDAC進(jìn)行的碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)；或者(ii)其中通過(guò)與草酰氯在合適的溶劑例如二氯甲烷存在下反應(yīng)而將羧基活化成酰氯的反應(yīng)。之后可于0℃-室溫的溫度下，在合適的溶劑例如氯仿或DCNM中，在堿例如三乙胺或吡啶存在下，將酰氯與式IIIb化合物反應(yīng)。
方法b)-脫保護(hù)反應(yīng)是本領(lǐng)域眾所周知的。P1的實(shí)例包括C1-6烷基和芐基。當(dāng)P1是C1-6烷基時(shí)，該反應(yīng)可在合適的溶劑例如THF/水中，在氫氧化鈉存在下進(jìn)行。
方法c)-可將式(IIId)和(IIIe)化合物一起在合適的溶劑例如DMF或THF中，使用堿例如氫化鈉或叔丁醇鉀，于0-100℃溫度下，任選使用金屬催化劑例如乙酸鈀(II)、披鈀碳、乙酸銅(II)或碘化銅(I)來(lái)進(jìn)行反應(yīng)；或者，可將式(IIId)和(IIIe)化合物一起在合適的溶劑例如THF或DCM中，使用合適的膦例如三苯基膦和偶氮二甲酸酯例如偶氮二甲酸二乙酯來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。
方法d)-可將式(IIId)和(IIIe)化合物一起在合適的溶劑例如DMF或THF中，使用堿例如氫化鈉或叔丁醇鉀，于0-100℃溫度下，任選使用金屬催化劑例如乙酸鈀(II)、披鈀碳、乙酸銅(II)或碘化銅(I)來(lái)進(jìn)行反應(yīng)；方法e)-式(IIIh)化合物與式(IIIi)化合物的反應(yīng)可以在極性溶劑例如DMF或非極性溶劑例如THF中，使用強(qiáng)堿例如氫化鈉例如氫化鈉或叔丁醇鉀，于0-100℃溫度下，任選使用金屬催化劑例如乙酸鈀(II)、披鈀碳、乙酸銅(II)或碘化銅(I)來(lái)進(jìn)行。
在制備方法期間，使用用于分子內(nèi)的官能團(tuán)的保護(hù)基可能是有利的。保護(hù)基可以通過(guò)文獻(xiàn)中描述的或化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于除去所關(guān)注的保護(hù)基的任何適宜方法來(lái)除去，方法的選擇應(yīng)實(shí)現(xiàn)保護(hù)基的除去并最小限度地干擾分子這的其他基團(tuán)。
方便起見(jiàn)，下面給出保護(hù)基的具體實(shí)例，其中“低級(jí)”表示該基團(tuán)優(yōu)選具有1-4個(gè)碳原子。應(yīng)理解這些實(shí)例不是窮舉的。雖然下面給出除去保護(hù)基的方法的具體實(shí)例，但這些方法同樣也不是窮舉的。沒(méi)有具體提及的保護(hù)基的使用和脫保護(hù)的方法顯然屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
羧基保護(hù)基可以是成酯脂族或芳脂族醇的殘基或成酯甲硅烷醇的殘基(所述醇或甲硅烷基優(yōu)選含有1-20個(gè)碳原子)。羧基保護(hù)基的實(shí)例包括直鏈和支鏈(C1-12)烷基(例如異丙基、叔丁基)；低級(jí)烷氧基低級(jí)烷基(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、異丁氧基甲基；低級(jí)脂族酰氧基低級(jí)烷基(例如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基)；低級(jí)烷氧基羰基氧基低級(jí)烷基(例如1-甲氧基羰基氧基乙基、1-乙氧基羰基氧基乙基)；芳基低級(jí)烷基(例如對(duì)甲氧基芐基、鄰硝基芐基、對(duì)硝基芐基、二苯甲基和2-苯并[c]呋喃酮基)；三(低級(jí)烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；三(低級(jí)烷基)甲硅烷基低級(jí)烷基(例如三甲基甲硅烷基乙基)；和(2-6C)鏈烯基(例如烯丙基和乙烯基乙基)。
特別適合除去羧基保護(hù)基的方法包括例如酸-、金屬-或酶促-催化的水解。
羥基保護(hù)基的實(shí)例包括低級(jí)鏈烯基(例如烯丙基)；低級(jí)烷酰基(例如乙?；?；低級(jí)烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低級(jí)鏈烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基低級(jí)烷氧基羰基(例如苯甲?；趸驶?duì)甲氧基芐基氧基羰基、鄰硝基芐基氧基羰基、對(duì)硝基芐基氧基羰基)；三低級(jí)烷基/芳基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)；芳基低級(jí)烷基(例如芐基)；和三芳基低級(jí)烷基(例如三苯基甲基)。
氨基保護(hù)基的實(shí)例包括甲?；?、芳烷基(例如芐基和取代的芐基，例如對(duì)甲氧基芐基、硝基芐基和2，4-二甲氧基芐基，和三苯基甲基)；二對(duì)茴香基甲基和呋喃基甲基；低級(jí)烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低級(jí)鏈烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基低級(jí)烷氧基羰基(例如芐基氧基羰基、對(duì)甲氧基芐基氧基羰基、鄰硝基芐基氧基羰基、對(duì)硝基芐基氧基羰基；三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；亞烷基(例如亞甲基)；亞芐基和取代的亞芐基。
適合除去羥基和氨基保護(hù)基的方法包括例如酸-、堿、金屬-或酶促-催化的水解，或?qū)τ诨鶊F(tuán)例如鄰硝基芐基氧基羰基，使用光解，或?qū)τ诩坠柰榛?，使用氟離子。
酰胺基的保護(hù)基的實(shí)例包括芳烷氧基甲基(例如芐基氧基甲基和取代的芐氧基甲基)；烷氧基甲基(例如甲氧基甲基和三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)；三烷基/芳基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)；三烷基/芳基甲硅烷基氧基甲基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基、叔丁基二苯基甲硅烷基氧基甲基)；4-烷氧基苯基(例如4-甲氧基苯基)；2，4-二(烷氧基)苯基(例如2，4-二甲氧基苯基)；4-烷氧基芐基(例如4-甲氧基芐基)；2，4-二(烷氧基)芐基(例如2，4-二(甲氧基)芐基)；和鏈烯基(例如烯丙基、丁-1-烯基和取代的乙烯基，例如2-苯基乙烯基)。
芳烷氧基甲基，可以通過(guò)后者與適當(dāng)芳烷氧基甲基氯反應(yīng)引入到酰胺基上，并且通過(guò)催化氫化除去。烷氧基甲基、三烷基/芳基甲硅烷基和三烷基/甲硅烷基氧基甲基可以通過(guò)將酰胺與適當(dāng)氯化物反應(yīng)來(lái)引入并用酸除去；或在含有甲硅烷基基團(tuán)的情況中，使用氟離子。所述烷氧基苯基和烷氧基芐基通過(guò)與適當(dāng)鹵化物芳基化或烷基化引入并通過(guò)用硝酸鈰銨氧化來(lái)除去。最后，烷-1-烯基可以通過(guò)將酰胺與適當(dāng)醛反應(yīng)來(lái)引入并用酸除去。
下列實(shí)施例舉例說(shuō)明且不限定本申請(qǐng)的范圍。各個(gè)例舉的化合物代表本發(fā)明的具體和獨(dú)立方面。在下列非限定實(shí)施例中，除非另外說(shuō)明(i)蒸發(fā)是通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在真空下進(jìn)行且處理過(guò)程是在除去殘留固體例如通過(guò)過(guò)濾除去干燥劑之后進(jìn)行的；(ii)操縱是在室溫下進(jìn)行的，也就是在18-25℃的范圍內(nèi)并在惰性氣體如氬氣或氮?dú)獾臍夥障逻M(jìn)行；
(iii)收率僅是舉例說(shuō)明且無(wú)需是最大收率；(iv)式(I)的終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是通過(guò)核(一般是質(zhì)子)磁共振(NMR)和質(zhì)譜技術(shù)來(lái)確定；質(zhì)子磁共振化學(xué)位移值是在δ刻度上測(cè)量且峰的多重態(tài)顯示如下s，單峰；d，二重峰；t，三重峰；m，多重峰；br，寬封；q，四重峰；quin，五重峰；(v)中間體一般沒(méi)有完全定性，且純度是通過(guò)薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外(IR)或NMR分析來(lái)評(píng)估的；(vi)Biotage筒是指預(yù)填充的硅膠筒(40g-400g)，用biotage泵和級(jí)份收集器系統(tǒng)洗脫；Biotage UK Ltd，Hertford，Herts，UK。
縮寫(xiě)DCM二氯甲烷；DMAP 4-(N.N-二甲基氨基)吡啶DMSO 二甲亞砜；DMF二甲基甲酰胺；EDAC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；HPLC 高壓液相色譜HPMC 羥丙基甲基纖維素；LCMS 液相色譜/質(zhì)譜；RT 室溫；和THF四氫呋喃。
根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)制備方法來(lái)描述制備。
方法A-酯水解向酯(0.2mmol)在THF(2-4mL)內(nèi)的溶液中加入氫氧化鋰一水合物(2.5當(dāng)量)或氫氧化鈉(5.0當(dāng)量)在水(2-4mL)中的溶液。將該混合物在室溫?cái)嚢?-4小時(shí)。將該反應(yīng)的pH調(diào)節(jié)至＜7.0，真空除去THF，用水(8mL)替換。將所得固體過(guò)濾，用水洗滌，干燥，獲得了所需的酸。如果適當(dāng)?shù)脑挘靡译鎸⑺嵫兄?，然后過(guò)濾，干燥所得固體以除去雜質(zhì)。
方法B-硼酸偶聯(lián)將苯酚化合物(0.5mmol)、硼酸(2當(dāng)量)、乙酸銅(II)(1-2當(dāng)量)、三乙胺(5當(dāng)量)和新活化的4分子篩(1g)在DCM(5-10mL)中的溶液于室溫和環(huán)境氣氛下攪拌2-6天。如果適當(dāng)?shù)脑挘偌尤隓CM以保持所需的溶液體積，加入另外的試劑以幫助轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)物。將該反應(yīng)混合物過(guò)濾，真空除去DCM，把殘余油狀物在乙酸乙酯與鹽酸(1-2N)之間分配。分離出乙酸乙酯層，用碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，蒸發(fā)，獲得了殘余物，通過(guò)硅膠色譜純化，用10-40％乙酸乙酯在異己烷中的混合物洗脫，獲得了所需的酯。
方法C-硼酸化合物合成在-78℃，向溴化物(10mmol)在乙醚(25mL)內(nèi)的溶液中加入1.6M正丁基鋰在己烷中的溶液(11mmol)。將該反應(yīng)混合物在-78℃攪拌10分鐘，加入硼酸三異丙酯(11mmol)，將該反應(yīng)混合物在-78℃攪拌30分鐘。讓該反應(yīng)混合物達(dá)到室溫，再攪拌30分鐘，然后用水(20mL)中止反應(yīng)。分離出水層，用乙醚(25mL)洗滌，用濃鹽酸酸化至pH1。過(guò)濾出所得固體，用水洗滌，干燥，獲得了所需的硼酸化合物。
實(shí)施例16-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-甲基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸 實(shí)施例1是依據(jù)方法A由相應(yīng)的酯6-[({3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(3-甲基苯基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯制得的。
m/z 437(M+H)+；1H NMRδ(d6-DMSO)1.2(d，3H)，2.3(s，3H)，3.3(s，3H)，3.45(m，2H)，4.75(m，1H)，6.75(dd，1H)，6.85(m，2H)，7.0(d，1H)，7.15(s，1H)，7.3(dd，1H)，7.4(s，1H)，8.25(dd，2H)，8.85(d，1H)，11.15(s，1H)。
使用類(lèi)似于實(shí)施例1的方法，采用合適的酯還制得了實(shí)施例1.1-1.6。
用于實(shí)施例1的制備的中間體是如下所述制得的6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-甲基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯
安裝方法B，由6-{[(3-羥基-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯和3-甲基苯基硼酸制得了用于實(shí)施例1的制備的合適的酯。
m/z 451(M+H)+。
還制得了用于實(shí)施例1.1-1.6的制備的合適的酯。
所用硼酸化合物是商購(gòu)獲得的或者是按照方法C由市售原料合成的。6-{[(3-羥基-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯是如下所述制得的。
6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-羥基苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯
向6-[({3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯(0.038mol)在THF(85mL)內(nèi)的攪拌著的溶液中加入甲醇(85mL)。在氬氣氛下加入披鈀碳催化劑(1.7g 10％w/w)，將所得懸浮液在室溫于氫氣氛下攪拌過(guò)夜。經(jīng)由硅藻土過(guò)濾出催化劑，用THF洗滌，將所得濾液蒸發(fā)，獲得了淺棕色固體。用乙醚研制，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為72％)。
m/z 361(M+H)+，359(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)1.25(d，3H)，3.3(s，3H)，3.45(m，2H)，3.85(s，3H)，4.65(m，1H)，6.55(m，1H)，6.95(m，1H)，7.1(m，1H)，8.3(m，2H)，8.9(m，1H)，11.0，(s，1H)。
6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{芐基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 在氬氣氛下向3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸(75.9mmol)在含有DMF(1mL)的DCM(250mL)內(nèi)的攪拌著的溶液中滴加草酰氯(151.7mmol)，將所得溶液攪拌4小時(shí)。然后將該溶液真空蒸發(fā)，再與DCM(3×100mL)共沸，將殘余物在高度真空下干燥，獲得了酰氯，其不用定性而直接使用。
將上面獲得的酰氯(約75.9mmol)溶解在THF(100mL)中，在氬氣氛下加到6-氨基煙酸甲酯(91.1mmol)在THF(100mL)與吡啶(100mL)的混合物內(nèi)的攪拌著的溶液中。將該反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜，然后真空除去大部分溶劑。將殘余物置于乙酸乙酯(250mL)中，把懸浮液依次用1M檸檬酸(2部分，直至洗滌液呈酸性)和鹽水洗滌；將所得溶液干燥(MgSO4)，蒸發(fā)，獲得了粗產(chǎn)物，為棕色樹(shù)膠狀物。將其通過(guò)色譜法純化(400g Biotage硅膠筒，用含有乙酸乙酯的己烷，20％v/v洗脫)，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為50％)。
m/z 451.47(M+H)+，449.48(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)1.21(d，3H)，3.47(m，2H)，3.86(s，3H)，3.72(m，1H)，5.16(s，2H)，6.78(t，1H)，7.23(s，1H)，7.29(s，1H)，7.31-7.49(m，5H)，8.32(s，2H)，8.90(app t，1H)，11.15(s，1H)。
3-[(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基-5-芐基氧基-苯甲酸 將3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯(77.4mmol)在THF(232mL)與甲醇(232mL)的混合物內(nèi)的溶液用氫氧化鈉溶液(2N)(232mmol)處理，將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將所得溶液用水(250mL)洗脫，真空除去大部分溶劑。將所得懸浮液用乙醚(3×200mL)洗滌，棄去洗滌液。將所得水溶液用鹽酸(2M)酸化至pH 4，用乙酸乙酯(2×200mL)萃?。粚⑤腿∫汉喜?，用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為99％)。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.20(d，3H)，3.46(m，2H)，4.64(m，1H)，5.15(s，2H)，6.83(app t，1H)，7.06(s，1H)，7.13(s，1H)，7.30-7.49(m，5H)，12.67(brs，1H)。
3-[(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基-5-芐基氧基-苯甲酸甲酯 向3-羥基-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯(77.4mmol)在THF內(nèi)的溶液中加入聚合物負(fù)載的三苯基膦(51.7g 3mmol/g負(fù)載量，155mmol)和(R)-(-)-1-甲氧基-2-丙醇(102mmol)。將該攪拌著的溶液用氬氣覆蓋，在冰浴中冷卻；通過(guò)注射器用10分鐘滴加偶氮二甲酸二異丙酯(116mmol)。加入完成后，將該溶液攪拌20分鐘，然后過(guò)濾，將殘余物用THF(500mL)洗滌；將濾液和洗滌液合并，蒸發(fā)，獲得了所需的化合物，其不用進(jìn)一步純化直接用于下一步驟。
1H NMRδ(d6-DMSO)3.26(s，3H)，3.44(m，2H)，3.82(s，3H)，4.63(m，1H)，5.14(s，2H)，6.85(s，1H)，7.05(s，1H)，7.11(s，1H)，7.30-7.47(m，5H)；光譜還含有與少量二(1-甲基乙基)肼-1，2-二甲酸酯相一致的信號(hào)。
3-羥基-5-[芐基氧基]苯甲酸甲酯 向3，5-二羥基苯甲酸甲酯(5.95mol)在DMF(6L)內(nèi)的攪拌著的溶液中加入碳酸鉀(9mol)，將該懸浮液在室溫于氬氣下攪拌。用1小時(shí)向該懸浮液中緩慢地加入芐基溴(8.42mol)，發(fā)生輕微的放熱，將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將其小心地用氯化銨溶液(5L)處理，然后用水(35L)處理。將該水懸浮液用DCM(1×3L和2×5L)萃取。將合并的萃取液用水(10L)洗滌，干燥(MgSO4)過(guò)夜。將該溶液真空蒸發(fā)，把粗產(chǎn)物分三批進(jìn)行色譜純化(快速柱，3×2kg硅膠，用含有10％DCM的己烷，至純DCM，至含有50％乙酸乙酯的DCM進(jìn)行梯度洗脫)以除去原料；然后將所得粗的洗脫液以175g批量進(jìn)行色譜純化(Amicon HPLC，5kg正相硅膠，用含有20％v/v乙酸乙酯的異己烷進(jìn)行洗脫)，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為21％)。
1H NMRδ(d6-DMSO)3.8(s，3H)，5.1(s，2H)，6.65(m，1H)，7.0(m，1H)，7.05(m，1H)，7.3-7.5(m，5H)，9.85(brs，1H)。
實(shí)施例26-[3-{1-甲基乙氧基}-5-{3，5-二氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸。
實(shí)施例2是按照方法A，由相應(yīng)的酯6-[({3-[(3，5-二氟苯基)氧基]-5-[(1-甲基乙基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯制得的。
m/z 429(M+H)+427(M-H)+；1H NMRδ(d6-DMSO)1.25(d，6H)，4.75(m，1H)，6.8(dd，2H)，6.9(s，1H)，7.0(m，1H)，7.3(s，1H)，7.45(s，1H)，8.3(s，2H)，8.9(s，1H)，11.2(brs，1H)。
使用類(lèi)似于實(shí)施例2的方法，采用合適的酯，還制得了實(shí)施例2.1-2.2。
用于實(shí)施例2的制備的中間體是如下所述制得的6-[3-{1-甲基乙氧基}-5-{3，5-二氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 用于實(shí)施例2的制備的合適的酯是按照方法B由6-[({3-羥基-5-[(1-甲基乙基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯和3，5-二氟苯基硼酸制得的。
m/z 443(M+H)+；1H NMRδ(d6-DMSO)1.3(d，6H)，3.9(s，3H)，4.75(m，1H)，6.8(d，2H)，6.9(s，1H)，7.0(m，1H)，7.3(s，1H)，7.45(s，1H)，8.3(s，2H)，8.9(s，1H)，11.2(brs，1H)。
還制得了用于實(shí)施例2.1-2.2的制備的合適的酯。
所用的硼酸化合物是商購(gòu)獲得的或者是按照方法C由市售原料合成的。還如下所述制得了6-[({3-羥基-5-[(1-甲基乙基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯。
6-[3-{1-甲基乙氧基}-5-羥基苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 向6-[({3-[(1-甲基乙基)氧基]-5-[(苯基甲基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯(64.9mmol)在1∶1 THF/甲醇混合物(1L)內(nèi)的攪拌著的溶液中加入披鈀碳催化劑(3.3g 10％w/w)。將所得懸浮液在氫氣氛下攪拌過(guò)夜。通過(guò)經(jīng)由硅藻土過(guò)濾來(lái)除去催化劑，將所得濾液真空蒸發(fā)。用乙醚研制，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為73％)。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.26(d，6H)，3.86(s，3H)，4.60-4.73(m，1H)，6.49(t，1H)，6.96(t，1H)，7.07(t，1H)，8.30(s，2H)，8.88(app t，1H)，9.67(s，1H)，11.01(s，1H)。
6-[3-{1-甲基乙氧基}-5-{芐基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 向3-[(1-甲基乙基)氧基]-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸(95.5mmol)在DCM(260mL)和DMF(1mL)內(nèi)的溶液中加入草酰氯(477.5mmol)。將所得溶液攪拌4小時(shí)。將該反應(yīng)混合物真空蒸發(fā)，將殘余物與乙醚(3×150mL)共沸，然后在高度真空下干燥1小時(shí)。把殘余物溶解在THF(100mL)中，在氬氣氛下加到6-氨基煙酸甲酯(114.6mmol)在含有吡啶(40mL)的THF(100mL)內(nèi)的攪拌著的溶液中。將該反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜，然后在乙酸乙酯與檸檬酸(1M)之間分配。將有機(jī)相合并，用檸檬酸(1M)、氫氧化鈉溶液(0.5M)、水、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，并真空濃縮。將殘余物用乙酸乙酯研制，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為68％)。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.26(d，6H)，3.86(s，3H)，4.65-4.77(m，1H)，5.16(s，2H)，6.74(app t，1H)，7.20(s，1H)，7.29(s，1H)，7.30-7.50(m，6H)，8.29-8.35(m，2H)，8.90(s，1H)，11.14(s，1H)。
3-[1-甲基乙氧基]-5-[芐基氧基]苯甲酸 向3-[(1-甲基乙基)氧基]-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯(37g)在1∶1的THF/甲醇混合物(300mL)內(nèi)的溶液中加入氫氧化鈉溶液(4M)(150ml)。將該混合物回流45分鐘，然后真空除去有機(jī)相。用鹽酸(2M)將水相酸化至pH4，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相合并，用水、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，并真空濃縮，獲得了所需的化合物(33.45g)。其不用純化而直接使用。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.26(d，6H)，4.59-4.69(m，1H)，5.15(s，2H)，6.80(app t，1H)，7.04(m，1H)，7.12(m，1H)，7.33(app t，1H)，7.40(t，2H)，7.46(d，2H)，12.95(s，1H)。
3-[1-甲基乙氧基]-5-[芐基氧基]苯甲酸甲酯 向3-羥基-5-[(1-甲基乙基)氧基]苯甲酸甲酯(25g)在DMF(250mL)內(nèi)的溶液中加入無(wú)水碳酸鉀(297mmol)和芐基溴(143mmol)。將該混合物在60℃攪拌5小時(shí)，然后冷卻至室溫。真空除去溶劑，把殘余物在乙酸乙酯與水之間分配。將有機(jī)相合并，進(jìn)一步用水、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，并真空濃縮，獲得了所需的化合物(37g)。其不用純化而直接使用。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.26(d，6H)，3.84(s，3H)，4.61-4.70(m，1H)，5.12(s，2H)，6.84(t，1H)，7.05(app t，1H)，7.12-7.15(m，1H)，7.31-7.37(m，1H)，7.40(t，2H)，7.46(d，2H)3-羥基-5-[1-甲基乙氧基]苯甲酸甲酯 向3，5-二羥基苯甲酸甲酯(0.1mol)在DMF(180mL)內(nèi)的攪拌著的溶液中加入碳酸鉀粉末(0.2mol)和2-碘丙烷(0.1mol)，將所得混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。將該反應(yīng)混合物倒入水(1000mL)中，用乙醚萃取該混合物。將萃取液合并，依次用水(2次)和鹽水洗滌；將該溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空蒸發(fā)，獲得了粗產(chǎn)物，為淺黃色油狀物(12.6g)。將其用甲苯(40mL)處理，讓其靜置過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾除去不溶物(苯酚原料)，把濾液真空蒸發(fā)。將所得油狀物進(jìn)行色譜法純化(2×90g Biotage硅膠筒，用含有乙酸乙酯，10％增至15％v/v的己烷洗脫)。獲得了本標(biāo)題化合物，為油狀物(產(chǎn)率為25％)，TLC表明，其與通過(guò)類(lèi)似方法制得的樣本相同。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.2(d，6H)，3.8(s，3H)，4.5-4.6(hept，1H)，6.55(m，1H)，7.85(m，1H)，7.95(m，1H)，9.8(s，1H)。
實(shí)施例36-[3-{4-氟苯氧基}-5-{(1S)-1-甲基丙-2-炔-1-基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸 實(shí)施例3是按照方法A，由相應(yīng)的酯6-{[3-[(4-氟苯基)氧基]-5-{[(1S)-1-甲基丙-2-炔-1-基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯制得的，然而，將酸性沉淀用乙酸乙酯萃取幾次，并濃縮，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為55％)。
m/z 421(M+H)+，419(M-H)-，1H NMRδ(d6-DMSO)1.55(d，3H)，3.55(s，1H)，5.21(m，1H)，6.83(s，1H)，7.15(m，2H)，7.25(m，3H)，7.47(s，1H)，8.27(m，2H)，8.86(s，1H)，11.15(s，1H)，13.13(brs，1H)。
用于實(shí)施例3的制備的中間體是如下所述制得的。
6-[3-{4-氟苯氧基}-5-{[(1S)-1-甲基丙-2-炔-1-基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 將偶氮二甲酸二異丙酯(1.1mmol)以滴加的方式加到6-[({3-[(4-氟苯基)氧基]-5-羥基苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯(1mmol)、三苯基膦(1.1mmol)和(R)3-丁炔-2-醇(1.1mmol)在THF(10mL)內(nèi)的溶液中。將該反應(yīng)在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。將該反應(yīng)混合物真空濃縮，把殘余物用1∶1乙酸乙酯/異己烷研制，過(guò)濾，把濾液真空濃縮。通過(guò)硅膠色譜純化殘余物，用20-25％乙酸乙酯在異己烷中的混合物作為洗脫劑，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為74％)。
m/z 436(M+H)+。
6-[3-{4-氟苯氧基}-5-羥基苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 在氬氣氛下，將披鈀碳(10％重量)(250mg)加到6-[({3-[(4-氟苯基)氧基]-5-[(苯基甲基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯(5.28mmol)在THF(70mL)和甲醇(70mL)內(nèi)的溶液中。將該惰性氣氛用氫氣替換，將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將氫氣氛用空氣替換，將該反應(yīng)混合物經(jīng)由硅藻土過(guò)濾，并真空濃縮。把殘余物通過(guò)硅膠色譜純化，用1-5％甲醇在DCM內(nèi)的混合物作為洗脫劑，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為78％)。
m/z 383(M+H)+，381(M-H)-，1H NMRδ(d6-DMSO)3.86(s，3H)，6.56(s，1H)，7.14(m，4H)，7.24(m，2H)，8.27(m，2H)，8.87(s，1H)，9.93(s，1H)，11.08(s，1H)。
6-[3-{4-氟苯氧基}-5-{芐基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 將草酰氯(22.2mmol)加到3-[(4-氟苯基)氧基]-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸(7.39mmol)在DCM(50mL)和DMF(0.5mL)內(nèi)的漿液中。將該反應(yīng)在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，然后真空濃縮。把殘余物與DCM(×3)共沸，真空干燥。向殘余物中加入6-氨基煙酸甲酯(8.87mmol)和吡啶(40-50mL)，將該反應(yīng)在氬氣氛下攪拌16小時(shí)。將該反應(yīng)真空濃縮，把殘余物在乙酸乙酯與鹽酸(2M)之間分配。分離出有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并真空濃縮。通過(guò)硅膠色譜純化殘余物，使用30％乙酸乙酯在異己烷中的混合物作為洗脫劑，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為72％)。
m/z 473(M+H)+，471(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)3.86(s，3H)，5.19(s，2H)，6.85(s，1H)，7.01-7.48(m，10H)，7.51(s，1H)，8.29(m，2H)，8.89(s，1H)，11.21(s，1H)。
3-(4-氟苯氧基)-5-(芐基氧基)苯甲酸 將氫氧化鈉溶液(1N)(42mmol)加到3-[(4-氟苯基)氧基]-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯(8.32mmol)在甲醇(30mL)和THF(10mL)內(nèi)的溶液中。將該反應(yīng)在室溫?cái)嚢?6小時(shí)，真空除去有機(jī)溶劑，用水代替。將該反應(yīng)混合物用鹽酸(2M)酸化，把沉淀過(guò)濾，用水洗滌，真空干燥，獲得了所需的化合物(產(chǎn)率為89％)。
m/z 337(M-H)-；1HNMR δ(d6-DMSO)5.14(s，2H)，6.89(s，1H)，6.96(s，1H)，7.14(m，2H)，7.17-7.49(m，8H)，13.07(brs，1H)。
3-(4-氟苯氧基)-5-(芐基氧基)苯甲酸甲酯
按照方法B，由3-羥基-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯制得了上述化合物。
m/z 351(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)3.80(s，3H)，5.15(s，2H)，6.88-7.00(m，2H)，7.06-7.50(m，10H)。
3-羥基-5-(芐基氧基)苯甲酸甲酯 實(shí)施例1中已經(jīng)描述了3-羥基-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯的制備。
生物學(xué)試驗(yàn)本發(fā)明的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的生物作用可以在下列試驗(yàn)中測(cè)試(1)GLK的酶活性可以通過(guò)培養(yǎng)GLK、ATP和葡萄糖來(lái)測(cè)定。產(chǎn)物生成的速率可以通過(guò)將該試驗(yàn)與G-6-P脫氫酶、NADP/NADPH體系偶聯(lián)并測(cè)定340nm下光密度的增加來(lái)測(cè)定(Matschinsky等人1993)?；衔飳?duì)GLK的激活可以使用該試驗(yàn)，在或不在GLKRP(GLK調(diào)控蛋白)存在下來(lái)評(píng)估，如Brocklehurst等人所述(Diabetes 2004，53，535-541)。
(2)GLK/GLKRP結(jié)合試驗(yàn)用于測(cè)定GLK和GLKRP之間的結(jié)合作用。該方法可以用來(lái)鑒定通過(guò)調(diào)節(jié)GLK和GLKRP之間的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)GLK的化合物。將GLKRP和GLK與抑制濃度的F-6-P、任選在試驗(yàn)化合物存在的條件下培養(yǎng)，并且測(cè)定GLK和GLKRP之間的相互作用。置換F-6-P或以某些其他方式減弱GLK/GLKRP之間相互作用的化合物將通過(guò)GLK/GLKRP復(fù)合物生成量的減少來(lái)檢測(cè)。促進(jìn)F-6-P結(jié)合或以某些其他方式提高GLK/GLKRP相互作用的化合物將通過(guò)GLK/GLKRP復(fù)合物生成量的增加來(lái)測(cè)定。此類(lèi)結(jié)合試驗(yàn)的具體實(shí)例描述如下。
GLK/GLKRP閃爍計(jì)數(shù)近接試驗(yàn)如WO01/20327所述(其內(nèi)容引入本文以供參考)，重組人GLK和GLKRP用來(lái)顯色(develop)″混合和測(cè)定″96孔SPA(閃爍計(jì)數(shù)近接試驗(yàn)(scintillation proximity assay))。GLK(生物素化的)和GLKRP與鏈霉抗生物素蛋白連接的SPA珠(Amersham)在抑制濃度的放射性標(biāo)記的[3H]F-6-P(Amersham Custom Synthesis TRQ8689)的存在下培養(yǎng)，得到信號(hào)。置換F-6-P或以某些其他方式打破GLK/GLKRP結(jié)合相互作用的化合物使該信號(hào)消失。
結(jié)合試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。含有50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、2mM ATP、5mM MgCl2、0.5mM DTT、重組生物素化的GLK(0.1mg)、重組GLKRP(0.1mg)、0.05m Ci[3H]F-6-P(Amersham)的反應(yīng)混合物給出100ml的終體積。隨后培養(yǎng)，通過(guò)加入0.1mg/孔鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的SPA珠(Amersham)并在Packard TopCount NXT上閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定GLK/GLKRP復(fù)合物形成的程度。
(3)F-6-P/GLKRP結(jié)合試驗(yàn)用于測(cè)定GLKRP和F-6-P之間的相互作用。這種方法可以用來(lái)提供有關(guān)所述化合物的作用機(jī)理的信息。在GLK/GLKRP結(jié)合試驗(yàn)中鑒定的化合物可以通過(guò)置換F-6-P或通過(guò)以某些其他方式改變GLK/GLKRP相互作用來(lái)調(diào)節(jié)GLK和GLKRP的相互作用。例如，蛋白-蛋白的相互作用一般被認(rèn)為是通過(guò)多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)間的相互作用而發(fā)生。所以可能是改變GLK和GLKRP間相互作用的化合物可通過(guò)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)若干不同結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用。
F-6-P/GLKRP結(jié)合試驗(yàn)鑒定出只有那些通過(guò)從GLKRP上其結(jié)合位點(diǎn)置換F-6-P來(lái)調(diào)節(jié)GLK和GLKRP間相互作用的化合物。
GLKRP與試驗(yàn)化合物和抑制濃度的F-6-P、在GLK不存在的條件下培養(yǎng)，并且測(cè)定F-6-P和GLKRP之間相互作用的程度。置換F-6-P結(jié)合GLKRP的化合物可以通過(guò)GLKRP/F-6-P復(fù)合物生成量的改變來(lái)測(cè)定。該結(jié)合試驗(yàn)的具體實(shí)例如下所述。
F-6-P/GLKRP閃爍計(jì)數(shù)近接試驗(yàn)如WO01/20327所述(其內(nèi)容引入本文以供參考)，重組人GLKRP用來(lái)顯色″混合和測(cè)定″96孔閃爍計(jì)數(shù)近接試驗(yàn)。FLAG-標(biāo)記的GLKRP與蛋白A涂層的SPA珠(Amersham)和抗FLAG抗體在抑制濃度的放射性標(biāo)記的[3H]F-6-P的存在下培養(yǎng)。產(chǎn)生信號(hào)。置換F-6-P的化合物將使這個(gè)信號(hào)消失。本試驗(yàn)和所述GLK/GLKRP結(jié)合試驗(yàn)的聯(lián)用將使觀察者能夠鑒定出通過(guò)置換F-6-P打破GLK/GLKRP結(jié)合作用的化合物。
結(jié)合試驗(yàn)是在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。含有50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、2mM ATP、5mM MgCl2、0.5mM DTT、重組FLAG標(biāo)記的GLKRP(0.1mg)，抗Flag M2抗體(0.2mg)(IBI Kodak)、0.05mCi[3H]F-6-P(Amersham)的反應(yīng)混合物得到100ml的終體積。培養(yǎng)后，通過(guò)加入0.1mg/孔鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的SPA珠(Amersham)并在PackardTopCount NXT上閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定F-6-P/GLKRP復(fù)合物形成的程度。
重細(xì)GLK和GLKRP的制備mRNA的制備人肝臟全mRNA是通過(guò)在4M異硫氰酸胍、2.5mM檸檬酸鹽、0.5％Sarkosyl、100mM β-巰基乙醇中polytron均化、隨后經(jīng)5.7MCsCl、25mM乙酸鈉在135,000g(最大)離心、按照Sambrook J，F(xiàn)ritschEF & Maniatis T，1989所述來(lái)制備。
Poly A+mRNA直接利用FastTrack″M mRNA分離試劑盒(Invitrogen)來(lái)制備。
GLK和GLKRP cDNA序列的PCR擴(kuò)增人GLK和GLKRP cDNA通過(guò)PCR、由人肝臟mRNA、利用Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，1989中所述的建立的技術(shù)來(lái)獲得。按照Tanizawa等1991和Bonthron，D.T.等1994(后者在Warner，J.P.1995修正)中所述的GLK和GLKRP cDNA 序列設(shè)計(jì)PCR引物。
在Bluescript II運(yùn)載體中克隆使用pBluescript II(Short等人1998)將GLK和GLKRP cDNA克隆在大腸桿菌中，pBluescript II是類(lèi)似于Yanisch-Perron C等(1985)所用的重組克隆載體體系，包含帶有含多個(gè)獨(dú)特限制位點(diǎn)的多連接體DNA片段的colEI-基復(fù)制子，側(cè)面具有噬菌體T3和T7啟動(dòng)子序列；復(fù)制的絲狀噬菌體源和氨芐青霉素耐藥性標(biāo)記基因。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化一般通過(guò)電穿孔來(lái)進(jìn)行。菌株DH5a或BL21(DE3)的400ml培養(yǎng)物在L-肉湯中生長(zhǎng)至OD 600為0.5且通過(guò)在2,000g下離心來(lái)收獲。細(xì)胞用冰冷的去離子水洗滌2次，再次懸浮在1ml 10％甘油中并以等份試樣保存在-70℃。連接混合物用Millipore V seriesTM膜(0.0025mm)孔徑)脫鹽。40ml的細(xì)胞與1ml的連接混合物或質(zhì)粒DNA在冰上在0.2cm電穿孔比色杯中培養(yǎng)10分鐘，并且隨后利用GenePulserTM儀(BioRad)在0.5kVcm-1，250mF下加脈沖。在補(bǔ)充有10mg/ml四環(huán)素或100mg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。
表達(dá)GLK由載體pTB375NBSE在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生重組蛋白，該重組蛋白含有與N-末端蛋氨酸緊鄰的6-His標(biāo)記?；蛘撸硪环N適當(dāng)?shù)牟皿w是pET21(+)DNA，Novagen，登記號(hào)697703。該6-His標(biāo)記用于重組蛋白在填充有購(gòu)自Qiagen(cat no 30250)的鎳-次氮基三乙酸瓊脂糖的柱上純化。
GLKRP由載體pFLAG CTC(IBI Kodak)在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá)，生成重組蛋白，該重組蛋白含有C-末端FLAG標(biāo)記。該蛋白首先通過(guò)DEAE瓊脂糖離子交換純化，隨后利用FLAG標(biāo)記在購(gòu)自Sigma-Aldrich(catno.A1205)的M2抗-FLAG免疫親和性柱上進(jìn)行最后純化。
GLK的生物素化GLK通過(guò)與購(gòu)自Sigma-Aldrich(登記號(hào)B2643)的生物素酰氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(生物素-NHS)反應(yīng)來(lái)生物素化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，靶向蛋白(GLK)的游離氨基與生物素-NHS以指定摩爾比反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，得到含有共價(jià)結(jié)合的生物素的產(chǎn)物。通過(guò)透析除去產(chǎn)物中的過(guò)量、未偶聯(lián)的生物素-NHS。具體而言，將7.5mg的GLK加入到存在于4mL 25mM HEPES pH＝7.3，0.15M KCl，1mM二硫蘇糖醇，1mMEDTA，1mM MgCl2(緩沖液A)中的0.31mg生物素-NHS。將該反應(yīng)混合物相對(duì)于100mL的含有22mg生物素-NHS的緩沖液A透析。4小時(shí)后通過(guò)對(duì)緩沖液A的充分透析除去過(guò)量的生物素-NHS。
對(duì)大鼠口服給藥后測(cè)定血漿水平和血漿蛋白結(jié)合化合物對(duì)大鼠給藥以及取血樣將行星式研磨的化合物[15分鐘s，500rpm，5 Zirconium Balls，在Puluerisette 7Mill(Glen Creston Ltd，Stanmore，Middlesex，UK)中]懸浮在0.5％HPMC Tween中，以5ml/kg的速度和0.3-10mg/kg的劑量通過(guò)口服管飼法對(duì)高脂肪飲食(Research Diets，D12451，隨意進(jìn)食14天)雌性Alderley Park Zucker或Alderley Park Wistar大鼠進(jìn)行給藥。
如下所述通過(guò)意識(shí)清醒狀態(tài)下的取血樣或最終的取血樣來(lái)獲得血樣意識(shí)清醒狀態(tài)下的取血樣(用于化合物水平或血液化學(xué))-靜脈內(nèi)血樣是使用600μl Starstedt Multivette(EDTA)和22G針頭在所需時(shí)間點(diǎn)從尾巴抽取的。在取血樣后的15-30分鐘內(nèi)，將血樣在冰上保持，并且以3000rpm離心10分鐘。抽吸出血漿，在-20℃貯存。
用于化合物水平或血液化學(xué)的最終的取血樣-在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過(guò)暴露于而CO2/O2將動(dòng)物安樂(lè)死。通過(guò)心臟穿刺來(lái)提取血樣。在取血樣后的15-30分鐘內(nèi)，將血樣在冰上保持，并且以3000rpm離心10分鐘。抽吸出血漿，在-20℃貯存。
測(cè)定大鼠血漿中的化合物水平將25μl大鼠血漿加到96孔蛋白沉淀板(Varian inc.Palo Alto，California，USA)的孔中。向每個(gè)孔中加到含有1ug/ml作為內(nèi)標(biāo)物的(3-異丙氧基-5-芐基氧基-苯甲?；?氨基吡啶-3-甲酸的500μl乙腈中以沉淀出血漿蛋白。然后將血漿/溶劑混合物在真空下從沉淀板中洗脫出來(lái)，收集洗脫液。使用離心蒸發(fā)器將洗脫液蒸發(fā)至干，在200μl甲醇∶水∶甲酸(60∶40∶0.1)中重新構(gòu)成。
然后高效液相色譜法分析重新構(gòu)成的樣本，該色譜具有串連的質(zhì)譜檢測(cè)(HPLC-MS-MS)″。該HPLC使用Phenomenex Prodigy C8，50×4.6，5μm.柱(Phenomenex，Macclesfield，UK)以1ml/分鐘的流速，使用10μl的注射體積以及下列梯度洗脫來(lái)進(jìn)行流動(dòng)相A 0.1％甲酸水溶液流動(dòng)相B 0.1％甲酸在甲醇中的溶液流動(dòng)相梯度0分鐘50％A0.5分鐘5％A2.5分鐘5％A2.6分鐘50％A3.0分鐘50％A.
質(zhì)譜是用Applied Biosystems API3000質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，USA)進(jìn)行的。在運(yùn)轉(zhuǎn)樣本之前，將質(zhì)譜儀進(jìn)行關(guān)于試驗(yàn)化合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。
試驗(yàn)樣本的濃度是由試驗(yàn)樣本的峰高度與內(nèi)標(biāo)物的峰高度的比例確定的。從關(guān)于濃度比例的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試驗(yàn)樣本的濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是用如上所述進(jìn)行處理的加到大鼠血清樣本中的已知濃度的試驗(yàn)樣本，使用(3-異丙氧基-5-芐基氧基-苯甲?；?氨基吡啶-3-甲酸作為內(nèi)標(biāo)物而制得的。
測(cè)定化合物與血漿蛋白的結(jié)合化合物與血漿蛋白的結(jié)合是用平衡透析技術(shù)(W.Lindner等人，J.Chromatography，1996，677，1-28)測(cè)定的。在37℃，使用血漿和等滲磷酸鹽緩沖液pH 7.4(在每個(gè)透析室中分別為1ml)將化合物以20μM的濃度透析18小時(shí)。使用Spectrum20-室平衡透析儀以及Teflon半微透析室和Spectra/Por2膜盤(pán)，其分子量截止為12-14000道爾頓，47mm(由PerBio Science UK Ltd，Tattenhall，Cheshire提供)。透析之后，取出血漿和緩沖液樣本，使用HPLCUV/MS(具有UV和質(zhì)譜檢測(cè)的高效液相色譜)進(jìn)行分析，獲得了在血漿中的％游離水平。
評(píng)估血漿半衰期血漿半衰期是指化合物在血漿中的濃度降至其初始值的一半時(shí)的時(shí)間。這一般是通過(guò)如下方法測(cè)定的靜脈內(nèi)施用試驗(yàn)化合物，然后如上所述測(cè)定血漿樣本中的化合物濃度。從半對(duì)數(shù)圖中估測(cè)血漿半衰期，所述圖是用血漿濃度的log值(lnCp)對(duì)著取樣時(shí)間(t，直線)而繪制的。表現(xiàn)一級(jí)消除速度常數(shù)k等于直線的斜率，消除半衰期(t1/2)是速度常數(shù)的倒數(shù)(Gibaldi，M和Perrier，D，1975 Pharmacokinetics，MarcelDekker，New York)t1/2=1k]]>本發(fā)明化合物具有下列特征(i)對(duì)于葡糖激酶的激活活性，其EC50小于約00nM；(ii)在血漿中的百分比游離濃度為約0.04％-約1％；(iii)對(duì)于1mg化合物/kg大鼠體重的標(biāo)準(zhǔn)化劑量，峰值血液水平(包括結(jié)合和游離的)為約0.3μM-約10μM；和(iv)在血漿中的半衰期(t1/2)為至少約1小時(shí)。
例如，實(shí)施例1的化合物具有下列值
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權(quán)利要求
1.式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑化物 式(I)其中R1選自氟、氯、C1-3烷基和C1-3烷氧基；R2-X-選自甲基、甲氧基甲基和 n是0、1或2。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ia)化合物 式(Ia)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ib)化合物 式(Ib)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ic)化合物 式(Ic)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Id)化合物 式(Id)其中R1和n如上面式(I)化合物中所定義；或其鹽、溶劑化物或前藥。
6.選自下列的化合物6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-甲基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-苯氧基苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3，5-二氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-氟苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-氯-5-氟苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{3-乙氧基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-{(1S)-1-甲基-2-甲氧基-乙氧基}-5-{4-甲氧基苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-異丙氧基-5-{3，5-二氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-異丙氧基-5-{苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；6-[3-異丙氧基-5-{3-氟-苯氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸；和6-[3-{4-氟苯氧基}-5-{(1S)-1-甲基丙-2-炔-1-基氧基}苯基羰基氨基]吡啶-3-甲酸或其鹽、溶劑化物或前藥。
7.藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥與可藥用稀釋劑或載體。
8.用作藥物的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
9.用于制備用來(lái)治療通過(guò)GLK介導(dǎo)的疾病，特別是2型糖尿病的藥物的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
10.治療GLK介導(dǎo)的疾病，尤其是糖尿病的方法，包括給需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
11.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥在制備用于糖尿病和肥胖的聯(lián)合治療或預(yù)防的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥在制備用于治療或預(yù)防肥胖的藥物中的應(yīng)用。
13.用于肥胖和糖尿病的聯(lián)合治療的方法，包括給需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
14.用于治療肥胖的方法，包括給需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑化物或前藥。
15.制備權(quán)利要求1的式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑化物的方法，所述方法包括(a)將式(IIIa)的酸或其活化衍生物與式(IIIb)化合物反應(yīng) 式(IIIa) 式(IIIb)；其中P1是氫或保護(hù)基；或者(b)將式(IIIc)化合物脫保護(hù)， 式(IIIc)其中P2是保護(hù)基；或者(c)將式(IIId)化合物與式(IIIe)化合物反應(yīng)， 式(IIId)式(IIIe)其中X1是離去基團(tuán)，且X2是羥基，或者X1是羥基，且X2是離去基團(tuán)，并且P1是氫或保護(hù)基；或者(d)將式(IIIf)化合物與式(IIIg)化合物反應(yīng) 式(IIIf)式(IIIg)其中X3是離去基團(tuán)或有機(jī)金屬試劑，并且X4是羥基，或者X3是羥基，并且X4是離去基團(tuán)或有機(jī)金屬試劑，并且其中P1是氫或保護(hù)基；或者(e)將式(IIIh)化合物與式(IIIi)化合物反應(yīng)， 式(IIIh) 式(IIIi)；其中X5是離去基團(tuán)，并且其中P1是氫或保護(hù)基；并且之后如果需要的話i)將一種式(I)化合物轉(zhuǎn)化成另一種式(I)化合物；ii)除去任何保護(hù)基；iii)形成其鹽、前藥或溶劑化物。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑化物，其中R
文檔編號(hào)A61K31/455GK1886377SQ200480035324
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2004年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月29日
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