專利名稱：Tim－3配體及其方法
相關(guān)的申請本發(fā)明要求了2003年10月3日提出的標(biāo)題為TIM-3配體及其方法的美國申請No.60/508,319的申請日期的優(yōu)先權(quán)。引用的專利申請的教導(dǎo)通過在此引述而合并于本文。
政府基金本文所述工作得到由國家健康研究所資助，資助基金號為1R01NS045937-01，2R01NS35685-06，2R37NS30843-11，1RO1AI44880-03，2PO1AI39671-07，1PO1NS38037-04和1F31GM20927-O1。因此，美國政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)力。
背景技術(shù)：
在抗原的刺激作用下，根據(jù)它們的細(xì)胞因子譜定義的初始CD4+T輔助細(xì)胞形成兩個主要的效應(yīng)通路，Th1和Th2細(xì)胞(參考文獻(xiàn)Mosmann et al.J Immunol 136，2348-2357(1986)，Mosmann et al.Immunol Today 19，138-146(1996)，Abbas，et al.Nature 383，787-793(1996))。
Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(干擾素IFN-γ、白細(xì)胞間介素(IL)-2、腫瘤壞死因子TNF-α和淋巴毒素子)，該細(xì)胞因子經(jīng)常與抗細(xì)胞內(nèi)病原體的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)相關(guān)。不合適的Th1反應(yīng)的病理結(jié)果是遲發(fā)型超過敏性(DTH)反應(yīng)(參考文獻(xiàn)Sher，et al.Annu RevImmunol.10，385-409(1992))、器官特異性自身免疫病的誘發(fā)(參考文獻(xiàn)Liblau，et al.Immunol Today 16，34-38(1995))、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸疾病(IBD)、I型糖尿病多發(fā)性硬化癥、和同種異體移植排斥。
Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-4，IL-10和IL-13)，該細(xì)胞因子對于細(xì)胞外蠕蟲感染的清除是必需的，并且不合適的Th2細(xì)胞活化引發(fā)特應(yīng)性疾病和過敏性疾病的發(fā)生(參考文獻(xiàn)Abbas，et al.Nature 383，787-793(1996)，Sher，et al.Annu Rev Immunol.10，385-409(1992))，例如過敏性哮喘。
除了他們在疾病中的不同作用之外，兩個輔助性T細(xì)胞亞群也交匯調(diào)節(jié)彼此的擴(kuò)增和功能。因此，Th2細(xì)胞的優(yōu)先誘導(dǎo)抑制了自體免疫疾病(參考文獻(xiàn)Nicholson，L.，et al.Immunity 3，397-405(1995)，Kuchroo，et al.Cell 80，707-718(1995))，然而Th1細(xì)胞的主要誘導(dǎo)可以調(diào)節(jié)哮喘、特應(yīng)性疾病和過敏癥(參考文獻(xiàn)Lack，et al.J Immunol 152，2546-2554(1994)；Hofstra，et al.JImmunol 161，5054-5060(1998))。
申請人最近已經(jīng)確定了新的細(xì)胞表面蛋白，Tim-3，該細(xì)胞表面蛋白在Th1細(xì)胞上有表達(dá)而在Th2細(xì)胞上無表達(dá)。Tim-3(T細(xì)胞免疫球蛋白和包含分子的T細(xì)胞黏蛋白結(jié)構(gòu)域)是281個氨基酸的I型膜蛋白，其胞外域由跟隨著粘液樣區(qū)域的類IgV結(jié)構(gòu)域組成。Tim-3的人直系同源性與小鼠的Tim-3氨基酸一致性為63％。Tim-3與其Tim家族成員是多形態(tài)的，并且與小鼠哮喘相關(guān)(參考文獻(xiàn)McIntire，J.et al.Nat Immunol 2，1109-1116(2001))。此外，Tim基因家族區(qū)是與人主要哮喘易感基因是同線的(參考文獻(xiàn)McIntire，J.et al.Nat Immunol 2，1109-1116(2001))。這些研究強(qiáng)調(diào)了Tim-3和Tim基因家族在免疫介導(dǎo)疾病的調(diào)節(jié)中的重要性。
在體內(nèi)進(jìn)行中的免疫反應(yīng)的試驗(yàn)期間，抗Tim-3抗體給藥增加了巨噬細(xì)胞的活性和擴(kuò)增(參考文獻(xiàn)Monney，L.et al.Nature415，536-541(2002)。抗Tim-3抗體治療也加劇了自體免疫疾病實(shí)驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎(EAE)，顯著性地提高了死亡率和導(dǎo)致增強(qiáng)的脫髓鞘和活性巨噬細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的滲透。
因此，保持了對鑒定試劑的需求，這種鑒定試劑調(diào)節(jié)tim-3功能，并且因此調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本發(fā)明的某些方面提供了這樣的試劑，鑒定該試劑的方法，和采用這個試劑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的多肽、核酸和組合物，包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的有效多肽、核酸和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了受驗(yàn)者所需的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，和鑒定可被用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑的方法。
本發(fā)明提供了分離多肽，該分離多肽包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域和tim-3細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中多肽不包括tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也提供了編碼這種多肽的核酸。
本發(fā)明也提供了分離核酸，這種分離核酸在高嚴(yán)緊條件下與編碼可溶tim-3的核酸雜交，但這種分離核酸在高嚴(yán)緊條件下不與編碼全長tim-3雜交。這種核酸的多種用途之一是對調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)為有效的。
此外，本發(fā)明提供了藥品包裝，該藥品包裝包括(i)多肽，這種多肽包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域；和(ii)對治療增生病癥的受驗(yàn)者組合物給藥的說明書。
本發(fā)明又提供了分離抗體或其片斷，該分離抗體或片斷與在SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合，但該分離抗體或片斷不與在SEQ ID NO13中列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合。同樣的，本發(fā)明提供了分離的抗體或其片斷，該分離抗體或片斷與在SEQ ID NO4中列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合，但該分離抗體或片斷不與在SEQ ID NO14中列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受驗(yàn)者免疫反應(yīng)的方法，例如受驗(yàn)者免疫忍受性，該方法包對受驗(yàn)者給藥有效劑量的調(diào)節(jié)tim-3活性的藥劑。本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)受驗(yàn)者的免疫反應(yīng)的方法，例如Th1反應(yīng)和Th2反應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑的方法，和鑒定調(diào)節(jié)tim-3和其配體的相互作用的試劑的方法，例如galectin-9。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)治療任何這里描述的紊亂的藥劑的試劑。這里公開的通過給受驗(yàn)者服用藥物來治療或預(yù)防紊亂的任何方法可以被用于該試劑在治療紊亂的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。例如，在一個具體實(shí)施方案中，tim-3IgV-HAS融合蛋白可被用在治療Th2-介導(dǎo)紊亂藥物的生產(chǎn)中，而聚乙二醇化galectin-9多肽可被用在治療Th1-介導(dǎo)紊亂藥物的生產(chǎn)中。
附圖的簡要說明

圖1顯示了Tim-3可變剪切可溶形式的鑒定。(a)Tim-3的全長形式和可變剪切形式從cDNA中被擴(kuò)增，該cDNA從伴刀豆球蛋白A-激活的脾細(xì)胞產(chǎn)生。在Tim-3基因的5′和3′UTR設(shè)計引物，并且進(jìn)行RT-PCR。產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上分解，并且使用溴乙非啶溴化物(曲線1)顯影。800bp和1kb的擴(kuò)增子被克隆到pEF6載體中。為了證實(shí)此克隆，采用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA(New England Biolabs)。使用染料標(biāo)記終止反應(yīng)，并在1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行操作，使用溴乙非啶溴化物顯影(曲線2和曲線3)。包含1kb或800bp的插入物的克隆被排序。曲線1，使用Tim-3-F和Tim-3-R引物，伴刀豆球蛋白A(con-A)活化的脾細(xì)胞cDNA通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增；曲線2，1kb克隆產(chǎn)物，fl-Tim-3；曲線3，800bp克隆產(chǎn)物，s-Tim-3。(b)來自1kb擴(kuò)增子的核苷酸序列的預(yù)期氨基酸翻譯符合Tim-3全長形式(fl-Tim-3)，該Tim-3全長形式由信號肽、IgV結(jié)構(gòu)域、黏蛋白結(jié)構(gòu)域、穿膜結(jié)構(gòu)域和胞漿域。來自fl-Tim-3的800bp擴(kuò)增子的核苷酸序列的氨基酸翻譯比對證明了新的異構(gòu)體(s-Tim-3)，這種異構(gòu)體僅包含信號肽、IgV結(jié)構(gòu)域和胞漿域。(c)Tim-3基因結(jié)構(gòu)示意圖、和fl-Tim-3和s-Tim-3相應(yīng)的可變剪接轉(zhuǎn)錄子。小鼠的Tim-3基因由7個外顯子組成。fl-Tim-3轉(zhuǎn)錄子由所有的7個外顯子組成。相反，s-Tim-3轉(zhuǎn)錄子僅由外顯子1、外顯子2、外顯子6和外顯子7組成。轉(zhuǎn)錄子的編碼區(qū)信號肽、IgV結(jié)構(gòu)域、黏蛋白結(jié)構(gòu)域、穿膜(tm)結(jié)構(gòu)域和胞漿域被顯示出來。
圖2顯示了Tim-3-配體在CD4+T細(xì)胞上有表達(dá)，(a)來自C57BL/6老鼠的完整脾細(xì)胞CD4+柱被純化、染色、和為CD4表達(dá)門控、和不同表面標(biāo)志物(CD25，CD62L，CD44，CD45RB和CD54)共同染色。為Tim-3-Ig，細(xì)胞被具有生物素化ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig與作為第二檢測試劑的鏈霉親和素(streptavidin-PE)共同染色。細(xì)胞在CD4+和正的表面標(biāo)記物群、或負(fù)表面標(biāo)記物群上被門控。插圖說明(細(xì)虛線)hIgG；(實(shí)粗線)，s-Tim-3-Ig；(粗點(diǎn)線)，ex-Tim-3-Ig。(b)Th1(AE7)和Th2(LR1F1)克隆用具有生物素化s-Tim-3-Ig或hIgG染色，后用鏈霉親和素(streptavidin-PE)染色。細(xì)胞作為休眠細(xì)胞被染色(0天)，在4天后活化作用時作為活化細(xì)胞(4天)被染色，和在10天的后活化作用時作為休眠細(xì)胞(10天)被染色。圖hIgG(細(xì)虛線)；(實(shí)粗線)s-Tim-3-Ig；圖3顯示了Tim-3-Ig給藥誘導(dǎo)了Th1細(xì)胞因子過度增殖和Th1細(xì)胞因子自發(fā)生成。(a)使用PLP 139-151/CFA使SJL/J老鼠免疫，并且從0-8天之間每隔一天腹膜內(nèi)注射100μg ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig，或hIgG(100，μg)或PBS(100μl)作為對照。老鼠在第10天就死亡了，取走老鼠的脾，在無肽的重復(fù)刺激下體外培養(yǎng)48小時。48小時后，采用[3H]胸苷摻入法測量48小時后三重孔中的增值。在48小時的時候，取走上清液，用在細(xì)胞因子ELISAs中；IL-2和IFN-γ產(chǎn)物被顯示出來；無IL-4，IL-10或TNF-α被檢測出來。顯示出個體老鼠的數(shù)據(jù)；10個增殖實(shí)驗(yàn)和5個細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)的代表性。(b)在10天的時候，使用0-100μg PLP 139-151肽體外刺激從免疫的、融合蛋白治療的老鼠身上取走的脾細(xì)胞。48小時后，采用[3H]胸苷摻入法測量三重孔中的增殖。在48小時的時候，取走使用PLP 139-151肽重復(fù)刺激的完整脾細(xì)胞的體外培養(yǎng)物的上清液，采用細(xì)胞因子ELISAs對IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α和IFN-γ進(jìn)行檢測。IL-2和IFN-y生成被顯示出來；沒有IL-4，IL-10或TNF-α被檢測出來。插圖說明▲，PBS；■，hIgG；●，ex-Tim-3-Ig；和○，處理過的s-Time-3-Ig。給出個體老鼠的數(shù)據(jù)；10個增值實(shí)驗(yàn)和5個細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)的代表性。
圖4顯示了通過T細(xì)胞被介導(dǎo)的自發(fā)過度增殖和細(xì)胞因子的釋放。(a)使用PLP 139-151/CFA使SJL/J老鼠免疫，并且使用100μg的ex-Tim-3-Ig或hIgG對SJL/J老鼠腹膜內(nèi)(從0-8天之間每隔一天)給藥治療作為對照，在10天的時候老鼠死亡。T，B和CD11b+細(xì)胞從脾中被純化。或者完整脾細(xì)胞(5×105)或者T細(xì)胞(105)在或者有2×105B細(xì)胞情況下或無2×105B細(xì)胞情況下孵育，在有2×105CD11b+細(xì)胞情況下或無2×105CD11b+細(xì)胞情況下孵育，或者兩者都有的情況下孵育或兩者均無的情況下孵育，并且進(jìn)行增殖反應(yīng)測量(在triplicate wells中采用[3H]胸苷摻入測量法)。結(jié)果表示為四個被組合老鼠的平均值；三個實(shí)驗(yàn)的代表性性。(b)在48小時的時候，取走在(a)中描述的體外培養(yǎng)物的上層清液，采用細(xì)胞因子ELISAs對IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α和IFN-γ進(jìn)行檢測。IL-2和IFN-y產(chǎn)物被表示出來；沒有IL-4，IL-10或TNF-α被檢測出來。結(jié)果表示為四個被組合老鼠的平均值。(c)使用PLP 139-151/CFA使SJL/J老鼠免疫，并且從0-8天之間每隔一天，腹膜內(nèi)給藥100μg ex-Tim-3-Ig，s-Tim-3-Ig或hIgG作為對照，在10天的時候取走脾。使用10μg BrdU在體外孵育完整脾細(xì)胞。48小時后，使用mAbs給CD3，CD25，CD69和BrdU細(xì)胞染色。圓點(diǎn)圖表示細(xì)胞群和BrdU摻入。結(jié)果是對個體老鼠的；是4個實(shí)驗(yàn)的代表。
圖5顯示了體內(nèi)Tim-3-Ig治療阻止了耐受性的誘導(dǎo)。使用PLP 139-151/CFA使SJL/J老鼠免疫和同時給老鼠腹膜內(nèi)注射誘導(dǎo)耐受性的500mg可溶PLP 139-151(或作為對照載體的PBS)。從0-8天之間每隔一天，給老鼠腹膜內(nèi)注射100mg ex-Tim-3-Ig或hIgG作為對照組。在10天的時候，老鼠死亡，取走淋巴結(jié)，增加PLP 139-151肽的濃度體內(nèi)孵育細(xì)胞(2×105/孔)(數(shù)據(jù)顯示100mg/ml PLP 139-151)。48小時后，采用[3H]胸苷摻入法測量三重孔里的增殖。在48小時的時候，取走體外培養(yǎng)物的上層清液，采用細(xì)胞因子ELISAs對IL-2，IL-4，IL-10和IFN-g進(jìn)行檢測。通過t檢驗(yàn)得到P值。插圖說明當(dāng)無耐受(PBS)hIgG組與耐受性(PLP)hIgG組對比時， P＜0.01。當(dāng)耐受性(PLP)hIgG組與耐受性(PLP)Tim-3-Ig組對比時，P＜0.01。當(dāng)無耐受(PBS)hIgG組與耐受性(PLP)hIgG組對比時， P＜0.01。當(dāng)耐受性(PLP)hIgG組與耐受性(PLP)Tim-3-Ig組對比時，◇P＜0.05。當(dāng)無耐受(PBS)hIgG組與耐受性(PLP)hIgG組對比時，§P＜0.5。當(dāng)耐受性(PLP)hIgG組與耐受性(PLP)Tim-3-Ig組對比時，ˇP＜0.1。
圖6顯示了Tim-3-Ig的給藥阻止了耐受性誘導(dǎo)。(a)使用PLP139-151/CFA使SJL/J老鼠免疫和同時給SJL/J老鼠免疫腹膜內(nèi)注射誘導(dǎo)耐受性的500μg可溶PLP 139-151(或作為對照載體的PBS)。從0-8天之間每隔一天，給老鼠腹膜內(nèi)注射100μgex-Tim-3-Ig、或PBS(100μl)、或hIgG(100μg)作為對照。在10天的時候，老鼠死亡，取走脾，增加PLP 139-151肽的濃度體外孵育細(xì)胞。48小時后，采用[3H]胸苷摻入法測量三重孔里的增殖。給老鼠輸注作為耐受源的對照PBS，△，PBS；□，hIgG，和○，ex-Tim-3-Ig治療。給老鼠輸注作為耐受源的對照PLP，▲，PBS，■，hIgG，和●，ex-Tim-3-Ig治療。給兩組老鼠/治療組取平均值。(b)48小時的時候，取走在(a)中描述的體外培養(yǎng)物的上層清液，采用細(xì)胞因子ELISAs對IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α和IFN-γ進(jìn)行檢測。像(a)中描述的符號。給兩組老鼠/治療組取平均值。
圖7顯示了TIM-3和TIM-3L的表達(dá)。(a)更顯著性的，ex-Tim-3-Ig和截短型s-TIM-3-Ig融合蛋白結(jié)合休眠CD4+T細(xì)胞和CD11c+一個部分，但不結(jié)合CD11b+，B220+或CD8+T細(xì)胞。亞類對照染色在閉合直方圖中顯示出來；開放直方圖顯示了ex-TIM-3-Fc(圓點(diǎn)線)與s-TIM-3-Ig(實(shí)線)結(jié)合。(b)在體外刺激后，CD4+CD25-抑制了TIM-3L，而不是調(diào)節(jié)劑CD4+C25+T細(xì)胞抑制了TIM-3L。CD4+CD25-和CD4+CD25+T細(xì)胞都結(jié)合處在睡眠狀態(tài)的s-TIM-3-Ig(上翼片)。然而，采用抗-CD3，抗-CD28和rIL-2(中翼片)體外刺激24小時之后，TIM-3L表達(dá)沒有改變，在48小時的時候，僅在CD4+CD25+T細(xì)胞上檢測到TIM-3L。亞類對照染色在閉合直方圖中顯示出來；開放直方圖顯示了與s-TIM-3-Ig結(jié)合。圖中顯示3個獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)具有代表性。
圖8顯示了在MHC錯配的胰島移植模式中，TIM-3有助于DST加抗-CD154治療的耐受性功效。(a)TIM-3和IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄在排斥中上調(diào)而不是在長期存活的胰島移植物中上調(diào)。數(shù)據(jù)表示為靶樣品和校準(zhǔn)物(分離的胰島)之間的相對倍數(shù)差異。標(biāo)出值代表4組獨(dú)立試驗(yàn)中得到的平均+/-標(biāo)準(zhǔn)差。(b)ex-Tim-3-Ig與DST加抗-CD154同時給藥阻止了胰島移植耐受的誘導(dǎo)。(c)ex-Tim-3-Ig的給藥顯著性地降低了CTLA4Ig的促進(jìn)耐受性能力。
圖9顯示了TIM-3調(diào)節(jié)對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的DST加抗-CD154治療的同種抗原特異性功效。(a)在DST加抗-CD154給藥之前，清除CD4+CD25+細(xì)胞導(dǎo)致快速的胰島移植排斥。MST＝中位生存期(天)。(b)在過繼皮膚移植模型中，如果在移植時給藥，ex-Tim-3-Ig不干擾CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的能力。(c)來自未經(jīng)DST加抗-CD154治療老鼠或DST加抗-CD154治療老鼠的1×105CD4+CD25-T細(xì)胞快速誘導(dǎo)皮膚移植排斥(左手翼片)。在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/效應(yīng)T細(xì)胞高比值(4×105∶1×105；中翼片)條件下過繼轉(zhuǎn)輸時，從初始宿主得到的CD4+CD25+T細(xì)胞和從DST加抗-CD154治療老鼠中獲得CD4+CD25+T細(xì)胞都能夠阻止皮膚移植排斥。當(dāng)?shù)攘康腃D4+CD25+T細(xì)胞被轉(zhuǎn)輸時(4×105∶1×105；右手翼片)，僅從治療老鼠中得到的T細(xì)胞發(fā)揮顯著的移植保護(hù)功效。在中翼片和右手翼片中，CD4+CD25-T細(xì)胞僅來自初始未治療的老鼠。(d)ex-Tim-3-Ig與DST加抗-CD154一起同時給藥去除了由DST加抗-CD154治療產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞的增加的免疫抑制性功效(初始CD4+CD25+T細(xì)胞被用作統(tǒng)計比較的基線)。MST＝median survival time(天)。
圖10顯示了作為TIM-3結(jié)合蛋白的galectin-9的鑒定。(a)TK-1細(xì)胞表達(dá)了TIM-3配體(s)的最高水平。三個T細(xì)胞株TK-1，S49.1G.3PHA 100/0，和BW1547.G.1.4，通過采用以1∶20和1∶50比例稀釋的生物素化sTIM-3-Ig(0.4mg/ml)被染色，并且通過采用TIM-3配體表達(dá)的抗人IgG-Fc-PE被檢測出來。采用TIM-3融合流式細(xì)胞儀分析，所有的T細(xì)胞株被陽性染色，其中采用flTIM-3-Ig和sTIM-3-Ig，高達(dá)90％的TK-1被陽性染色。(b)通過結(jié)合洗脫(pull-down)實(shí)驗(yàn)，35kD蛋白和TIM-3之間的特異性相互作用的說明。在室溫下，采用pH7.9磷酸緩沖液中的NHS-LC-Biotin，在活TK-1細(xì)胞上的胞外膜相關(guān)蛋白被生物素化。一小時的孵育后，采用DMEM培養(yǎng)基停止反應(yīng)。在4℃下，采用5μgflTIM-3-Ig，sTIM-3-Ig，TIM-2-Ig，和hIgG分別加蛋白G-瓊脂糖微球進(jìn)行孵育，生物素化TK-1細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物被用在結(jié)合洗脫(pull-down)實(shí)驗(yàn)中，從微球洗脫的蛋白樣品用PNGase F處理除去N-連接的糖鏈，或不用PNGase F處理除去N-連接的糖鏈，并且從微球洗脫的蛋白樣品被用于SDS-PAGE和Western印跡法。僅生物素化膜相關(guān)蛋白的信號與抗生物素蛋白連接過氧化物酶結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光信號被檢測出。
圖11顯示了galectin-9和TIM-3之間的特異性相互作用。(a)galectin-9規(guī)則長鏈異構(gòu)體(galectin-9和galectin-9-L)能與TIM-3結(jié)合。除了在galectin-9-L鉸鏈區(qū)31個氨基酸肽插入物之外，兩個galectin-9異構(gòu)體之間的蛋白質(zhì)序列是相同的。TK-1細(xì)胞的galectin-9異構(gòu)體小鼠cDNAs亞克隆到真核順反子表達(dá)載體pIRES2-EGFP中。每個質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。使用flTIM-3-Ig，sTIM-3-Ig，和hIgG，細(xì)胞被固定進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，并在轉(zhuǎn)染后48小時，通過抗人IgG-Fc-PE檢測細(xì)胞。FACS分析中的EGFP陽性信號指出轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？谷薎gG-Fc-PE用于檢測Ig融合的結(jié)合或hIgG的結(jié)合。(b)galectin-9、galectin-4、galectin-3和galectin-1小鼠cDNAs亞克隆到pIRES2-EGFP中。通過s-TIM-3-Ig細(xì)胞內(nèi)染色，僅產(chǎn)生EGFP的質(zhì)粒和空載體瞬時轉(zhuǎn)染CHO。抗人IgG-Fc-PE用于檢測sTIM-3-Ig結(jié)合。(c)Galectin-9cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pTrcHis 2B中。重組galectin-9(r-galectin-9)表達(dá)于BL21E菌株中，并且在乳糖瓊脂糖柱層析中得到純化。2μg的純化galectin-9用于與結(jié)合洗脫(pull-down)實(shí)驗(yàn)中使用的Ig融合蛋白孵育。蛋白G微球的洗脫物用于SDS-PAGE，并且用考馬斯亮藍(lán)給其染色。曲線1到曲線3代表sTIM-3-Ig，TIM-2-Ig，和TIM-4-Ig的洗脫物和他們分別捕獲的蛋白質(zhì)。曲線4到曲線6只代表Ig融合蛋白。r-galectin-9的分子量是38kD。
圖12顯示了galectin-9識別TIM-3寡糖鏈中β-半乳糖苷鍵。(a)Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并且使用sTIM-3-Ig固定Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。實(shí)驗(yàn)中使用0到100mM不同濃度α-乳糖的孵育緩沖液。組織曲線圖中長方塊代EGFP雙陽性細(xì)胞群的百分含量和在α-乳糖存在下sTIM-3-Ig染色。(b)在結(jié)合洗脫(pull-down)實(shí)驗(yàn)中，2μg r-galectin-9與4μg sTIM-3-Ig在0到100mM的α-乳糖不同濃度下混合。蛋白G微球的洗脫物用于SDS-PAGE，并且用考馬斯亮藍(lán)給其染色。在50kD處反應(yīng)條帶代表sTIM-3-Ig，38kD反應(yīng)條帶代表r-galectin-9。(c)galectin-9CRD結(jié)構(gòu)域需要與TIM-3相互作用。通過N-端CRD結(jié)構(gòu)域的R64A突變、C-端CRD結(jié)構(gòu)域的R238A突變、或兩者突變進(jìn)行構(gòu)建，并亞克隆到表達(dá)載體pIRES2-EGFP中。Wt和突變galection-9表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并使用sTIM-3-Ig細(xì)胞內(nèi)染色。EGFP和抗人IgG-Fc-PE使galectin-9和sTIM-3-Ig之間相互作用的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)加倍。
圖13顯示了galectin-9誘導(dǎo)活性小鼠Th1細(xì)胞凋亡，并且它的凋亡功效與它與TIM-3相互作用功能性相關(guān)。(a)DO11.10轉(zhuǎn)基因老鼠脾CD4+CD62L+T細(xì)胞需要至少3輪體外分裂成Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。VOA肽刺激后3天的Th1細(xì)胞核Th2細(xì)胞，APCs用PBS、galectin-3、和不同劑量的galectin-9進(jìn)行處理。8小時之后，細(xì)胞用PI和Annexin V-FITC染色檢測凋亡細(xì)胞。PI陽性細(xì)胞群(PI+Annexin V+和PI+Annexin V-)是死細(xì)胞或者晚期凋亡細(xì)胞。PI-Annexin V+細(xì)胞群是早期凋亡細(xì)胞；雙陰性細(xì)胞群是活細(xì)胞。(b)用PBS、0.75mM galectin-9、0.75mM galectin-9處理Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞0小時、2小時、4小時、8小時和12小時。細(xì)胞進(jìn)行核小體富集測定。凋亡過程誘導(dǎo)釋放到細(xì)胞溶解產(chǎn)物上層清液中的核小體結(jié)構(gòu)片段，ELISA測試中抗組蛋白和基因DNA的抗體檢測核小體結(jié)構(gòu)片段，在OD405nm處取得讀數(shù)。(a)中，Th2細(xì)胞能抵抗galectin-9的凋亡作用。
圖14顯示了通過下調(diào)IFN-g and IL-2生產(chǎn)細(xì)胞，對老鼠galectin-9給藥導(dǎo)致IFN-γ和IL-2產(chǎn)物的減少。然而，它并不能影響整個脾細(xì)胞的增值。用100mg MOG35-55肽加200mlCFA使C57BL/6J老鼠免疫。從第3天到第9天每天給老鼠腹腔內(nèi)注射R-galectin-9。老鼠死亡，并且取走它的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增值檢測、ELISA、和ELISPOT。
發(fā)明詳細(xì)概述(i)綜述本發(fā)明是關(guān)于試劑、組合物和調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞活性的方法、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，該免疫反應(yīng)包括但不限于，免疫耐受性和移植耐受性。
本發(fā)明分部來自老鼠和人體中的編碼tim-3可溶形式的tim-3新剪切異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)，tim-3可溶形式包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域，但沒有tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域和tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明提供了編碼tim-3可溶形式和其片段的分離核酸，例如免疫球蛋白的IgFc結(jié)構(gòu)域。此外，本發(fā)明提供了調(diào)解可溶tim-3蛋白的表達(dá)和/或功能的試劑，而不是全長tim-3的表達(dá)和功能的試劑。
本發(fā)明也分部來自用配體阻斷tim-3活性導(dǎo)致Th1細(xì)胞活性增加的發(fā)現(xiàn)，該Th1細(xì)胞活性增加包含但不限于Th1細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2 and IFN-γ。此外，本發(fā)明來自tim-3活性，例如tim-3與配體的相互作用，需要建立小鼠模型中免疫耐受性和移植耐受性的發(fā)現(xiàn)。
此外，本發(fā)明也來自galectin-9是tim-3配體的發(fā)現(xiàn)。galectin-9是galectin家族成員，Galectin-9在許多細(xì)胞形式均有表達(dá)，并且Galectin-9與β-galactoside結(jié)合。人體中9-galactoside的兩個形式，長鏈形式和短鏈形式，已經(jīng)被描述出來。人的短鏈異構(gòu)體缺少31氨基酸，這種31氨基酸位于N-末端糖結(jié)合域和長鏈異構(gòu)體的交聯(lián)肽之間(人長鏈異構(gòu)體的殘基149-180)。人和小鼠短鏈galectin-9氨基酸序列列于SEQ ID NO10和17中，然而他們的相應(yīng)編碼序列列于SEQ ID NO9和16中。小鼠和人的長鏈galectin-9氨基酸序列列于SEQ ID NO18和19中。
在人短鏈galectin-9異構(gòu)體中，N-端糖類識別結(jié)合域和C-端糖類識別結(jié)合域分別從16-146和195-322伸張。從149-174伸張的交聯(lián)肽把它們結(jié)合在一起(參見Genbank Accession No.NP002299)。人長鏈異構(gòu)體中的兩個糖類識別結(jié)合域分別從殘基16-146和殘基227-354伸張。
galectin-9氨基酸和DNA編碼序列也在美國專利No6,468,768和6,027,916中進(jìn)行描述，通過在此引述將它們合并于本文。因此，本發(fā)明提供了調(diào)解免疫反應(yīng)的方法，例如增強(qiáng)Th1和/或Th2反應(yīng)，或減少Th1和/或Th2反應(yīng)，本發(fā)明也提供了增強(qiáng)或減少免疫耐受性的方法和移植耐受性的方法。
本發(fā)明一方面提供了一種分離多肽，這種分離多肽包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域和tim-3胞內(nèi)域，其中這種多肽不包括tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，這種多肽是哺乳動物多肽，例如人和小鼠多肽。在一個實(shí)施方案中，tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO13的氨基酸22-131或SEQ ID NO14氨基酸22-132。在一個實(shí)施方案中，tim-3胞內(nèi)域包括SEQ ID NO13的氨基酸226-301或SEQ ID NO14氨基酸217-281。在一些實(shí)施方案中，分離多肽進(jìn)一步包括免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域或其他載體蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括在本這里描述的分離多肽的組合物。在一個實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括藥物用載體。本發(fā)明也提供了在這里描述的編碼多肽的核酸。本發(fā)明也提供了分離核酸，在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，這種核酸與編碼可溶tim-3的核酸雜交，但不與全長tim-3雜交，例如，核酸包括SEQ ID NO5列出的序列。
本發(fā)明的另一個方面提供了藥物包裝。具體提供了一種藥物包裝，這種藥物包裝包括(i)包括tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域的多肽；和(ii)對受驗(yàn)者進(jìn)行治療增生或治療Th2-介導(dǎo)病癥的組合物給藥的說明書。在一個具體實(shí)施方案中，增生是腎細(xì)胞癌、Kapos′s肉瘤、慢性白血病、前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、白血病、卵巢癌、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、淋巴瘤、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌、睪丸癌、Hodgkin′s淋巴瘤、胃腸癌、或胃癌。
在一個具體實(shí)施方案中，藥物包裝包括(i)包括galectin-9多肽的多肽；和(ii)給受驗(yàn)者組合物給藥的說明書，這種組合物治療自體免疫紊亂。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了免疫學(xué)試劑。具體提供了分離抗體或它的片段，這種抗體或片段與具有SEQ ID NO2列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合，而不與具有SEQ ID NO13列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合，或者抗體或片段與具有SEQ ID NO4列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合，而不與具有SEQ ID NO14氨基酸序列多肽結(jié)合，例如抗體與具有SEQ ID NO6或8中列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了雜交瘤細(xì)胞株，這種雜交瘤細(xì)胞株分泌上述單克隆抗體。
本發(fā)明的一個方面提供了調(diào)節(jié)受驗(yàn)者免疫反應(yīng)的方法。發(fā)明一個方面提供了調(diào)節(jié)受驗(yàn)者免疫反應(yīng)的方法，這種方法包括對受驗(yàn)者進(jìn)行有效治療劑量藥劑給藥，這種藥劑調(diào)節(jié)tim-3活性。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)Th1反應(yīng)或減少Th2反應(yīng)，其中試劑減少tim-3活性。
本這里描述的通過降低tim-3活性來增強(qiáng)Th1反應(yīng)或降低Th2反應(yīng)的方法的一個實(shí)施方案中，受驗(yàn)者經(jīng)受增生或Th2-介導(dǎo)紊亂的折磨，例如哮喘、敏感癥、過敏性鼻炎、胃腸敏感、食物敏感、嗜酸細(xì)胞增多、結(jié)膜炎、或血管球性腎炎。在另一個具體實(shí)施方案中，試劑抑制可溶tim-3的表達(dá)。減少tim-3活性的試劑可以是抗體或它的片段，例如與tim-3結(jié)合抗體，例如與tim-3胞外域結(jié)合的抗體，例如與SEQ ID NO13氨基酸30-128結(jié)合的抗體。
本這里描述的通過減少tim-3活性來增強(qiáng)Th1反應(yīng)或減少Th2反應(yīng)的方法的一個實(shí)施方案中，試劑減少galectin-9與tim-3的結(jié)合。在一個具體實(shí)施方案中，試劑包括多肽，這種多肽包括(i)SEQID NO13的氨基酸30-128；或(iii)氨基酸序列至少90％與SEQID NO13的氨基酸30-128相同。在某些實(shí)施方案中，修飾多肽試劑來增強(qiáng)它們在體內(nèi)的穩(wěn)定性，例如用聚乙二醇修飾或與質(zhì)粒蛋白融合進(jìn)行修飾，質(zhì)粒蛋白如人血清蛋白或免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。在一個具體實(shí)施方案中，試劑包括多肽，這種多肽包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域，但沒有tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域和tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。在一個具體實(shí)施方案中，試劑減少tim-3多肽或galectin-9多肽的表達(dá)水平。在一個具體實(shí)施方案中，試劑是雙鏈RNA反義寡脫氧核苷酸。在一個具體實(shí)施方案中，試劑抑制全長tim-3與galectin-9結(jié)合，例如試劑抑制(i)包括SEQ ID NO13氨基酸30-128的多肽的結(jié)合；與(ii)galectin-9結(jié)合(例如，SEDID NO10或SED ID NO19)。在另一個實(shí)施方案中，減少tim-3/galectin-9結(jié)合的試劑包括糖類，例如乳糖、β-半乳糖苷、糖基化多肽、膠質(zhì)或改良膠質(zhì)。
在一個調(diào)節(jié)受驗(yàn)者免疫反應(yīng)的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括減少Th1反應(yīng)或增強(qiáng)Th2反應(yīng)，其中試劑增強(qiáng)tim-3活性。在一個具體實(shí)施方案中，受驗(yàn)者經(jīng)受自體免疫疾病、移植物抗宿主病(HVGD)的折磨，或受驗(yàn)者是器官移植受體。
在這里描述的通過減少tim-3活性來增強(qiáng)Th1反應(yīng)或減少Th2反應(yīng)的方法的一個實(shí)施方案中，試劑是抗體、抗體片段，或多肽。在一個具體實(shí)施方案中，抗體是對tim-3和galectin-9特異性的雙特異性抗體。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑與tim-3結(jié)合增強(qiáng)了tim-3胞內(nèi)域的磷酸化。在另一個具體實(shí)施方案中，試劑是tim-3配體，例如天然配體的重組版。在另一個具體實(shí)施方案中，tim-3配體與全長tim-3結(jié)合增強(qiáng)了tim-3胞內(nèi)域的磷酸化。在另一個具體實(shí)施方案中，tim-3配體包括galectin-9多肽。在另一個具體實(shí)施方案中，試劑是包括至少galectin-9的兩個糖類識別域(CRD)中一種糖類識別域的多肽。在另一個具體實(shí)施方案中，多肽包括galectin-9兩個糖類識別域。在另一個具體實(shí)施方案中，試劑包括多肽，這種多肽包括至少80％、90％或95％與SEQ IDNO10或SEQ ID NO18列出的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的一方面提供了用于調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽的結(jié)合鑒定試劑的方法。本發(fā)明的一個具體方面提供了鑒定調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽的結(jié)合的試劑的方法，該方法包括(a)在測試試劑存在條件下，接觸tim-3多肽和galectin-9多肽；和(b)確定測試試劑對tim-3多肽和galectin-9多肽的結(jié)合的功效；因此，鑒定一種調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽的結(jié)合的試劑。
另一個方面提供了鑒定調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑的方法，例如這種方法包括(a)在測試試劑存在條件下，接觸tim-3多肽和galectin-9多肽；和(b)確定測試試劑對tim-3多肽和alectin-9多肽的結(jié)合的功效。在某些實(shí)施方案中，步驟(b)包括在測試試劑存在條件下，a tim-3/galectin-9復(fù)合物的形成與適當(dāng)對照之間的對比。適當(dāng)?shù)膶φ瞻o測試試劑條件下，第一多肽和第二多肽之間復(fù)合物的形成。試劑可以增強(qiáng)或減少tim-3和galectin-9之間的結(jié)合，并且可包括小的化合物、抗體或多肽。在鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)試劑方法的某些實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)是Th1免疫反應(yīng)或Th2免疫反應(yīng)。
鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)試劑的方法或鑒定調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽之間結(jié)合試劑的方法可在體外或體內(nèi)實(shí)施。在一個具體實(shí)施方案中，tim-3多肽在細(xì)胞中表達(dá)或galectin-9多肽在細(xì)胞中表達(dá)或tim-3多肽和galectin-9多肽都在細(xì)胞中表達(dá)。在一個具體實(shí)施方案中，檢測復(fù)合物形成包括檢測報告基因的表達(dá)，其中報告基因的表達(dá)依賴于復(fù)合物的形成。在另一個實(shí)施方案中，tim-3多肽用熒光分子標(biāo)記或galectin-9多肽用熒光分子標(biāo)記或tim-3多肽和galectin-9多肽都用熒光分子標(biāo)記。在另一個具體實(shí)施方案中，前述方法中的galectin-9多肽包括(i)SEQ ID NO10的氨基酸1-323；(ii)SEQ ID NO19的氨基酸1-355；或(iii)氨基酸序列至少90％與SEQ ID NO10氨基酸1-323相同；(iii)氨基酸序列至少90％與SEQ ID NO19氨基酸1-355相同。在另一個具體實(shí)施方案中，前述方法中的tim-3多肽包括(i)SEQ ID NO13氨基酸30-128；或(ii)氨基酸序列至少90％與SEQ ID NO13氨基酸30-128相同。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了開展藥物開發(fā)業(yè)務(wù)的方法，該方法包括(a)鑒定影響tim-3和galectin-9之間結(jié)合的化合物；(b)構(gòu)建步驟(a)中鑒定的動物體內(nèi)功效和毒性試驗(yàn)的化合物的治療譜，或其進(jìn)一步的類似物的治療譜；和(c)配制藥物學(xué)制劑，該藥物學(xué)制劑包含一種或多種步驟(b)中鑒定的化合物作為可用治療譜。本發(fā)明進(jìn)一步提供了開展藥物開發(fā)業(yè)務(wù)的方法，該方法包括(a)鑒定影響tim-3和galectin-9之間結(jié)合的化合物；(b)可任選地構(gòu)建步驟(a)中鑒定的動物體內(nèi)功效和毒性試驗(yàn)的化合物的治療譜、或其進(jìn)一步的類似物的治療譜；和(c)向第三方提供進(jìn)一步發(fā)展和/或銷售步驟(a)中鑒定的化合物，或其類似物的許可。一個具體實(shí)施方案進(jìn)一步包括了基于上述步驟(a)中鑒定化合物或其類似物銷量征稅。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了增強(qiáng)tim-3活性的方法，該方法包括用一定量的雙鏈RNA接觸表達(dá)可溶tim-3的細(xì)胞以充分減少可溶tim-3的表達(dá)，其中雙鏈RNA不抑制細(xì)胞中全長tim-3的表達(dá)，因此增強(qiáng)了tim-3活性。在一個具體實(shí)施方案中，在高嚴(yán)緊條件下，雙鏈RNA與包括SEQ ID NO1的核酸雜交，而在高嚴(yán)緊條件下，不與包括SEQ ID NO11的核酸雜交。在另一個具體實(shí)施方案中，雙鏈RNA包括SEQ ID NO15列出的核酸序列。在另一個具體實(shí)施方案中，雙鏈RNA是siRNA或hairpin RNA。在另一個具體實(shí)施方案中，接觸受到對受驗(yàn)者的雙鏈RNA給藥的影響。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測可溶tim-3基因表達(dá)的方法，該方法包括檢測編碼可溶tim-3的核酸的存在，其中編碼可溶tim-3核酸的檢測指出可溶tim-3基因表達(dá)。
除非其他說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，包括細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)、分子生物學(xué)、基因改造生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、和免疫學(xué)的傳統(tǒng)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中被描述出來。參見，例如Sambrook、Fritsch和Maniais編著的分子克隆A實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版(參見Cold Spring HarborLaboratory Press1989)；DNA克隆，第一卷和第二卷(參見D.N.Glover cd.，1985)；寡核苷酸合成(參見M.J.Gait ed.，1984)；Mullis等.美國專利No4,683,195；核酸雜化(參見B.D.Hames&amp；S.J.Higgins eds.1984)；轉(zhuǎn)錄和翻譯(參見B.D.Hames&amp；S.J.Higgins eds.1984)；動物細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)(參見R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；固定細(xì)胞和酶(IRL Press，1986)；B.Perbal，分子克隆操作指南(1984)；論文，酶學(xué)方法書(Academic Press，Inc.，N.Y.)；哺乳動物基因轉(zhuǎn)錄載體(J.H.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。這些參考資料都通過在此引述而合并于本文。
(2)定義為方便起見，在說明書、實(shí)例、和附加權(quán)利要求書中使用的特定術(shù)語在這里列出來。除非另有其他定義，在這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的含義相同。
在這里使用的冠詞“一”和“一個”是指文章語法賓語的一個或一個以上(例如，至少為一)。舉個例子，“一個元素”意思是一個元素或一個以上的元素。
在這里使用的術(shù)語“包括”，可與短語“包括但不限于”交換使用的。
如果上下文沒有明顯的其他說明，在這里使用的術(shù)語“或”，可與術(shù)語“和/或”交換使用的。
在這里使用的術(shù)語“例如”，可與短語“例如但不限于”交換使用。
術(shù)語“核酸”是指多聚核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)，和在適當(dāng)?shù)胤?，核糖核?RNA)。術(shù)語也應(yīng)理解為包含，等同的，核苷類似物的RNA類似物或DNA類似物，和，可用于被描述的實(shí)施方案中，單鏈(正義或反義)多聚核苷酸和雙鏈多聚核苷酸。
術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中被交換使用。術(shù)語“預(yù)防”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，被使用時與癥狀相關(guān)，在本領(lǐng)域中可被理解為的癥狀例如局部復(fù)發(fā)(如，疼痛)，如癌癥疾病，如心力衰竭綜合癥或其他并發(fā)癥，并且與沒有服用組合物的受驗(yàn)者對比，術(shù)語“預(yù)防”包含病癥開始之前服用組合物，這種組合物減少受驗(yàn)者并發(fā)癥的頻率、減少并發(fā)癥的嚴(yán)重性、或推遲受驗(yàn)者并發(fā)癥癥狀的開始。因此，癌癥的預(yù)防包含，如與未治療對照組對比，接受預(yù)防性治療受驗(yàn)組減少了可檢測出的癌增長的數(shù)量，和/或相對于未治療對照組，推遲治療組中可檢測出癌增長的出現(xiàn)，例如，通過統(tǒng)計學(xué)上顯著性的量或臨床顯著性的量。傳染病的預(yù)防包含，例如相對于未治療對照組，減少了治療組傳染病診斷的數(shù)量，和/或相對于未治療對照組，推遲了治療組傳染病癥狀的發(fā)生。疼痛的預(yù)防包含，例如相對于未治療對照組，減少了治療組受驗(yàn)者患有疼痛感的頻率、減少疼痛感的嚴(yán)重性、或可供選擇地推遲疼痛感。
在這里使用的術(shù)語“有效量”定義為得到預(yù)期結(jié)果需要的用量和時間周期下的有效劑量。本發(fā)明化合物的有效量可按照如疾病階段、動物年齡、動物性別和動物體重而改變。用量方案可為提供最佳治療反應(yīng)而進(jìn)行調(diào)整。例如，每天幾次分開服用或按治療情形的緊急程度可按比例地減少劑量。
在這里使用的“受驗(yàn)者”是指一些脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，并且更優(yōu)選人。受驗(yàn)者的實(shí)例包括人、非人的靈長類、嚙齒動物、幾內(nèi)亞豬、兔子、綿羊、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥、和魚。
在這里使用的主體蛋白質(zhì)的“變異”是指被一個或多個氨基酸改變的氨基酸序列。變異可具有保守改變，其中取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，(例如，采用異亮氨酸置換亮氨酸)。更罕見的是，變異可具有無保守改變(例如，采用色氨酸置換糖膠)。類似的次要變異也可包含氨基酸缺失或氨基酸插入物，或兩者都有。在無生物修飾或免疫學(xué)活性條件下，可使用本領(lǐng)域共知的計算機(jī)軟件找出哪種氨基酸片段可被取代、插入、或缺失的確定指南，例如，這種計算機(jī)軟件是DNASTAR軟件。
在這里使用的，“Th1相關(guān)紊亂”是疾病或異常病癥，例如增強(qiáng)的Th1細(xì)胞活性(如，增強(qiáng)的Th1細(xì)胞反應(yīng))或與文獻(xiàn)對比的數(shù)量，例如正常對照。Th1相關(guān)紊亂的實(shí)例包含如自體免疫紊亂(如，多重硬化癥、風(fēng)濕癥的關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和Crohn′s疾病)。
在本文中使用的，“Th2相關(guān)紊亂”是疾病或異常病癥，例如與文獻(xiàn)對比，增強(qiáng)的Th2細(xì)胞活性(如，增強(qiáng)的Th2細(xì)胞反應(yīng))或Th2細(xì)胞數(shù)量，例如正常對照。Th2相關(guān)紊亂的實(shí)例包含哮喘、敏感癥、和抗體組成成分相關(guān)的紊亂(如，風(fēng)濕癥的關(guān)節(jié)炎)。
在這里使用的術(shù)語“類似物”包括，但不限于含有所指序列的一個或多個氨基酸取代、插入、和/或缺失的氨基酸序列。氨基酸取代可是保守性的或非保守性的。保守氨基酸取代包含使用具有相似電荷、尺寸、和/或疏水性特征的氨基酸替代本發(fā)明蛋白的一個或多個氨基酸。當(dāng)僅保守取代發(fā)生時，結(jié)果類似物應(yīng)具有等同的功能。非保守取代包含使用一個或多個擁有不同電荷、尺寸、和/或疏水性特征的氨基酸替代氨基酸序列的一個或多個氨基酸。氨基酸插入物可由單一氨基酸殘基或氨基酸長度從2到15變化的連續(xù)氨基酸組成。缺失可由一個或多個氨基酸的去除、或氨基酸序列的不連續(xù)部分組成。缺失的氨基酸可是鄰接的或不鄰接的。
在這里使用的術(shù)語“重組”是指性質(zhì)不接近的序列組成核酸。重組核酸可體外生成，例如使用分子生物學(xué)方法重組核酸，或可體內(nèi)生成，例如，通過同源重組或非同源重組，在新的染色體定位插入核酸。
術(shù)語“激動劑”是指模擬或上調(diào)(例如，加強(qiáng)或補(bǔ)充)蛋白質(zhì)生物活性的試劑，例如，多肽X。激動劑可是野生型蛋白或其衍生物，這種衍生物具有至少一種野生型蛋白的生物活性。激動劑也可是化合物，這種化合物上調(diào)基因表達(dá)或增強(qiáng)至少一種蛋白活性。激動劑也可是增強(qiáng)多肽和其他分子的相互作用的化合物，例如，靶肽或核酸。
術(shù)語“拮抗劑”是指下調(diào)(例如，抑制或限制)至少一種蛋白生物活性的試劑。拮抗劑可是限制或減少蛋白和其他分子之間相互作用的化合物，例如，靶肽或酶底物。拮抗劑也可是下調(diào)基因表達(dá)的化合物或減少表達(dá)蛋白數(shù)量的化合物。
術(shù)語“治療效果”是指動物局部效果或全身效果，特指哺乳動物，更特指由藥理學(xué)活性物質(zhì)導(dǎo)致的人的局部效果或全身效果。因此，因此，術(shù)語意味著用在動物或人的診斷、治療、緩解、處理或疾病預(yù)防或預(yù)期增進(jìn)身體或心理改善和病癥的任何物質(zhì)。短語″治療有效劑量″意味著任何治療采用的合理的效益/危險比，產(chǎn)生某些預(yù)期的局部或全身效果的物質(zhì)的劑量。在某些實(shí)施方案中，化合物的治療有效劑量依賴它的治療指數(shù)、溶解性、和類似物。例如，通過本發(fā)明的方法，服用足夠劑量來產(chǎn)生對治療合理的效益/危險比。
術(shù)語“治療紊亂的受驗(yàn)者”是確診紊亂的受驗(yàn)者或有紊亂的疑似受驗(yàn)者。
在這里使用的其它的技術(shù)術(shù)語都具有在本領(lǐng)域中使用它們時的常規(guī)意思，可見于各種技術(shù)詞典，例如McGraw-Hill化學(xué)術(shù)語詞典和Stedman醫(yī)學(xué)詞典。
(3)核酸在某些方面中，本發(fā)明提供了編碼人可溶tim-3多肽或其片段的分離和/或重組核酸，例如SEQ ID NO1和5。本發(fā)明的一個方面提供了包括SEQ ID NO1列出的核苷酸序列的分離核酸。SEQ ID NO1是人可溶tim-3異構(gòu)體的DNA編碼序列。人可溶tim-3包括與人全長tim-3胞內(nèi)域(SEQ ID NO13殘基226-301融合)的IgV結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO13殘基22-131)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的可溶人tim-3核酸編碼翻譯多肽N端的全長tim-3(SEQ ID NO13氨基酸殘基1-21)的信號序列。本發(fā)明的另一個方面提供了編碼人可溶tim-3多肽的分離氨基酸，該可溶tim-3多肽包括SEQ ID NO2氨基酸序列。
同樣的，本發(fā)明的另一個方面提供了編碼小鼠可溶tim-3多肽或其片段的分離和/或重組氨基酸，例如SEQ ID NO3和7。本發(fā)明的一個方面提供了包括SEQ ID NO3列出的核苷酸序列。SEQ ID NO3是小鼠可溶tim-3異構(gòu)體的DNA編碼序列。小鼠可溶tim-3包括與人全長tim-3胞內(nèi)域(SEQ ID NO14殘基217-281)融合的IgV結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO14殘基22-132)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的小鼠可溶tim-3核酸編碼翻譯多肽N端的全長tim-3(SEQ ID NO14氨基酸殘基1-21)的信號序列。本發(fā)明的另一個方面提供了編碼小鼠可溶tim-3多肽的分離氨基酸，該可溶tim-3多肽包括SEQ ID NO4列出的氨基酸序列。
本發(fā)明的核酸進(jìn)一步理解為包括SEQ ID NO1、3、5、和7變異體的各種核酸。變異體核苷酸序列包括一個或多個核苷酸不同的序列，如不同取代、添加或缺失的序列，例如等位基因變異；因此變異體核苷酸序列包括編碼序列，該編碼序列不同于SEQ IDNO1，3，5，和7中指定的編碼序列的核苷酸序列，例如由于遺傳編碼簡并。舉個例子，核酸編碼可溶tim-3多肽可以是包括至少有90％、95％、99％或100％與SEQ ID NO1和3序列相同的序列的核酸，或編碼SEQ ID NO2和4多肽的序列的核酸。
采用數(shù)學(xué)算法得到兩個序列間的基因序列比較和同源性、相似性的確定。(參見Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Génome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過Needleman和Wunsch算法確定兩個氨基酸序列間的同源性(參見J Mol.Biol.(48)444-453(1970))，Needleman和Wunsch算法已經(jīng)合并到GCG軟件包里的GAP程序中(在http://www.gcg.Com可得到)。
在另一個實(shí)施方案中，采用NWSgapdna-CMP matrix，通過使用GCG軟件包里的GAP程序來確定兩個核苷酸序列間的同源性(參見Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Res.12(1)387(1984))(在http://www.gcg.Com可得到)。在另一個實(shí)施方案中，通過E.Myers和W.Miller算法，確定兩個氨基酸間的同源性或核苷酸序列(參見CABIOS，411-17(1989))，E.Myers和W.Miller算法已經(jīng)合并到ALIGN程序里(2.0版本)。
在另外的實(shí)施方案中，變異體也包括序列，這個序列是在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1和3中指定的核酸序列的編碼序列雜交。在一個實(shí)施方案中，變異體核苷酸序列編碼可溶tim-3多肽，該可溶tim-3多肽缺少黏蛋白結(jié)構(gòu)域和胞外域。在另一個實(shí)施方案中，變異體核苷酸序列編碼能與tim-3配體結(jié)合的可溶tim-3多肽，例如但不限于galectin-9。
本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員很容易理解促進(jìn)DNA雜交的能夠被改變的適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)條件。例如，在約45℃6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉條件下，一個本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)能完成雜交，然后在50℃2.0×SSC條件下洗脫。例如，從50℃約2.0×SSC的低嚴(yán)謹(jǐn)條件下到50℃約0.2×SSC的高嚴(yán)謹(jǐn)條件下選擇洗脫步驟的鹽濃度。此外，洗脫步驟的溫度能從約22℃室溫的低嚴(yán)謹(jǐn)條件增加到約65℃室溫的高嚴(yán)謹(jǐn)條件。當(dāng)其它變量改變時，溫度和鹽都能改變，或者溫度可保持恒定或者鹽濃度可保持恒定。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了核酸，這種核酸在室溫6×SSC低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，然后在室溫2×SSC條件下洗脫。
因遺傳密碼簡并而不同于SEQ ID NO1和3的分離核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，氨基酸被多于一個三聯(lián)體指定指定相同氨基酸、或同物異名(例如，CAU和CAC是組氨酸的同物異名)的密碼子可導(dǎo)致″靜″突變，這種″靜″突變不影響蛋白質(zhì)氨基酸序列。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將識別編碼特殊蛋白的核酸的一個或多個核苷酸中的變異，這種特殊蛋白由于天然等位基因變異可存在于給定種類個體中。這種核苷酸變異的一些或全部和結(jié)果氨基酸多態(tài)性在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也提供了核酸，這種核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼可溶tim-3核酸雜交，并且這種核酸不編碼tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域或tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，這些核酸至少編碼tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域。這些核酸可編碼具有突變、缺失、或IgV結(jié)構(gòu)域插入物或胞內(nèi)域插入物的可溶tim-3蛋白。在一個實(shí)施方案中，這些核酸編碼能與tim-3配體結(jié)合的多肽，如galectin-9。在一個實(shí)施方案中，這些核酸編碼融合蛋白，這種融合蛋白包括有基因突變可溶tim-3或無基因突變可溶tim-3，和來自其它蛋白的一個或多個結(jié)構(gòu)域，例如血清白蛋白或免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明也提供了核酸，這種核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下或在生理狀態(tài)下與編碼可溶tim-3核酸雜交而在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下或在生理狀態(tài)下不與編碼全長tim-3核酸雜交。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離核酸，這種分離核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1(編碼人可溶tim-3)列出的核酸雜交而不與SEQ ID NO 11(編碼全長人tim-3)列出的核酸雜交。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離核酸，這種分離核酸在在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO3(編碼小鼠可溶tim-3)列出的核酸雜交而不與SEQ ID NO 12(編碼全長小鼠tim-3)核酸雜交。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，這種分離核酸跨越可溶tim-3 cDNA中的新剪接，這種新剪接連接人tim-3IgV結(jié)構(gòu)域編碼序列和小鼠tim-3IgV結(jié)構(gòu)域編碼序列。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸具有SEQ ID NO5和7列出的核苷酸序列。這些核酸能用在這里描述方法中來檢測編碼可溶tim-3的核酸，也能用在檢測Th1細(xì)胞中編碼tim-3核酸的存在。
在某些本發(fā)明的方面，通過輸送核酸，如直接輸送，編碼可溶tim-3多肽和其變異體的核酸可用于增強(qiáng)生物體和細(xì)胞中可溶tim-3表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建的核酸治療法能被輸送，例如，象表達(dá)質(zhì)粒，當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時，表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生編碼可溶tim-3多肽的RNA。
本發(fā)明也提供了檢測可溶tim-3基因表達(dá)的方法，這種方法包括檢測編碼可溶tim-3核酸的存在，其中編碼可溶tim-3核酸的檢測給出了可溶tim-3基因表達(dá)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸是mRNA。編碼可溶tim-3 mRNA的檢測能使用本領(lǐng)域周知的常規(guī)方法而進(jìn)行mRNA分子檢測，這種方法包含Northern痕跡法、反轉(zhuǎn)錄mRNA的PCR-擴(kuò)增，或DNA微陣列技術(shù)。在另一個實(shí)施方案中，使用抗體檢測可溶tim-3基因表達(dá)，優(yōu)選在與可溶tim-3結(jié)合而不是與全長tim-3結(jié)合的抗體上檢測可溶tim-3基因表達(dá)。
(4)RNA干擾、核酶、反義在某些方面，本發(fā)明是關(guān)于RNAi、核酶、反義和用于操作(代表性地減少基因表達(dá))全長tim-3、可溶tim-3或tim-3配體的核酸相關(guān)方法和組合物。在本發(fā)明的一個方面，這種方法和組合物僅對tim-3一個形式是特異性的，或全長形式或可溶形式。在本發(fā)明的另一個方面，被操作的tim-3配體是galectin-9。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案通過RNA干擾(RNAi)使用物質(zhì)和方法影響tim-3形式或其配體的敲除。RNAi是真核細(xì)胞中發(fā)生的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因抑制的工藝。一般的，這個工藝包含雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)特殊序列mRNA降解，雙鏈RNA與那個序列同源。例如，與特殊單鏈mRNA(ss mRNA)相應(yīng)的長dsRNA表達(dá)標(biāo)記那個信息，因此，用相應(yīng)基因表達(dá)進(jìn)行干擾。因此，被選擇基因可通過引入dsRNA被抑制，dsRNA為那個基因全部mRNA或部分mRNA。可以看出，當(dāng)長dsRNA被表達(dá)時，通過核糖核酸酶III，長dsRNA加工成21到22堿基對長度的短dsRNA寡核苷酸。此外，RNAi可被相對短的同源dsRNAs的誘導(dǎo)或表達(dá)影響。確實(shí)，相對短的同源dsRNAs的使用可產(chǎn)生某些下面討論的優(yōu)勢。
哺乳動物細(xì)胞具有至少兩個通路，這兩個通路受雙鏈RNA(dsRNA)影響。在RNAi(序列特異性)通路中，最初dsRNA首先斷裂成上面描述的短干擾(si)RNAs。siRNAs具有約21個核苷酸的正義鏈和反義鏈，21個核苷酸形成在3′端伸出兩個核苷酸的約19個核苷酸的siRNAs。短干擾RNAs被認(rèn)為提供序列信息，這個序列信息讓特異性信息RNA降解。相反，只要任一序列dsRNA具有至少30個堿基對長度，非特異性通路可被用任一序列dsRNA引發(fā)。因?yàn)閐sRNA活化兩個PKR和2′，5′寡腺苷酸合成酶(2′，5′-AS)而產(chǎn)生非特異作用，在活性形式中的PKR使翻譯起始因子cIF2磷酸化而停止所有蛋白合成，2′，5′寡腺苷酸合成酶(2′，5′-AS)合成了活化的分子，RNAse L是瞄準(zhǔn)所有mRNAs的非特異性酶。非特異性通路可表示應(yīng)激或病毒感染的宿主反應(yīng)，并且一般的，在采用本發(fā)明的優(yōu)選方法下，非特異性通路的功效被更適宜地最小化。顯然，長dsRNAs要求用于誘導(dǎo)非特異性通路，因此優(yōu)選短于30堿基對的dsRNAs通過RNAi來影響基因表達(dá)(參見Hunter et al.(1975)J Biol Chem 250409-17；Manche et al.(1992)Mol Cell Biol 125239-48；Minks et al.(1979)J Biol Chem25410180-3；和Elbashir et al.(2001)Nature411494-8)。
RNAi顯示了出在減少或消除不同生物體基因表達(dá)上的有效性，這些不同生物體包含秀麗小桿線蟲(參見Fire et al.(1998)Nature 391806-11)、小鼠卵和胚胎(參見Wianny et al.(2000)Nature Cell Biol 270-5；Svoboda et al.(2000)Development 1274147-56)、和孵育的RAT-1纖維原細(xì)胞(參見Bahramina et al.(1999)Mol Cell Biol 19274-83)，RNAi看起來像真核植物細(xì)胞和真核動物細(xì)胞內(nèi)有的古進(jìn)化通路(參見Sharp (2001)Genes Dev.15485-90)。RNAi已經(jīng)被證明降低多種細(xì)胞類型中基因表法的有效方法，這些細(xì)胞類型包含HeLa細(xì)胞、NIH/3T3細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞，并且使用RNAi典型性地降低基因表達(dá)的水平低于采用所有反義技術(shù)得到的基因表達(dá)水平，RNAi確實(shí)經(jīng)常完全消除表達(dá)(參見Bass(2001)Nature 411428-9)。在哺乳動物細(xì)胞中，siRNAs有效濃度比在反義試驗(yàn)中使用的代表性濃度低幾個數(shù)量級(參見Elbashir et al.(2001)Nature411494-8)。
用于影響RNAi的雙鏈寡核苷酸優(yōu)選低于30個堿基對長度，并且更優(yōu)選包括約25、24、23、22、21、20、19、18或17個堿基對的核糖核酸。本發(fā)明的dsRNA寡核苷酸可任選地包含3′伸出端。典型的2-核苷酸3′伸出可由任何類型的核糖核酸殘基組成，甚至可由2′-抗胸腺嘧啶核苷殘基組成，這種組成低于RNA合成費(fèi)用，典型的2-核苷酸3′伸出可增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)基中siRNAs核酸酶抗性和轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)siRNAs核酸酶抗性(參見Elbashi et al.(2001)Nature 411494-8)。50、75、100或甚至500個堿基對的長dsRNAs或更多堿基對的長dsRNAs也可在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中使用。影響RNAi的dsRNAs典型濃度是約0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM或100nM，盡管根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易辨識的治療細(xì)胞性質(zhì)、靶基因和其它因子，其它濃度可以使用。典型dsRNAs可采用化學(xué)合成，或使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體體外產(chǎn)生或體內(nèi)產(chǎn)生。典型合成RNAs包含采用文獻(xiàn)中周知方法通過化學(xué)合成21核酸苷RNAs(例如，快速RNA亞磷酰胺和]胸苷亞磷酰胺(Proligo，Germany))。合成的寡核苷酸采用文獻(xiàn)中周知方法被適當(dāng)?shù)厝ケＷo(hù)和凝膠純化(方法參見Elbashir et al.(2001)Genes Dev.I5188-200)。較長RNAs可從本領(lǐng)域周知的啟動子轉(zhuǎn)錄，例如T7RNA聚合酶啟動子。位于體外啟動子下游可能定位的單個靶RNA將轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的兩個鏈以制造預(yù)期靶序列的dsRNA寡核苷酸。
如果tim-3或galectin-9是雙鏈RNA靶目標(biāo)，任何上述RNA系列將設(shè)計為包含tim-3核酸或galectin-9核酸表示的核酸序列的一部分，例如，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下或在生理狀態(tài)下，核酸與SEQ ID NO1、3、9、10、11或12或其補(bǔ)足物雜交。如果目標(biāo)是為了減少全長tim-3活性，下調(diào)全長tim-3表達(dá)的雙鏈RNA試劑是優(yōu)選的而可溶tim-3不是優(yōu)選的。因此，RNA試劑能減少全長tim-3水平來阻止與全長tim-3相互作用，而可溶tim-3能滴定tim-3配體時，如galectin-9，。在這個實(shí)施方案中，RNA系能被設(shè)計包含出現(xiàn)在全長tim-3而不是可溶tim-3中編碼黏蛋白結(jié)構(gòu)域或穿膜結(jié)構(gòu)域的mRNA區(qū)域。
本發(fā)明相關(guān)方面提供了通過抑制可溶tim-3表達(dá)來增強(qiáng)tim-3活性方法，該方法包括使用一定量雙鏈RNA接觸表達(dá)可溶tim-3的細(xì)胞來充分抑制可溶tim-3表達(dá)，其中雙鏈RNA不抑制全長tim-3表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雙鏈RNA與包括SEQ ID NO1核酸雜交而不在相同條件下包括SEQ ID NO11的核酸雜交。在另一個實(shí)施方案中，在生理狀態(tài)下雙鏈RNA與包括SEQ ID NO1核酸雜交而不是相同條件下與包括SEQ IDNO11核酸雜交。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，雙鏈RNA中的一個鏈包括SEQ ID NO15列出的核酸序列。本發(fā)明的方法能在表達(dá)tim-3的分離細(xì)胞中實(shí)施，或在受驗(yàn)者體內(nèi)實(shí)施，優(yōu)選人。
當(dāng)galectin-9是靶目標(biāo)時，RNA系列可包含galectin-9核酸表示的氨基酸序列的一部分，例如，核酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下或在生理狀態(tài)下與to SEQ ID NO9的核酸或其補(bǔ)足物的核酸雜交。
在寡核苷酸設(shè)計中用的特異性序列可是包含靶向物的表達(dá)基因信息內(nèi)的核酸的任何鄰接序列。本領(lǐng)域周知的程序和算法可用于選擇適當(dāng)?shù)陌行蛄?。此外，使用設(shè)計預(yù)測特異單鏈核酸序列二級結(jié)構(gòu)的程序和選擇可能發(fā)生在折疊mRNA外露單鏈區(qū)域可用于選擇最佳序列。例如，美國專利Nos.6,251,588給出了設(shè)計適宜寡核苷酸的方法和組合物，專利的內(nèi)容被引述并合并在本文中。信使RNA(mRNA)一般被認(rèn)為是線性分子，這種線性分子包含指導(dǎo)核苷酸序列內(nèi)蛋白合成信息，然而研究已經(jīng)公開了在大部分mRNAs中許多二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。RNA二級結(jié)構(gòu)單元大部分由同一個RNA分子的不同區(qū)域間Watson-Crick型相互作用形成。重要的二級結(jié)構(gòu)單元包含胞內(nèi)雙鏈區(qū)域、發(fā)夾環(huán)、雙鏈體RNA中突起部分和內(nèi)部環(huán)。當(dāng)二級結(jié)構(gòu)與彼此接觸或與單鏈區(qū)域接觸生成更復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)時形成了三級結(jié)構(gòu)單元。
許多研究學(xué)者測量了大量RNA雙鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)合能，并且導(dǎo)出用于預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)的一系列規(guī)則。(參見Jaeger et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867706(1989)；和Turner et al.(1988)Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.17167)。規(guī)則在確定RNA結(jié)構(gòu)單元是有效的，特別對確定單鏈RNA區(qū)域有效，這個單鏈區(qū)域可表示為沉默RNAi、核酶、反義技術(shù)的靶mRNA優(yōu)選片斷。因此，靶mRNA的優(yōu)選片斷能因?yàn)镽NAi介導(dǎo)dsRNA寡核苷酸的設(shè)計和本發(fā)明適當(dāng)核酶組合物和錘頭狀核酶組合物的設(shè)計而被確定。
通過采用如質(zhì)粒的載體組合物轉(zhuǎn)染異源靶基因，dsRNA寡核苷酸可被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，載體組合物是本領(lǐng)域周知的，如貼壁細(xì)胞株的生產(chǎn)商描述的Lipofectamine 2000(Life Technologies)。以內(nèi)源性基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染可通過Oligofectamine(Life Technologies)實(shí)現(xiàn)。編碼pAD3的hGFP聯(lián)合轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染效率可通過哺乳動物細(xì)胞株熒光顯微法檢測(參見文獻(xiàn)Kehlenback et al.(1998)J Cell Biol 141863-74)。RNAi效力可通過按照dsRNAs導(dǎo)入后的任何測定試驗(yàn)進(jìn)行評估。這些包含在新蛋白合成被抑制之后內(nèi)生池翻轉(zhuǎn)足夠時間之后，使用識別tim-3多肽的抗體進(jìn)行Western blot分析，而tim-3多肽包含可溶形式和/或全長形式、或tim-3配體，如galectin-9，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也包含定現(xiàn)有靶mRNA水平，例如全長tim-3、可溶tim-3或galectin-9 MARNA的Northern印跡法分析確。
RNAi技術(shù)的組合物、方法和應(yīng)用在美國專利Nos.6,278,039，5,723,750和5,244,805，中提出，上述所有引用的專利都通過在此引述而合并于本文。
設(shè)計催化切割tim-3或galectin-9 mRNA轉(zhuǎn)錄的核酶分子也能用于阻止研究對象tim-3或galectin mRNAs的翻譯(參見如PCT International Publication WO90/11364，published October 4，1990；Sarver et al.(1990)Science 2471222-1225和U.S.PatentNo.5,093,246)。核酶是能催化RNA特異性切割的酶RNA分子。(作為參考，參見Rossi(1994)Current Biology 4469-471)。核酶作用機(jī)理包含核酶分子互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交，然后進(jìn)行內(nèi)切核苷酸的切割。核酶分子組合物優(yōu)選包含一個或多個tim-3或galectin-9mRNA互補(bǔ)序列，和眾所周知的mRNA切割相關(guān)催化序列或功能等效序列(參見如美國專利No.5,093,246，上述所有引用的專利都通過在此引述而合并于本文。
因?yàn)樵谖稽c(diǎn)特異性識別序列處切割mRNA的核酶被用于破壞靶mRNAs，優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶切割側(cè)翼區(qū)域定位的mRNAs，側(cè)翼區(qū)域形成靶mRNA互補(bǔ)堿基對。優(yōu)選地，靶mRNA具有下面兩個堿基序列5′-UG-3′。錘頭狀核酶的構(gòu)建和制備技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在Haseloff and Gerlach(1988)Nature 334585-591中進(jìn)行了全面描述；參見PCT Apple.No.WO89/05852，上述引用的內(nèi)容都通過在此引述而合并于本文。錘頭狀核酶序列能被包埋在穩(wěn)定RNA中，如增加體內(nèi)切割效率的轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)(參見文獻(xiàn)Perriman et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，926175-79；de Feyter，and Gaudron，Methods in Molecular Biology，Vol.74，Chapter 43，″ExpressingRibozymes in Plants″，Edited by Turner，P.C，Humana Press Inc.，Totowa，N.J)。特殊的是，RNA聚合酶III介導(dǎo)tRNA融合核酶表達(dá)是本技術(shù)領(lǐng)域周知的(參見Kawasaki et al.(1998)Nature 393284-9；Kuwabara et al.(1998)Nature Biotechnol.16961-5；和Kuwabara et al.(1998)Mol.Cell 2617-27；Koseki et al.(1999)JVirol 731868-77；Kuwabara et al.(1999)Proc Natl Acad SciUSA 961886-91；Tanabe et al.(2000)Nature 406473-4)。給定的靶cDNA序列內(nèi)有典型的潛在錘頭狀核酶切割位點(diǎn)。優(yōu)選的核酶被設(shè)計使切割識別位點(diǎn)定位接近靶mRNA的5′端，提高效率且使無動能性mRNA轉(zhuǎn)錄胞內(nèi)累積最小化。此外，定位在編碼長鏈形式和短鏈形式靶標(biāo)的C-端氨基酸結(jié)構(gòu)域的不同部分的任何切割識別位點(diǎn)的使用將導(dǎo)入一個或另一個靶標(biāo)形式的選擇性靶基因，因此對一種形式靶基因產(chǎn)物有選擇性作用。
基因靶核酶必要地包含補(bǔ)足兩個區(qū)域的雜化區(qū)域，每個區(qū)域至少有靶mRNA長度內(nèi)的5個、優(yōu)選6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸。tim-3靶mRNA包含任何一種SEQID NO1、3、5或7。Galectin mRNA包括SEQ ID NO9。
此外，核酶具有高度特異性內(nèi)核糖核酸酶活性，內(nèi)核糖核酸酶活性自動催化切割靶基因mRNA。本發(fā)明擴(kuò)展涉及核酶，這種核酶與編碼a tim-3或galectin-9蛋白正義mRNA雜交，如治療靶藥物候選基因，因此，與正義mRNA雜交并對其切割，以至正義mRNA不再能被翻譯合成功能多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明提供的核酶也包含RNA內(nèi)核糖核酸酶(下文中的″Cech-type核酶″)，例如自然存在于嗜熱四膜蟲中的RNA內(nèi)核糖核酸酶(以IVS，或L-19IVS RNA著稱)和被Thomas Cech和其合作者廣泛描述的RNA內(nèi)核糖核酸酶(參見Zaug，et al.(1984)Science 224574-578；Zaug，et al.(1986)Science 231470-475；Zaug，et al.(1986)Nature 324429-433；published Internationalpatent application No.WO88/04300 by University Patents Inc.；Been，et al.(1986)Cell 47207-216)。Cech-type核酶具有八個堿基對活性位點(diǎn)，Cech-type核酶與靶RNA序列雜交隨后進(jìn)行靶RNA切割。本發(fā)明包含這些以八個堿基對活性位點(diǎn)為靶標(biāo)的Cech-type核酶，而這八個堿基對活性位點(diǎn)存在于靶基因中或核酸序列中。
核酶能由被修飾的寡核苷酸(如，提高穩(wěn)定性的寡核苷酸、作用靶標(biāo)寡核苷酸，等)組成并被輸送給體內(nèi)表達(dá)靶基因的細(xì)胞。優(yōu)選的遞送方法包含在強(qiáng)大固有pol III或pol II啟動子的控制下，使用DNA構(gòu)建″編碼″核酶，以至轉(zhuǎn)染細(xì)胞將生成足夠量的核酶破壞內(nèi)生靶信息和阻止翻譯。因?yàn)楹嗣妇哂写呋?，不像反義分子，在較低濃度下才就具有功效。
在某些實(shí)施方案中，可首先通過確定由RNAi充分引發(fā)敲低的序列部分對核酶進(jìn)行設(shè)計。相同的序列部分可合并到一個核酶中。在本發(fā)明的一個方面中，核酶或RNAi的基因靶蛋白有至少5個、優(yōu)選6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個或更多tim-3或galectin-9核酸鄰接核苷酸的相同序列。
在長的靶RNA鏈中，顯著性數(shù)量的靶位點(diǎn)不易接近核酶，因?yàn)樗鼈兟癫卦诙壗Y(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中(參見Birikh et al.(1997)Eur J Biochem 2451-16)。為了解決靶RNA可接近性的問題，預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的電腦典型用于最可能的單鏈靶標(biāo)或開放式靶標(biāo)的確定(參見Jaeger et al.(1989)Methods Enzymol 183281-306)。其它方法利用系統(tǒng)化方法預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)包含評估大量候補(bǔ)雜化寡核苷酸分子(參見Milner et al.(1997)NatBiotechnol 15537-41；和Patzel和Sczakiel(1998)Nat Biotechnol1664-8)。此外，美國專利No.6,251,588，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文，它描述了通過評估寡核苷酸探針序列來預(yù)測潛在靶核酸序列雜化的方法。本發(fā)明提供的方法用于選擇靶mRNA序列的優(yōu)選片斷，優(yōu)選片斷被預(yù)測為單鏈的，本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步用于機(jī)會性利用本發(fā)明的RNAi寡核苷酸和核酶的設(shè)計中的相同或明顯相同靶mRNA序列，優(yōu)選包括靶mRNA約10-20保守核苷酸。
(5)多肽在某些方面，本發(fā)明的公開制備了可利用的分離和/或純化可溶tim-3多肽形式，可溶tim-3多肽形式是分離的或是明顯游離的，和制備了可能與蛋白質(zhì)或包含蛋白質(zhì)特殊復(fù)合物相關(guān)的其他蛋白。在某些實(shí)施方案中，可溶tim-3多肽是包括氨基酸序列的多肽，這種氨基酸序列與SEQ ID NO2、4、6或8氨基酸序列至少90％、95％、97％、99％或100％等同。采用比對算法通過比對兩個多肽序列確定兩個多肽之間的氨基酸同源性，如基于PAM250 matrix的比對算法。
在某些實(shí)施方案中，可溶tim-3多肽是包括氨基酸序列一部分的多肽，該氨基酸序列的一部分至少與SEQ ID NO2、4、6和8的任何一個序列90％、95％、97％、99％或100％等同，其中上述部分優(yōu)選功能性部分，例如充分調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞活性部分或能和tim-3配體結(jié)合部分。在一個實(shí)施方案中，這部分包括tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，可溶tim-3多肽包含保守的氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)序列與SEQ ID NO1、3、5和7氨基酸序列至少90％、95％、97％、99％或100％等同的氨基酸在細(xì)胞中表達(dá)時，得到多肽是可溶tim-3多肽。在某些實(shí)施方案中，可溶tim-3多肽被純化或部分純化。
在一些實(shí)施方案中，可溶tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域包括SEQ IDNO13氨基酸22-131。而在其他實(shí)施方案中，它包括SEQ ID NO14氨基酸22-132。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的可溶tim-3多肽胞內(nèi)域包括SEQ ID NO13氨基酸226-301，然而在另一個實(shí)施方案中，它包括SEQ ID NO14氨基酸217-281。
本發(fā)明進(jìn)一步包含融合蛋白，這種融合蛋白包括可溶tim-3多肽和異源蛋白。在一個實(shí)施方案中，可溶tim-3蛋白包括IgV結(jié)構(gòu)域而不包括黏蛋白結(jié)構(gòu)域、穿膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域。在某些實(shí)施方案中，提供了包括可溶tim-3多肽的融合蛋白和免疫球蛋白單元。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域、tim-3胞內(nèi)域、免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的多肽，其中蛋白不包含tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。tim-3多肽可能是小鼠或人的。模擬免疫球蛋白單元是像人IgG1重鏈Fc結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)(參見Browning et al.，J.Immunol.，154，pp.33-46(1995))?？扇苁荏wIgG融合蛋白是普通的免疫球蛋白試劑和本技術(shù)領(lǐng)域周知的構(gòu)建方法(參見如美國專利No.5,225,538，5,766,883和5,876,969)，這些美國專利的內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶肽被融合到Fc異構(gòu)體。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾蛋白包括帶有免疫球蛋白Fc區(qū)的tim-3和galectin-9融合蛋白。眾多周知，每個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)包括4個或5個結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域命名如下CH1-hinge-CH2-CH3(-CH4)。重鏈結(jié)構(gòu)域的DNA序列在免疫球蛋白類中具有交叉同源性，如IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgA和IgD的CH2結(jié)構(gòu)域有同源性，IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgM和IgE有CH3結(jié)構(gòu)域有同源性。在這里使用的術(shù)語″免疫球蛋白Fc區(qū)″理解為免疫球蛋白鏈恒定區(qū)的羰基末端部分，優(yōu)選的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，或其一個部分。例如，免疫球蛋白Fc區(qū)可包括1)CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、和CH3結(jié)構(gòu)域，2)CH1結(jié)構(gòu)域、和CH2結(jié)構(gòu)域，3)CH1結(jié)構(gòu)域、和CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域、和CH3結(jié)構(gòu)域，或5)兩個或多個結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鏈區(qū)的組合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白Fc區(qū)包括至少免疫球蛋白鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，并優(yōu)選無CH1結(jié)構(gòu)域。
在一個實(shí)施方案中，來自重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白類是IgG(Igγ)(γ亞類1、2、3或4)。免疫球蛋白其它類，IgA(Igα)，IgD(Igδ)，IgE(Igε)和IgM(Igμ)，可被使用。適當(dāng)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的選擇在美國專利Nos.5,541,087和5,726,044中進(jìn)行了詳細(xì)討論。為得到特殊結(jié)果選擇來自某一個免疫球蛋白類和亞類的特殊免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列的技術(shù)被認(rèn)為處在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)水平之內(nèi)。編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA構(gòu)建部分優(yōu)選包括至少絞鏈結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選至少包括Fcγ的CH3結(jié)構(gòu)域或IgA、IgD、IgE、或IgM中任何一些內(nèi)的同源性結(jié)構(gòu)域。
此外，預(yù)期免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)內(nèi)氨基酸的取代或缺失可對本發(fā)明的實(shí)施有益。一個實(shí)施例將在上CH2區(qū)導(dǎo)入氨基酸取代來通過減少的Fc受體的親和力制備Fc變異體(參見Cole et al.(1997)J.IMMUNOL.1593613)。本領(lǐng)域普遍技術(shù)之一能采用周知分子生物技術(shù)制備這個結(jié)構(gòu)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，融合蛋白包括可溶tim-3多肽和二級異源多肽，而可溶tim-3多肽和二級異源多肽用于增強(qiáng)體內(nèi)融合蛋白穩(wěn)定性、或調(diào)節(jié)其生物活性或定位、或便于融合蛋白純化。用于制備tim-3可溶融合蛋白的其它模擬異源蛋白包含，但不限于，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、酶活性如堿性磷酸酶(AP)、表位標(biāo)記如hemagluttin(HA)。
優(yōu)選的穩(wěn)定質(zhì)粒蛋白典型地具有大于循環(huán)20小時的半衰期，這種質(zhì)粒蛋白用于構(gòu)建帶有tim-3或galectin-9的融合蛋白。這種質(zhì)粒蛋白包含但不限于免疫球蛋白、血清蛋白、脂蛋白、載脂蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。能以特殊細(xì)胞或組織型可溶tim-3或galectin-9分子為靶標(biāo)的序列也可附著在可溶tim-3上制成特異性定位可溶tim-3融合蛋白。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了tim-3或融合清蛋白的galectin-9。在本文中使用的“清蛋白”統(tǒng)指清蛋白或氨基酸序列、或清蛋白片段或異構(gòu)體，這種“清蛋白”具有一個或多個清蛋白功能活性(如，生物活性)。特殊的，“清蛋白”是指人血清蛋白或其片段(參見EP 201 239，EP 322 094 WO 97/24445，WO95/23857)尤其是成熟人清蛋白、或其它脊椎動物的清蛋白。特殊的，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白質(zhì)可包含自然發(fā)生的人清蛋白多態(tài)變異體和人清蛋白片段(參見WO95/23857)，例如在BP 322094公開的那些片段(即HA(Pn)，n是369到419)。清蛋白可來自任何脊椎動物，特別是任何哺乳動物，如人、牛、綿羊、或豬。非哺乳動物清蛋白包含，但不限于，雞和鮭魚。與tim-3或galectin-9蛋白相比，清蛋白融合蛋白質(zhì)的清蛋白部分可來自不同動物。
在一些實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白質(zhì)的清蛋白部分對應(yīng)于血清蛋白的片段。血清蛋白多肽片段包含具有從氨基端或C端刪除一個或多個殘基的多肽。總的來說，HA片段或變異體將至少有100個氨基酸長，優(yōu)選至少150個氨基酸長。HA變異體可由包括或可選擇地包括至少一個完整HA結(jié)構(gòu)域。人清蛋白結(jié)構(gòu)域在美國專利公開No.2004/0171123中進(jìn)行描述。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含編碼可溶tim-3多肽的核酸。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明也適合包括可溶tim-3多肽和相關(guān)衍生物的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可是任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，本發(fā)明的多肽可在如E.coli細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(如，使用桿狀病毒表達(dá)體系)、酵母菌、或哺乳動物細(xì)胞中有表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，可溶tim-3多肽由哺乳動物細(xì)胞制備和分泌，可溶tim-3多肽從培養(yǎng)基中被純化。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案進(jìn)一步適合生產(chǎn)可溶tim-3多肽的方法。
為提高治療或預(yù)防的功效、或穩(wěn)定性的目的(如，體外有效期和抗體內(nèi)蛋白水解變性)而修飾受驗(yàn)者tim-3多肽的結(jié)構(gòu)也是可能的。當(dāng)修飾的多肽被設(shè)計成保留至少一個蛋白自然生成形式活性時，它被認(rèn)為與在這里更詳細(xì)描述的tim-3多肽在功能上是等價的。這種修飾多肽能用氨基酸取代、缺失、或增加來制備。
例如，可以預(yù)期的是用異亮氨酸或纈氨酸亮氨酸、谷氨酸鹽取代天冬氨酸、絲氨酸取代蘇氨酸、或用結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸取代氨基酸(例如，保守突變)的分離取代將不對結(jié)果分子生物活性產(chǎn)生主要影響。保守取代是在氨基酸家族側(cè)鏈內(nèi)取代。遺傳編碼氨基酸能被分成一個家族(1)酸式＝天冬氨酸，谷氨酸鹽；(2)堿式＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷極性＝糖膠、天冬酰胺酸、谷氨酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯基丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸有時被共同分類為芳香族氨基酸。在類似的模式中，氨基酸譜系能被分組為(1)酸式＝天冬氨酸、谷氨酸鹽；(2)堿式＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)脂肪族的＝糖膠、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，絲氨酸和蘇氨酸可任選地分別組成脂肪羥基；(4)芳香族＝苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺＝天冬酰胺酸、谷氨酰胺酶；和(6)含硫＝胱氨酸和蛋氨酸。(參見例如，Biochemistry，2nd ed.，Ed.by L.Stryer，W.H.Freeman andCo.，1981)。是否多肽氨基酸序列改變導(dǎo)致了功能類似物，通過評估變異多肽制造類似野生型蛋白質(zhì)模式中的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的能力很容易確定這種功能類似物。舉個例子，tim-3多肽變異形式能被評估，例如，對于它們通過Th1細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的能力，或與tim-3配體結(jié)合的能力，如galectin-9。發(fā)生一個以上取代的多肽能容易地用相同的方式被測試出。
在某些方面中，功能變異體或受驗(yàn)者可溶tim-3和galectin-9多肽的修飾形式包含具有至少可溶多肽一個部分的融合蛋白和一個或多個融合結(jié)構(gòu)域。眾所周知這種融合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包含，但不限于，多聚組氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G、和免疫球蛋白重鏈恒定域(Fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，采用親和層析對融合蛋白分離有獨(dú)特的效果。為了親和純化，，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-、和鎳-或鈷-共軛樹脂被使用。本領(lǐng)域周知的另一個融合蛋白結(jié)構(gòu)域是綠色熒光蛋白(GFP)。融合結(jié)構(gòu)域也包含表位標(biāo)記，這種表位標(biāo)記經(jīng)常是可用特異性抗體短肽序列。容易得到的眾所周知特異性單克隆抗體表位標(biāo)記包含F(xiàn)LAG、流感病毒血凝素(HA)、和C-myc標(biāo)記。在一些案例中，融合結(jié)構(gòu)域具有蛋白酶切割位點(diǎn)，例如因子Xa蛋白酶切割位點(diǎn)或凝血酶蛋白酶切割位點(diǎn)，蛋白酶切割位點(diǎn)讓相關(guān)蛋白酶部分消化融合結(jié)構(gòu)域，因此在那里釋放重組蛋白。被釋放的蛋白能通過隨后的層析分離從融合結(jié)構(gòu)域中分離出來。
一些本發(fā)明提供的，或在本發(fā)明方法中使用的tim-3或galectin-9多肽，可進(jìn)一步包括翻譯后的修飾。模擬翻譯后蛋白修飾包含磷酸化、乙?；?、甲基化、ADP核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、蘇素化、生物素化或多肽側(cè)鏈增加或憎水基的增加。結(jié)果，修飾的可溶多肽可包含無氨基酸單元，例如脂類、多聚糖或單糖、和磷酸鹽。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，受驗(yàn)者tim-3和galectin-9可溶多肽的修飾形式包括受驗(yàn)者可溶多肽和非蛋白質(zhì)類聚合體的連接。在一個具體實(shí)施方案中，聚合體是美國專利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列出的聚乙二醇(″PEG″)、聚丙二醇、或聚氧化烯形式。
眾所周知，PEG是市場容易得到的水溶聚合體或能按照本領(lǐng)域周知方法通過乙二醇開環(huán)聚合反應(yīng)制得(參見Sandler and Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，pages138-161)。廣泛使用的術(shù)語″PEG″包含聚乙烯醇分子，不考慮尺寸或PEG末端修飾，能用下面公式表示X-O(CH2CH2)n-1CH2CH2OH，n是20到2300，X是末端修飾，例如C1-4烷基。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG一個末端以羥基或甲基終止，例如，X是H或CH3(″含甲基PEG″)。PEG能進(jìn)一步包含結(jié)合反應(yīng)必需的化學(xué)基團(tuán)；PEG來自分子化學(xué)合成；PEG或是分子部分最佳距離間隔裝置。此外，這種PEG能由一個或多個連接在一起的PEG側(cè)鏈組成。帶有一個以上PEG鏈的PEG被稱作多臂PEG或分支PEG。分支PEG能通過，例如，聚乙烯氧化物加入到不同的多羥基化合物制得，這種多羥基化合物包含丙三醇、季戊四醇、山梨醇。例如，四臂分支PEG能從季戊四醇和乙烯氧化物制得。分支PEG在如EP-A 0 473 084和U.S.Pat.No.5,932,462中進(jìn)行了描述。PEG的一個形式包含兩個PEG側(cè)鏈(PEG2)，兩個側(cè)鏈通過賴氨酸的伯胺基連接在一起(參見Monfardini，C.，et al.，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
與肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的PEG一般包含PEG活性，和直接靶向蛋白/肽或linker的活性PEG中介的耦合，隨后該P(yáng)EG結(jié)合被活化并且與靶蛋白/肽耦合(參見Abuchowski，A.et al，J.Biol.Chem.，252，3571(1977)和J.Biol.Chem.，252，3582(1977)，Zalipsky，etal.，和Harris et.al.，inPoly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications；(J.M.Harris cd.)Plenum PressNew York，1992；Chap.21 and 22)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能選擇合適的分子量的PEG，例如，根據(jù)聚乙二醇化tim-3或galectin-9多肽怎樣治療使用、預(yù)期劑量、循環(huán)時間、抗蛋白質(zhì)水解、致免疫力、和其它方面的考慮。PEG的討論和它的使用提高蛋白質(zhì)的性能，參見N.V.Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 1091-114(1993)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，PEG分子可被活化與tim-3或galectin-9多肽上的氨基反應(yīng)，例如與賴氨酸反應(yīng)(參見BenchamC.O.et al.，Anal.Biochem.，131，25(1983)；Veronese，F(xiàn).M.et al.，Appl.Biochem.，11，141(1985).；Zalipsky，S.et al.，PolymericDrugs and Drug Delivery Systems，adrs 9-110 ACS SymposiumSeries 469(1999)；Zalipsky，S.et al.，Europ.Polym.J.，19，1177-1183(1983)；Delgado，C.et al.，Biotechnology and AppliedBiochemistry，12，119-128(1990))。在另一個實(shí)施方案中，PEG分子可與tim-3或galectin-9的巰基結(jié)合(參見Sartore，L.，et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.，27，45(1991)；Morpurgo et al.，Biocon.Chem.，7，363-368(1996)；Goodson et al.，Bio/Technology(1990)8，343；U.S.Patent No.5,766,897)。美國專利Nos.6,610,281和5,766,897描述了模擬反應(yīng)性PEG類，其可連接到巰基上。在一個實(shí)施方案中，聚乙二醇化tim-3或galectin-9多肽包括一個PEG分子與N端氨基酸的α氨基共價結(jié)合。位點(diǎn)特異性N端還原胺化在Pepinsky et al.，(2001)JPET，297，1059，和U.S.Pat.No.5,824,784中進(jìn)行了描述。利用其它可得親核氨基與PEG-乙醛反應(yīng)制得蛋白質(zhì)還原胺化在美國專利No.4,002,531、Wieder etal.，(1979)J.Biol.Chem.254，12579、和Chamow et al.，(1994)Bioconjugate Chem.5，133進(jìn)行了描述。
(6)免疫學(xué)試劑本發(fā)明另外提供了能與tim-3多肽結(jié)合的免疫學(xué)試劑，tim-3多肽包含小鼠和人的多肽，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫學(xué)試劑與可溶tim-3結(jié)合但不與全長tim-3結(jié)合。
本發(fā)明的一個方面提供了分離抗體或其片段，這種分離片段與具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽結(jié)合，但不與SEQ IDNO13氨基酸序列的多肽結(jié)合。SEQ ID NO2是人可溶tim-3蛋白而SEQ ID NO13是人全長tim-3蛋白。因此，這種抗體將結(jié)合可溶人tim-3但不與全長人tim-3結(jié)合。
本發(fā)明的另一個方面提供了分離抗體或其片段，這種分離片段與具有SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽結(jié)合，但不與SEQ IDNO14氨基酸序列的多肽結(jié)合。SEQ ID NO4是小鼠可溶tim-3蛋白而SEQ ID NO14是小鼠全長tim-3蛋白。因此，這種抗體將結(jié)合可溶小鼠tim-3但不與全長小鼠tim-3結(jié)合。
能夠得到生成的與溶tim-3結(jié)合而不與全長tim-3結(jié)合的特異性抗血清，例如，通過生成具有包含在可溶tim-3蛋白內(nèi)氨基酸序列多肽的免疫原，其中這種多肽不存在于全長蛋白中。這種多肽可跨越可溶tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域的連接點(diǎn)。這個連接點(diǎn)不在全長tim-3序列中，在此連接點(diǎn)黏蛋白結(jié)構(gòu)域和穿膜結(jié)構(gòu)域插入IgV結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域之間。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)SEQ IDNO6，16個氨基酸的人可溶tim-3肽作為生成這種抗體的免疫原而被使用。為生成等量的小鼠tim-3抗體，根據(jù)SEQ ID NO8的肽能被使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能通過延伸另外的殘基C端或N端或殘基的兩端操控多肽，或由于希望得到增強(qiáng)的致免疫力或溶解性而縮短來操控多肽。此外，胱氨酸基團(tuán)或其它殘基能被加到肽中與載體形成共軛或賦予額外的需要的性質(zhì)。
同樣地，結(jié)合全長tim-3但不結(jié)合可溶tim-3的肽能使用含有全長tim-3序列的肽而不是含有可溶形式tim-3序列的肽制得。例如，這種肽符合tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域的序列或更有選地符合tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域的序列?？扇芜x地，這些肽可包含跨越全長tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域間連接點(diǎn)的序列，或可包含全長tim-3的穿膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域間連接點(diǎn)的序列。
雞、哺乳動物，例如小鼠、倉鼠、山羊、幾內(nèi)亞豬或兔子，能采用被描述的任何肽變異體免疫原形式被免疫(例如，能引起抗體反應(yīng)的抗原性片段)。在蛋白質(zhì)或肽上賦予免疫原性技術(shù)包含與載體結(jié)合或本領(lǐng)域中周知的其它技術(shù)。例如，在佐劑存在條件下，在一個受驗(yàn)蛋白肽基部位給藥。通過血漿中或血清中抗體滴度檢測監(jiān)控免疫過程。標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它的免疫測定通過使用免疫原作為抗原評估抗體水平而被采用。
能獲得下列免疫、抗血清，如果需要時，抗靶蛋白的多克隆抗體能進(jìn)一步從血清中分離出。為生產(chǎn)單克隆抗體，抗體生產(chǎn)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)能從免疫動物體內(nèi)得到并且通過標(biāo)準(zhǔn)肉體細(xì)胞融合技術(shù)與永生化細(xì)胞融合，該永生化細(xì)胞如制備雜種瘤細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞。這種技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包含，如雜種瘤技術(shù)(最初由Kohler和Milstein發(fā)展起來的，Nature，256495-497，1975)，和人B細(xì)胞雜種瘤技術(shù)(參見Kozbar et al.，Immunology Today，472，1983)，和生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜種瘤技術(shù)(參見Cole et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96，1985)。采用免疫化學(xué)篩選雜種瘤細(xì)胞用于制備tim-3肽特異性活性抗體和單克隆分離抗體的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的其它方面提供了制備在這里描述的抗體的雜種瘤細(xì)胞株。
抗體被測試其與全長tim-3和可溶tim-3的結(jié)合特異性。例如，生產(chǎn)抗SEQ ID NO6序列肽的抗體，其對應(yīng)人可溶tim-3的IgV-胞內(nèi)域結(jié)合點(diǎn)，通過固定膜上多肽和進(jìn)行抗體western blot測試能檢測出其與tim-3任一形式結(jié)合的能力。如果抗體結(jié)合蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可采用任何常規(guī)方法進(jìn)行檢測。
在另一個實(shí)施方案中，為了確定僅對可溶tim-3的抗體特異性，抗全部tim-3可溶蛋白的單克隆抗體能被生產(chǎn)出來，并且通過他們是否與全長tim-3蛋白結(jié)合而被篩選。
在這里使用的術(shù)語抗體包含片段，該片段是這里描述的有特異性活性的蛋白，或包括這種蛋白的復(fù)合物。使用傳統(tǒng)技術(shù)能把抗體變成片段，并且片段采用上面描述的相同方式篩選全部抗體。例如，F(xiàn)(ab′)2片段能通過使用胃蛋白酶處理抗體而得到。為制得Fab′片段，結(jié)果的F(ab′)2片段被處理以減少二硫鍵。本發(fā)明的抗體進(jìn)一步包含雙特異性分子和嵌合分子，和單鏈(scFv)抗體。
受驗(yàn)抗體包含三聚抗體和人源化抗體，這種抗體能按照如美國專利No5,585,089中描述的方法制得。單鏈抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所有這些抗體的修飾形式和抗體的片段包含在術(shù)語″抗體″中。
(7)Tim-3/Galectin-9免疫調(diào)節(jié)試劑的鑒定本發(fā)明的另一個方面提供了鑒定調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)試劑的方法，例如，鑒定調(diào)節(jié)tim-3和galectin-9之間相互作用的試劑。在一個方面中，本發(fā)明提供了抑制tim-3與tim-3配體結(jié)合的試劑的鑒定，例如鑒定galectin-9。阻斷相互反應(yīng)的試劑將預(yù)期通過增強(qiáng)Th1反應(yīng)和/或減少Th2反應(yīng)而阻止tim-3活性。在另一個方面，本發(fā)明提供了鑒定促進(jìn)tim-3與tim-3配體結(jié)合的試劑的方法。這將預(yù)期通過減少Th1反應(yīng)和/或增強(qiáng)Th2反應(yīng)而促進(jìn)tim-3活性。因此，使用本文描述方法被鑒定試劑可用于調(diào)節(jié)受驗(yàn)者體內(nèi)TH1和TH2反應(yīng)。
在一個方面，根據(jù)tim-3和galectin-9蛋白結(jié)構(gòu)特征，本發(fā)明中tim-3/galectin-9復(fù)合物的鑒定方便了激動劑和拮抗劑的合理設(shè)計，tim-3/galectin-9復(fù)合物的鑒定能采用X-ray結(jié)晶學(xué)、神經(jīng)細(xì)胞衍射、核磁共振波譜法、和其它技術(shù)。合理藥物設(shè)計方法在本領(lǐng)域眾所周知。(參見Chemical and Structural Approaches toRational Drug Design，David B Weiner，William V.Williams，CRCPress(1994)；Rational Drug DesignNovel Methodology andPractical Applications，Vol.719，Abby L.Parrill(Editor)，AmericanChemical Society(1999)；Structure-based Ligand Design，ClausGubernator，Wiley，John & amp；Sons，Incorporated(1998))。本發(fā)明的相關(guān)方面提供了包括tim-3多肽和/或galectin-9多肽的再生蛋白質(zhì)的制備。在一個具體實(shí)施方案中，在再生組合物中至少1％蛋白質(zhì)是tim-3多肽和galectin-9多肽，更優(yōu)選地是至少2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％蛋白質(zhì)是tim-3多肽和galectin-9多肽。在一個實(shí)施方案中，再生組合物中蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個方面提供了篩選促進(jìn)或抑制tim-3和galectin-9之間復(fù)合物形成的試劑的方法。這些方法可在體外或細(xì)胞內(nèi)實(shí)施，并且他們可通過使用全長蛋白質(zhì)或其片段，如一個蛋白質(zhì)或兩個蛋白質(zhì)的可溶片段(例如，缺少穿膜結(jié)構(gòu)域的可溶片段)，而被實(shí)施。在這里描述方法的一些實(shí)施方案中，包括tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域可溶蛋白和可任選地包括tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域可溶蛋白被使用。多種其它試劑可被包含在過篩檢測中。這些包含了象鹽、中性蛋白(如清蛋白)、去污劑等試劑，這些試劑用于使最佳蛋白-蛋白的結(jié)合變得容易和/或減少非特異性相互作用或不重要的相互作用。提高測定效率的試劑，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌抑制劑等也可被使用。以任何順序加入提供必不可少的粘結(jié)的成分混合物。在任何合適溫度下進(jìn)行孵育，典型在4℃到40℃之間。為得到最佳活性而選擇孵育期，但也可優(yōu)化地促進(jìn)快速高通量篩選。代表性地在0.1小時到1小時之間將充分完成體外測定。
本發(fā)明試劑鑒定方法非常適合多孔培養(yǎng)板中化合物文庫的篩選(例如，96孔板)，在多孔培養(yǎng)板的每一個孔中有不同測試化合物或測試化合物的組。特殊地，使用組合文庫可采用這種方法。通過一些可用微型化方法，這些方法在測定系統(tǒng)中可被縮小化，該方法包含但不限于多孔培養(yǎng)板，例如每個培養(yǎng)板、微芯片或載玻片有24、48、96、或384個孔。測定可被減少尺寸而在微芯片載體上進(jìn)行，在微芯片載體上方便包含較少量的試劑和其它材料。有益于高通量篩選過程的任何微小型都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案提供了鑒定治療試劑的方法，這種治療試劑調(diào)節(jié)Th1功能。因此，本發(fā)明的一個方面提供了評估試劑調(diào)節(jié)Th1活性的能力的方法，該方法包括1)混合在沒有試劑存在，tim-3多肽和galectin-9多肽相互作用的條件下，tim-3多肽或其片段，galectin-9多肽或其片段，和試劑相互混合，2)確定是否試劑干涉相互作用，和任選地干涉相互作用，3)對于干涉相互作用試劑，進(jìn)一步評估其促進(jìn)Th1細(xì)胞活性的能力。
本發(fā)明的另一個方面提供了鑒定調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽間結(jié)合的試劑的方法，該方法包括(a)在測定試劑存在條件下，接觸tim-3多肽和galectin-9多肽；和(b)確定測定試劑對tim-3多肽和galectin-9多肽結(jié)合的影響；因此鑒定調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽間結(jié)合的試劑。
本發(fā)明相關(guān)具體實(shí)施方案提供了鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑的方法，這種方法包括(a)在測定試劑存在條件下，接觸tim-3多肽和galectin-9多肽；和(b)確定測定試劑對tim-3多肽和galectin-9多肽結(jié)合的影響；因此鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑。
在這里描述的關(guān)于檢測tim-3多肽和galectin-9多肽間相互作用的方法的一個實(shí)施方案中，galectin-9多肽包括(i)SEQ ID NO10的氨基酸1-323；或(ii)SEQ ID NO19的氨基酸1-355；或(iii)氨基酸序列至少有90％與SEQ ID NO10的氨基酸1-323等同；(iii)氨基酸序列至少有90％與SEQ ID NO19的氨基酸1-355等同。在另一個實(shí)施方案中，tim-3多肽包括(i)SEQ ID NO13的氨基酸30-128；或(iii)氨基酸序列至少有90％與SEQ ID NO13的氨基酸30-128等同。
本發(fā)明的一些方面中，通過體外測定鑒定試劑。按照目前的說明書公開，許多測定形式將足夠用，那些在本文中沒有清楚描述的將通過本領(lǐng)域的一個普通技術(shù)而被理解。接近蛋白質(zhì)復(fù)合物形成條件的測定形式可在許多不同形式中得到，并且包含非細(xì)胞體系測定，例如純化蛋白測定或細(xì)胞溶解產(chǎn)物測定，和包含利用完整細(xì)胞的細(xì)胞測定。簡單的結(jié)合測定也能用于檢測與tim-3或galectin-9結(jié)合的試劑。這種結(jié)合測定也可鑒定破壞tim-3多肽和galectin-9多肽間相互作用的試劑。
被檢測試劑能通過如細(xì)菌、酵母或其它有機(jī)體(如，自然產(chǎn)物)制得，能通過化學(xué)制得(如，小分子，包含peptidomimetics)，或重組制得。因?yàn)閠im-3和galectin-9是穿膜蛋白質(zhì)，測定優(yōu)選的實(shí)施方案和描述出來用于鑒定調(diào)節(jié)tim-3和galectin-9間復(fù)合物形成的試劑的方法采用蛋白可溶形式而不是全長蛋白。可溶形式包含缺少穿膜結(jié)構(gòu)域和/或包括IgV結(jié)構(gòu)域或其片段那些蛋白，那些蛋白保留著與同源結(jié)合伙伴結(jié)合的能力。
在許多測定化合物和天然提取物文庫的藥物篩選程序中，為了最大化在所給期間內(nèi)被調(diào)查化合物數(shù)量，高通量篩選是值得考慮的。本發(fā)明的測定在無細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)實(shí)施，可采用純化或半純化蛋白進(jìn)行測定或采用溶解產(chǎn)物進(jìn)行測定。本發(fā)明的測定方法經(jīng)常是優(yōu)選的主要篩選方法，因?yàn)檫@種測定方法能允許快速測定并且相對容易測定測試化合物介導(dǎo)的分子靶的改變。此外，細(xì)胞毒性影響和/或測試化合物生物藥效率一般能在體外體系中忽視，測定主要關(guān)注藥物對分子靶作用，因?yàn)樗幬镉绊懣稍谂c其它蛋白質(zhì)的結(jié)合能力明顯改變或分子靶的酶性質(zhì)明顯改變中得到證實(shí)。
在本測定優(yōu)選的體外實(shí)施方案中，再生tim-3/galectin-9復(fù)合物包括至少半純化蛋白的再生復(fù)合物。通過半純化，再生復(fù)合物中使用的蛋白已經(jīng)預(yù)先從其它細(xì)胞蛋白或病毒蛋白分離出。例如，對比細(xì)胞溶解產(chǎn)物，在混合物中，包含在tim-3/galectin-9復(fù)合物形成中的蛋白相對混合物中所有其它蛋白的純度至少是50％。在本方法的某些實(shí)施方案中，再生蛋白混合物通過混合高效純化蛋白得到，使得再生混合物中大量缺少其它蛋白(例如細(xì)胞來源或病毒來源)，這些其它蛋白可能集中或分開干擾或改變測量tim-3/galectin-9復(fù)合物的能力。
在候選試劑存在或無該候選試劑條件下，測定tim-3/galectin-9復(fù)合物能在任何適合包含反應(yīng)物的器皿內(nèi)完成。實(shí)例包含微孔板、測試試管、和微量離心過濾試管。在篩選測定中，測試試劑的功效可通過如評估測試試劑對細(xì)胞因子的作用、反應(yīng)的穩(wěn)定態(tài)和/或終點(diǎn)進(jìn)行評估。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，根據(jù)集中干擾tim-3/galectin-9復(fù)合物的能力或tim-3/galectin-9復(fù)合物的穩(wěn)定性得到藥物篩選檢測。在模擬的結(jié)合測定中，主體化合物與包括tim-3/galectin-9復(fù)合物的混合物接觸。tim-3/galectin-9復(fù)合物的檢測和定量提供了確定抑制(或加強(qiáng))兩種多肽間相互作用的化合物功效的方法?；衔锏墓π芡ㄟ^由使用不同濃度測試化合物得到數(shù)據(jù)繪制的劑量反應(yīng)曲線被評估。此外，對照測定也能被進(jìn)行而提供了對比基線。在對照測定中，復(fù)合物的形成在無測試化合物時測定其含量。
復(fù)合物形成可通過多種技術(shù)被檢測出。例如，通過免疫測定或通過色譜法測定法，復(fù)合物形成中的調(diào)制使用如，使用可檢測的標(biāo)記蛋白(如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記)測定其含量。表面等離子體諧振體系，如Biacore International AB(Uppsala，Sweden)，也可用于檢測蛋白-蛋白相互作用。
在這里描述的蛋白和肽可固定不動。經(jīng)常，固定肽和多肽以使從一個蛋白的非復(fù)合形式中分離復(fù)合物變得容易，固定肽和多肽來提供測定的自動化。肽和多肽能固定在任何固體介質(zhì)上，例如平板、珠子或過濾器。肽或多肽能固定在包含結(jié)合多肽的活性基團(tuán)介質(zhì)上。任選其一地或聯(lián)用的活性基團(tuán)如蛋白質(zhì)中胱氨酸能反應(yīng)并與介質(zhì)結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，多肽可與另一個具有高結(jié)合能力的多肽一起表達(dá)為融合蛋白，例如，結(jié)合高親和力的鏈霉親和素融合蛋白。
在說明性實(shí)施方案中，能提供增加了允許蛋白與不溶介質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，GST-TIM-3-IgV-結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括融合到谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶上的tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域，GST-TIM-3-IgV-結(jié)構(gòu)域融合蛋白能被吸附到谷胱甘肽瓊脂糖微球上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或與galectin-9或其片段及結(jié)合的谷胱甘肽衍生化微孔板，如35S-標(biāo)記多肽，測試化合物和在條件下被孵育有益于復(fù)合物形成。下面的孵育，洗脫微球除去一些非結(jié)合作用蛋白，和直接測定的介質(zhì)微球結(jié)合放射性標(biāo)記(例如，放置在閃爍晶體內(nèi)的微球)，或復(fù)合體被解離后的上層清液中，如當(dāng)微孔板被使用時?？扇芜x其一地，在洗脫非結(jié)合蛋白后，復(fù)合物能從介質(zhì)中解離出，通過SDS-PAGE凝膠被分離，使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)對凝膠介質(zhì)結(jié)合片斷中相互作用多肽的水平含量進(jìn)行測量。
可以理解，上面描述的測定的不同修飾包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，蛋白質(zhì)的任務(wù)被轉(zhuǎn)換--就是，galectin-9蛋白可被固定到固體載體上，含有tim-3蛋白的溶液可與結(jié)合galectin-9蛋白接觸。此外，在結(jié)合實(shí)驗(yàn)前，固定蛋白或游離蛋白可與被測試化合物接觸，欲接觸的作用可與對照組比較進(jìn)行評估。采用這種方法鑒定的化合物也抑制tim-3與galectin-9的結(jié)合，反之亦然?？扇芜x其一地，測試化合物可被隨后加到tim-3和galectin-9的混合物中。在這個測定中有效減少結(jié)合水平的化合物用galectin-9蛋白取代tim-3蛋白，反之亦然。
除了Western印跡法之外，其它、更快速、檢測方案，例如多孔ELISA型方法，可被采用。例如，通過導(dǎo)入包含蛋白的溶液到培養(yǎng)板里并使蛋白結(jié)合到塑膠上，部分被純化蛋白可附著在多孔培養(yǎng)板的孔底部(如，96孔培養(yǎng)板)。剩余包含蛋白的溶液被沖掉，抑制液(含有，如牛血清白蛋白(BSA)被導(dǎo)入來阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后平板被沖洗多次，溶液包含galectin-9蛋白，依據(jù)實(shí)驗(yàn)(與對照對比)孔情況，加入測試化合物。不同的孔可包含不同的測試化合物、不同濃度的相同測試物質(zhì)、不同tim-3蛋白或galectin-9蛋白、或不同濃度的tim-3蛋白或galectin-9蛋白?？蛇M(jìn)一步理解，可以對檢測方案進(jìn)行不同修改。例如，多孔培養(yǎng)板的孔可涂上包含galectin-9蛋白而不是tim-3蛋白的多肽，并且加入游離tim-3蛋白測定結(jié)合作用。這些孔也可預(yù)涂增強(qiáng)被固定蛋白的附著和減少非特異性結(jié)合水平的化合物。例如，這些孔可衍生化包含谷胱甘肽，并且為促進(jìn)帶有外露結(jié)合位點(diǎn)的已知定位固定蛋白附著，這些孔可被預(yù)涂BSA。
這種測定中有用的檢測方法包含抗體方法(例如，指定抗“游離”蛋白抗體)、合并到“游離”蛋白中信息半族的直接檢測(例如，熒光標(biāo)記)、和鄰近能量轉(zhuǎn)移方法(例如，導(dǎo)致合并到固定蛋白或固體載體中分子的熒光或閃爍的放射性“游離”蛋白)。
本發(fā)明的方法用于鑒定能影響tim-3蛋白與galectin-9蛋白結(jié)合的化合物，這種方法的另一個改變是通過的親合型生物傳感器使用實(shí)現(xiàn)。這種方法以壓電效應(yīng)、電化學(xué)、或光學(xué)法如橢偏光度法、光波引導(dǎo)、表面等離子體諧振(SPR)。SPR對實(shí)時監(jiān)測分子相互作用具有特殊優(yōu)勢，與上面討論方法比較，SPR能使測定化合物影響兩肽間結(jié)合作用的靈敏和全面分析可行。然而，通過使用低通量技術(shù)，優(yōu)勢有點(diǎn)偏移(與multi-well plate-based method比較)。
這里以前提到的，如果化合物對tim-3與galectin-9蛋白結(jié)合有任何影響(例如，如果化合物增強(qiáng)或減少結(jié)合)，測試化合物能說成對tim-3蛋白與galectin-9蛋白間結(jié)合產(chǎn)生影響，并且影響超過極限值(極限值被本發(fā)明的專業(yè)人員設(shè)定為上面描述的預(yù)期水平；例如，結(jié)合的幾倍增加或幾倍減少)。結(jié)合的適宜作用是顯著作用。在這里使用的術(shù)語“顯著性的”，特別的術(shù)語“顯著性作用”，是指被比較的兩個基團(tuán)間量化參數(shù)的差異，使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計檢驗(yàn)差異是統(tǒng)計學(xué)上顯著性。在這里描述的方法的實(shí)施方案中，步驟(b)包括與適當(dāng)對照組對比，測試試劑存在下tim-3/galectin-9復(fù)合物的形成。在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)對照組包括無被測試的試劑或化合物存在下第一個多肽和第二個多肽間復(fù)合物的形成。
因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了篩選影響tim-3蛋白和galectin-9蛋白間結(jié)合的化合物的方法，該方法包括(a)測試化合物存在下，接觸tim-3蛋白和galectin-9蛋白；(b)確定試劑化合物對tim-3蛋白和galectin-9蛋白結(jié)合的作用；和(c)如果對結(jié)合程度的影響被測量是在極限水平之上，鑒定這個有效化合物。
術(shù)語“影響tim-3蛋白和galectin-9蛋白間結(jié)合”意思是與無測試試劑存在下(對照組)tim-3蛋白和galectin-9蛋白間的結(jié)合對比，測試化合物在tim-3蛋白和galectin-9蛋白間的結(jié)合中引起差異性。結(jié)合中適當(dāng)?shù)牟町愂秋@著性差異。在一個具體實(shí)施方案中，顯著性差異包括在結(jié)合中至少增加或減少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％、200％或500％?；衔锟梢种苹蛟鰪?qiáng)結(jié)合，或依據(jù)對tim-3的影響，發(fā)揮拮抗劑、促進(jìn)劑作用或發(fā)揮增強(qiáng)其它促進(jìn)劑或拮抗劑的化合物的作用。用于量化測試化合物對tim-3蛋白和galectin-9蛋白間結(jié)合作用的這類測量將依靠這類測定和被使用的檢測方法，并且能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易被確定。
在本測定的進(jìn)一步實(shí)施方案中，tim-3/galectin-9復(fù)合物產(chǎn)生在完整細(xì)胞中，其利用細(xì)胞孵育技術(shù)進(jìn)行受驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。例如，象下面描述的，tim-3/galectin-9復(fù)合物能在真核細(xì)胞培養(yǎng)體系中構(gòu)建，如哺乳動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞中。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的細(xì)胞也可被使用。在完整細(xì)胞中進(jìn)行受驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢包含檢測抑制劑的能力，這種抑制劑在抑制劑需要的更接近治療使用的環(huán)境中發(fā)揮功能，包含試劑進(jìn)入細(xì)胞的能力。此外，某些測試的體內(nèi)實(shí)施方案，例如下面給出的實(shí)施例，是關(guān)于測試試劑的高通量分析。the tim-3/galectin-9復(fù)合物的成分內(nèi)生在被選出的進(jìn)行測定的細(xì)胞內(nèi)。可供選擇的，這些成分的一些或全部能來自于外源。例如，融合蛋白能通過重組技術(shù)引入到細(xì)胞中(例如，通過表達(dá)載體的使用)，也通過微量注入融合蛋白或編碼融合蛋白mRNA引入到細(xì)胞中。
在另一個實(shí)施方案中，tim-3和galectin-9多肽能被用于建立相互作用陷井試驗(yàn)，(也參見美國專利No5,283,317；Zervos etal.(1993)Cell 72223-232；Madura et al.(1993)J Biol Chem 26812046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14920-924；andIwabuchi et al.(1993)Oncogene 81693-1696)，隨后采用該方法測定破壞一個蛋白與其它蛋白間結(jié)合的試劑。
酵母雙雜交蛋白相互作用試驗(yàn)也可用于鑒定影響tim-3蛋白和galectin-9蛋白結(jié)合的化合物。試驗(yàn)以真核轉(zhuǎn)錄激活劑是模塊化的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，例如激活劑典型包含激活轉(zhuǎn)錄的活性結(jié)構(gòu)域，和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域定位激活劑在DNA分子適當(dāng)范圍內(nèi)。
在雙雜交體系中，第一個融合蛋白包含一對與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的相互作用蛋白中的一個，第二個融合包含一對融合與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域蛋白的相互作用蛋白中的另一個。兩個融合蛋白分別在同一個細(xì)胞中表達(dá)，并且融合的相互作用蛋白部分間相互作用再生轉(zhuǎn)錄激活因子功能，這種再生轉(zhuǎn)錄激活因子功能通過受體基因轉(zhuǎn)錄的激活檢測出來。至少兩個差異細(xì)胞雙雜交蛋白-蛋白相互作用試驗(yàn)體系用于評估結(jié)合相互作用和/或鑒定相互作用蛋白。采用一對融合雜交蛋白，其中一對中的一個包含與轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合的兩個″相互作用″蛋白中的第一個，一對中的另一個包含與轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的兩個″相互作用″蛋白中的第二個。
在另一個實(shí)施方案中，一個蛋白在細(xì)胞上有表達(dá)，例如在細(xì)胞表面上有表達(dá)，然而另一個蛋白是初始蛋白或重組蛋白，初始蛋白或重組蛋白被純化或部分純化，并與細(xì)胞接觸，如與細(xì)胞接觸使復(fù)合物形成。
在一個實(shí)施方案中，作為調(diào)節(jié)tim-3和galectin-9間相互作用的鑒定試劑可被進(jìn)一步評估其功能作用，例如通過體外T細(xì)胞或體內(nèi)T細(xì)胞，鑒定試劑對Th1/Th2反應(yīng)誘導(dǎo)的作用，例如，通過使用在實(shí)驗(yàn)部分描述的測定。在一些實(shí)施方案中，動物模型病情進(jìn)一步被用于表征鑒定試劑，通過使用這里表述的方法，如自身反應(yīng)性腦脊髓炎實(shí)驗(yàn)動物模型、II型糖尿病KKAy鼠模型和Fabry腎病模型(α-Gal敲除)給鑒定試劑進(jìn)行表征。也參見Bedellet al.，Genes Dev.1997 Jan 1；11(1)11-43的可被使用的人疾病的另外的小鼠模型。
測試試劑或測試化合物能是想要測試包括，但不限于，蛋白(包括抗體)、肽、核酸(包括RNA、DNA、反義寡核苷酸、肽核酸)、糖類、有機(jī)化合物、無機(jī)化合物、天然產(chǎn)物、文庫提取物、體液的任何試劑或化合物，和想要測試影響a tim-3和galectin-9多肽的其它樣品。特殊的，測試化合物可是tim-3蛋白模擬肽或其片段模擬肽。在一些實(shí)施方案中，測試試劑被純化或部分純化，而在其它實(shí)施方案中，測試試劑不被純化。
測試試劑包括許多化學(xué)類，盡管他們是典型有機(jī)分子，具有分子量介于大于50小于2500Da適當(dāng)小分子有機(jī)化合物。測試試劑包括蛋白相互作用必要的功能基團(tuán)、特殊的氫鍵、適宜的至少兩種功能化學(xué)基團(tuán)。測試試劑經(jīng)常包括碳環(huán)結(jié)構(gòu)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和或芳香族結(jié)構(gòu)或一個或多個上述功能基團(tuán)取代的多環(huán)結(jié)構(gòu)。測試試劑也在生物分子中發(fā)現(xiàn)，這些生物分子包含，但不限于肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合物。
測試試劑從多種資源中得到，這些資源包括合成化合物或天然化合物文庫。例如，許多可從有機(jī)化合物和生物分子的無序合成和定向合成中得到，包含隨機(jī)寡核苷酸和低聚肽的表達(dá)。小分子有機(jī)的/肽文庫可通過使用組合技術(shù)建立，這些組合技術(shù)在Bondelle et al.(1995)Trends Anal.Chum.1483；the Affymax U.S.Patents 5,359,115 and 5,362,899；the Ellman U.S.Patent 5,288,514；the Still et al.PCT publication WO 94/08051；Chen et al.(1994)JACS 1162661；Kerr et al.(1993)JACS 115252；PCTpublications WO92/10092，WO93/09668and WO91/0787；and theLeaner et al.PCT publication WO93/20242中進(jìn)行表述。
可任選其一地，細(xì)菌、真菌、植物、和動物提取物形式的天然化合物文庫是可得到或容易制得的。此外，天然文庫和化合物或合成得到的文庫和化合物很容易通過傳統(tǒng)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法進(jìn)行修改，并且可被用于建立組合文庫。周知的藥理學(xué)試劑可被定向或隨機(jī)化學(xué)修改，例如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等來得到結(jié)構(gòu)類似物。
在其它實(shí)施方案中，測試試劑是tim-3模擬肽、galectin-9模擬肽、或其片段模擬肽。模擬肽是基于肽或蛋白的化合物，或來自肽或蛋白的化合物。典型用在本發(fā)明中模擬肽能通過已知類似肽序列的結(jié)構(gòu)修飾使用非天然氨基酸、構(gòu)象約束、等比容取代、和這一類而得到。受驗(yàn)?zāi)M肽組成肽和非肽合成結(jié)構(gòu)間的連續(xù)結(jié)構(gòu)空間；因此，類似模擬肽可有益于確定藥效基團(tuán)和使用親代類似肽活性幫助肽轉(zhuǎn)移到非肽化合物中。
此外，如本公開中所表明，受驗(yàn)tim-3和galectin-9序列的模擬物能被得到。這種模擬肽能具有如非水解的(例如，增強(qiáng)的抗蛋白酶的穩(wěn)定性或降解相應(yīng)肽的其它生理狀態(tài))、增強(qiáng)的特異性和/或效能、和增強(qiáng)的胞內(nèi)定位模擬肽的細(xì)胞滲透性。為說明目的，本發(fā)明肽類似物能使用如，苯(并)二氮而制得(例如，參見Freidinger et al.in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshal ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)，使用gamma內(nèi)酰胺環(huán)而制得(參見Garvey et al.in PeptidesChemistryand Biology，G.R.Marshal ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，pa123)，C-7模擬物而制得(參見Huffman et al.in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshal ed.，ESCOMPublisherLeiden，Netherlands，1988，p.105)，使用酮基-亞甲基類肽而制得(參見Ewenson et al.(1986)J Med Chem 29295；andEwenson et al.in PeptidesStructure and Function(Proceedings ofthe 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)，α-旋轉(zhuǎn)二肽核而制得(參見Nagai et al.(1985)Tetrahedron Lett 26647；and Sato et al.(1986)J Chem Soc PerkinTrans 11231)，α-氨基醇而制得(參見Gordon et al.(1985)Biochem Biophys Res Commun 126419；和Dann et al.(1986)Biochem Biophys Res Commun 13471)，二氨基酮而制得(參見Natarajan et al.(1984)Biochem Biophys Res Commun 124141)，和修飾的亞甲氨基而制得(參見Roark et al.in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshal ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p134)。一般也參見，主題III肽中的分析和合成方法Chemistry and Biology，G.R.Marshal ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)。
除了用于生成受驗(yàn)擬肽類似物的多種側(cè)鏈取代之外，本發(fā)明特殊注意肽二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象約束模擬物。多數(shù)替代物形成了肽的酰胺鍵。經(jīng)常使用的酰胺鍵替代物包含下列基團(tuán)(i)反烯烴，(ii)氟代烯烴，(iii)亞甲氨基，(iv)氨基膦酸酯，和(v)磺胺。
在一些實(shí)施方案中，在確定是否測試試劑能影響tim-3或galectin-9多肽間的結(jié)合，預(yù)選選擇具有與tim-3或galectin-9蛋白結(jié)合的能力的測試試劑。在一個實(shí)施方案中，可首先選擇有結(jié)合tim-3或galectin-9多肽的測試試劑。測試試劑可通過篩選測試試劑文庫被預(yù)選選出，例如肽文庫或噬菌體展示文庫。
(8)組合物、制劑和包裝本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了包括核酸、多肽或在這里被描述試劑的組合物。在一個實(shí)施方案中，組合物是藥物學(xué)組合物。依照本發(fā)明使用的藥物學(xué)組合物可使用一個或多個生理用載體或賦型劑可按傳統(tǒng)方法制成。因此，化合物和它們的生理用鹽和溶劑化物可按配方制成如，噴霧給藥、靜脈給藥、口服給藥或局部路線給藥。給藥包括瘤內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射或靜脈注射；輸液；脂質(zhì)體介導(dǎo)輸送；局部輸送、鞘內(nèi)輸送、齦袋輸送、經(jīng)由直腸輸送、支氣管內(nèi)輸送、鼻腔輸送、黏膜輸送、腸內(nèi)輸送、口服輸送、眼睛輸送或耳輸送。
本發(fā)明的模擬組合物包括混有輸送體系的RNAi，輸送體系如脂質(zhì)體體系，和任選地包含可用賦型劑。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物按配方注射。
方法和制劑一般可在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA中找到。對于全身給藥，優(yōu)選的是注射，包含肌肉注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。對于注射，本發(fā)明的化合物能按配方制成液體溶液、生理互不排斥緩沖液如Hank′s緩沖液或Ringer′s溶液。此外，化合物可按配方制成固體形式和使用前立即重新溶解或懸浮。凍干形式也包含在內(nèi)。
對于口服給藥，藥物學(xué)組合物可采用如，藥片或膠囊形式，藥物和膠囊使用藥物用賦形劑如結(jié)合試劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；裝填物(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；分解質(zhì)(例如，馬鈴薯淀粉或羥乙酸淀粉鈉)；或潤濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。
藥片可用本領(lǐng)域周知的方法在表面涂敷一層。口服液體制劑可采用如，溶液、糖漿或懸浮液形式，或使用前表現(xiàn)為由水或其它合適介質(zhì)組成的干物質(zhì)。這種液體制劑可通過傳統(tǒng)方法采用藥物用添加劑如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用油)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水介質(zhì)(例如，ationd oil、油酯、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(例如，甲基或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)制成。制劑也可包含適當(dāng)?shù)柠}緩沖液、調(diào)味劑、顏料劑或甜味劑。
口服給藥制劑可按配方制得控制釋放活性化合物。對于口腔給藥，組合物可采用藥片形式或按傳統(tǒng)方法制得錠劑形式。對于吸入給藥，按照本發(fā)明化合物的使用便于以壓縮包裝或噴霧器產(chǎn)生伴有合適揮發(fā)劑的噴霧形式輸送，揮發(fā)劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、四氟二氯乙烷、二氧化碳或其它合適氣體。根據(jù)壓縮氣霧劑，給藥劑量可通過提供定量輸送的數(shù)值而確定。如用于吸入器或吹藥器的凝膠膠囊和藥盒可按配方制得包含化合物和合適粉末如乳糖或淀粉的粉末混合物。
化合物可按配方制成通過注射腸胃外給藥，例如通過丸劑注射或連續(xù)灌輸腸胃外給藥。注射配方可表現(xiàn)為如一次用量針劑的加入防腐劑的單位劑量形式或多劑量容器內(nèi)的加入防腐劑的單位劑量形式。組合物可采用這種懸浮液形式、溶液形式或油內(nèi)乳液形式或水性介質(zhì)形式，并且可包含配方試劑如懸浮液試劑、穩(wěn)定化處理試劑和/或分散劑。可任選其一地，活性成分可是以粉末形式組成合適介質(zhì)，例如使用前消毒處理無熱原水。
化合物也可按配方制成直腸用藥組合物，例如栓劑或滯留型灌腸劑，如包含如可可豆油或其它甘油酯的傳統(tǒng)栓劑基質(zhì)。
除了前面描述的制劑，化合物也可按配方制成存儲制劑。這個長期起作用配方可通過植入給藥(例如，皮下給藥或肌肉給藥)或通過肌肉注射。因此，化合物可采用合適的聚合材料或憎水材料(例如，可用油里的乳劑)或離子交換樹脂，或如同難溶衍生物，例如難溶鹽，按配方制得。
全身給藥也能通過粘膜給藥方法或真皮給藥方法實(shí)現(xiàn)。對于粘膜給藥或真皮給藥，適于滲入載體的滲透劑在配方中使用。這種滲透劑一般在本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知，并且包含，例如粘膜給藥的膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物，此外，去污劑可被用于促進(jìn)滲入。粘膜給藥可通過鼻腔噴霧或使用栓劑實(shí)現(xiàn)。對于局部給藥，本發(fā)明的低聚體按配方制成本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的軟膏、油膏劑、凝膠、或面霜。洗脫溶液能被局部使用來治療損傷或炎癥而加速治愈。
當(dāng)需要時，組合物可存在于包裝中或給料裝置中，組合物可包含一個或多個含有活性成分的單個試劑形式。包裝可包括如金屬或塑料薄膜，例如硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝。包裝或給料裝置可附帶服用說明書。
對于包含核酸給藥的治療，本發(fā)明的低聚體能按配方制成不同給藥形式，這些形式包含全身給藥和局部給藥或限制區(qū)域內(nèi)給藥。方法和配方一般可在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA中找到。對于全身給藥，優(yōu)選的是注射給藥，包含肌肉注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、結(jié)點(diǎn)內(nèi)注射、和皮下注射，本發(fā)明的低聚體能按配方制成液體溶液，適宜在生理互不排斥緩沖液中，如Hank′s溶液或Ringer′s溶液。此外，低聚體可按配方制成固體形式和使用前立即重新溶解或懸浮的。凍干形式也包含在內(nèi)。
全身給藥也能通過粘膜給藥方法或真皮給藥方法實(shí)現(xiàn)，或化合物能被口服給藥。對于粘膜給藥或真皮給藥，適于滲入載體的滲透劑在配方中使用。這種滲透劑一般在本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知，并且包含，例如粘膜給藥的膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物，此外，去污劑可被用于促進(jìn)滲入。粘膜給藥可通過鼻腔噴霧或使用栓劑實(shí)現(xiàn)。對于口服給藥，低聚體按配方制成傳統(tǒng)口服給藥形式如膠囊、藥片、和補(bǔ)劑。對于局部給藥，本發(fā)明的低聚體按配方制成本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的軟膏、油膏劑、凝膠、或面霜。
本發(fā)明試劑和組合物的毒性和治療功效能通過細(xì)胞培養(yǎng)中或?qū)嶒?yàn)動物中標(biāo)準(zhǔn)制藥程序被確定，例如為確定LD50(人致死劑量的50％)和ED50(對人藥物有效劑量的50％)。毒性作用和治療作用之間的劑量比率是治療指數(shù)，能表達(dá)為LD50/ED50比。顯示較大治療誘導(dǎo)的化合物是優(yōu)選的。雖然毒性副作用的化合物可被使用，應(yīng)該注重設(shè)計以患病組織部位的化合物為靶標(biāo)的遞送體系以最小化對未被感染細(xì)胞的潛在損害，從而減少副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)和動物研究能被用在設(shè)計使用在人身上的劑量范圍配方中。這種化合物的劑量更適宜在一定范圍的循環(huán)濃度內(nèi)，循環(huán)濃度包含帶有少量毒性或無毒性的ED50。劑量可在依靠使用劑型范圍之內(nèi)和被采用的給藥路線而改變。對于在本發(fā)明方法中使用的任何化合物，治療有效劑量能初步從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中評估出。在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的劑量可在動物模型中按配方設(shè)計出來以獲得包含IC50(例如，獲得癥狀的半最大抑制的測試化合物濃度)的血漿濃度范圍。這種信息能用于更準(zhǔn)確確定人體內(nèi)有效劑量。血漿水平可被測量，如通過高效液相色譜被測量出。
在這里表述的方法的一個實(shí)施方案中，受驗(yàn)者體重每一公斤內(nèi)含試劑有效劑量在約1mg和約50mg之間。在一個實(shí)施方案中，受驗(yàn)者體重每一公斤內(nèi)含試劑有效劑量在約2mg和約40mg之間。在一個實(shí)施方案中，受驗(yàn)者體重每一公斤內(nèi)含試劑有效劑量在約4mg和約20mg之間。在一個實(shí)施方案中，受驗(yàn)者體重每一公斤內(nèi)含試劑有效劑量在約5mg和約10mg之間。
在這里表述的方法的一個實(shí)施方案中，試劑至少每天給藥一次。在一個實(shí)施方案中，試劑每天給藥。在一個實(shí)施方案中，試劑每隔一天給藥。在一個實(shí)施方案中，試劑每6到8天給藥。在一個實(shí)施方案中，試劑一星期給藥一次。
至于對受驗(yàn)者給藥的化合物和/或試劑的劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道怎么確定適當(dāng)劑量。與在這里被使用的一樣，一劑或劑量將是足夠量對于或者抑制紊亂、治療紊亂、治療受驗(yàn)者或阻止受驗(yàn)者遭受紊亂折磨。這個劑量可被認(rèn)為是有效劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能執(zhí)行簡單的滴定實(shí)驗(yàn)以確定什么劑量被要求用于治療患者。本發(fā)明組合物的劑量將隨受驗(yàn)者和使用給藥特殊路線而改變。在一個實(shí)施方案中，劑量能變動范圍從受驗(yàn)者體重的約0.1μg/kg到約100,000μg/kg。根據(jù)組合物，劑量能連續(xù)遞送，例如通過連續(xù)泵連續(xù)遞送，或定期間隔連續(xù)遞送。例如，在一個或多個隔開的時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員能在無不合理實(shí)驗(yàn)的情況下確定多劑特殊組合物的要求時間間隔。
有效劑量可以根據(jù)，其中之一，化合物尺寸、化合物的生物降解能力、化合物生物活性和化合物生物藥效率為基礎(chǔ)。如果化合物不迅速降解，生物可用的和高活性的，小劑量將會是有效的。
有效劑量在本領(lǐng)域周知的常規(guī)技術(shù)之一；它也將根據(jù)化合物的形式、化合物尺寸和化合物生物活性。本領(lǐng)域的技術(shù)之一能按步驟實(shí)施化合物經(jīng)驗(yàn)活性測試以確定生物測定中的生物活性，并因此確定有效劑量。在上述方法的一個實(shí)施方案中，化合物的有效劑量包括從受驗(yàn)者體重的約1.0ng/kg到約100mg/kg。在上述方法的另一個實(shí)施方案中，化合物的有效劑量包括從受驗(yàn)者體重的約100ng/kg到約50mg/kg。在上述方法的另一個實(shí)施方案中，化合物的有效劑量包括從受驗(yàn)者體重的約1μg/kg到約10mg/kg。在上述方法的另一個實(shí)施方案中，化合物的有效劑量包括從受驗(yàn)者體重的約100μg/kg到約1mg/kg。
至于化合物、組合物和/或試劑何時給藥，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定什么時候進(jìn)行這種化合物和/或試劑給藥。對于某一時間段或周期的和在特定時間間隔可持續(xù)的給藥?；衔锟砂葱r、一天、一星期、一個月、一年給藥(例如，以一個時間釋放形式進(jìn)行)或在一個時間給藥。輸送可是一段時間的持續(xù)輸送，例如，靜脈內(nèi)輸送。在這里描述的方法的一個實(shí)施方案中，每天至少一次進(jìn)行該試劑給藥。在這里描述的方法的一個實(shí)施方案中，該試劑每天給藥。在這里描述的方法的一個實(shí)施方案中，該試劑每隔一天給藥。在這里描述的方法的一個實(shí)施方案中，該試劑每6天到8天給藥。在這里描述的方法的一個實(shí)施方案中，該試劑每星期給藥。
本發(fā)明的另一個方面提供了藥品包裝，這種藥品包裝包括(i)包括tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域的多肽；和(ii)對受到增生折磨的受驗(yàn)者組合物給藥的說明書，受驗(yàn)者選自于包括腎臟細(xì)胞癌、卡波西氏肉瘤、慢性白血病、前列腺癌、乳癌、肉瘤、胰腺癌、白血病、卵巢癌、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、淋巴瘤、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌、睪丸癌、胃腸癌和胃癌。
(9)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法本發(fā)明的一個方面提供了調(diào)解免疫反應(yīng)的方法，例如但不限于，調(diào)節(jié)Th1或Th2反應(yīng)、免疫耐受性和移植耐受性。在這里使用的術(shù)語調(diào)節(jié)是指增強(qiáng)或減少。本發(fā)明調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法部分根據(jù)滴定測定tim-3配體的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。使用融合蛋白包括可溶tim-3，Th1反應(yīng)被增強(qiáng)，外周耐受性的建立被取消，移植耐受性被減少。通過對比，對哺乳動物進(jìn)行作為tim-3配體應(yīng)用被發(fā)現(xiàn)的galectin-9給藥，導(dǎo)致Th1反應(yīng)減少。
本發(fā)明的另一個方面提供了在受驗(yàn)者體內(nèi)減少免疫耐受性、增強(qiáng)Th1介導(dǎo)免疫反應(yīng)、和/或減少Th2介導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，方法包括給受驗(yàn)者服用有效治療劑量的試劑，這種試劑減少tim-3表達(dá)或tim-3活性、galectin-9或兩個如tim-3激動劑或galectin-9激動劑，或增強(qiáng)tim-3與galectin-9結(jié)合的方法。
通過減少tim-3活性而減少免疫耐受性和增強(qiáng)Th1介導(dǎo)免疫反應(yīng)對癌癥免疫療法是有益的。免疫體系能形成抗腫瘤抗原耐受性，因此使腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)控。在本發(fā)明的一個方面，給遭受增生折磨受驗(yàn)者進(jìn)行減少tim-3活性的試劑的給藥。
術(shù)語“癌癥”和“腫瘤”可交替使用，兩個術(shù)語都指增生狀態(tài)。在一個實(shí)施方案中，癌癥選自由卡波西氏肉瘤、慢性白血病、前列腺癌、乳癌、肉瘤、胰腺癌、白血病、卵巢癌、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、淋巴瘤、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌、和胃腸癌或胃癌組成的組。在另一個實(shí)施方案中，癌癥選自由基底細(xì)胞癌、膽管癌；膀胱癌；骨癌；腦癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌；乳癌；宮頸癌；絨膜癌；結(jié)腸癌和直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌；上皮內(nèi)吸瘤；腎臟癌；喉癌；白血??；肝癌；肺癌(例如，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)；包含Hodgkin′s淋巴瘤和非Hodgkin′s淋巴瘤的淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌(例如，唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌，和其它癌癥和肉瘤組成的組。
在另一個實(shí)施方案中，用來通過抑制tim-3活性而增強(qiáng)Th1活性的試劑被制成疫苗用于提高受驗(yàn)者免疫反應(yīng)。在一個具體實(shí)施方案中，抑制tim-3活性試劑如包括tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域的多肽，或抑制全長tim-3和tim-3配體間復(fù)合物形成的抗體，與疫苗一起被給藥以提高對疫苗的免疫反應(yīng)。疫苗包括，但不限于，目的在于阻止病毒感染或細(xì)菌感染的那些疫苗。在其他實(shí)施方案中，在接種疫苗前進(jìn)行試劑給藥，然而在其他實(shí)施方案中，給受驗(yàn)者注射疫苗后，再進(jìn)行試劑給藥。
然而在另一個方面，本發(fā)明描述了減少、抑制、減低、改善、或延遲受驗(yàn)者體中Th2型反應(yīng)(例如，過敏反應(yīng)或哮喘反應(yīng))的方法，方法包括對受驗(yàn)者進(jìn)行減少tim-3表達(dá)或活性、galectin-9表達(dá)或活性或兩者的表達(dá)或活性的試劑的給藥，例如對受驗(yàn)者進(jìn)行tim-3或galectin-9拮抗劑的給藥，或?qū)κ茯?yàn)者進(jìn)行減少galectin-9結(jié)合到tim-3的試劑的給藥。
在這里使用的“Th2介導(dǎo)紊亂”統(tǒng)指與Th2免疫反應(yīng)形成相關(guān)的疾病。在這里使用的″Th2免疫反應(yīng)″統(tǒng)指至少一個Th2細(xì)胞因子或Th2抗體的誘導(dǎo)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個以上Th2細(xì)胞因子或Th2抗體被誘導(dǎo)。因此，Th2介導(dǎo)疾病是和Th2反應(yīng)誘導(dǎo)相關(guān)的疾病，并且Th2介導(dǎo)疾病統(tǒng)指至少一個Th2細(xì)胞因子或Th2抗體的局部或全部誘導(dǎo)，或至少Th2細(xì)胞因子或Th2抗體水平的增長。這些紊亂是本技術(shù)領(lǐng)域周知，包含但不限于，例如，過敏癥狀如哮喘和過敏、胃腸敏感如食物過敏、嗜曙紅細(xì)胞過多、結(jié)膜炎、血管球性腎炎、某種病菌易感性如驅(qū)蟲劑(例如，利什曼病)和某種病毒感染，包含人體免疫缺陷病毒(HIV)，和某種細(xì)菌感染，包含肺結(jié)核和瘤型麻風(fēng)病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Th2型反應(yīng)是哮喘或敏感癥。
在這里定義的哮喘，是一段時間內(nèi)人體內(nèi)可逆氣流限制。通過如嗜曙紅細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和氣道內(nèi)CD25+T淋巴細(xì)胞存在下，哮喘被表述出其性質(zhì)。因?yàn)榫哂卸喾N通訊和生物效應(yīng)器性質(zhì)的細(xì)胞因子活性，這些細(xì)胞間有密切相互作用。趨化因子引導(dǎo)細(xì)胞貼近發(fā)炎部位，細(xì)胞因子活化這些引發(fā)黏膜發(fā)炎和損害的細(xì)胞。隨著過程的長期性，第二個改變發(fā)生，例如基底膜變厚和纖維化。通過增強(qiáng)對多種刺激物的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥，表述出疾病的性質(zhì)。隨著時間的過去，診斷患有哮喘的患者一般有多種跡象，例如呼吸困難、哮喘發(fā)作、乙酰甲膽堿激發(fā)的陽性反應(yīng)，例如少于約4mg/ml PC20乙酰甲膽堿激發(fā)。例如診斷標(biāo)準(zhǔn)可在National Asthma Education Program Expert PanelGuidelines for Diagnosis and Management of Asthma，NationalInstitutes of Health，1991，Pub.No.91-3042中找到。
在這里使用的“過敏癥”應(yīng)該統(tǒng)指對某種物質(zhì)的獲得性超敏性。過敏癥狀包含濕疹、過敏性鼻炎或傷風(fēng)、干燒、支氣管哮喘、風(fēng)疹(麻疹)和食物過敏、和其它過敏性癥狀?！盎加羞^敏癥的受驗(yàn)者”是患有或?qū)^敏原形成過敏反應(yīng)風(fēng)險的受驗(yàn)者?！斑^敏原”是指能引發(fā)敏感受驗(yàn)者的過敏反應(yīng)或哮喘反應(yīng)的物質(zhì)。過敏原列表是巨大的，能包含花粉、昆蟲毒液、動物皮毛屑、灰塵、真菌孢子和藥物(例如，青霉素)。
目的抗原包括在食物中發(fā)現(xiàn)的抗原，例如草莓、花生、牛奶蛋白質(zhì)、蛋白等中發(fā)現(xiàn)的抗原。其它的目的抗原包含不同空氣傳播抗原，例如禾本科花粉、動物皮毛屑、馬排泄物等。分子克隆過敏原包含屋塵螨(Der PI)；來自黑麥禾本科花粉的Lol pl-V；許多昆蟲毒液，包含跳蚤Myrmecia pilosula身上毒液；蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(PLATZ和抗原5S；小黃蜂蜂毒磷脂酶；大量花粉蛋白，包含白樺花粉、豚草屬花粉、口頭(Parietaria成藥主要過敏原)和可交叉反應(yīng)過敏原Parjl(屬于猶大墻草)，和其它大氣花粉包含油橄欖、蒿、禾本科等。其它目的過敏原是由引發(fā)的過敏性皮炎，例如吸血節(jié)肢動物，例如雙翅目昆蟲如蚊子(瘧蚊、伊蚊、庫蚊)；蒼蠅(白蛉、庫蠓)獨(dú)特黑色蒼蠅、牛虻和吸血蠓；扁虱(革蜱、鈍緣蜱、耳蜱屬)；跳蚤，例如，蚤目，包含客蚤屬、人蚤、和貓?zhí)?。特異性過敏原可是多聚糖、脂肪酸半族、蛋白等。
本發(fā)明的一個具體方面提供了阻止或減少受驗(yàn)者遭受過敏癥著折磨可能性的方法，這個方法包括給受驗(yàn)者實(shí)施有效治療劑量的多肽的給藥，上述多肽包括(i)SEQ ID NO10；(ii)SEQ IDNO18；(iii)氨基酸序列至少90％等同于或相似于SEQ ID NO10；或(iv)氨基酸序列至少90％等同于或相似于SEQ ID NO18。
根據(jù)本發(fā)明，調(diào)節(jié)tim-3或galectin-9活性、或調(diào)解tim-3和galectin-9間復(fù)合物形成的試劑可用在與其它組合物和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)方法或治療紊亂或癥狀的程序的組合中。例如，腫瘤可采用外科手術(shù)、放射療法或化學(xué)療法治療進(jìn)行傳統(tǒng)治療。減少tim-3活性試劑，例如可溶tim-3-IgFc融合蛋白，可隨后對患者給藥來延長微轉(zhuǎn)移休眠和穩(wěn)定任何殘余原發(fā)性腫瘤。
在一些實(shí)施方案中，相對于全長tim-3表達(dá)，減少tim-3活性的試劑優(yōu)先抑制可溶tim-3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，阻滯tim-3與galectin-9結(jié)合的試劑是抗體、或抗體片段如保留了與其抗原高親和力的抗體片段。這種抗體可通過或與galectin-9結(jié)合或與tim-3結(jié)合來阻滯tim-3/galectin-9結(jié)合。在一個具體實(shí)施方案中，試劑是抗體或或抗體片段，其抗體片段與包括SEQ ID NO13的氨基酸30-128結(jié)合。
結(jié)合tim-3胞外域的單克隆抗體能被本領(lǐng)域技術(shù)人員制得，使用目前發(fā)明提供的方法，能進(jìn)一步測試這些抗體阻滯tim-3配體如galectin-9與全長tim-3結(jié)合的能力。在沒有它們自己作為全長tim-3活性的激活劑的情況下，優(yōu)選的抗體將阻滯全長tim-3和它的配體間結(jié)合相互作用。使用在實(shí)驗(yàn)程序中描述的測定，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定是否候選抗體是tim-3活性的激活劑，例如通過給被免疫小鼠服用抗體并通過體外增值測試和從小鼠脾分離出的Th1細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行確定。減少免疫耐受性的優(yōu)選抗體將阻滯tim-3配體和tim-3的結(jié)合并且不包含tim-3活化如不抑制細(xì)胞增值和細(xì)胞因子釋放。
在一個實(shí)施方案中，試劑用于抑制包括抗體的tim-3功能。在一個實(shí)施方案中，抗體結(jié)合到tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域上(SEQ IDNO13的氨基酸30-128)和抗體阻滯tim-3配體和全長tim-3的結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，tim-3配體是galectin-9。因此，在另一個實(shí)施方案中，抗體結(jié)合galectin-9。一經(jīng)結(jié)合，抗體可阻止galectin-9和全長tim-3間的物理相互作用。
在另一個實(shí)施方案中，阻滯受驗(yàn)者體內(nèi)全長tim-3和galectin-9結(jié)合的試劑包括重組tim-3多肽，這種重組tim-3多肽與內(nèi)生tim-3競爭結(jié)合galectin-9。在一個具體實(shí)施方案中，包括多肽的試劑包括(i)SEQ ID NO13的氨基酸30-128；或(iii)氨基酸序列至少90％等同于SEQ ID NO13的氨基酸30-128。在一個具體實(shí)施方案中，多肽試劑是聚乙二醇化和/或是有人血清蛋白的融合蛋白或有免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在另一個實(shí)施方案中，在這個方法中使用以激活Th1細(xì)胞或減少免疫耐受性的試劑包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的可溶tim-3多肽。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑包括tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO13的氨基酸30-128)。在另一個實(shí)施方案中，可溶tim-3多肽包括tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域，可任選的包括tim-3胞內(nèi)域，和免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域，但不包含tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些多肽結(jié)合galectin-9。不同種的這些多肽，如增強(qiáng)tim-3配體結(jié)合的多肽，能被使用。
在一些實(shí)施方案中，減少tim-3活性的試劑抑制(i)包括SEQID NO13的氨基酸30-128多肽與(ii)galectin-9，例如galectin-9長鏈形式或短鏈形式，的結(jié)合。
申請人發(fā)現(xiàn)乳糖抑制galectin-9和tim-3的結(jié)合。因此，在一個實(shí)施方案中，抑制全長tim-3和galectin-9結(jié)合的試劑包括糖類，例如乳糖或膠質(zhì)和/或修飾膠質(zhì)。修飾的膠質(zhì)在美國專利公開Nos.2003/0004132和2002/0187959中進(jìn)行了描述。
在另一個實(shí)施方案中，在這里描述的方法中的試劑被用于激活促進(jìn)Th1反應(yīng)和/或抑制Th2反應(yīng)，減少全長tim-3多肽或tim-3配體如galectin-9多肽的表達(dá)水平。在一個具體實(shí)施方案中，試劑是在本發(fā)明提供的雙鏈RNA類，試劑包含那些定向的全長tim-3或tim-3配體，例如galectin-9。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在這里描述的方法中的試劑被用于激活促進(jìn)Th1反應(yīng)和/或抑制Th2反應(yīng)，或用于抑制tim-3功能的試劑是小型有機(jī)分子，例如，不同于肽或寡核苷酸，小于2000Da分子量的試劑抑制tim-3與其配體如galectin-9的結(jié)合。這種試劑能被鑒定出，例如使用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行鑒定。在另一個實(shí)施方案中，抑制tim-3功能的試劑是肽或肽衍生物，該肽衍生結(jié)構(gòu)模擬結(jié)合tim-3的galectin-9部分。通過阻止tim-3與其配體間功能相互作用，這種肽可作為拮抗競爭者。在一個實(shí)施方案中，配體是galectin-9。
根據(jù)本發(fā)明，減少tim-3活性的試劑，例如通過減少表達(dá)水平或減少tim-3/配體復(fù)合物形成來減少tim-3活性的試劑，可用在其它組合物和治療增生癥狀程序的組合中。例如，腫瘤可采用外科手術(shù)、放射療法或化學(xué)療法治療、和雙鏈RNA、抗體或抗tim-3或抗tim-3配體的小分子抑制劑如galectin-9進(jìn)行傳統(tǒng)治療，可隨后對患者給藥以延長微轉(zhuǎn)移休眠和穩(wěn)定任何殘余原發(fā)性腫瘤。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療或阻止或減少需要這種治療的受驗(yàn)者遭受Th1介導(dǎo)紊亂的可能性，這個方法包括給受驗(yàn)者服用有效治療劑量的試劑，這種試劑增強(qiáng)tim-3表達(dá)或tim-3活性、galectin-9表達(dá)或galectin-9活性、或兩者的表達(dá)或活性，或這種試劑增強(qiáng)tim-3與galectin-9的結(jié)合。
本發(fā)明也描述了減少、抑制、減低、改善、或延遲受驗(yàn)者體中Th1介導(dǎo)免疫反應(yīng)，方法包括給受驗(yàn)者服用tim-3或galectin-9激動劑，例如，在這里表述的tim-3或galectin-9激動劑，以減少、抑制、減低、改善、或延遲上述受驗(yàn)者體中Th1介導(dǎo)免疫反應(yīng)的足夠劑量給藥。
相對于Th2介導(dǎo)紊亂，在這里使用的“Th1介導(dǎo)紊亂”統(tǒng)指與Th1免疫反應(yīng)形成相關(guān)的疾病。在這里使用的″Th1免疫反應(yīng)″統(tǒng)指至少一個Th1因子或Th1抗體的誘導(dǎo)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個Th1細(xì)胞因子或Th1抗體被誘導(dǎo)。因此，Th1介導(dǎo)疾病是與Th1反應(yīng)誘導(dǎo)相關(guān)的疾病，并統(tǒng)指至少一個Th1細(xì)胞因子或Th1抗體的局部或全部誘導(dǎo)或至少Th1細(xì)胞因子或Th1抗體水平的增長。這些紊亂是本技術(shù)領(lǐng)域周知，包含但不限于，自體免疫(特別是器官特異性)疾病、牛皮癬、Th1炎癥引發(fā)紊亂、胞外寄生蟲感染(例如，對寄生蟲的反應(yīng))、實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)(例如，急性腎臟移植排斥反應(yīng))、乙型肝炎(HBV)感染癥狀(例如，HBV急性階段或恢復(fù)階段)、慢性丙型肝炎(HCV)感染、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、多重硬化征(MS)、亞急性性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎(″寂靜性甲狀腺炎″)、克羅恩病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、結(jié)節(jié)病、動脈硬化癥、急性移植物抗宿主(GvHD)、腎小球腎炎、抗腎小球基膜性疾病、韋格納肉芽腫病、炎性肌病、干燥綜合征、Beget′s綜合癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、和原因不明性習(xí)慣性流產(chǎn)。
在一些實(shí)施方案中，Th1介導(dǎo)紊亂選自由動脈硬化癥、胞外寄生蟲感染、乙型肝炎(HBV)感染癥狀(例如，HBV急性階段或恢復(fù)階段)、慢性丙型肝炎(HCV)感染、寂靜性甲狀腺炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、腎小球腎炎、抗腎小球基膜性疾病、韋格納肉芽腫病、炎性肌病、干燥綜合征、Beget′s綜合癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和原因不明性習(xí)慣性流產(chǎn)組成的組。
在這里表述的減少Th1介導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法可顯著有益于治療受驗(yàn)者的自體免疫疾病。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的減少受驗(yàn)者Th1反應(yīng)的方法定向針對遭受、或發(fā)展自體免疫疾病的高危受驗(yàn)者?！白泽w免疫疾病”是受驗(yàn)者自身抗體與宿主組織間反應(yīng)的一類疾病，或免疫效應(yīng)T細(xì)胞是對內(nèi)生自身肽的自身反應(yīng)性和引起組織破壞的自身反應(yīng)性的疾病。
這里使用的“自身抗原”統(tǒng)指正常宿主組織的抗原。宿主組織的抗原不包含癌細(xì)胞。因此在自體免疫疾病環(huán)境下，抗自身抗原的免疫反應(yīng)是想要得到的免疫反應(yīng)并促使正常組織的毀壞和損壞，然而抗癌癥抗原的免疫反應(yīng)是想要得到的免疫反應(yīng)并促使腫瘤或癌癥的毀壞和損壞。
自體免疫疾病包含但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多重硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無力(MG)、橋本氏甲狀腺炎、肺出血腎炎綜合癥、天皰瘡(例如，尋常型天皰瘡)、Graves病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、抗膠原抗體硬皮病、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性肌炎、胃黏膜萎縮造成的惡性貧血、自發(fā)性阿狄森氏病、自體免疫相關(guān)不育癥、血管球性腎炎(例如，新月體性腎小球腎炎、增生性腎炎)、大皰性類天皰瘡、干燥綜合征、胰島素抵抗、和自體免疫性糖尿病(I型糖尿??；胰鳥素依賴型糖尿病)。最近，自體免疫疾病也被認(rèn)為包含動脈硬化癥和阿茲海默癥。在一個具體實(shí)施方案中，自體免疫疾病選自由多重硬化癥、I型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胃炎、自身免疫性肝炎、再生障礙性貧血、自身免疫性血友病、自體免疫淋巴組織增殖綜合征(ALPS)、自體免疫眼色素層鞏膜炎、血管球性腎炎、格林-巴利綜合征、牛皮癬和重癥肌無力組成的組。在另一個實(shí)施方案中，Th1介導(dǎo)紊亂是移植物抗宿主病(HVGD)。在一個相關(guān)的實(shí)施方案中，受驗(yàn)者是器官或組織移植接受者。
然而本發(fā)明的另一個方面提供了增強(qiáng)受驗(yàn)者體內(nèi)移植耐受性的方法，該方法包括給受驗(yàn)者服用有效治療劑量的增強(qiáng)tim-3或galectin-9融合、表達(dá)、或tim-3與galectin-9結(jié)合的試劑。在一個具體實(shí)施方案中，受驗(yàn)者是異種移植的接受著。移植能是任何器官或組織移植，包含但不限于心臟、腎臟、肝臟、皮膚、胰腺、骨髓、皮膚或軟骨。在這里使用的移植耐受性統(tǒng)指缺乏接受者免疫體系對捐獻(xiàn)器官的排斥。此外，試劑能被用于阻止或減少組織移植或細(xì)胞移植排斥折磨的可能性。
在這里使用的，術(shù)語“試劑”和“化合物”包括蛋白質(zhì)半族和非蛋白質(zhì)半族。試劑能是化學(xué)的(元素、分子、化合物、藥物)，合成制得、重組技術(shù)制得或從天然原料中分離出。例如，試劑能是肽、多肽、抗體或抗體片段、肽、糖、激素、或核酸分子(例如，反義或RNAi核酸分子)。此外，試劑能是采用組合化學(xué)制得的小分子或較大復(fù)合物分子，例如，乙醇、烷基鹵化物、胺、氨基化合物、酯、醛、醚和其它類的有機(jī)化合物。試劑也能是從溶解產(chǎn)物、細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基、動物或植物中分離的天然的或基因工程的產(chǎn)物。
在一個實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑，例如那些用于促進(jìn)Th2反應(yīng)和/或抑制Th1反應(yīng)，促進(jìn)全長tim-3與配體的結(jié)合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，tim-3配體是galectin-9。試劑可是多肽，可自己與tim-3結(jié)合或自己可與tim-3配體結(jié)合，例如試劑galectin-9，并且這種試劑增強(qiáng)tim-3與配體間的結(jié)合的相互作用。
在這里描述的方法的一個實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑是tim-3配體。這種配體的一個實(shí)例是galectin-9。因此，在一些實(shí)施方案中，上述試劑包括galectin-9多肽。在另一個實(shí)施方案中，上述試劑包括多肽，這種多肽包括至少galectin-9的兩個糖類認(rèn)知結(jié)構(gòu)域(CRD)中的一個，例如，至少N端或C端，或兩端。
在另一個實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑包括多肽，這種多肽包括氨基酸序列至少80％等同于SEQ ID NO10或SEQID NO18氨基酸序列。在其它的實(shí)施方案中，序列是85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同于SEQ IDNO10或SEQ ID NO18的氨基酸序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽包括氨基酸序列，這種序列至少85％、90％或95％等同于至少一個人galectin-9認(rèn)知結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
在其它的實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑包括模擬肽或能起到激活tim-3受體內(nèi)galectin-9作用的小分子。肽或小分子可結(jié)構(gòu)類似結(jié)合tim-3的galectin-9表面，例如包含增強(qiáng)的細(xì)胞增生和細(xì)胞因子分泌的肽或小分子一經(jīng)結(jié)合它便能激活tim-3，而導(dǎo)致了tim-3活性增強(qiáng)和Th1細(xì)胞激活。在一個具體實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑促進(jìn)tim-3胞內(nèi)域的酪氨酸磷酸化。
在另一個實(shí)施方案中，在這里描述的方法中增強(qiáng)tim-3活性的試劑是抗體和其片段。導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號的抗體能被制得，這種抗體與tim-3和模擬配體的結(jié)合。一經(jīng)制得與tim-3胞外域結(jié)合的抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可測試是否抗體激活tim-3，這種抗體導(dǎo)致Th1細(xì)胞增殖抑制、減少的細(xì)胞因子釋放、和耐受性的增強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)程序中描述的方法能用于確定是否抗體結(jié)合激活全長tim-3。在一個具體實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的抗體是對tim-3和galectin-9特異性的雙特異性抗體。
然而在另一個實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑減少可溶tim-3表達(dá)或功能，但不直接影響全長tim-3表達(dá)或功能。在一個實(shí)施方案中，試劑是雙鏈RNA類，這種雙鏈RNA類特異性地抑制可溶tim-3表達(dá)，例如包括SEQ ID NO15核苷序列的試劑。這種雙鏈RNA可作為雙鏈短發(fā)夾狀RNA被給藥。在另一個實(shí)施方案中，增強(qiáng)tim-3活性的試劑是特異性結(jié)合可溶tim-3而不結(jié)合全長tim-3的抗體，例如本發(fā)明提供的那些。序列列表描述SEQ ID NO1是人可溶tim-3異構(gòu)體的編碼序列SEQ ID NO2是人可溶tim-3蛋白SEQ ID NO3是小鼠可溶tim-3異構(gòu)體的編碼序列SEQ ID NO4是小鼠可溶tim-3蛋白SEQ ID NO5是等同于人可溶tim-3 cDNA新剪接結(jié)合點(diǎn)的16核苷DNA片段SEQ ID NO6是等同于人可溶tim-3 cDNA新IgV結(jié)構(gòu)域/胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合點(diǎn)的16氨基酸肽SEQ ID NO7是等同于小鼠可溶tim-3 cDNA新剪接結(jié)合點(diǎn)的16bp DNA片段SEQ ID NO8是等同于小鼠可溶tim-3 cDNA新IgV結(jié)構(gòu)域/胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合點(diǎn)的16氨基酸肽SEQ ID NO9 is編碼人galectin-9的序列，短鏈形式
SEQ ID NO10是人galectin-9的氨基酸序列，短鏈形式SEQ ID NO11是全長人tim-3的編碼序列SEQ ID NO12是全長小鼠tim-3的編碼序列SEQ ID NO13是全長人tim-3的氨基酸序列SEQ ID NO14是全長小鼠tim-3的氨基酸序列SEQ ID NO15是對應(yīng)人可溶tim-3 cDNA新剪接結(jié)合點(diǎn)的16核苷RNA序列SEQ ID NO16是小鼠galectin-9的編碼序列SEQ ID NO17是小鼠galectin-9的氨基酸序列SEQ ID NO18是小鼠galectin-9的氨基酸序列，長鏈形式(也參見Genbank Accession No.NP034838)SEQ ID NO19是人galectin-9的氨基酸序列，長鏈形式(也參見Genbank Accession No.NP033665)實(shí)施例現(xiàn)在對本發(fā)明進(jìn)行一般的描述，參考以下實(shí)施例可以更容易理解本發(fā)明，這些實(shí)施例只是為了說明發(fā)明的一些方面和實(shí)施方案，不是為了限定本發(fā)明。
實(shí)施例分為兩個系列，每個系列有它自己的在實(shí)施例中使用方法的描述。
第一系列實(shí)施例A.方法學(xué)s-Tim-3克隆用1μg/mL伴刀豆球蛋白A活化脾細(xì)胞(Sigma，St.Louis，MO)。48小時活化后，得到細(xì)胞并且使用TRIzol試劑(Invitrogen)按照每個生產(chǎn)商說明書方法萃取RNA。使用Superscript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，Los Angeles，CA)反轉(zhuǎn)錄RNA。帶有SmaI抑制性懸突的Tim-3引物在Tim-3基因的5′UTR(TIM-3-F5′GCCCGGGAGGAGCTAAAGCTATCCCTACACA3′)和3′UTR(TIM3-R5′GCCCGGGCCAATGAGGTTGCCAAGTGACATA 3′)中被設(shè)計而擴(kuò)增fl-Tim-3和s-Tim-3。在DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer，Chicago，IL)中反應(yīng)35個周期并伴有95℃時變性反應(yīng)一分鐘，在55℃時退火30秒，每個周期在72℃時延長90秒。反應(yīng)在最后72℃時的10分鐘延長內(nèi)完成。所有的產(chǎn)品在1.2％瓊脂糖凝膠上分解并使用溴乙非啶溴化物顯影。
T細(xì)胞類和Tim-3-配體染色從初始C57BL/6老鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)身上得到完整脾和淋巴結(jié)細(xì)胞，并且親和層析柱純化CD4+T細(xì)胞(R&D Systems，Minneapolis，MN)。使用mAbs，CD4+T細(xì)胞被染色CD25、CD62L、CD45RB、CD44和CD54上(Pharmingen，San Diego，CA)。使用生物素化ex-Tim-3-Ig、s-Tim-3-Ig或hIgG對細(xì)胞進(jìn)行染色，并且streptavidin-PE作為第二檢測試劑在流式細(xì)胞術(shù)檢測中被使用。
AE7、特異性鴿細(xì)胞色素c、I-Ek-限制Th1克隆34，35和LR1F1、特異性PLP 139-151修飾肽Q144(HSLGKQLGHPDKF)、I-As限制Th2克隆36保存在補(bǔ)充了0.1mM非必需氨基酸、丙酮酸鈉(1mM)、L-谷酰胺(2mM)、培養(yǎng)基必需維生素混合物(lux)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100U/ml)、慶大霉素(0.1mg/ml)、10％熱滅活胎牛血清(Bio Whittaker，Incorporated，Walkersville，MD)、天門冬素(0.1mM)、葉酸(0.1mg/ml)、和2-巰基乙醇(5×10-5M)(Sigma，St.Louis，MO)、0.6％T細(xì)胞生長因子(T-Stim，Collaborative Biomedical Research，Bedford，MA)和0.06％重組IL-2的DMEM中。細(xì)胞保存在被描述6，34的休眠實(shí)驗(yàn)/刺激實(shí)驗(yàn)中(刺激介質(zhì)是無T-Stim和r-IL-2的介質(zhì))和細(xì)胞被染色進(jìn)行s-Tim-3-Ig結(jié)合。
增殖測定雌性SJL/J老鼠(6-12周大)(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)在每個腋窩皮下注射(s.c.)50μg PLP 139-151肽(HSLGKWLGHPDKF)(Quality Controlled Biochemicals，Boston，MA)，該P(yáng)LP 139-151肽在弗氏完全佐劑(CFA)(Diico，IZansasCity，MO)中被乳化。每隔一天(因?yàn)槊庖撸谕惶扉_始，0天，持續(xù)到第8天)給老鼠腹膜內(nèi)注射或者100μg ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig，或者100μg對照hIgG或100μl PBS。老鼠在10天就死亡了，取走老鼠的脾。在96孔培養(yǎng)板(Falcon，BectonDickinson，Los Angeles，CA)的園底內(nèi)，每孔內(nèi)濃度為5×105個細(xì)胞，并且加入0-100μg/ml的PLP 139-151培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)板每個孔內(nèi)摻入1μCi3[H]胸苷脈沖處理16-18小時。合并的輻射標(biāo)記胸苷采用β-培養(yǎng)板閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer Wallac Inc，Atlanta，GA)進(jìn)行測量。三次重復(fù)孔內(nèi)數(shù)據(jù)采用平均cpm值。
細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)，CD11b+和B220+細(xì)胞通過MACS類磁性珠(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)陽性選擇被純化，在CD11b+和B220+細(xì)胞消耗后，CD3+T細(xì)胞通過陰性選擇層析柱被純化(R&DSystems，Minneapolis，MN)。CD3+T細(xì)胞在每孔內(nèi)濃度為5×105個，CD11b+和B220+細(xì)胞在每孔內(nèi)濃度為2×105個。
耐受性誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，SJL老鼠使用50μg PLP 139-151/CFA進(jìn)行免疫反應(yīng)s.c.，同時腹膜內(nèi)注射500μg PLP 139-151誘導(dǎo)耐受性。脾細(xì)胞在每孔內(nèi)濃度為5×105個，淋巴結(jié)細(xì)胞在每孔內(nèi)濃度為2×105個。
細(xì)胞因子ELISAs采用定量捕捉ELISAs對細(xì)胞因子產(chǎn)生的IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α和IFN-γ進(jìn)行檢測。簡單的說，小鼠IL-2的純化鼠mAb(clone JES-1A12)、IL-4(clone BVD4-1D11)，IL-10(cloneJES5-2A5)，IFN-γ(clone R4-6A2)and TNF-α(clone G281-2626)從Pharmingen(San Diego，CA)中獲得，并用于涂敷ELISA培養(yǎng)板(Immulon 4，Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)。來自Pharmingen的重組小鼠細(xì)胞因子被用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，和生物素化小鼠IL-2的rat mAbs(clone JES6-5H4)，IL-4(cloneBVD6-24G2)，IL-10(clone SXC-1)，IFN-γ(clone XMG 1.2)和TNF-α(clone MP6-XT3)作為第二抗體使用。培養(yǎng)板被制成帶有TMB微孔過氧化物酶底物(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)，在加入終止溶液后，使用酶標(biāo)儀(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)在450nm處讀數(shù)。
BrdU滲入法第10天從PLP 139-151/CFA免疫、Tim-3-Ig或hIgG處理過的老鼠身上取走脾，在10％ CO2和5-10μM溴脫氧尿苷(Sigma，St.Louis，MO)存在下，5×105到1×105個完整脾細(xì)胞(96孔，圓底培養(yǎng)盤)在37℃下孵育48小時。48小時之后，細(xì)胞用mAb染色CD3-CyC、CD25-PE、和CD69-PE(Pharmingen，San Diego，CA)。細(xì)胞隨后被固定住并使其通透(Cytoperm，Pharmingen，San Diego，CA)，用DNAse I處理該細(xì)胞(Sigma，St.Louis，MO)。然后用異硫氰酸熒光素標(biāo)記mAb染色的細(xì)胞與BrdU進(jìn)行反應(yīng)(或作為同種型對照組的老鼠IgG1)，采用FACS(Becton Dickinson，LosAngeles，CA)對其進(jìn)行分析。
B.第一系列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例實(shí)施例1鑒定包含胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域但缺少全長Tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域的可溶Tim-3在鼠類Tim-3基因5′和3′非翻譯區(qū)(UTRs)設(shè)計引物，這種引物用于從cDNA擴(kuò)增Tim-3，這種cDNA產(chǎn)生于PCR活化脾細(xì)胞伴刀豆球蛋白。除了接近1kb的Tim-3全長形式，鑒定出尺寸為800bp擴(kuò)增子(圖1A，曲線1)。預(yù)期的1kb擴(kuò)增子氨基酸翻譯證明了可讀片段(ORF)與、包含信號肽、IgV結(jié)構(gòu)域、穿膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的全長、膜結(jié)合型Tim-3(fl-Tim-3)一致(曲線1B)。800bp產(chǎn)物可讀片段分析證明存在新異構(gòu)型Tim-3，這種新異構(gòu)型Tim-3僅包含信號肽、IgV結(jié)構(gòu)域、穿膜結(jié)構(gòu)域但黏蛋白結(jié)構(gòu)域和穿膜結(jié)構(gòu)域缺失(曲線1B，1C)。黏蛋白結(jié)構(gòu)域和穿膜結(jié)構(gòu)域缺失與鼠基因剪切外顯子3、4和5相一致(曲線1C)。這些數(shù)據(jù)顯示編碼800bp擴(kuò)增子產(chǎn)物是選擇性剪接、可溶Tim-3(s-Tim-3)，其包含融合細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的鼠類Tim-3胞外結(jié)構(gòu)域IgV部分。
實(shí)施例2.可溶Tim-3融合蛋白的構(gòu)建鑒定潛在Tim-3配體(s)和TIM-3體內(nèi)功能相互作用，設(shè)計全長和可溶Tim-3(21)的可溶融合蛋白。編碼小鼠Tim-3全胞外部分但無穿膜和胞質(zhì)尾區(qū)的cDNA與編碼人cDNA融合。形成全長Tim-3-Ig融合蛋白的IgG1 Fc尾(ex-Tim-3-Ig)。根據(jù)存在的僅包含胞外域IgV部分Tim-3分泌形式(圖1A，1B)，重建第二融合蛋白，該第二融合蛋白由與編碼小鼠Tim-3 Fc尾組成的IgV部分的cDNA融合的編碼人形成全長Tim-3-Ig融合蛋白(s-Tim-3-Ig)IgG1的cDNA組成。這些構(gòu)建物穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染NS.1B細(xì)胞，表面懸浮液(21)的蛋白被純化。
實(shí)施例3.CD4+T細(xì)胞表達(dá)Tim-3配體確定細(xì)胞表達(dá)Tim-3配體，來自初始、非免疫的SJL/J、NOD、C57BL/6和BALB/c小鼠完整脾細(xì)胞采用ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig進(jìn)行染色，共同染色成不同細(xì)胞表面標(biāo)記物。當(dāng)采用低速細(xì)胞分析技術(shù)分析時，從每個菌株中獲得用ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig染色的CD4+T細(xì)胞對Tim-3配體表達(dá)是陽性的。當(dāng)純化的CD4+T細(xì)胞被共同染色成一組細(xì)胞表面標(biāo)記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用ex-Tim-3-Ig和s-Tim-3-Ig染色評估，初始(CD25-，CD62L+，CD44lo，CD45RBhi，CD54-)和活化、記憶/調(diào)節(jié)性(CD25+、CD62L-、CD44hi、CD45RBlo、CD54+)群表達(dá)Tim-3-配體(圖2A)。當(dāng)純化和分類CD25表達(dá)的CD4+T細(xì)胞時，CD4+25+和CD4+25-群都表達(dá)Tim-3配體。然而，當(dāng)通過增加抗CD3/抗-CD28和IL-2濃度體外活化分類細(xì)胞48小時，CD4+CD25+T細(xì)胞保留Tim-3配體表達(dá)，然而CD4+CD25-表達(dá)下調(diào)。完整脾CD11c+樹突狀細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞也通過Tim-3-Ig融合蛋白染色。但完整脾B細(xì)胞(B220+，CD19+)用任何融合蛋白不染色Tim-3配體。
因?yàn)镃D4+T細(xì)胞確定被用Tim-3-Ig融合蛋白染色，一組長期Th1或Th2克隆被檢測確定是否Th1或Th2細(xì)胞上Tim-3配體具有選擇性表達(dá)的Tim-3配體表達(dá)。有趣的是，測試狀態(tài)(0天，圖2B)的兩個Th1和Th2細(xì)胞用s-Tim-3-Ig染色都表現(xiàn)為陽性，然而這些細(xì)胞株激活下調(diào)Tim-3配體表達(dá)(第4天，圖2b)。激活后7-10天間，靜止T細(xì)胞克隆下調(diào)Tim-3配體表達(dá)(第10天，圖2b)。因此，顯示了Tim-3配體在兩個休眠Th1和Th2細(xì)胞上都有表達(dá)，一經(jīng)激活表達(dá)下調(diào)。這些數(shù)據(jù)和第二系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致，第二系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明一經(jīng)激活CD4+CD25-T細(xì)胞(包含效應(yīng)T細(xì)胞)下調(diào)Tim-3配體表達(dá)。
實(shí)施例4.Tim-3-Ig體內(nèi)給藥誘導(dǎo)過渡增殖Th1免疫反應(yīng)過程中確定Tim-3/Tim-3-配體相互作用的體內(nèi)作用，SJL/J小鼠用弗氏完全佐劑髓磷脂脂蛋白進(jìn)行免疫，用ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig處理，人IgG(hIgG)或PBS為對照組。處理的老鼠在第10天死亡，體外再次刺激脾細(xì)胞確定增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。完整對照組hIgG-或PBS-處理老鼠的脾細(xì)胞顯示在無抗原再刺激下反應(yīng)降低(圖3A)，說明加入PLP 139-151多肽增殖劑量-依賴性增強(qiáng)(圖3B)。相反，ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig處理老鼠脾細(xì)胞在無抗原再刺激具有高基質(zhì)增殖，在一些實(shí)驗(yàn)中，這種脾細(xì)胞高達(dá)120,000cpm(圖3A)。然而，當(dāng)特異性抗原滴加到ex-Tim-3-Ig-或s-Tim-3-Ig-處理老鼠的細(xì)胞培養(yǎng)物中，觀察到增殖反應(yīng)中無主要增加(圖3B)。
放到一起，這些數(shù)據(jù)顯示使用融合蛋白處理免疫老鼠脾細(xì)胞體內(nèi)迅速增殖以致它們在無進(jìn)一步抗體刺激下繼續(xù)體外增殖(圖3A，3B)。
實(shí)施例5.Tim-3-Ig體內(nèi)給藥誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生確定是否增殖細(xì)胞也產(chǎn)生細(xì)胞因子，從48小時體外培養(yǎng)物中取得上層懸浮液，通過細(xì)胞因子ELISAs分析IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ。分析顯示無抗原再刺激，ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig處理的免疫SJL/J老鼠產(chǎn)生大量Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ(圖3A)。相反，對照組PBS或hIgG處理老鼠脾細(xì)胞在無抗原再刺激不產(chǎn)生IL-2或IFN-γ(圖3A)。ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig處理老鼠脾細(xì)胞在PLP 139-151肽再刺激之后，也體外分泌大量IL-2和IFN-γ(圖3B)。放到一起，這些數(shù)據(jù)顯示用或者ex-Tim-3-Ig或者s-Tim-3-Ig體內(nèi)處理誘導(dǎo)Th1細(xì)胞過渡增殖和Th1細(xì)胞因子體外釋放。
實(shí)施例6.Tim-3-Ig處理老鼠體內(nèi)T細(xì)胞誘導(dǎo)的過渡增殖和Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生確定免疫、Tim-3-Ig處理老鼠增生的細(xì)胞型的表型，CD3+T細(xì)胞單個細(xì)胞群、CD11b+巨噬細(xì)胞和B220+B細(xì)胞從免疫老鼠脾中純化出來。在純化后，細(xì)胞群分離培養(yǎng)或體外重組，并且通過3[H]-胸苷摻入法測定評估它們增殖能力。在所有細(xì)胞型中，ex-Tim-3-Ig處理老鼠的純化CD3+T細(xì)胞在無肽再刺激下旺盛地增殖，然而對照組hIgG處理老鼠的CD3+T細(xì)胞僅證明了低水平增殖(圖4A)。B220+B細(xì)胞或?qū)φ战MhIgG處理老鼠的CD11b+細(xì)胞的單個群顯示了低水平增殖(接近10,000cpm，圖4A)。然而，ex-Tim-3-Ig處理老鼠的B細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞顯示比來自hIgG處理對照組老鼠增殖高近一倍(接近20,000cpm，圖4A)，這個增殖相對于ex-Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞的增殖是最小的。這表明ex-Tim-3-Ig處理老鼠的T細(xì)胞是過度增殖的、而B220+B細(xì)胞或CD11b+巨噬細(xì)胞不是過度增殖。這個與處理老鼠抗TIM-3抗體的觀察相反，大部分活化和擴(kuò)增在CD11b+/F4-80+巨噬細(xì)胞群中能觀察到，但在T或B細(xì)胞隔室內(nèi)不被觀察到。通過給免疫RAG-2-/-老鼠服用Tim-3-Ig得到的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了ex-Tim-3-Ig處理老鼠體內(nèi)過度增殖型淋巴細(xì)胞依賴性。當(dāng)用PLP 139-151使SJL-RAG-2-/-老鼠免疫，并用ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig對其進(jìn)行處理，對觀察的抗原再刺激無增殖基底或反應(yīng)，顯示基底反應(yīng)能在免疫、融合蛋白處理老鼠脾細(xì)胞內(nèi)觀察到依賴于T和/或B細(xì)胞的存在。給未免疫老鼠服用ex-Tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig也增強(qiáng)基底增殖反應(yīng)，但這不應(yīng)歸于融合蛋白中人Fc尾的多克隆反應(yīng)，因?yàn)門細(xì)胞不回應(yīng)或者人Ig融合蛋白或Tim-3-Ig融合蛋白的任一個。此外，免疫老鼠中人Ig給藥不誘導(dǎo)基質(zhì)增殖反應(yīng)(圖3A)。這提出未免疫老鼠敏銳地正在進(jìn)行免疫反應(yīng)也能通過Tim-3-Ig給藥不檢出。
當(dāng)hIgG處理老鼠CD3+T細(xì)胞與hIgG處理老鼠B220+B細(xì)胞或CD11b+細(xì)胞混合在一起時，增殖保持低值(接近20,000cpm)，并且通過加入ex-Tim-3-Ig處理老鼠B220+B細(xì)胞或CD11b+細(xì)胞(接近30-40,000cpm)(圖4A)僅是微小增長。當(dāng)ex-Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞與或者h(yuǎn)IgG處理老鼠或者ex-Tim-3-Ig處理老鼠B220+B細(xì)胞(～150,000cpm)(圖4A)一起培養(yǎng)時，可分辨出最大增殖。有趣的是，當(dāng)ex-Tim-3-Ig處理老鼠CD3+ T細(xì)胞與或者h(yuǎn)IgG處理老鼠或者ex-Tim-3-Ig處理老鼠B220+B細(xì)胞混合在一起時，Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞中觀察到的自發(fā)增殖顯著地減少(單個純化CD3+T細(xì)胞自發(fā)增殖從90,000cpm降到30-38,000cpm)(圖4A)。放到一起，這些數(shù)據(jù)間接說明正在進(jìn)行免疫反應(yīng)期間，ex-Tim-3-Ig給藥誘導(dǎo)CD3+ T細(xì)胞過度增殖，對APCs(B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)增殖有比較小效應(yīng)。B220+B細(xì)胞，不管它們的來源，提高ex-Tim-3-Ig處理老鼠T細(xì)胞增殖，然而CD11b+巨噬細(xì)胞抑制ex-Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞自發(fā)增殖。
確定這些單個細(xì)胞群的細(xì)胞因子分泌模式，在48小時取上層清液，通過ELISA分析IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α and IFN-γ產(chǎn)生。然而，沒有發(fā)現(xiàn)ex-Tim-3-Ig處理老鼠細(xì)胞單個群產(chǎn)生ex-Tim-3-Ig處理老鼠IL-2、CD3+ T細(xì)胞，對大部分IFN-γ的產(chǎn)生是重要的(圖4B)。通過ex-Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞B220+B細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞的加入導(dǎo)致IL-2的分泌。相反，B220+B細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞加入到ex-Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞導(dǎo)致CD3+T細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生減少(圖4B)。簡而言之，這些數(shù)據(jù)說明ex-Tim-3-Ig處理老鼠過度增殖CD3+T細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-γ，但要求APCs生產(chǎn)IL-2。
進(jìn)一步表述對ex-Tim-3-Ig體內(nèi)處理產(chǎn)生增殖反應(yīng)的細(xì)胞，摻入5-溴脫氧尿苷(BrdU)細(xì)胞型，與周期細(xì)胞合并的胸苷類似物被確定。Tim-3-Ig處理老鼠體內(nèi)活化CD3+CD25+細(xì)胞的百分比高過hIgG處理對照組2-3倍。從這個數(shù)據(jù)(圖4C)，當(dāng)與hIgG處理對照組比較，很清楚顯示了摻入BrdU的Tim-3-Ig處理老鼠CD3+T細(xì)胞的增長百分比。與對照組hIgG處理老鼠相比，數(shù)據(jù)與在來自Tim-3-Ig處理老鼠完整脾細(xì)胞中觀察的CD3+CD25+細(xì)胞和CD3+CD69+細(xì)胞的百分比增長是相一致的。這個觀察支持了體外增殖和細(xì)胞因子數(shù)據(jù)(圖4A，4B)，并且證實(shí)了Tim-3-Ig處理、免疫老鼠T細(xì)胞被高度激活，迅速增殖細(xì)胞(圖4C)。
實(shí)施例7.給老鼠服用Tim-3-Ig去除耐受性誘導(dǎo)因?yàn)門im-3-Ig體內(nèi)給藥導(dǎo)致IL-2擴(kuò)增產(chǎn)物Th1細(xì)胞增殖，申請者假設(shè)Tim-3-Ig給藥可阻止或去除外周耐受性。SJL/J老鼠耐受高劑量可溶PLP 139-151肽和同時用CFA中乳化PLP 139-151進(jìn)行免疫。耐受性試驗(yàn)導(dǎo)致PLP 139-151特異性細(xì)胞耐受后來激活以至于細(xì)胞增殖并不產(chǎn)生IL-2(24)。測試ex-Tim-3-Ig對耐受性誘導(dǎo)功效，耐受老鼠每隔一天用Tim-3-Ig或者對照PBS或hIgG處理8天，淋巴結(jié)點(diǎn)和脾在第10天被取走，通過增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生檢查它們PLP 139-151體外回憶反應(yīng)。
引流淋巴結(jié)耐受性誘導(dǎo)被檢查出來，除了脾之外，因?yàn)橐髁馨徒Y(jié)耐受性誘導(dǎo)，T細(xì)胞被誘導(dǎo)并且首先被激活。在圖5中所見，免疫老鼠淋巴結(jié)減耐受可溶PLP顯示了與對照組(PBS耐受hIgG處理組)進(jìn)行比較，PLP 139-151再刺激下增殖顯著性減少。當(dāng)Tim-3-Ig與耐受性劑量PLP 139-151共同給藥時，可觀察到顯著性增殖反應(yīng)，這種顯著性增殖反應(yīng)比較于或甚至遠(yuǎn)大于對照組、非耐受性老鼠增殖反應(yīng)，說明Tim-3-Ig去除或干擾耐受性誘導(dǎo)(圖5)。然而，PLP 139-151耐受性導(dǎo)致對照hIgG處理組IL-2和IFN-γ完全喪失，當(dāng)用同源抗原體外再刺激時，Tim-3-Ig處理老鼠持續(xù)產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子(圖5)。
老鼠脾中耐受性誘導(dǎo)作用被確定出。如圖5顯示，在PLP免疫老鼠體中共同體內(nèi)可溶PLP 139-151肽給藥導(dǎo)致PLP 139-151肽增殖反應(yīng)戲劇性減少，證實(shí)可溶PLP 139-151體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞的能力。hIgG或PBS與可溶PLP 139-151一起給藥不改變耐受性誘導(dǎo)(圖6A)。然而，當(dāng)ex-Tim-3-Ig與致耐受性劑量PLP139-151一起服用時，ex-Tim-3-Ig處理老鼠的脾細(xì)胞增殖與非耐受性對照組動物的脾細(xì)胞增殖是相等的(圖6A)。因此，Tim-3-Ig給藥控制去除耐受性誘導(dǎo)，并且導(dǎo)致T細(xì)胞擴(kuò)增。
既然眾所周知高劑量可溶抗原主要誘導(dǎo)Th1細(xì)胞耐受性，并且顯著地抑制IL-2產(chǎn)生，申請者下一次調(diào)查耐受性老鼠脾內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生。在48小時時，從體外培養(yǎng)物中取走上層清液，并且通過實(shí)施細(xì)胞因子ELISAs對IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γand TNF-α進(jìn)行檢測以確定是否耐受性的和Tim-3-Ig處理老鼠的脾細(xì)胞正產(chǎn)生細(xì)胞因子。就像預(yù)期的那樣，對PLP免疫老鼠給藥可溶PLP抑制了IL-2產(chǎn)生(圖6B)。ex-Tim-3-Ig的伴同服用導(dǎo)致IL-2生產(chǎn)的戲劇性增長，以至于當(dāng)與非耐受性的、PLP免疫老鼠對比時，ex-Tim-3-Ig處理老鼠體內(nèi)較低抗原濃度時IL-2被生產(chǎn)(圖6B)。然而，PLP免疫老鼠不顯示IFN-γ或TNF-α任何顯著性生產(chǎn)，一經(jīng)體外再刺激，Tim-3-Ig處理老鼠導(dǎo)致脾培養(yǎng)物的IFN-γ和TNF-α戲劇性生產(chǎn)(圖6B)。觀察到僅在最高劑量特異性抗原體外再刺激下，耐受性的和ex-Tim-3-Ig處理老鼠的上層清液中的低水平的IL-4和IL-10(圖6B)。
C.第一系列實(shí)驗(yàn)討論Th1特異性穿膜蛋白Tim-3的發(fā)現(xiàn)提供了從Th2細(xì)胞表型辨別Th1細(xì)胞的新方法。細(xì)胞表面蛋白表達(dá)完全定向Th1細(xì)胞的功能性作用開始被闡述。最初研究說明免疫反應(yīng)期間抗Tim-3抗體給藥使自體免疫疾病EAE加劇，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞(20)的激活和擴(kuò)增。通過使用可溶Tim-3融合蛋白，這里提出的資料開始研究Tim-3/Tim-3配體相互作用的功能性體內(nèi)效應(yīng)。正在進(jìn)行免疫反應(yīng)期間，甚至在抗原性再刺激缺乏時，ex-tim-3-Ig或s-Tim-3-Ig融合蛋白的體內(nèi)給藥導(dǎo)致有Th1細(xì)胞因子(IFN-γand IL-2)自發(fā)產(chǎn)生的T細(xì)胞過度增殖。此外，Tim-3-Ig去除或干擾受高劑量可溶抗原給藥介導(dǎo)的耐受性誘導(dǎo)。
初始老鼠的淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析和Tim-3-Ig染色的淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示Tim-3配體在CD4+T細(xì)胞上有表達(dá)。此外，T細(xì)胞克隆，是否是Th1 or Th2表型克隆，結(jié)合Tim-3-Ig。盡管少量CD11c+樹突狀細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞也出現(xiàn)了用Tim-3-Ig染色，CD4+T細(xì)胞是表達(dá)Tim-3配體的主要細(xì)胞型。數(shù)據(jù)稍稍令人驚訝，既然我們的關(guān)于Tim-3的最初觀察顯示通過巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞(20)間細(xì)胞對細(xì)胞的相互作用，抗Tim-3抗體處理免疫SJL/J老鼠增加了完整脾細(xì)胞的基質(zhì)增殖。這說明了Tim-3配體在巨噬細(xì)胞上潛在表達(dá)，并說明抗Tim-3抗體聯(lián)合加帽通過配體激活巨噬細(xì)胞的Th1細(xì)胞上的任一個Tim-3、或者阻滯導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活性的陰性信號。一個可能的解釋是通過抗體給藥，以這種方式激活的可帶有Tim-3配體的小型但潛在的關(guān)鍵巨噬細(xì)胞群。另一個可能性是經(jīng)抗Tim-3抗體體內(nèi)治療可被觀察到的巨噬細(xì)胞活性可是干擾在其它T細(xì)胞(25)上表達(dá)的Tim-3配體與Tim-3相互作用的第二結(jié)果。
據(jù)此得出的Tim-3在末端差異Th1細(xì)胞被表達(dá)和潛在的Tim-3配體在CD4+T細(xì)胞上有表達(dá)，提出了這些細(xì)胞在體內(nèi)怎樣相互作用的問題。至少兩個潛在機(jī)理為何Tim-3融合蛋白可以與Tim-3配體體內(nèi)相互作用。首先，在免疫作用期間和信號通過配體期間，Tim-3-Ig可體內(nèi)結(jié)合CD4+T細(xì)胞。這個信號可優(yōu)先地辨別Th1細(xì)胞內(nèi)初始CD4+T細(xì)胞或者增強(qiáng)這些CD4+T細(xì)胞的活性階段。CFA內(nèi)PLP 139-151免疫作用建立已知Th1環(huán)境，這些活化的細(xì)胞可優(yōu)先極化Th1表型，因此解釋了顯著性增加的T細(xì)胞增殖和Th1細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生。然而，帶有CD3-交聯(lián)或無CD3-交聯(lián)培養(yǎng)板結(jié)合抗體的作用，T細(xì)胞上Tim-3配體的直接交聯(lián)，不誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的過渡增殖或Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。說明在Th1極化狀態(tài)下，活化事實(shí)上不可以通過Tim-3配體的Tim-3-Ig結(jié)扎而發(fā)生。第二個可能性是在配體關(guān)聯(lián)細(xì)胞(T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或樹突狀細(xì)胞)上，Tim-3-Ig可結(jié)合Tim-3配體，因此抑制它與極化Th1細(xì)胞上的Tim-3相互作用的能力。如果Tim-3和Tim-3配體間相互作用的正常生理功能是下調(diào)Th1反應(yīng)，通過服用Tim-3-Ig阻滯配體能解釋觀察到的增加的Th1細(xì)胞增殖和Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生。
這里提出的數(shù)據(jù)和第二實(shí)驗(yàn)系列的數(shù)據(jù)證實(shí)了這種假設(shè)，這種假設(shè)是Tim-3與其配體的相互作用可是抑制性的相互作用，Tim-3-Ig給藥阻斷導(dǎo)致Th1細(xì)胞擴(kuò)增的陰性相互作用?？赡艿臋C(jī)理進(jìn)一步被這些數(shù)據(jù)支持，這些數(shù)據(jù)是Tim-3-Ig給藥去除了表型耐受性的誘導(dǎo)，說明了Tim-3和Tim-3配體間相互作用的生理相互作用可限制Th1細(xì)胞擴(kuò)增并有助于效應(yīng)Th1細(xì)胞中耐受性的誘導(dǎo)。至少有兩種為何Tim-3-Ig可以去除耐受性誘導(dǎo)德可能機(jī)理。Tim-3-Ig可過度激活效應(yīng)Th1細(xì)胞，因此產(chǎn)生的IL-2可通過高劑量可溶抗原阻止無反應(yīng)力誘導(dǎo)。然而，另一個可能性是Tim-3-Ig可以誘導(dǎo)非耐受T細(xì)胞內(nèi)增殖和效應(yīng)功能，這種非耐受T細(xì)胞正常不可以增殖(由于低親合力TCR/MHC肽相互作用)，例如最終結(jié)果是T細(xì)胞擴(kuò)增而不是無響應(yīng)性。周知的，當(dāng)保留或擴(kuò)增Th2細(xì)胞(26)時，高劑量耐受性經(jīng)常耐受Th1細(xì)胞。因?yàn)門im-3-Ig給藥去除了Th1細(xì)胞的耐受性誘導(dǎo)，Th2細(xì)胞可保持不被影響，經(jīng)脾細(xì)胞體外再刺激，導(dǎo)致觀察到的Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10的產(chǎn)生(圖5B)。
我們的結(jié)果說明Tim-3/Tim-3-配體通路對于耐受性誘導(dǎo)是重要的。有趣的是，也顯示了CTLA-4對耐受性誘導(dǎo)(27)是必需的。就耐受性誘導(dǎo)中Tim-3和Tim-3-配體的重要性而言，Tim-3/Tim-3-配體通路在CTLA-4的類似方法中可具有作為免疫反應(yīng)的陰性調(diào)節(jié)劑的功能，但特定的對效應(yīng)Th1細(xì)胞。
可溶、Tim-3的Ig結(jié)構(gòu)域形式的發(fā)現(xiàn)提出了可溶Tim-3在Th1反應(yīng)調(diào)節(jié)中作用的問題。Tim-3可溶剪切變異體類似于其它的免疫調(diào)節(jié)的/抑制性的受體，這些免疫調(diào)節(jié)的/抑制性的受體作為可溶分子用T細(xì)胞制得(例如CTLA-4)，并且這些受體可溶得可選擇性剪切形式顯示出在自體免疫疾病的敏感性和抗耐性中發(fā)揮了重要的作用(23)。然而，對Th1細(xì)胞分化期間什么時候s-Tim-3被制得和它的功能可能是什么不清楚如果。像這些數(shù)據(jù)說明，Tim-3/Tim-3-配體相互作用是抑制性的相互作用，s-Tim-3的產(chǎn)生可起到阻斷抑制性的作用，并且促進(jìn)Th1細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。如果s-Tim-3與Tim-3配體結(jié)合與膜結(jié)合ex-tim-3與Tim-3-配體的結(jié)合進(jìn)行競爭，這可能發(fā)生。競爭能減少或阻止ex-Tim-3與Tim-3配體的結(jié)扎，并且隨后減少或去除Th1反應(yīng)的下調(diào)。在mRNA和蛋白水平上ex-Tim-3相對于s-Tim-3的產(chǎn)生的潛在調(diào)節(jié)能提供調(diào)節(jié)效應(yīng)性Th1細(xì)胞的免疫功能的動力學(xué)方法。
因?yàn)閟-Tim-3僅包含IgV結(jié)構(gòu)域但缺少黏蛋白結(jié)構(gòu)域，這個數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明多數(shù)Tim-3的免疫調(diào)節(jié)能力可被它的Ig結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。初步的數(shù)據(jù)說明s-Tim-3-Ig顯示了結(jié)合CD4+T細(xì)胞的高親和性/活性，也介導(dǎo)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。以前結(jié)果顯示了小核糖核酸病毒家族成員(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒和鼻病毒)和人免疫缺陷病毒(HIV)優(yōu)選結(jié)合受體Ig結(jié)構(gòu)域而不是隨后功能結(jié)構(gòu)域(28-31)。此外，havcr-1，小核糖核酸病毒家族成員甲型肝炎病毒(HAV)的受體顯示了通過havcr-1的N-端胱氨酸(Cys)-富集區(qū)(是受體Ig結(jié)構(gòu)域的部分)(28，29)結(jié)合HAV。假定havcr-1是鼠類Tim-1的人類似物(19)，Tim基因家族的成員，理所當(dāng)然，通過Tim-3的Ig結(jié)構(gòu)域，Tim-3可與它的配體以類似的方法相互作用。
黏蛋白結(jié)構(gòu)域的潛在功能作用是不確定的，該黏蛋白結(jié)構(gòu)域是Tim-3的全長膜結(jié)合型的部分?？梢约俣?，havcr-1的蘇氨酸/絲氨酸/脯氨酸(TSP)-富集黏蛋白-類似區(qū)可起到擴(kuò)增在細(xì)胞表面上面的Cys-富集區(qū)的作用來使結(jié)合HAV(28，32)變得容易。Tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域可在相似結(jié)構(gòu)的結(jié)合方法中起作用而不是在功能結(jié)合方法中起作用。另一個可能性是，Tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域可提供能與選擇素相互作用的糖類半族，因此使效應(yīng)Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)變得容易。例如，推動淋巴細(xì)胞歸巢中的作用已經(jīng)假設(shè)為結(jié)構(gòu)類似的多重結(jié)構(gòu)域受體MADAM-1(33)的黏蛋白區(qū)的作用。
總結(jié)起來，這些數(shù)據(jù)說明Tim-3與其配體相互作用可表示抑制性通路，該抑制性通路調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞免疫反應(yīng)期間Th1細(xì)胞的擴(kuò)增和功能。這個通路也可在調(diào)節(jié)效應(yīng)Th1細(xì)胞的外周耐受性中起到至關(guān)重要的作用。
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第二系列實(shí)驗(yàn)A.引言T效應(yīng)群里T輔助(Th)前體細(xì)胞的分化和克隆擴(kuò)增在自適應(yīng)免疫反應(yīng)中起到重要作用，并且提供了抗細(xì)胞內(nèi)病毒和致病細(xì)菌的保護(hù)。然而，Th效應(yīng)細(xì)胞的非限制性活化也顯示出成為許多炎性紊亂的基礎(chǔ)。在上下文中，Th1效應(yīng)細(xì)胞涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、和其它的自體免疫紊亂的發(fā)病機(jī)理，其它的自體免疫紊亂包含I型糖尿病和多重硬化癥(1，2)，和同種異體移植排斥(3，4)。
相反，Th2細(xì)胞活化在過敏性哮喘(5)的發(fā)病機(jī)理中起到關(guān)鍵性作用，并且與移植耐受性的獲得物相關(guān)。通過T細(xì)胞受體介導(dǎo)刺激(6)的持續(xù)時間和強(qiáng)度，T細(xì)胞活化的程度和分化的方式很大程度上被確定。此外，許多共刺激分子和包含TNF受體(7)和免疫球蛋白(Ig)超家族成員(8)的副分子，和細(xì)胞因子例如IL-2，調(diào)節(jié)克隆擴(kuò)增、敲除、和/或無應(yīng)力誘導(dǎo)(9)的程度。然而，當(dāng)申請者意識到許多調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞活化的細(xì)胞機(jī)理和分子機(jī)理時，確定效應(yīng)T細(xì)胞亞群命運(yùn)分子被闡述。
Ig超家族成員TIM-3(T細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、黏蛋白結(jié)構(gòu)域)最初被Monney et al(10)描述成優(yōu)選在分化Th1細(xì)胞上表達(dá)的穿膜蛋白。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、Th1介導(dǎo)自體免疫反應(yīng)疾病模型中，體內(nèi)給藥抗TIM-3單克隆抗體(mAb)導(dǎo)致更嚴(yán)重的腦內(nèi)炎性結(jié)果和更嚴(yán)重的臨床疾病?；谶@些觀察，提議TIM-3作為EAE(10)內(nèi)組織破壞性免疫反應(yīng)的陰性調(diào)節(jié)劑。
然而，還不確定是否這些數(shù)據(jù)反映了TIM-3供給的陰性信號的抑制性或，相反的，是否TIM-3與有陽性信號的mAb體內(nèi)交聯(lián)來誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和疾病惡化。根據(jù)這里提到的結(jié)果，申請者總結(jié)出TIM-3協(xié)同其推定配體提供抑制信號來抑制體內(nèi)炎性反應(yīng)。TIM-3路徑阻斷通過TIM-3-Ig融合蛋白治療加速NOD(非肥胖糖尿病)模型的糖尿病發(fā)作，解除了CTLA4和移植中組合供體特異性輸血(DST)加抗CD154(CD40L)處理、潛能的、以阻滯為基礎(chǔ)的共刺激、耐受性促進(jìn)試驗(yàn)(11-13)，來誘導(dǎo)MHC錯配同種異體移植耐受性。當(dāng)充分地闡述準(zhǔn)確機(jī)理時，申請者提出TIM-3調(diào)節(jié)至少部分地通過調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞抑制炎性反應(yīng)的能力來調(diào)節(jié)自體免疫反應(yīng)和同種免疫反應(yīng)結(jié)果。
B.方法學(xué)老鼠所有老鼠來自Jackson試驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)，并且根據(jù)相關(guān)制度標(biāo)準(zhǔn)和國家標(biāo)準(zhǔn)在傳統(tǒng)動物設(shè)備，的無特定病原體環(huán)境中飼育，該設(shè)備是Millenium醫(yī)藥品公司生產(chǎn)(Cambridge，MA，USA)貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心(Boston，MA，USA)，或DRFZ(柏林，德國)。
老鼠TIM-3的鑒定和克隆采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech，Palo Alto，CA)生成Th1特異性文庫?；钚訲h1克隆的RNA被用作是″試驗(yàn)計″，活性Th2克隆的RNA被用作是″驅(qū)動器″。個體克隆的質(zhì)粒DNA點(diǎn)樣于尼龍膜上，Th1和Th2 RNA單鏈探針進(jìn)行雜交。Th1文庫的一個克隆由857-bp cDNA組成，通過使用老鼠Th1細(xì)胞cDNA文庫獲得全長克隆。人同源物被鑒定出并且從人脾cDNA文庫確定成分的順序。每10-14天用肽、絲裂霉素C處理的APCs和IL-2(100U/ml)刺激老鼠抗原特異性Th1(AE7和Dorris)和Th2(D10.G4、DAX、CDC25)克隆。用抗CD3 mAb(2C11，Pharmingen)和分離RNA活化細(xì)胞。采用Northern印跡法確定來自休眠和抗CD3活化克隆的TIM-3 cDNA的差異表達(dá)。
生成TIM-3 mAb和TIM-3融合蛋白包含TIM-3胞外域的DNA序列是PCR-擴(kuò)增，并且克隆到包含CD5信號序列的載體內(nèi)和人IgG1恒定區(qū)內(nèi)。COS細(xì)胞被轉(zhuǎn)染并且重組蛋白在ProteinA親和層析柱上被純化。Wky大鼠在CFA內(nèi)用純化的老鼠TIM-3融合蛋白進(jìn)行免疫(100μg)并被腹膜內(nèi)和皮下推進(jìn)。脾細(xì)胞與SP/2骨髓瘤細(xì)胞融合，為TIM-3-穿膜CHO細(xì)胞上的結(jié)合結(jié)果進(jìn)行克隆篩選。這些克隆中的一個，8H7，根據(jù)對TIM-3的特異性結(jié)合被選出，而不是對ICOS轉(zhuǎn)染子的結(jié)合被選出。采用特異性抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)抗TIM-38H7 mAb象大鼠IgG1一樣被同種型化。象在第一實(shí)驗(yàn)系列中描述的，ex-Tim-3-Ig和s-TIM-3-Ig與人IgG1 Fc尾融合蛋白一樣被構(gòu)建，在NS.1細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。生物素化TIM-3相關(guān)融合蛋白或人IgG1與熒光素標(biāo)記鏈霉胍激酶一起(BD PharMingen)被用于TIM-3L染色實(shí)驗(yàn)。
胰島移植按照以前描述的方法(51)實(shí)施胰島移植。
大約700DBA/2(H-2d)胰島被移植。通過連續(xù)的血糖檢測監(jiān)測同種異體移植物的功能。耐受性試驗(yàn)實(shí)施包含在移植前，第28天，靜脈注射07DBA/2脾細(xì)胞和在第28天、26天、24天腹腔注射250μg倉鼠mAb抗鼠CD154((MR1，IgG2a，ATCC HB11048，American Type Culture Collection，Rockville，MD)。在第28天、26天、24天，ex-Tim-3-Ig對照hIgG1腹腔注射250μg。在被選擇的接受者中，在第40天、38天、36天也被腹腔注射200μg劑量的大鼠抗鼠CD25 mAb(PC61、5.3、IgG1、ATCC TB222)。申請者以前已經(jīng)確定了抗-CD25 mAb以這種劑量被服用除去了在第二個淋巴組織和外周血液中大于80％的CD4+CD25+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，耐受性在移植后通過在第0天、2天、4天、6天、8天服用0.1μg CTLA4Ig被誘導(dǎo)。
實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)全部RNA使用trizol從胰島移植物中提取出來，反轉(zhuǎn)錄采用Multiscribed反轉(zhuǎn)錄酶(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)被實(shí)施。實(shí)時PCR使用ABI 7700序列檢測器系統(tǒng)(PE AppliedBiosystems)進(jìn)行。為定量MARNA水平，靶基因的表達(dá)正常對照看家基因2，3-二羥基丙醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，數(shù)據(jù)表達(dá)為研究樣和校準(zhǔn)樣的cDNA間的相對倍數(shù)差異。TIM-3引物/探針序列如下所述探針，5-′ACAGCTGCCTGCCCAGTGCCC-3′；正向引物，5′-GCCGGTGGACCTCAGTTTC-3′；反向引物，5′-TGGGAG CCAG CACAGATCA-3′。GAPDH、If-7、IL-4和IL-10引物/探針從Applied Biosystems購買。
過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)染皮膚移植受體淋巴結(jié)細(xì)胞的單細(xì)胞上層清液從初始C3H/He(H-2k)老鼠中得到，或從107DBA/2脾細(xì)胞體內(nèi)注射，和或者抗-CD154(在第28天、26天和24天，每天250μg)或抗-CD154加ex-Tim3-Ig(在第28天、26天和24天，每天250μg)處理的C3H/He老鼠中得到(28天前；-28)。用熒光標(biāo)記抗-CD25和抗-CD4(all from BDPharMingen)染色細(xì)胞，并使用MoFlo高速流式細(xì)胞分選儀分類(Cytomation；Fort Collins，CO)。CD4+CD25-和CD4+CD25+制劑純度始終大于90％。不同量的CD4+CD25+T reg和CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞被注射到接受異源移植28小時后的C3H/He Scid小鼠宿主尾靜脈內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，3劑250μg ex-Tim-3-Ig在皮膚移植后的第0天、2天和4天給藥。全層DBA/2尾皮膚移植按照以前描述的方法(52)實(shí)施，并且每天進(jìn)行移植存活監(jiān)測。排斥被定義為皮膚移植物全長壞死。類似的實(shí)施方案通過使用作為T細(xì)胞群供體的野生型C57BL/6老鼠和使用作為DBA/2同種異體皮膚移植受體的C57BL/6Rag-/-被實(shí)施。
體內(nèi)增殖測定為評估CD4+T細(xì)胞的增殖，亞群CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞按照上述描述的方法進(jìn)行分類并以細(xì)胞密度5×105/mL與2μg/mL抗-CD3mAb、5μg/mL抗-CD28mAb和100U/mL rIL-2(所有來自PharMingen)一起在圓底96孔微量滴定板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。得到細(xì)胞并在24小時和48小時用生物素化s-TIM-3-Ig或?qū)φ杖薎gG1其次鏈霉親和素-CyChrome對細(xì)胞進(jìn)行染色并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
C.第二系列實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例實(shí)施例11.TIM-3配體在CD4+T細(xì)胞上表達(dá)TIM-3的結(jié)構(gòu)有一點(diǎn)黏膜地址素細(xì)胞黏附分子1(MAdCam-1)的明顯特征，黏膜地址素細(xì)胞黏附分子包含兩個Ig結(jié)構(gòu)域和一個黏蛋白富集結(jié)構(gòu)域(10)。為了評估推測TIM-3配體(TIM-3L)的貢獻(xiàn)，人IgG1衍生Fc融合蛋白結(jié)合老鼠TIM-3(全長或ex-Tim-3-Ig)胞外結(jié)構(gòu)域、或截短型、可溶的、僅(s-TIM-3-Ig)Ig結(jié)構(gòu)域(16)被制得。ex-Tim-3-Ig和s-TIM-3-Ig都結(jié)合休眠CD4+T細(xì)胞，而不結(jié)合CD8+、B220+或CD11b+細(xì)胞(圖8C)，s-TIM-3-Ig結(jié)合更強(qiáng)烈。一些與脾CD11c+樹突狀細(xì)胞結(jié)合也是顯著的(圖7A)，但染色模式遠(yuǎn)不與觀察到的CD4+T細(xì)胞的染色模式一致。根據(jù)擴(kuò)增的染色模式用s-TIM-3-Ig進(jìn)行觀察，與用ex-Tim-3-Ig進(jìn)行觀察進(jìn)行對比，TIM-3的Ig結(jié)構(gòu)域顯示出起到了與TIM-3L相互作用。
實(shí)施例12.活化后CD4+CD25-T細(xì)胞，而不是CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞下調(diào)TIM-3L表達(dá)在休眠狀態(tài)中，TIM-3相關(guān)融合蛋白結(jié)合類似的效應(yīng)CD4+CD25-T細(xì)胞亞群和調(diào)節(jié)劑CD4+CD25+T細(xì)胞亞群(圖7B，上翼片)。為了鑒定TIM-3可能選擇性地靶向調(diào)節(jié)劑CD4+T細(xì)胞或效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的潛在機(jī)理，使用s-TIM-3-Ig在體內(nèi)活化被研究后的CD4+CD25-T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞上的結(jié)合評估TIM-3L表達(dá)動力學(xué)。培養(yǎng)的第一個24小時過程中(圖7B，中翼)，用抗-CD3和抗-CD28 mAbs進(jìn)行刺激不改變TIM-3L表達(dá)。相反，在培養(yǎng)48小時，TIM-3L表達(dá)一經(jīng)活化CD4+CD25-T細(xì)胞就被下調(diào)了，然而TIM-3L表達(dá)一遇到CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞(圖7B下翼)就持續(xù)表達(dá)。一經(jīng)用伴刀豆球蛋白A或LPS體內(nèi)活化，CD4+CD25-T細(xì)胞上TIM-3L表達(dá)的下調(diào)也被觀察到。在活化調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞上推定TIM-3L的優(yōu)先表達(dá)通過活化Th1細(xì)胞上的TIM-3表達(dá)被反映出。因此，申請者已經(jīng)調(diào)查了這個假設(shè)，這個假設(shè)是TIM-3/TIM-3L相互作用對免疫調(diào)節(jié)和Th1-介導(dǎo)免疫反應(yīng)耐受性的獲得和/或維持是關(guān)鍵的。
實(shí)施例16.TIM-3通路阻斷同種異體移模式耐受性的捕獲當(dāng)移植耐受性在Th1和Th2極化狀態(tài)下(4，25，26)能夠獲得，Th1對Th2的免疫偏差使耐受性的發(fā)生變得容易(4，27)。確實(shí)，許多耐受的免疫抑制體的功效與對Th2型同種異體移植的免疫偏差有關(guān)(4)。為了說明Th1-特異性TIM-3細(xì)胞表面蛋白在移植耐受性獲得中的作用，胰島移植模型在采用供體特異性輸血(DST)和獲得CD40-CD154共刺激阻滯(11，12，28)抗-CD154(CD40L)mAb的組合物處理的受體中使用。在這個模型里，在移植前服用單劑量DST和anti-CD154一個月時間，確保MHC-錯配胰島同種異體移植的不確定成活。此外，處理的長期成活移植受體雖然迅速排斥第三方細(xì)胞株移植物卻很容易接受來自相同供體的第二移植物，這表明治療誘導(dǎo)了供體特異性同種異體移植耐受性(12，28)。相反，在未治療的對照受體中，胰島入侵性淋巴細(xì)胞滲透能在移植后第7天被觀察到，并大部分移植在移植后20天全部被破壞。
為確定是否TIM-3表達(dá)是與這個模型相關(guān)的，實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)被實(shí)施來比較治療和對照受體移植物內(nèi)基因表達(dá)。當(dāng)移植后7天，高度移植物內(nèi)αIFN和TIM-3基因表達(dá)在治療的和對照宿主體內(nèi)被觀察到(圖8A)，長存成活耐受性受體(移植后120天)同種異體移植反應(yīng)通過降低TIM-3和γIFN移植物內(nèi)基因表達(dá)來進(jìn)行描述(圖8A)。IL-2移植物內(nèi)表達(dá)與第7天的治療組和未治療組宿主的TIM-3和γIFN移植物內(nèi)表達(dá)密切相關(guān)。相反，與排斥移植物對比，在第7天和120天DST加抗-CD154處理的宿主內(nèi)觀察到IL-4和IL-10的移植物內(nèi)表達(dá)增長2-3倍。因此，治療與下調(diào)Th2-型基因表達(dá)相關(guān)，然而Th1反應(yīng)下調(diào)發(fā)生在維持階段(120天)，而不是移植耐受性誘導(dǎo)階段(7天)。
是否移植耐受性的獲得需要完整的TIM-3路徑是下一個要評估的。ex-Tim-3-Ig與DST加抗-CD154一起給藥完全阻止胰島同種異體移植耐受性產(chǎn)生并迅速降低排斥(圖8B)。此外，ex-Tim-3-Ig給藥也去除了使用高劑量抗-CD154單一治療介導(dǎo)耐受性的誘導(dǎo)。
為確定是否TIM-3路徑僅在使用抗-CD154+/-DST治療得到耐受性的機(jī)理中是重要的，測定TIM-3在通過CTLA4Ig給藥得到耐受性的移植模型中的阻滯功效。CTLA4Ig體內(nèi)作用機(jī)理包含抗原活化T細(xì)胞增殖的抑制和免疫調(diào)節(jié)和外周耐受性(30-32)的誘導(dǎo)。當(dāng)來自9組處理受體中的7組中CTLA4Ig治療產(chǎn)生胰島同種異體移植不確定植入時，ex-Tim-3-Ig的伴同給藥導(dǎo)致多數(shù)同種異體移植的排斥(圖8C)。把第一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)起來，這些數(shù)據(jù)清晰地表明TIM-3是免疫學(xué)耐受性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。
實(shí)施例16.TIM-3阻斷不消除初始CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞抑制CD4+CD25-T細(xì)胞排斥同種異體移植的能力。
申請者以前已經(jīng)確定了CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞關(guān)鍵性包含在DST加抗-CD154誘導(dǎo)的耐受維持階段中(12)。申請者目前已經(jīng)測試了是否這個調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞子群也需要移植耐受性階段的誘導(dǎo)。有趣的是，CD4+CD25+T細(xì)胞亞群敲除的結(jié)果類似于ex-Tim-3-Ig給藥誘導(dǎo)的功效，并且胰島同種異體移植的快速排斥在抗-CD25 mAb治療的宿主體內(nèi)被觀察到(圖9A)。
基于這些結(jié)果，可以假設(shè)通過初始宿主內(nèi)的TIM-3L結(jié)合CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞作用，Th1效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)TIM-3的植入可能首要它們的免疫抑制功能。為確定是否從初始老鼠身上獲得的調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞能在無TIM-3植入的情況下運(yùn)用它們的免疫抑制功能，采用轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)通過評估初始CD4+CD25+T細(xì)胞阻止同種異體移植排斥的能力來實(shí)施。在TIM-3阻斷存在下，該同種異體移植排斥被CD4+CD25-T細(xì)胞介導(dǎo)。在這個模型中，低至1×105CD4+CD25-或CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染免疫低下MHC-錯配皮膚移植受體導(dǎo)致快速皮膚同種異體移植排斥，然而被移植的初始CD4+CD25+T細(xì)胞不誘導(dǎo)排斥和阻止破壞移植物的CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞群(33，34)。給DBA/2皮膚同種異體移植的C3H/HeScid受體服用ex-Tim-3-Ig不抑制被移植的初始CD4+CD25+T細(xì)胞阻止具有移植排斥的伴同移植CD4+CD25-T cell的能力(圖9B)。當(dāng)初始CD4+CD25+T細(xì)胞與初始CD4+CD25-T細(xì)胞或Th1極化的CD4+T細(xì)胞共同孵育并在ex-Tim-3-Ig存在時用可溶抗-CD3刺激初始CD4+CD25+T細(xì)胞時，類似的結(jié)果在體內(nèi)被觀察到。此外，不考慮是否服用ex-Tim-3-Ig或?qū)φ説IgG，1×105CD4+CD25-T細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染導(dǎo)致具有等同的快速移植排斥。把這些結(jié)果總結(jié)起來說明了，在缺少TIM-3植入情況下，從無同種抗原經(jīng)歷老鼠身上獲得的初始CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能抑制Th1依賴性細(xì)胞病變反應(yīng)。因此，TIM-3阻斷不能取消無同種抗原經(jīng)歷CD4+CD25+T細(xì)胞排斥皮膚同種異體移植的免疫調(diào)節(jié)功效功能。
實(shí)施例17.TIM-3調(diào)節(jié)特異性同種抗原CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞群效能增強(qiáng)眾所周知，一些引發(fā)移植耐受性的治療方案用于鞏固特異性同種抗原CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞效能(33-35)。為確定DST加抗-CD154治療對特異性同種抗原CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞產(chǎn)生的影響，采用附加轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來對比初始宿主或DST加抗-CD154治療的老鼠CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制能力。治療組或未治療組初始老鼠CD4+CD25-或CD8+T細(xì)胞在它們促進(jìn)急性皮膚同種異體移植排斥的能力無差異(在圖9C中CD4+CD25-T細(xì)胞數(shù)據(jù))，說明在DST加抗-CD154治療模型中，對效應(yīng)T細(xì)胞群無重要影響。
相反，DST加抗-CD154治療宿主的CD4+CD25+T細(xì)胞對初始CD4+CD25-T細(xì)胞運(yùn)用的免疫抑制作用比初始老鼠的CD4+CD25+T細(xì)胞多更多。因此，初始CD4+CD25+T細(xì)胞能阻止CD4+CD25-T細(xì)胞排斥皮膚移植，當(dāng)以CD4+CD25+與CD4+CD25-(圖9C，中翼)高比例(4∶1)時被傳染時，DST加抗-CD154治療宿主的CD4+CD25+T細(xì)胞在調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞比僅為1∶1時能夠介導(dǎo)有效的免疫抑制(圖9C，右手翼)。顯然，DST加抗-CD154治療后，增強(qiáng)的免疫抑制表型是嚴(yán)格供體特異性，因?yàn)槟褪蹹ST加抗-CD154不同供體系宿主的CD4+CD25+T細(xì)胞不介導(dǎo)比初始CD4+CD25+T細(xì)胞對供體DBA/2皮膚同種異體移植更大的移植保護(hù)性功效(平均皮膚同種異體移植存活時間14天和12天，n＝5和7)。此外，因?yàn)闊oCD40-CD154共刺激阻斷的抗原供給對CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能無明顯作用，DST和抗-CD154需要得到增強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功效。
這些觀察說明了通過增強(qiáng)特異性供體CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞的免疫抑制功能，DST加抗-CD154很大量程度上發(fā)揮了它的耐受性功效。申請者提出是否TIM-3路徑對這種治療老鼠是關(guān)鍵性的，它們的體內(nèi)免疫抑制功能與用DST、抗-CD154和ex-Tim-3-Ig治療的老鼠調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞的免疫抑制功能進(jìn)行了比較。DST和抗-CD154治療產(chǎn)生的增強(qiáng)特異性同種抗原抑制性表型通過ex-Tim-3-Ig的同時給藥而被消除(圖9D)，因?yàn)橹委熕拗鰿D4+CD25+T細(xì)胞接受ex-Tim-3-Ig治療不產(chǎn)生比初始調(diào)節(jié)劑細(xì)胞更大的抑制性功效(圖9D)。在這些實(shí)施方案中，ex-Tim-3-Ig僅給CD4+CD25+T細(xì)胞供體服用，無論給皮膚移植受體服用什么沒有治療作用，因而最小化ex-Tim-3-Ig治療干擾CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞間的相互作用的可能性。事實(shí)上，在我們采用的移植模型中，申請者已經(jīng)觀察到移植后ex-Tim-3-Ig給藥不消除先前產(chǎn)生的特異性供體CD4+CD25+T細(xì)胞的保護(hù)性功效?？偨Y(jié)起來，我們的數(shù)據(jù)說明i)在耐受性誘導(dǎo)期間，TIM-3路徑使特異性供體CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)變得容易，和ii)TIM-3/TIM-3L相互作用對特異性供體CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞產(chǎn)生是關(guān)鍵性的，而不對特異性供體CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)功能是關(guān)鍵性。
實(shí)施例18.TIM-3配體galectin-9的鑒定為了分析推定TIM-3配體表達(dá)分布，用TIM-3-Ig融合蛋白進(jìn)行細(xì)胞表面染色用于篩選表達(dá)細(xì)胞類型的TIM-3配體。已有研究表明flTIM-3-Ig和sTIM-3-Ig結(jié)合休眠CD4+T細(xì)胞并結(jié)合小量的脾CD11c+樹突狀細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞，而不結(jié)合CD8+或B220+細(xì)胞(參見Sabatos et al.Nat Immunol 41102-1110，Sanchez-Fueyo et al.Nat Immunol 41093-1101)，這表明TIM-3配體在休眠CD4+T細(xì)胞上有主要表達(dá)。因此，許多T細(xì)胞株/T細(xì)胞淋巴瘤被篩選出。FACS結(jié)果說明迄今為止，被檢測的三個T細(xì)胞株結(jié)合sTim-3-Ig，而不結(jié)合在TK-1(T細(xì)胞淋巴瘤)對sTim-3-Ig具有最高結(jié)合的對照組之中(圖10A)的人IgG1對照組。用flTIM-3-Ig染色顯示了類似結(jié)果(圖10A)。
為了鑒定TIM-3結(jié)合蛋白的特異性胞外膜，TK-1活細(xì)胞被生物素標(biāo)記并且與對TIM-3-Ig融合蛋白孵育的完整細(xì)胞溶解產(chǎn)物實(shí)施了結(jié)合洗脫實(shí)驗(yàn)。SDS-PAGE-Western blot測試結(jié)果說明flTim-3-Ig和sTim-3-Ig能夠去蛋白或分子重量在40kD到60kD的蛋白復(fù)合物(圖1b，曲線1，2)。與TIM-2-Ig或hIgG被洗脫蛋白(圖10b，曲線3，4)的對照組比較，flTIM-3-Ig和sTIM-3-Ig的特異性條帶是40kD到60kD。當(dāng)N-糖鏈被N-糖酰胺酶F切下時，40kD到60kD條帶的分子重量減少到35kD。采用35S-Met代謝性標(biāo)記TK-1細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物實(shí)施的同一個實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步排除了35kD可能污染物。從銀染色的SDS-PAGE凝膠中分離的35kD條帶的質(zhì)譜分析鑒定了象galectin-9的蛋白，該蛋白為淋巴細(xì)胞表達(dá)和其它細(xì)胞類型表達(dá)的galectin家族的一個成員。
實(shí)施例19.galectin-9和TIM-3間的特異性相互作用Galectin是一組結(jié)合包含在細(xì)胞表面與糖半分子結(jié)合的糖類識別結(jié)構(gòu)域(CRD)的結(jié)合凝集素的β-galactoside；它們是免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑(參見Rabinovich et al.Trends Immunol 23313-320；Rabinovich et al.Biochim Biophys Acta 1572274-284.)。Galectin沒有ER-Golgi通路分泌信號肽。TK-1細(xì)胞的總RNA利用RT-PCR克隆galectin-9 cDNA。兩個編碼序列的galectin-9被克隆，隨后被發(fā)現(xiàn)作為正常galectin-9 cDNA，它的長異構(gòu)體在galectin-9的兩個糖類認(rèn)知結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)有31個氨基酸插入物，該長異構(gòu)體已經(jīng)被報道主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞。
為確定galectin-9和TIM-3間的相互作用，兩個galectin-9異構(gòu)體cDNAs亞克隆到雙順反子表達(dá)EGFP蛋白的表達(dá)載體。當(dāng)galectin-9表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞時，表達(dá)EGFP的細(xì)胞將同時表達(dá)galectin-9。在瞬時轉(zhuǎn)染中，galectin-9的表達(dá)在細(xì)胞表面不被檢測。有可能的是在瞬轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞中的galectin-9表達(dá)可能從交替運(yùn)輸機(jī)器中分離出來。因此，蛋白產(chǎn)物可在細(xì)胞質(zhì)中累積。確實(shí)，用轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞sTIM-3-Ig和flTIM-3-Ig的進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色顯示了相同的陽性染色部分，這說明了當(dāng)與TIM-3融合蛋白相互作用時，正常galectin-9和其長異構(gòu)體間無差異。該轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是陽性的增強(qiáng)型熒光蛋白基因。然而，它們兩個都不能結(jié)合對照的hIgG(圖11A)。
為了證明galectin-9和TIM-3間結(jié)合特異性，galectin-9瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)染色。FlTIM-3-Ig和sTIM-3-Ig是唯一的具有g(shù)alectin-9表達(dá)細(xì)胞內(nèi)陽性染色的融合蛋白。通過對比，TIM-2-Ig，、IM-4-Ig、和hIgG不能結(jié)合相同的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，這說明了TIM-3相對于其它的TIM家族成員，對galectin-9有最高的親和力。作為替換方法，純化的重組galectin-9能被sTIM-3-Ig特定洗脫下來，而不被TIM-2和TIM-4Ig融合洗脫下來(圖11C)。在另一方面，flTIM-3-Ig和sTIM-3-Ig都僅顯示出陽性結(jié)合galectin-9表達(dá)細(xì)胞，然而如果細(xì)胞不表達(dá)這些非常高水平蛋白，它們不結(jié)合galectin-1、galectin-3和galectin-4，這說明了TIM-3和這些galectin間確定的非特異性相互作用(圖11C)。
總之，galectin-9是特異性結(jié)合TIM-3胞外部分的蛋白。因?yàn)閒lTIM-3-Ig和sTIM-3-Ig都能結(jié)合galectin-9，TIM-3上的Ig V結(jié)構(gòu)域可能需要與galectin-9相互作用。當(dāng)乳糖被加進(jìn)培養(yǎng)緩沖器中，galectin-9和TIM-3間的相互作用在細(xì)胞內(nèi)染色和洗脫試驗(yàn)中按照劑量依賴性方式被削弱(圖12A)。此外，部分地失去與TIM-3相互作用的突變galectin-9構(gòu)建或者N端糖類識別結(jié)構(gòu)域或者C端糖類識別結(jié)構(gòu)域，然而結(jié)合TIM-3的兩個糖類認(rèn)知結(jié)構(gòu)域的雙點(diǎn)突變完全去除了。因此，galectin-9和TIM-3間的相互作用依賴于galectin-9糖類識別結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例20.TIM-3-galectin-9在效應(yīng)Th1細(xì)胞調(diào)節(jié)中的作用申請者假設(shè)在Th1細(xì)胞擴(kuò)增和凋亡機(jī)制穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中g(shù)alectin-9-TIM-3通路的功能性作用。為測試效應(yīng)T細(xì)胞內(nèi)galectin-9的凋亡作用，DO11.10基因工程老鼠的初始脾CD4+T細(xì)胞用CD4T細(xì)胞陰極陰性選擇柱被純化并歸類為CD4+CD62L+細(xì)胞。細(xì)胞在體內(nèi)用VOA肽和輻射過APC刺激，并體外極化至少3個循環(huán)后進(jìn)入Th1和Th2細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)活化的Th1細(xì)胞用重組galectin-9治療，細(xì)胞死亡在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)被誘發(fā)。通過對比，活化的Th2細(xì)胞對抗galectin-9-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖13)。關(guān)于AE7(Th1細(xì)胞株)和D10G4(Th2細(xì)胞株)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明了體外重組galectin-9誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的類似功效。
實(shí)施例21.重組Galectin-9削弱Th1細(xì)胞活化為確定Th1免疫反應(yīng)期間galectin-9和TIM-3間相互作用的體內(nèi)功效，用弗氏完全佐劑(CFA)中的MOG 35-55對C57BL/6J老鼠進(jìn)行免疫治療。重組galectin-9(100μg)從3天到9天每天被腹腔內(nèi)注射到免疫老鼠體內(nèi)。脾細(xì)胞用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生試驗(yàn)。與PBS治療對照組比較，利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入反映細(xì)胞增殖效果，發(fā)現(xiàn)galectin-9給藥不改變脾細(xì)胞增殖。然而，ELISA結(jié)果表明IFN-γ產(chǎn)生極少大于50％。ELISPOT進(jìn)一步證明來自galectin-9治療脾的較少細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ和IL-2。有趣的是，與PBS治療老鼠對比，IL-4和IL-5產(chǎn)生不被改變(圖14)。
實(shí)施例22.EAE治療中g(shù)alectin-9-TIM-3的治療功效TIM-3已被證明在Th1細(xì)胞反應(yīng)和外周耐受性中具有重要的功能。它的表達(dá)與EAE和人多重硬化癥(MS)的病理學(xué)都有關(guān)。有趣的是，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中g(shù)alectin-9的表達(dá)被IL-1β誘導(dǎo)，這表明這個蛋白可包含在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的限制性炎癥里(參見Yoshidaet et al.Neuroreport 123755-3758)。因?yàn)門IM3-TIM-3配體相互作用可調(diào)節(jié)Th1反應(yīng)和促進(jìn)免疫學(xué)耐受性，這些功能被TIM-3-galectin-9的相互作用介導(dǎo)是有可能的。為了闡述這個可能性，從免疫那天開始，重組galectin-9將每隔一天給MOG肽35-55/CFA免疫的C57BL/6J老鼠服用。疾病將被監(jiān)測并且對大腦和脊髓作組織病理學(xué)地檢查。作為TIM-3的功能配體，galectin-9給藥期望減輕EAE的嚴(yán)重性，和/或誘導(dǎo)抗EAE耐受性。作為對照實(shí)驗(yàn)，申請者也將測試在C57BL/6J基質(zhì)中的Tim-3-/-老鼠?？梢灶A(yù)期的是，Tim-3缺陷型老鼠將不受galectin-9給藥的影響。
D.第二系列實(shí)驗(yàn)的討論Th1或Th2通路中Th前體的擴(kuò)增和分化調(diào)節(jié)對細(xì)菌、病毒、自身抗原和同種異體抗原免疫反應(yīng)的結(jié)果。這些T細(xì)胞反應(yīng)的程度受細(xì)胞因子和一組副分子的影響，副分子包含TNF受體(7)和Ig超家族成員(8)。TIM-3是最近被Monkey et al確定的新特異性Th1 Ig超家族成員(10)，作為EAE內(nèi)組織破壞性免疫反應(yīng)的陰性調(diào)節(jié)劑。在這個模型中，抗-TIM-3mAb治療增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的數(shù)量和活性水平，并且增強(qiáng)了腦內(nèi)組織損傷的嚴(yán)重性?；谶@些結(jié)果，抗-TIM-3可能通過提高Th1細(xì)胞移植到大腦中或通過抑制TIM-3和推定的抑制劑TIM-3L間的相互作用來活化巨噬細(xì)胞。
申請者已經(jīng)通過比較活化Th1和Th2克隆的基因表達(dá)譜鑒定出TIM-3，并且申請者現(xiàn)在報導(dǎo)了在自身免疫模型和同種異體免疫模型中，TIM-3抑制Th1介導(dǎo)反應(yīng)起到重要作用，并且報導(dǎo)了這些功效看來可能通過CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞群的免疫抑制性功能被介導(dǎo)，至少部分被介導(dǎo)。
CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞在自身耐受性的維持(36-38)和在異源移植的長期接受性中起到重要作用(12，34，35)。盡管它們的嚴(yán)格的作用機(jī)理還沒有詳細(xì)說明，cell-to-cell接觸相互作用和可溶因子被包含在它們的免疫抑制性功能中(39，40)。我們的結(jié)果表明TIM-3不是CD4+CD25+T細(xì)胞輸送免疫抑制性功效的分子通路，因?yàn)槌跏蓟蚰褪芩拗鞯腃D4+CD25+T細(xì)胞能強(qiáng)烈抑制體內(nèi)和體外缺少TIM-3效應(yīng)性表達(dá)的CD4+CD25-T細(xì)胞(圖9B)。然而，TIM-3/TIM-3L敏感性路徑需要特異性供體CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞的功能產(chǎn)生，這種功能產(chǎn)生在耐受性治療給藥后出現(xiàn)，耐受性治療例如DST加抗-CD154治療(圖9D)。因此，TIM-3依賴性通路和非依賴性通路包含在CD4+CD25+T細(xì)胞依賴性免疫調(diào)節(jié)中。
盡管包含TIM-3和其配體的精確細(xì)胞相互作用和分子相互作用被充分闡述出，TIM-3和TIM-3L顯示的表達(dá)模式暗示了TIM-3陽性Th1效應(yīng)細(xì)胞和TIM-3L陽性調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞間的定向相互作用可以組合機(jī)構(gòu)，通過這個機(jī)構(gòu)，CD4+CD25+T細(xì)胞獲得增強(qiáng)的免疫抑制性功能。二者可選其一地，倘若TIM-3L表達(dá)也在一些樹突狀細(xì)胞上被觀察到，通過APCs的干涉作用，TIM-3對調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞的功效能間接地被運(yùn)用。這最后的闡述將與CD4+CD25+T細(xì)胞介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)(41，42)調(diào)制中樹突狀細(xì)胞顯型作用的觀察一致，最后，TIM-3一經(jīng)結(jié)扎能恢復(fù)Src激酶，因此能影響下游信號活動，這表明TIM-3結(jié)扎也能運(yùn)用Th1細(xì)胞上的定向抑制性信號。然而，ex-Tim-3-Ig治療的移植受體的脾中IL-2-和γIFN-產(chǎn)生效應(yīng)性T細(xì)胞的頻率無顯著性增加，這暗示TIM-3移植對調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞群比對效應(yīng)性T細(xì)胞群有更有效的影響。
我們的發(fā)現(xiàn)提供了對這個作用機(jī)理的新見解，在移植中通過這個作用機(jī)理DST加抗-CD154促進(jìn)耐受性。目前的理解陳述了對抗-CD154誘導(dǎo)的免疫抑制性環(huán)境中的宿主T細(xì)胞供給同種抗原通過使細(xì)胞無反應(yīng)與/或凋亡直接滅活了異型反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞。申請者現(xiàn)在提供了表明多克隆體系中，DST加抗-CD154通過增強(qiáng)同種特異性抗原式CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制性功能主要起作用的證據(jù)，而對效應(yīng)T細(xì)胞群排斥同種異體移植物的能力的治療功效更不用說有效了。
在無CD40-CD154共刺激下優(yōu)先與同種抗原相遇誘導(dǎo)TIM-3-靈敏性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制是具有猜測性的。能識別異源基因肽的調(diào)解劑T細(xì)胞克隆可能經(jīng)歷選擇性擴(kuò)增(44，45)和/或獲得更有效的免疫抑制性功能。確實(shí)，在我們的模型中缺少DST單一治療的功效說明了促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡和無能而周知的CD154阻滯提供了或甚至增強(qiáng)了調(diào)解劑T細(xì)胞的功能和成活。二者可選其一地，CD40-CD154共刺激阻斷可能調(diào)制留居抗原提呈細(xì)胞(APC)的表型，導(dǎo)致初始供體活性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)室的補(bǔ)充。有趣的是，缺少的APCs上CD40表達(dá)已經(jīng)被報導(dǎo)出在一些案例中通過產(chǎn)生CD4+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞(49)促進(jìn)了特異性抗原耐受性(46-49)。因此，基于我們的發(fā)現(xiàn)，申請者推測CD40和TIM-3具有對立的功效，并且在耐受性和免疫性間的判定中，它們的平衡作為檢測點(diǎn)。TIM-3/TIM-3L通路促進(jìn)免疫耐受性的重要性不僅局限于DST加抗-CD154獲得移植耐受性作用機(jī)制。確實(shí)，基于自己觀察ex-Tim-3-Ig去除了CTLA4Ig治療后的耐受性誘導(dǎo)(圖9D)。申請者總結(jié)出TIM-3在調(diào)解Th1介導(dǎo)免疫反應(yīng)和促進(jìn)免疫耐受性的產(chǎn)生中起到重要的作用。
簡而言之，申請者已經(jīng)表述了Ig超家族成員TIM-3抑制Th1介導(dǎo)自體免疫反應(yīng)和異體免疫反應(yīng)的功能。這些功效看來可能被CD4+CD25+調(diào)節(jié)劑T細(xì)胞的免疫抑制性效能的調(diào)節(jié)介導(dǎo)，至少部分被介導(dǎo)。因此，Th1細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)提供了重要的檢測點(diǎn)，這種檢測點(diǎn)起到消除促炎性Th1依賴性T細(xì)胞反應(yīng)和限制相關(guān)組織損傷的作用。
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等同物本領(lǐng)域的技術(shù)人員只使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法將會識別，或能判定這里表述發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同物。這些等同物包含在權(quán)力要求書中。本申請引用了多個公開文獻(xiàn)，這些公開的內(nèi)容通過在此引述而全部合并于本申請中。
序列表SEQ ID NO1ATGTTTTCACATCTTCCCTTTGACTGTGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTACTACTTACAAGGTCCTCAGAAGTGGAATACAGAGCGGAGGTCGGTCAGAATGCCTATCTGCCCTGCTTCTACACCCCAGCCGCCCCAGGGAACCTCGTGCCCGTCTGCTGGGGCAAAGGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATGTGGCAACGTGGTGCTCAGGACTGATGAAAGGGATGTGAATTATTGGACATCCAGATACTGGCTAAATGGGGATTTCCGCAAAGGAGATGTGTCCCTGACCATAGAGAATGTGACTCTAGCAGACAGTGGGATCTACTGCTGCCGGATCCAAATCCCAGGCATAATGAATGATGAAAAATTTAACCTGAAGTTGGTCATCAAACCAGGGTATTCTCATAGCAAAGAGAAGATACAGAATTTAAGCCTCATCTCTTTGGCCAACCTCCCTCCCTCAGGATTGGCAAATGCAGTAGCAGAGGGAATTCGCTCAGAAGAAAACATCTATACCATTGAAGAGAACGTATATGAAGTGGAGGAGCCCAATGAGTATTATTGCTATGTCAGCAGCAGGCAGCAACCCTCACAACCTTTGGGTTGTCGCTTTGCAATGCCATAG
SEQ ID NO2MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPGYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQRSQPLGCRFAMPSEQ ID NO3ATGTTTTCAGGTCTTACCCTCAACTGTGTCCTGCTGCTGCTGCAACTACTACTTGCAAGGTCATTGGAAGATGGTTATAAGGTTGAGGTTGGTAAAAATGCCTATCTGCCCTGCAGTTACACTCTACCTACATCTGGGACACTTGTGCCTATGTGCTGGGGCAAGGGATTCTGTCCTTGGTCACAGTGTACCAATGAGTTGCTCAGAACTGATGAAAGAAATGTGACATATCAGAAATCCAGCAGATACCAGCTAAAGGGCGATCTCAACAAAGGAGATGTGTCTCTGATCATAAAGAATGTGACTCTGGATGACCATGGGACCTACTGCTGCAGGATACAGTTCCCTGGTCTTATGAATGATAAAAAATTAGAACTGAAATTAGACATCAAAGCAGGGTATTCCTGTAAGAAAAAGAAGTTATCGAGTTTGAGCCTTATTACACTGGCCAACTTGCCTCCAGGAGGGTTGGCAAATGCAGGAGCAGTCAGGATTCGCTCTGAGGAAAATATCTACACCATCGAGGAGAACGTATATGAAGTGGAGAATTCAAATGAGTACTACTGCTACGTCAACAGCCAGCAGCCATCCTGASEQ ID NO4MFSGLTLNCVLLLLQLLLARSLEDGYKVEVGKNAYLPCSYTLPTSGTLVPMCWGKGFCPWSQCTNELLRTDERNVTYQKSSRYQLKGDLNKGDVSLIIKNVTLDDHGTYCCRIQFPGLMNDKKLELKLDIKAGYSCKKKKLSSLSLITLANLPPGGLANAGAVRIRSEENIYTIEENVYEVENSNEYYCYVNSQQPSSEQ ID NO5CAAACCAG GGTATTCTSEQ ID NO6NLKLVIKP GYSHSKEKSEQ ID NO7CAAAGCAG GGTATTCCSEQ ID NO8ELKLDIKA GYSCKKKKSEQ ID NO9ATGGCCTTCAGCGGTTCCCAGGCTCCCTACCTGAGTCCAGCTGTCCCCTTTTCTGGGACTATTCAAGGAGGTCTCCAGGACGGACTTCAGATCACTGTCAATGGGACCGTTCTCAGCTCCAGTGGAACCAGGTTTGCTGTGAACTTTCAGACTGGCTTCAGTGGAAATGACATTGCCTTCCACTTCAACCCTCGGTTTGAAGATGGAGGGTACGTGGTGTGCAACACGAGGCAGAACGGAAGCTGGGGGCCCGAGGAGAGGAGGACACACATGCCTTTCCAGAAGGGGATGCCCTTTGACCTCTGCTTCCTGGTGCAGAGCTCAGATTTCAAGGTGATGGTGAACGGGATCCTCTTCGTGCAGTACTTCCACCGCGTGCCCTTCCACCGTGTGGACACCATCTTCGTCAATGGCTCTGTGCAGCTGTCCTACATCAGCTTCCAGCC
TCCCGGCGTGTGGCCTGCCAACCCGGCTCCCATTACCCAGACAGTCATCCACACAGTGCAGAGCGCCCCTGGACAGATGTTCTCTACTCCCGCCATCCCACCTATGATGTACCCCCACCCCGCCTATCCGATGCCTTTCATCACCACCATTCTGGGAGGGCTGTACCCATCCAAGTCCATCCTCCTGTCAGGCACTGTCCTGCCCAGTGCTCAGAGGTTCCACATCAACCTGTGCTCTGGGAACCACATCGCCTTCCACCTGAACCTCCGTTTTGATGAGAATGCTGTGGTCCGCAACACCCAGATCGACAACTCCTGGGGGTCTGAGGAGCGAAGTCTGCCCCGAAAAATGCCCTTCGTCCGTGGCCAGAGCTTCTCAGTGTGGATCTTGTGTGGAGCTCACTGCCTCAAGGTGGCCGTGGATGGTCAGCACCTGTTTGAATACTACCATCGCCTGAGGAACCTGCCCACCATCAACAGACTGGAAGTGGGGGGCGACATCCAGCTGACCCATGTGCAGACATAGSEQ ID NO10MAFSGSQAPYLSPAVPFSGTIQGGLQDGLQITVNGTVLSSSGTRFAVNFQTGFSGNDIAFHFNPRFEDGGYVVCNTRQNGSWGPEERRTHMPFQKGMPFDLCFLVQSSDFKVMVNGILFVQYFHRVPFHRVDTIFVNGSVQLSYISFQPPGVWPANPAPITQTVIHTVQSAPGQMFSTPAIPPMMYPHPAYPMPFITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNLRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCGAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQTSEQ ID NO11ATGTTTTCACATCTTCCCTTTGACTGTGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTACTACTTACAAGGTCCTCAGAAGTGGAATACAGAGCGGAGGTCGGTCAGAATGCCTATCTGCCCTGCTTCTACACCCCAGCCGCCCCAGGGAACCTCGTGCCCGTCTGCTGGGGCAAAGGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATGTGGCAACGTGGTGCTCAGGACTGATGAAAGGGATGTGAATTATTGGACATCCAGATACTGGCTAAATGGGGATTTCCGCAAAGGAGATGTGTCCCTGACCATAGAGAATGTGACTCTAGCAGACAGTGGGATCTACTGCTGCCGGATCCAAATCCCAGGCATAATGAATGATGAAAAATTTAACCTGAAGTTGGTCATCAAACCAGCCAAGGTCACCCCTGCACCGACTCTGCAGAGAGACTTCACTGCAGCCTTTCCAAGGATGCTTACCACCAGGGGACATGGCCCAGCAGAGACACAGACACTGGGGAGCCTCCCTGATATAAATCTAACACAAATATCCACATTGGCCAATGAGTTACGGGACTCTAGATTGGCCAATGACTTACGGGACTCTGGAGCAACCATCAGAATAGGCATCTACATCGGAGCAGGGATCTGTGCTGGGCTGGCTCTGGCTCTTATCTTCGGCGCTTTAATTTTCAAATGGTATTCTCATAGCAAAGAGAAGATACAGAATTTAAGCCTCATCTCTTTGGCCAACCTCCCTCCCTCAGGATTGGCAAATGCAGTAGCAGAGGGAATTCGCTCAGAAGAAAACATCTATACCATTGAAGAGAACGTATATGAAGTGGAGGAGCCCAATGAGTATTATTGCTATGTCAGCAGCAGGCAGCAACCCTCACAACCTTTGGGTTGTCGCTTTGCAATGCCATAGSEQ ID NO12ATGTTTTCAGGTCTTACCCTCAACTGTGTCCTGCTGCTGCTGCAACTACTACTTGCAAGGTCATTGGAAGATGGTTATAAGGTTGAGGTTGGTAAAAATGCCTATCTGCCCTGCAGTTACACTCTACCTACATCTGGGACACTTGTGCCTATGTGCTGGGGCAAGGGATTCTGTCCTTGGTCACAGTGTACCAATGAGTTGCTCAGAACTGATGAAAGAAATGTGACATATCAGAAATCCAGCAGATAC
CAGCTAAAGGGCGATCTCAACAAAGGAGATGTGTCTCTGATCATAAAGAATGTGACTCTGGATGACCATGGGACCTACTGCTGCAGGATACAGTTCCCTGGTCTTATGAATGATAAAAAATTAGAACTGAAATTAGACATCAAAGCAGCCAAGGTCACTCCAGCTCAGACTGCCCATGGGGACTCTACTACAGCTTCTCCAAGAACCCTAACCACGGAGAGAAATGGTTCAGAGACACAGACACTGGTGACCCTCCATAATAACAATGGAACAAAAATTTCCACATGGGCTGATGAAATTAAGGACTCTGGAGAAACGATCAGAACTGCTATCCACATTGGAGTGGGAGTCTCTGCTGGGTTGACCCTGGCACTTATCATTGGTGTCTTAATCCTTAAATGGTATTCCTGTAAGAAAAAGAAGTTATCGAGTTTGAGCCTTATTACACTGGCCAACTTGCCTCCAGGAGGGTTGGCAAATGCAGGAGCAGTCAGGATTCGCTCTGAGGAAAATATCTACACCATCGAGGAGAACGTATATGAAGTGGAGAATTCAAATGAGTACTACTGCTACGTCAACAGCCAGCAGCCATCCTGASEQ ID NO13MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMPSEQ ID NO14MFSGLTLNCVLLLLQLLLARSLEDGYKVEVGKNAYLPCSYTLPTSGTLVPMCWGKGFCPWSQCTNELLRTDERNVTYQKSSRYQLKGDLNKGDVSLIIKNVTLDDHGTYCCRIQFPGLMNDKKLELKLDIKAAKVTPAQTAHGDSTTASPRTLTTERNGSETQTLVTLHNNNGTKISTWADEIKDSGETIRTAIHIGVGVSAGLTLALIIGVLILKWYSCKKKKLSSLSLITLANLPPGGLANAGAVRIRSEENIYTIEENVYEVENSNEYYCYVNSQQPSSEQ ID NO15CAAACCAGGGUAUUCUSEQ ID NO16ATGGCTCTCTTCAGTGCCCAGTCTCCATACATTAACCCGATCATCCCCTTTACTGGACCAATCCAAGGAGGGCTGCAGGAGGGACTTCAGGTGACCCTCCAGGGGACTACCAAGAGTTTTGCACAAAGGTTTGTGGTGAACTTTCAGAACAGCTTCAATGGAAATGACATTGCCTTCCACTTCAACCCCCGGTTTGAGGAAGGAGGGTATGTGGTTTGCAACACGAAGCAGAACGGACAGTGGGGGCCTGAGGAGAGAAAGATGCAGATGCCCTTCCAGAAGGGGATGCCCTTTGAGCTTTGCTTCCTGGTGCAGAGGTCAGAGTTCAAGGTGATGGTGAACAAGAAATTCTTTGTGCAGTACCAACACCGCGTACCCTACCACCTCGTGGACACCATCGCTGTCTCCGGCTGCTTGAAGCTGTCCTTTATCACCTTCCAGACTCAGGACTTTCGTCCTGCCCACCAGGCACCCATGGCTCAAACTACCATCCATATGGTTCACAGCACCCCTGGACAGATGTTCTCTACTCCTGGAATCCCTCCTGTGGTGTACCCCACCCCAGCCTATACCATACCTTTCTACACCCCCATTCCAAATGGGCTTTACCCGTCCAAGTCCATCATGATATCAGGCAATGTCTTG
CCAGATGCTACGAGGTTCCATATCAACCTTCGCTGTGGAGGTGACATTGCTTTCCACCTGAACCCCCGTTTCAATGAGAATGCTGTTGTCCGAAACACTCAGATCAACAACTCCTGGGGGCAGGAAGAGCGAAGTCTGCTTGGGAGGATGCCCTTCAGTCGAGGCCAGAGCTTCTCGGTGTGGATCATATGCGAAGGTCACTGCTTCAAGGTGGCTGTGAATGGTCAACACATGTGTGAATATTACCACCGCCTGAAGAACTTGCAGGATATCAACACTCTAGAAGTGGCGGGTGATATCCAGCTGACCCACGTGCAGACATAGSEQ ID NO17MALFSAQSPYINPIIPFTGPIQGGLQEGLQVTLQGTTKSFAQRFVVNFQNSFNGNDIAFHFNPRFEEGGYVVCNTKQNGQWGPEERKMQMPFQKGMPFELCFLVQRSEFKVMVNKKFFVQYQHRVPYHLVDTIAVSGCLKLSFITFQTQDFRPAHQAPMAQTTIHMVHSTPGQMFSTPGIPPVVYPTPAYTIPFYTPIPNGLYPSKSIMISGNVLPDATRFHINLRCGGDIAFHLNPRFNENAVVRNTQINNSWGQEERSLLGRMPFSRGQSFSVWIICEGHCFKVAVNGQHMCEYYHRLKNLQDINTLEVAGDIQLTHVQTSEQ ID NO18MALFSAQSPYINPIIPFTGPIQGGLQEGLQVTLQGTTKSFAQRFVVNFQNSFNGNDIAFHFNPRFEEGGYVVCNTKQNGQWGPEERKMQMPFQKGMPFELCFLVQRSEFKVMVNKKFFVQYQHRVPYHLVDTIAVSGCLKLSFITFQNSAAPVQHVFSTLQFSQPVQFPRTPKGRKQKTQNFRPAHQAPMAQTTIHMVHSTPGQMFSTPGIPPVVYPTPAYTIPFYTPIPNGLYPSKSIMISGNVLPDATRFHINLRCGGDIAFHLNPRFNENAVVRNTQINNSWGQEERSLLGRMPFSRGQSFSVWIICEGHCFKVAVNGQHMCEYYHRLKNLQDINTLEVAGDIQLTHVQTSEQ ID NO19MAFSGSQAPYLSPAVPFSGTIQGGLQDGLQITVNGTVLSSSGTRFAVNFQTGFSGNDIAFHFNPRFEDGGYVVCNTRQNGSWGPEERKTHMPFQKGMPFDLCFLVQSSDFKVMVNGILFVQYFHRVPFHRVDTISVNGSVQLSYISFQNPRTVPVQPAFSTVPFSQPVCFPPRPRGRRQKPPGVWPANPAPITQTVIHTVQSAPGQMFSTPAIPPMMYPHPAYPMPFITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNPRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCEAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQT
權(quán)利要求
1.一種分離多肽，其包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域和tim-3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中多肽不包括tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim-3穿膜結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中多肽是人多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中多肽是小鼠多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中tim-3IgV結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO13的氨基酸22-131。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中tim-3IgV結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO14的氨基酸22-132。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中tim-3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO13的氨基酸226-301。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中tim-3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO14的氨基酸217-281。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離多肽，其包括SEQ ID NO2列出的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離多肽，其包括SEQ ID NO6列出的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離多肽，其包括SEQ ID NO4列出的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離多肽，包括，其中多肽進(jìn)一步包括SEQ ID NO8列出的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離多肽，進(jìn)一步包括免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域。
13.一種組合物，其包括權(quán)利要求1所述的分離多肽和藥物用載體。
14.一種分離核酸，其編碼權(quán)利要求1所述多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離核酸，其包括SEQ ID NO1列出的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離核酸，其包括SEQ ID NO3列出的核酸序列。
17.一種分離核酸，其在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼可溶tim-3的核酸雜交，但該分離核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下不與編碼全長tim-3的核酸雜交。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離核酸，其中編碼可溶tim-3的核酸包括SEQ ID NO1列出的核酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離核酸，其包括SEQ ID NO5列出的核酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離核酸，其中編碼全長tim-3的核酸包括SEQ ID NO11列出的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離核酸，其包括SEQ ID NO15列出的核酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離核酸，其中編碼可溶tim-3的核酸包括SEQ ID NO3列出的核酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離核酸，其包括SEQ ID NO7列出的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離核酸，其中編碼全長tim-3的核酸包括SEQ ID NO12列出的核酸序列。
25.一種分離核酸，其編碼權(quán)利要求17所述的分離多肽。
26.一種藥物包裝，其包括(i)包括tim-3IgV結(jié)構(gòu)域的多肽；和(ii)對受驗(yàn)者組合物給藥治療增生病癥或治療Th2病癥的說明書。
27.根據(jù)權(quán)利要求書26所述的藥物包裝，其中增生病癥是腎細(xì)胞癌、Kapos′s肉瘤、慢性白血病、前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、白血病、卵巢癌、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、淋巴瘤、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌、睪丸癌、Hodgkin′s淋巴瘤、胃腸癌、或胃癌。
28.一種藥物包裝，其包括(i)包括galectin-9多肽的多肽；和(ii)對受驗(yàn)者組合物給藥治療自體免疫紊亂的說明書。
29.一種分離抗體或其片段，其結(jié)合具有SEQ ID NO2列出氨基酸序列的多肽，但不結(jié)合具有ID NO13列出氨基酸序列的多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的抗體，其中抗體結(jié)合包括SEQ IDNO6列出氨基酸序列的多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的抗體，其中抗體是單克隆抗體。
32.一種雜交瘤細(xì)胞株，其分泌權(quán)利要求31所述的單克隆抗體。
33.一種分離抗體或其片段，其結(jié)合具有SEQ ID NO4列出氨基酸序列的多肽，但不結(jié)合具有SEQ ID NO14列出氨基酸序列的多肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的抗體，其中抗體結(jié)合包括SEQ IDNO8列出氨基酸序列的多肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的抗體，其中抗體是單克隆抗體。
36.一種雜交瘤細(xì)胞株，其分泌權(quán)利要求35所述的單克隆抗體。
37.一種調(diào)節(jié)受驗(yàn)者免疫反應(yīng)的方法，該方法包括對受驗(yàn)者給藥有效治療劑量的調(diào)節(jié)tim-3活性的試劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)Th1反應(yīng)或減少Th2反應(yīng)，并且其中試劑減少tim-3活性。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中受驗(yàn)者患有增生病癥。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中增生病癥是腎細(xì)胞癌、Kapos′s肉瘤、慢性白血病、前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、白血病、卵巢癌、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、淋巴瘤、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌、睪丸癌、胃腸癌、或胃癌、Hodgkin′s淋巴瘤、或其組合。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中受驗(yàn)者患有Th2介導(dǎo)的紊亂。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中Th2介導(dǎo)的紊亂是哮喘、敏感癥、過敏性鼻炎、胃腸敏感、食物敏感、嗜酸細(xì)胞增多、結(jié)膜炎或血管球性腎炎。
43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑抑制可溶tim-3的表達(dá)。
44.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑是抗體或其片段。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中抗體或其片段結(jié)合tim-3。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中抗體或其片段結(jié)合tim-3的胞外域。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中試劑是結(jié)合多肽的抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO13氨基酸30-128。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中試劑減少galectin-9與tim-3的結(jié)合。
49.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑包括多肽，該多肽包括(i)SEQ ID NO13氨基酸30-128；或(ii)與SEQ ID NO13氨基酸30-128有至少90％等同的氨基酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中多肽被聚乙二醇化。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中多肽包括(a)人血清蛋白；或(b)免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域。
52.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑包括多肽，該多肽包括tim-3的IgV結(jié)構(gòu)域、tim-3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、和免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域，但不包含tim-3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim-3的穿膜結(jié)構(gòu)域。
53.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑減少tim-3多肽或galectin-9多肽的表達(dá)水平。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中試劑是雙鏈RNA反義寡核苷酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑抑制全長tim-3與galectin-9的結(jié)合。
56.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中試劑抑制(i)包括SEQ IDNO13氨基酸的多肽；與(ii)galectin-9的結(jié)合。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中g(shù)alectin-9包括SED IDNO10列出的氨基酸序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中g(shù)alectin-9包括SED IDNO19列出的氨基酸序列。
59.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中試劑包括糖類。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中糖類是乳糖或β-半乳糖苷。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中試劑包括糖基化多肽。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中試劑包括膠質(zhì)或修飾的膠質(zhì)。
63.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括減少Th1反應(yīng)或增強(qiáng)Th2反應(yīng)，并且其中試劑增強(qiáng)tim-3活性。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中受驗(yàn)者患有自體免疫疾病。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中自體免疫疾病是多重硬化癥、I型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胃炎、自身免疫性肝炎、再生障礙性貧血、自身免疫性血友病、自體免疫淋巴組織增殖綜合征(ALPS)、自體免疫眼色素層鞏膜炎、血管球性腎炎、格林-巴利綜合征、牛皮癬和重癥肌無力。
66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中受驗(yàn)者患有宿主抗移植物病(HVGD)。
67.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中受驗(yàn)者是器官移植接受者。
68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中試劑是抗體、抗體片段、或多肽。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中抗體是對tim-3和galectin-9有特異性的雙特異性抗體。
70.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中試劑對tim-3的結(jié)合增強(qiáng)了tim-3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化。
71.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中試劑是tim-3配體。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中tim-3配體對全長tim-3的結(jié)合增強(qiáng)了tim-3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化。
73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中tim-3配體包括galectin-9多肽。
74.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中試劑包括至少galectin-9兩個糖類識別結(jié)構(gòu)域(CRD)中的一個。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中多肽包括galectin-9兩個糖類識別結(jié)構(gòu)域(CRD)。
76.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中試劑包括多肽，該多肽包括氨基酸序列，該氨基酸序列至少80％等同于SEQ ID NO10或SEQ ID NO18列出的氨基酸序列。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中多肽包括氨基酸序列，該氨基酸序列至少90％等同于SEQ ID NO10或SEQ IDNO18列出的氨基酸序列。
78.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中多肽包括氨基酸序列，這種氨基酸序列至少95％等同于SEQ ID NO10或SEQ IDNO18列出的氨基酸序列。
79.一種鑒定調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽結(jié)合的試劑的方法，該方法包括(a)在測定試劑存在下，接觸tim-3多肽和galectin-9多肽；和(b)確定測試試劑對tim-3多肽和galectin-9多肽結(jié)合的作用；從而，鑒定調(diào)節(jié)tim-3多肽和galectin-9多肽間結(jié)合的試劑。
80.一種鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑的方法，該方法包括(a)在測定試劑存在下，接觸tim-3多肽和galectin-9多肽；和(b)確定測試試劑對tim-3多肽和galectin-9多肽結(jié)合的作用；從而，鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的試劑。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中步驟(b)包括在測定試劑存在下，與適當(dāng)?shù)膶φ毡容^tim-3/galectin-9復(fù)合物的形成。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中適當(dāng)?shù)膶φ瞻ㄔ跓o測試試劑時第一個多肽和第二個多肽間的復(fù)合物的形成。
83.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中試劑增強(qiáng)tim-3和galectin-9間的結(jié)合。
84.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中試劑減少tim-3和galectin-9間的結(jié)合。
85.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中試劑是小的化合物、抗體或多肽。
86.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中tim-3多肽或galectin-9多肽或兩者在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中檢測復(fù)合物形成包括檢測報導(dǎo)基因的表達(dá)，其中報導(dǎo)基因的表達(dá)依賴于復(fù)合物形成。
88.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中tim-3多肽或galectin-9多肽或兩者被用熒光分子標(biāo)記。
89.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中g(shù)alectin-9多肽包括(i)SEQ ID NO10的氨基酸1-323；或(ii)SEQ ID NO19的氨基酸1-355；或(iii)至少90％等同于SEQ ID NO10氨基酸1-323的氨基酸序列；或(iii)至少90％等同于SEQ ID NO19氨基酸1-355的氨基酸序列。
90.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中tim-3多肽包括(i)SEQ ID NO13的氨基酸30-128；或(ii)至少90％等同于SEQ ID NO13氨基酸30-128的氨基酸序列。
91.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中免疫反應(yīng)是Th1免疫反應(yīng)。
92.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中免疫反應(yīng)是Th2免疫反應(yīng)。
93.一種開展藥物開發(fā)業(yè)務(wù)的方法，該方法包括(a)鑒定影響tim-3和galectin-9之間結(jié)合的化合物；(b)構(gòu)建步驟(a)中鑒定的動物體內(nèi)功效和毒性試驗(yàn)的化合物的治療譜，或其進(jìn)一步的類似物的治療譜；和(c)配制藥物制劑，該藥物制劑包括一種或多種步驟(b)中鑒定的可用作為治療譜的化合物。
94.一種開展藥物開發(fā)業(yè)務(wù)的方法，該方法包括(a)鑒定影響tim-3和galectin-9之間結(jié)合的化合物；(b)可任選地構(gòu)建步驟(a)中鑒定的動物體內(nèi)功效和毒性試驗(yàn)的化合物的治療譜，或其進(jìn)一步的類似物的治療譜；和(c)配制藥物制劑，該藥物制劑包括一種或多種步驟(b)中鑒定的可用作為治療譜的化合物。
95.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)步驟(a)中鑒定的上述化合物或其類似物的銷量收取使用費(fèi)。
96.一種增強(qiáng)tim-3活性的方法，包括用足夠減少可溶tim-3表達(dá)的一定量雙鏈RNA去接觸表達(dá)可溶tim-3的細(xì)胞，其中雙鏈RNA不抑制細(xì)胞內(nèi)全長tim-3的表達(dá)，從而增強(qiáng)tim-3活性。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中雙鏈RNA在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包括SEQ ID NO1的核酸雜交，而在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下不與包括SEQ ID NO11的核酸雜交。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中雙鏈RNA包括SEQ IDNO15列出的核酸序列。
99.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中雙鏈RNA是小干擾RNA或發(fā)夾狀RNA。
100.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中接觸受到對受驗(yàn)者雙鏈RNA給藥的影響。
101.一種檢測可溶tim-3基因表達(dá)的方法，包括檢測編碼可溶tim-3的核酸的存在，其中編碼可溶tim-3的核酸的檢測顯示了可溶tim-3基因表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于分離多肽和編碼該多肽的酸，該多肽包括tim－3IgV結(jié)構(gòu)域和tim－3細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中多肽不包括tim－3黏蛋白結(jié)構(gòu)域或tim－3穿膜結(jié)構(gòu)域。此外，本發(fā)明是關(guān)于調(diào)節(jié)受驗(yàn)者免疫反應(yīng)的方法，該方法包括對受驗(yàn)者給藥有效治療劑量的調(diào)節(jié)tim－3活性的藥劑。免疫反應(yīng)包括，但不限于，免疫耐受性、移植耐受性、Th1反應(yīng)和Th2反應(yīng)。
文檔編號A61P37/02GK1902227SQ200480036158
公開日2007年1月24日 申請日期2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月3日
發(fā)明者維杰伊·K·庫查魯, 特麗·斯特羅姆, 尤金·K·查, 修蒙尼·查克瓦替, 凱瑟琳·薩貝斯, 朱琛, 鄭心校, 阿伯托·桑切茲－菲戈 申請人:布賴漢姆婦女醫(yī)院, 貝斯以色列護(hù)理醫(yī)療中心