專利名稱：通過電刺激獲得的生物活性血清的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備血清產(chǎn)品的方法、血清產(chǎn)品和包含所述血清產(chǎn)品的藥物組合物，以及其在治療包括癲癇發(fā)作和中風(fēng)的多種疾病和病癥中的用途。
背景技術(shù)：
從血清制備活性物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。一種方法是從人或動物中抽取血液，接著孵育和分離活性物質(zhì)，最后保存該物質(zhì)(例如參見JP2123287、EP 0 542 303、RU 2096041、RU 2120301)?，F(xiàn)有技術(shù)的方法涉及制備改善身體對外源和內(nèi)源性因子抗性的血清，這些因子如氣壓、氣溫、重力、光等，和饑餓、渴、睡眠和性欲等。從預(yù)先已被帶入某種功能狀態(tài)的供者中抽取血清，并根據(jù)應(yīng)用功能狀態(tài)的時間長度和功能狀態(tài)的類型，例如缺乏睡眠、酒精濫用、尼古丁濫用等，可獲得具有不同生物活性的血清，其表現(xiàn)出促有絲分裂、催眠、opthalmogenic、促進(jìn)聽說(audio active)、減肥(thermo active)、促進(jìn)食欲(diatary active)、增強(qiáng)性功能(sexually active)、抗缺氧、解酒和抗尼古丁活性。
在EP 1 283 047中公開了一種不同方法，其中涉及用γ照射處理動物血清，目的是增加血清產(chǎn)品的生物活性。
目前，大量研究集中于調(diào)節(jié)不同人類組織的細(xì)胞增殖的機(jī)理上。在這一方面，研究了包括神經(jīng)細(xì)胞的正常和病理異常體細(xì)胞增殖的刺激劑和抑制劑(例如參見Aschmarin，I.P.″Neurochemistry″，Moskwa，Publishers of the Biomedical ChemicalInstitute of the Russian Academy of Science″，1996)。
人們已經(jīng)注意到肽生長因子除了具有它們正常的活化功能，例如刺激有絲分裂、不同類型正常組織的細(xì)胞分化和細(xì)胞生長、加快傷口愈合以外，還可導(dǎo)致腫瘤形成和增殖(例如參見Bouneres，P.(1993)，Horm.Res.4031；Robinson，C.，(1993)Ann.Med.25535；Dignez，C.and Casanueva F.(1995)Trends Endocrin.Metab.655，Menster D.et al.(1995)Clin.Exp.Metastasis 1367)這樣的肽例如甲狀旁腺肽、胃泌素或鈴蟾肽有助于腫瘤細(xì)胞發(fā)生和乳腺癌、骨癌和結(jié)腸癌發(fā)生(例如參見Kitazawa S.and Maeda S.(1995)Clin Orthop.31245-50和Kaji et al.(1995)Endocrinology 136842)。
雖然某些肽促進(jìn)正常細(xì)胞分裂，并且是人類和動物的刺激劑，但是存在著使用這些肽導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生并最終導(dǎo)致癌癥發(fā)生的危險。
早先的試驗已經(jīng)證明用電刺激動物導(dǎo)致血液中β-內(nèi)啡肽水平增加(例如參見Litvinova S.V.et al(1990)Biomed，Sci.5471)。在Udovitschenko，W.I.的參考工作中，提供了與多種原因引起的刺激或休克的結(jié)果相關(guān)的大量數(shù)據(jù)。例如，已經(jīng)表明，電擊導(dǎo)致血液內(nèi)β-內(nèi)啡肽、甲硫氨酸-(meta-)腦啡肽和亮氨酸-腦啡肽濃度顯著增加(參見Udowitschenko，W.I.(1989)“Xenogenic Opioid in Shock”PathiologicalPhysiology and Experimental Therapy”672-77)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是開發(fā)從動物血中制備生物活性血清的新方法。令人驚奇地是，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的生物活性血清表現(xiàn)出新的治療性質(zhì)。
因此，本發(fā)明的一個方面是制備生物活性血清的方法，包括以下步驟a)電刺激非人類動物b)從所述動物抽取血液，c)從所述血液中分離血清，和d)γ照射所述血清。
在一個優(yōu)選的實施方案中，非人類動物選自哺乳動物和鳥類，優(yōu)選選自家禽，如雞、鴨(dug)、鵝、鴕鳥和鵪鶉。
盡管電刺激可施加于身體的任何部位，優(yōu)選本發(fā)明方法的步驟a)施加于動物頭、頸、軀干和/或一個或多個肢體。除此之外，優(yōu)選地電刺激動物的頭。在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語電刺激和電擊(electroshock)可交替使用。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，電刺激進(jìn)行的時間段為1至60秒，優(yōu)選1至30秒，更優(yōu)選2至10秒。也優(yōu)選的是實施電刺激的電壓范圍為50V至150V，優(yōu)選80V至120V范圍，更優(yōu)選110V至120V范圍。在實施電刺激的過程中，優(yōu)選一定的電流，優(yōu)選地實施電刺激的電流為0.01A至0.4A，優(yōu)選0.02A至0.1A，更優(yōu)選0.04A至0.06A。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，實施電刺激的頻率為10至200Hz，優(yōu)選20至100Hz，更優(yōu)選45至65Hz。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，其中所述給予的γ照射的吸收照射劑量為10至40kGy，優(yōu)選15至35kGy，更優(yōu)選為20至30kGy。γ照射源可以是任意來源，然而，優(yōu)選的γ照射源選自60Co、137Cs、67Cu、67Ga、111In、192Ir、99mTc和170Tm。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括在步驟c)之前孵育所述血液的步驟。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括在步驟d)之前冷凍干燥所述血清的步驟。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，血液是動脈和/或靜脈血。
本發(fā)明的另一個方面是可根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的生物活性血清。
本發(fā)明的另一個方面是藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的血清和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑；載體；賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑；和/或防腐劑。
在本發(fā)明藥物組合物的一個優(yōu)選的實施方案中，該組合物被配制成糖漿、輸注液或注射液、片劑、膠囊、囊片、錠劑、脂質(zhì)體、栓劑、硬膏劑、繃帶、緩釋膠囊(retardcapsule)、粉劑或緩釋制劑。優(yōu)選地稀釋劑為水、緩沖液、緩沖鹽溶液或鹽溶液，載體優(yōu)選地選自其中所述載體選自可可脂和vitebesole。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的血清或本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，所述疾病或病癥可受需要治療的患者的腦部中環(huán)腺苷酸單磷酸含量增加影響。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的血清或本發(fā)明的藥物組合物在制備用于改善認(rèn)知或?qū)W習(xí)能力尤其是改善長期記憶的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的血清或本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療發(fā)作尤其是癲癇發(fā)作的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的血清或本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療增殖性疾病和中風(fēng)的藥物中的用途。
在本發(fā)明用途的優(yōu)選的實施方案中，增殖性疾病選自胃腸道或結(jié)腸直腸道、肝臟、胰、腎、膀胱、甲狀腺、前列腺、子宮內(nèi)膜、宮頸、卵巢、子宮、睪丸、皮膚、口腔的癌(malignomas)；黑素瘤；口腔粘膜發(fā)育異常；侵入性口腔癌；小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌；乳房腫瘤，尤其是激素依賴性乳腺癌和非激素依賴性乳腺癌；移行細(xì)胞癌和扁平細(xì)胞癌；神經(jīng)惡性腫瘤，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、骨肉瘤、腦膜瘤；軟組織肉瘤；血管瘤和內(nèi)分泌腫瘤，尤其是垂體腺瘤；嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、血液癌變，尤其是淋巴瘤和白血病。
在本發(fā)明用途的另一個優(yōu)選的實施方案中，增殖性疾病包括類似于人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji、人黑素瘤細(xì)胞系Bro、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人腺癌細(xì)胞系MCF-7、骨肉瘤細(xì)胞系Mg63、纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和肝癌細(xì)胞系HepG2的細(xì)胞。
在本發(fā)明用途的另一個優(yōu)選的實施方案中，給予需要治療的患者的藥物量為50至150mg/kg體重，優(yōu)選90至100mg/kg體重。
具體實施例方式
本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)用電流刺激動物尤其是雞并進(jìn)一步用γ-射線處理從血液獲取的血清導(dǎo)致血清產(chǎn)品生物活性顯著增加。獲得的產(chǎn)品能夠正向影響患者的多種身體功能、病癥和疾病。
用電擊和γ-射線處理的血清的有益效果是令人驚奇的，理由有兩點。其一，現(xiàn)有技術(shù)中已知電擊可引起所有生命功能和機(jī)體內(nèi)的系統(tǒng)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液和循環(huán)系統(tǒng)以及呼吸系統(tǒng)的嚴(yán)重紊亂(參見例如Orlow，A.N.et al.(1977)Medicine)。其二，也發(fā)現(xiàn)血液和從血液中制備的血清對照射敏感，并且在電離輻射下不穩(wěn)定并失活(例如參見Radiomedicine-M.Atomisdat(1972)123-125和Gergely，J.et al.(1967)Radiosterilization of Medical Products 115-124)。
這些研究不能導(dǎo)致本發(fā)明的結(jié)果，并提示通過電擊和γ-射線處理不可能得到生物活性血清。因此，令人驚奇地是從用II級和III級電擊并用γ-射線處理的動物尤其是雞中抽取的動脈和/或靜脈血可得到生物活性血清。下文將更詳細(xì)地描述由此得到的血清的具體活性。
因此，本發(fā)明的第一個方面是制備生物活性血清的方法，包括以下步驟a)電刺激非人類動物，b)從所述動物抽取血液，c)從所述血液中分離血清，和d)γ照射所述血清。
在本發(fā)明的方法中可使用多種動物，然而，優(yōu)選的非人類動物選自哺乳動物和鳥類。因為它們?nèi)菀椎玫?，特別優(yōu)選使用家養(yǎng)動物，例如家禽，例如雞、鴨、鵝、鴕鳥和鵪鶉?？稍诒景l(fā)明的方法中使用的特別優(yōu)選的動物是雞?？稍诒景l(fā)明的方法中使用的哺乳動物的類型不具體限制，包括但不限于嚙齒動物，例如小鼠、倉鼠和大鼠、貓、狗、馬、驢、綿羊、牛和山羊。
可以想象電刺激導(dǎo)致某些化合物在動物體內(nèi)釋放，其引起和/或有助于本發(fā)明的生物活性血清的令人驚奇的治療效果。可以在身體的不同區(qū)域刺激非人類動物。優(yōu)選地，實施電刺激是在頭、頸、軀干和/或一個或多個肢體。每次電刺激僅僅在一個位置或在多個位置都是可以的。特別優(yōu)選的用于電刺激的身體部位是各個動物的頭部。當(dāng)刺激鳥類尤其是雞時，優(yōu)選電刺激頭部。
可以采用任何已知的方法實施電刺激，優(yōu)選使用金屬電極或水浴，例如在屠宰家畜或電死家禽時使用的。優(yōu)選地，實施電刺激的時間段為1至60秒，優(yōu)選1至30秒，更優(yōu)選2至10秒，最優(yōu)選為3至4秒。時間段的長度在電刺激大動物時將延長，在電刺激小動物時可以縮短。例如刺激雞的頭部時，電刺激的特別優(yōu)選的時間為2至10秒，更優(yōu)選為3至4秒。在電刺激動物過程中，可調(diào)節(jié)的其它變量為電壓、電流和電流頻率，本發(fā)明已經(jīng)限定了這些變量的某些優(yōu)選范圍。選擇的實際參數(shù)將部分地取決于動物大小和受刺激的動物部位。通常，較大動物和較大的部位將需要較高的電壓和電流。因此，實施電刺激優(yōu)選采用的電壓為50V至150V，優(yōu)選80V至120V，更優(yōu)選110V至120V?？墒┘拥碾娏鳛?.01A至0.4A，優(yōu)選0.02A至0.1A，更優(yōu)選0.04A至0.06A，最優(yōu)選為約0.05A。優(yōu)選地，選擇電壓、電流和應(yīng)用時間以給予1至1,000W、優(yōu)選10至200W、更優(yōu)選15至100W的能量。
對于刺激優(yōu)選的動物即雞，優(yōu)選實施電刺激的電壓為80V至120V，更優(yōu)選110V至120V。而且，在鳥類尤其是雞的電刺激中，電流為0.04A至0.06A，特別優(yōu)選0.05A。
在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實施方案中，以80V至120V、尤其是110V至120V的電壓對鳥類尤其是雞進(jìn)行3至4秒電刺激。在這個優(yōu)選的實施方案中，電流優(yōu)選為0.04A至0.06A，更優(yōu)選為約0.05A。
電刺激的頻率似乎不是特別關(guān)鍵，但是優(yōu)選為10至200Hz，更優(yōu)選為45至65Hz，最優(yōu)選為約50Hz。
本發(fā)明方法的步驟d)中血清的γ照射可采用包括X-射線源和放射性核素的任意γ源進(jìn)行。優(yōu)選地，γ照射源為具有確定γ照射模式的放射性核素。優(yōu)選的γ照射源選自60Co、137Cs、67Cu、67Ca、111In、192Ir、99mTc和170Tm。在本發(fā)明的方法中，對我們而言，其中60Co、137Cs、192Ir和170Tm是特別優(yōu)選的，60Co是最優(yōu)選的γ照射源。被血清吸收的照射劑量為10至40kGy，優(yōu)選15至35kGy，更優(yōu)選20至30kGy，即25±5kGy。
從動物中抽取血液可通過任意已知的方法實現(xiàn)，這些方法包括使用注射器和動脈或靜脈穿刺，或采用斷頭術(shù)，尤其是在從鳥類抽取血液時。可以抽取動物的一部分血液或完全抽取動物的血液。如果已經(jīng)給動物施加了致死量的電，優(yōu)選使用后者。抽取的血液可以是動脈和/或靜脈血。
可通過任意已知的方法分離血清，所述方法包括過濾、沉淀和離心分離。然而，優(yōu)選在低溫例如在2至10℃、優(yōu)選4-8℃下孵育血液4至72小時，以使血液凝集，使另外的因子釋放進(jìn)入血液。因此，在本發(fā)明方法的優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括從動物中抽取血液后和在從血液中分離血清前孵育血液的步驟，例如在低溫例如在2至10℃、優(yōu)選4-8℃下孵育血液4至72小時。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括在照射的步驟d)之前冷凍干燥所述血清的步驟。冷凍干燥使得更容易在照射期間操作血清，并血清成分對照射的吸收。
本發(fā)明的另一個方面是生物活性血清自身，其可以根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)。它與現(xiàn)有技術(shù)中沒有采用本發(fā)明的方法的步驟得到的血清明顯不同，這點可通過其特定的治療效果加以證實，而現(xiàn)有技術(shù)血清產(chǎn)品不能表現(xiàn)出這一效果。
由于令人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的生物活性血清產(chǎn)品提供特定的治療效果，例如抗增殖活性或抗癲癇活性，本發(fā)明的另一方面是藥物組合物，其包含可根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的生物活性血清。這樣的藥物組合物可進(jìn)一步地包含一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑；載體；賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑；和/或防腐劑。
本發(fā)明的藥物組合物可通過各種已知的途徑給藥，包括口服和非胃腸道給藥，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等給藥途徑。優(yōu)選非胃腸道給藥，特別是靜脈給藥。根據(jù)給藥途徑，需要各種藥物制劑，這些制劑中的某些可能需要給藥物制劑應(yīng)用保護(hù)性包衣來防止生物活性血清在例如消化道的降解。
因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物制成糖漿、輸注液或注射液、片劑、膠囊、囊片、錠劑、脂質(zhì)體、栓劑、硬膏劑、繃帶、緩釋膠囊、粉劑或緩釋制劑。
特別優(yōu)選的藥物形式是適用于注射的形式，包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉劑。在所有的情況下，最終的溶液或分散液形式必須是無菌的和流動的。典型地，這樣的溶液或分散液將包括溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水緩沖的水性溶液，例如生物相容性緩沖液、乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其適宜的混合物、表面活性劑或植物油。本發(fā)明的生物活性血清也可配制成脂質(zhì)體，特別是對于非胃腸道給藥而言。與游離藥物相比，脂質(zhì)體提供增加的循環(huán)中半壽期并延長所包裹藥物的更均勻釋放。
可通過任意數(shù)量的本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)實現(xiàn)對輸注液和注射液的滅菌，這樣的技術(shù)包括但不限于添加防腐劑例如抗細(xì)菌劑或抗真菌劑，例如尼泊金類(Parabene)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸或硫柳汞。而且，也可以將等滲劑例如糖類或鹽類尤其是氯化鈉摻入到輸注液或注射液中。
通過將需要量的生物活性血清摻入到含上述列舉的各種成分的適宜溶劑中，根據(jù)需要，接著進(jìn)行滅菌，制備含生物活性血清的無菌注射液。為了獲得無菌粉劑，根據(jù)需要將上述溶液真空干燥或冷凍干燥。本發(fā)明優(yōu)選的稀釋劑為水、生理可接受的緩沖液、生理可接受的緩沖鹽溶液或鹽溶液。本發(fā)明優(yōu)選的載體是可可脂和vitebesole?？膳c生物活性血清的各種藥物形式使用的賦形劑選自以下非限制性列表a)粘合劑，例如乳糖、甘露醇、結(jié)晶山梨醇、磷酸氫二鹽類、磷酸鈣、糖類、微晶纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等；b)潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、氫化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰富馬酸鈉；c)崩解劑，例如淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(croscaramellose)、甲基纖維素鈉、瓊脂、膨潤土、海藻酸、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其它適宜的賦形劑可參見由the American Pharmaceutical Association出版的Handbook of Pharmaceutical Excipients，本文將其引入作為參考。
本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明的生物活性血清或藥物組合物在制備用于治療可受需要治療的患者的腦中環(huán)腺苷酸單磷酸含量增加影響的疾病或病癥的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明的生物活性血清或藥物組合物在制備用于改善受治療患者中益智(nootropic)、認(rèn)知和/或?qū)W習(xí)能力尤其是改善長期記憶的藥物中的用途。用于這個適應(yīng)癥的用途是基于發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的血清或藥物組合物增加受治療患者的學(xué)習(xí)能力。
而且，所述血清或藥物組合物可用于治療任意類型的發(fā)作，尤其是用于治療癲癇發(fā)作。具體而言，在嚴(yán)重的癲癇形式中和在癲癇大發(fā)作期間，給予本發(fā)明的生物活性血清或藥物組合物可以預(yù)防有時與嚴(yán)重發(fā)作相關(guān)的死亡。與本發(fā)明可用于治療癲癇發(fā)作的觀察相結(jié)合，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的血液、血清或藥物組合物可用于治療神經(jīng)疾病，包括但不限于雙極性精神障礙、抑郁、焦慮相關(guān)病癥、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、外周神經(jīng)病變、腦淀粉樣血管病、神經(jīng)退行性疾病和脊髓損傷。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的血清或藥物組合物在制備用于治療增殖性疾病和中風(fēng)的藥物中的用途。特別令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果體外測試多種腫瘤細(xì)胞系，本發(fā)明的生物活性血清或藥物組合物表現(xiàn)出明顯的抗增殖效果。因此，顯然本發(fā)明的生物活性血清或藥物組合物特別適用于治療增殖性疾病，可根據(jù)本發(fā)明的用途治療的優(yōu)選的增殖性疾病選自胃腸道或結(jié)腸直腸道、肝臟、胰、腎、膀胱、甲狀腺、前列腺、子宮內(nèi)膜、宮頸、卵巢、子宮、睪丸、皮膚、口腔的癌變(malignomas)；黑素瘤；口腔粘膜發(fā)育異常；侵入性口腔癌；小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌；乳房腫瘤，尤其是激素依賴性乳腺癌和非激素依賴性乳腺癌；移行細(xì)胞癌和扁平細(xì)胞癌；神經(jīng)惡性腫瘤，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、骨肉瘤、腦膜瘤；軟組織肉瘤；血管瘤和內(nèi)分泌腫瘤，尤其是垂體腺瘤；嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、血液癌變，尤其是淋巴瘤和白血病。
由于本發(fā)明的生物活性血清或本發(fā)明的藥物組合物的抗增生效果已經(jīng)對多種腫瘤細(xì)胞系首次確立，它特別適用于治療增殖性疾病，其中包含類似于在那些試驗中使用的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞和/或包含這些細(xì)胞的腫瘤組織。相應(yīng)地，可以使用所述生物活性血清或包含所述生物活性血清的藥物組合物治療的優(yōu)選的增殖性疾病包含與以下細(xì)胞類似的細(xì)胞人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji、人黑素瘤細(xì)胞系Bro、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人腺癌細(xì)胞系MCF-7、骨肉瘤細(xì)胞系Mg63、纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和肝癌細(xì)胞系HepG2。在本發(fā)明中，術(shù)語″類似的細(xì)胞″是指這樣的細(xì)胞，它們與各個細(xì)胞系具有相同起源如T細(xì)胞、B細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞譜系，它們攜帶相同或功能等價的基因中的突變，其中這種突變與細(xì)胞的增殖活性相關(guān)，例如p53、pRb、cdc2、cdk4、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、p21ras、c-fos、c-jun、p107、p130等中的突變；它們攜帶相同或功能類似的外源基因，例如人乳頭瘤病毒(HPV)、E6或E7，乙型肝炎病毒等插入細(xì)胞周期蛋白B啟動子；或者它們具有相同的染色體重排或異常的染色體重排，即缺失、染色體多倍化等。
根據(jù)動物和細(xì)胞培養(yǎng)物中的結(jié)果，優(yōu)選一定量的生物活性血清用于治療可應(yīng)用所述血清和藥物組合物的疾病或病癥。然而，應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)相應(yīng)病癥和待治療的相應(yīng)患者，即根據(jù)疾病或病癥的嚴(yán)重性、患者的一般健康狀況等，需要不同劑量的生物活性血清或藥物組合物以實現(xiàn)治療效果。適宜劑量的確定取決于主治醫(yī)師的判斷。可以考慮本發(fā)明方法中的生物活性血清的劑量應(yīng)當(dāng)在約0.1mg至約200mg血清每千克體重的范圍內(nèi)。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選的用途中，給予需要的患者的生物活性血清的劑量為50至150mg/kg體重，優(yōu)選為90至100mg/kg體重。用生物活性血清治療的持續(xù)時間將根據(jù)待治療疾病的嚴(yán)重性和每個患者個體的狀況和特異體質(zhì)反應(yīng)而改變。
包括下述的實施例以舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在下述實施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人在實施本發(fā)明中效果良好的技術(shù)，因此，可以認(rèn)為是優(yōu)選的實施方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以在不背離所附權(quán)利要求確定的本發(fā)明范圍和實質(zhì)的情況下，對已經(jīng)公開的具體實施方案進(jìn)行多種改變。本文中引用的所有文獻(xiàn)引入本文作為參考。


圖1兩種藥物制劑對Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示Jurkat細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖2兩種藥物制劑對Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示Raji細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖3兩種藥物制劑對Bro B-19細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Bro B-19的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示Bro B-19細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖4兩種藥物制劑對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系HeLa的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示HeLa細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖5兩種藥物制劑對MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示MCF-7細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖6兩種藥物制劑對IMR-32細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系IMR-32的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示IMR-32細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖7兩種藥物制劑對HT1080細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系HT1080的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示HT1080細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖8兩種藥物制劑對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)描述包含本發(fā)明生物活性血清的兩種不同藥物制劑以不同濃度對人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系HepG2的細(xì)胞毒效應(yīng)。在y軸上以百分?jǐn)?shù)表示HepG2細(xì)胞的存活率，同時在x軸上以mg/ml標(biāo)明生物活性血清的量。
圖9用絲裂原處理的細(xì)胞的增殖活性的″鐘形″曲線基于相對于絲裂原濃度的DNA生物合成量測定淋巴細(xì)胞的曲線。通過摻入放射性的量和每分鐘酸不溶性計數(shù)來測定DNA生物合成的活性。
圖10藥物組合物的促有絲分裂活性描述0.1至100.0mg/ml的物質(zhì)濃度范圍內(nèi)藥物組合物對DNA生物合成量的促有絲分裂效應(yīng)。DNA合成的量以摻入DNA中的放射性量為基準(zhǔn)評價。
圖11藥物組合物對MCF-7細(xì)胞的影響描述人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中DNA合成的量與藥物組合物中含有的生物活性血清的量的關(guān)系。
實施例實施例1獲得電擊處理的雞血的方法為了制備雞血清，用II級至III級的電擊(電壓為80-120V，電流0.05A，頻率50Hz，施加時間3至4秒，在頭部)處理雞。然后從頸動脈抽取血液，進(jìn)一步在聚乙烯燒瓶中于4-8℃下孵育18-24小時。在血凝塊完全收縮以后，以3,000rpm旋轉(zhuǎn)燒瓶20-30分鐘。將血凝塊與血清分離，于本領(lǐng)域已知的條件下冷凍干燥。在RZ-100-M裝置上用60Co作為γ輻射源以20-30kGy、優(yōu)選約25kGy處理含有凍干血清的燒瓶。將處理的血清在4-8℃的溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> 用電擊處理的雞血清的刺激效應(yīng)的證據(jù)使用平均體重為280-300g的雄性Wistar大鼠進(jìn)行下面的實驗。將動物隨機(jī)分配為4組，每組10只。第一組給予1.0ml的生理鹽水溶液。第二組以1.0ml溶液的形式給予100±5.0mg/kg體重的本發(fā)明血清。注射30分鐘后，將大鼠斷頭。給予第三組大鼠1ml的生理鹽水溶液，第四組大鼠以1.0ml溶液形式接受含生理活性血清(100±5mg/kg體重)。注射30分鐘后，將在尾部負(fù)重的動物(大鼠體重的10％)放置在水盆中(25℃)。在劇痛的第一次征兆后，從水中取出大鼠，斷頭。
取腦、心臟、肝臟(全是極端適應(yīng)過程中處于高度緊張狀態(tài)的器官)以及骨骼肌(作為主要的效應(yīng)器官)作為樣品用于進(jìn)一步的分析。稱重每只大鼠的組織樣品，用等滲NaCl溶液冷卻，在液氮中快速冷凍。在施加“脅迫”和最終處理樣品之間的全部時間最多為5至6分鐘。
確定大鼠骨骼肌中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷的量。通過用AnionitDowex 1的離子交換柱色譜法分離核苷酸。在256nm的范圍(分光光度計Hitachi-557)進(jìn)行光度分析確定三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷的量。根據(jù)下述公式確定能量勢
(ATP-0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)使用已知的放射免疫學(xué)分析法用Amersham(Great Britain)檢測裝置測定腦、心臟和肝臟中的環(huán)單磷酸腺苷含量。
使用本領(lǐng)域已知的方法應(yīng)用閃爍計數(shù)器GS-8進(jìn)行標(biāo)記的單磷酸腺苷的測定。
結(jié)果當(dāng)?shù)谌M與對照組1或第二組(p＜0.05)比較時，第四組與對照組1或第二組(p＜0.05)比較時，還有當(dāng)?shù)谌M與第四組互相比較時(p＜0.05)時，都可明顯看出三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷的不同含量和能量勢的增加(也參見表1)。
表1給予或不給予生物活性血清的骨骼肌組織內(nèi)三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷的量和能量勢

在活動期或由注射導(dǎo)致的輕度脅迫后30分鐘(對照組I)測定腺苷磷酸的含量證實，在血清影響下，三磷酸腺苷和二磷酸腺苷量的混合出現(xiàn)在肌肉組織中的上限范圍值，而同時單磷酸腺苷的量降低。
這些結(jié)果可以解釋為生物活性血清促進(jìn)了肌肉組織內(nèi)能量勢的增加。計算能量勢證實了這種傾向。
在第三組(生理鹽溶液+游泳)中在極端游泳脅迫影響下，測得相對于對照組而言，三磷酸腺苷降低，二磷酸腺苷和單磷酸腺苷增加。
在極端脅迫下，在第四組(血清+游泳)的大鼠中，觀察到三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷的含量改變的大致趨勢與第三組中的類似，然而，三磷酸腺苷的含量顯著更高，當(dāng)計算能量勢時，觀察到與第三組相比能量勢增加43％(p＜0.05)。
在第一和第二組大鼠的心臟和肝臟組織以及腦組織中的環(huán)單磷酸腺苷的比較分析證實，在血清的影響下，與對照組相比，可檢測出腦組織中的環(huán)單磷酸腺苷量的增加(p＜0.01)，而心臟和肝臟組織中環(huán)單磷酸腺苷的含量沒有顯著差異(參見表2)表2給予生物活性血清后，腦、心臟和肝臟中環(huán)單磷酸腺苷的量

在第三組(生理鹽溶液+游泳)和第四組(血清+游泳)大鼠的所有組織中可觀察到在極端脅迫的影響下，環(huán)單磷酸腺苷的量顯著減少(p＜0.05)。然而，在生物活性血清的影響下，這種減少減弱。因此，腦組織中單磷酸腺苷的量比第三組的各自的量高92％(p＜0.05)，心臟組織中高96％，肝臟組織中高25.7％。
所以，在靜止期和在極端脅迫下，用電擊和γ射線處理的本發(fā)明的血清增加了大鼠骨骼肌中的能量勢，增加了腦組織中環(huán)單磷酸腺苷的量，并在物理脅迫大鼠后促進(jìn)心臟和肝臟組織中環(huán)單磷酸腺苷的增加。
實施例2長期記憶在這個實驗中，使用150只雄性Wistar大鼠。起先用經(jīng)典的“開場”試驗測試所有的大鼠，再根據(jù)活動分為三組活動(active)組、中等活動組和被動組。
為了建立條件反射，將大鼠置于恒溫控制盆內(nèi)的圓筒中。將圓筒放置在三個支撐體上，并允許動物從圓筒下沿潛至圓筒外的平臺。
確定第一次實驗的潛伏時間和最后解決從封閉空間和從水中“逃出”的任務(wù)的潛伏時間。
當(dāng)建立條件反射時，將大鼠分為三組－″快速潛水者″指那些能在第一分鐘發(fā)現(xiàn)出口的大鼠；－″慢速潛水者″指那些在2至3分鐘后才開始尋找出口的大鼠－在10分鐘內(nèi)沒有意愿去解決問題的大鼠。
在進(jìn)行實驗的30分鐘前，以100mg/kg體重將生物活性血清注射入腹膜腔。向?qū)φ战M動物給予1ml生理鹽溶液。第二天，測試條件反射行為，之后給大鼠40天間歇。
根據(jù)該方法，120只大鼠－60只對照大鼠和60只接受生物活性血清的大鼠－接受“訓(xùn)練”。如上將大鼠預(yù)先另外分為三組，即活動組、中等活動組和被動組(每組20只動物)，而且，根據(jù)“快速”和“慢速”潛水者的分析將它們再進(jìn)行分組。
結(jié)果有些大鼠根本不表現(xiàn)″潛水反射″(表3)。在對照組中，6只活動大鼠和中等活動大鼠和12只被動組動物完全不表現(xiàn)″潛水反射″(表3)。第二天，對于活動大鼠和中等活動大鼠，該數(shù)目依舊保持相同，然而被動組動物該數(shù)下降為7。42天后，相同的11只被動組大鼠拒絕在圓筒邊緣下潛水(在實驗中1只大鼠死亡)。
對于接受生物活性血清大鼠的活動大鼠，在第二天沒有一只大鼠拒絕解決該問題。對于所有的中等活動大鼠，在第一天有三只拒絕解決該問題，但是在第二天解決了該問題，并且即使在42天后仍繼續(xù)具有這個能力。在接受血清大鼠的被動大鼠中，4只大鼠沒有意愿去解決該問題，然而，在第二天該數(shù)降低至2只，并一直保持至42天后。
表3沒有表現(xiàn)出″潛水反射″的大鼠數(shù)量

*在實驗中一只大鼠死亡在″快速潛水″組內(nèi)，在試驗的40天時間內(nèi)，單次血清注射沒有表現(xiàn)出條件反射的明顯改變。
對于″慢速潛水″組，存在統(tǒng)計學(xué)顯著的維持快速發(fā)現(xiàn)從極端條件下逃險路線的能力(表4)。因此，對于對照組和試驗組而言，與第一天相比，第二天形成反射的時間減少。在對照組中，42天后這種反射完全消失，然而對于接受生物活性血清注射的動物而言，該反射全部保持。此外，在反射需要的時間上存在差異，對照組要高2-3倍(p＜0.01)。
表4血清對“慢速潛水”組中條件反射的形成和保持的影響(以秒計)

在信息的形成和長期保持期間，顯著作用歸因于H-膽堿能感受機(jī)理。教育如何在″鐘″下潛水持續(xù)5天的30只動物分為3組。
在第一組(10只大鼠)動物測試前30分鐘，以1mg/kg體重向腹腔注射zytisin(腦的H-膽堿能感受拮抗劑)的生理溶液。
以100mg/kg體重的劑量向第二組動物(10只大鼠)給予生理活性血清，30分鐘后，以1mg/kg體重給予zytisin溶液。
第三組動物(對照組－10只大鼠)接受1ml的生理鹽溶液注射液。
根據(jù)上述指出的方法，在注射指定的物質(zhì)48小時后，測試動物的復(fù)雜行為。生物測試顯示應(yīng)用zytisin 48小時后，從封閉空間的“逃險反應(yīng)”與對照動物相比減慢了3倍。
與對照組相比，在zytisin注射前給藥血清不僅減輕了拮抗效果，而且導(dǎo)致“逃險”反應(yīng)增加20％，生物血清的總體效果超過拮抗劑效果的5倍。
表5大鼠對給予zytisin和生物活性血清的刺激反應(yīng)的潛伏期(秒)

根據(jù)所述結(jié)果，確定了腦H-膽堿能受體在與動物的復(fù)雜行為建模相關(guān)的“逃險反應(yīng)”的恢復(fù)中起重要作用，并且生物活性血清防止了學(xué)習(xí)衰減的建立。
因此，生物活性血清刺激了長期記憶的形成，尤其在從封閉空間中和從水中逃險反應(yīng)減慢的動物中表現(xiàn)出這種效果。而且，很明顯，H-膽堿能感受的腦部機(jī)理在長期記憶的保持中起重要的作用，并且消極地影響H-膽堿能感受的腦部機(jī)理的物質(zhì)的效果受到本發(fā)明的生物活性血清的拮抗。
實施例3癲癇現(xiàn)有技術(shù)中已知，中毒劑量的樟腦可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運動區(qū)域活動過強(qiáng)，接著引起強(qiáng)直性痛性痙攣的發(fā)生。因為這點，樟腦被用于除了戊四唑以外的產(chǎn)生痛性痙攣的動物模型中。根據(jù)給予樟腦的劑量，可以引起所有類型的小或大的癲癇發(fā)作，包括癲癇大發(fā)作。
在該試驗中，觀察生物活性血清對癲癇癥活動的影響，所述癲癇癥通過將樟腦注射入大鼠的腹腔引起。在該實驗中使用體重為190-210g的40只雄性Wistar大鼠。將樟腦油溶液(20％)以0.25和0.5ml的量注射入腹腔(使用20只大鼠)。以100±5.0mg/kg體重的劑量注射血清(使用20只大鼠)。
由專家觀察和評價發(fā)作。評定下述的參數(shù)。反應(yīng)的潛伏時間、痛性痙攣反應(yīng)類型(強(qiáng)直陣攣性發(fā)作、大發(fā)作和小發(fā)作)、癲癇發(fā)作的時間長短和它們之間的時間間隔、正常運動的降低和最終結(jié)果(動物的死亡或從病理性狀態(tài)的恢復(fù))。結(jié)果在表6中概述。
表6生物活性血清對試驗誘導(dǎo)的癲癇的影響

在經(jīng)注射樟腦引起的癲癇發(fā)作的潛伏期中以100mg/kg給予生物活性血清降低了發(fā)作活動的所有病征發(fā)作活動的潛伏時間增加、陣攣性痛性痙攣嚴(yán)重性減輕并且不喪失正常運動性，另外用電擊處理的血清可預(yù)防嚴(yán)重癲癇模型中動物的死亡(給藥0.5ml 20％的樟腦溶液，所有的動物都活著)。
實施例4本發(fā)明的血清對人細(xì)胞增殖的影響本發(fā)明的血清為真空干燥的用II級和III級電擊和γ射線處理的雞血清。使用的生物活性血清為兩種制劑類型(i)以100mg/ml濃度重懸在水中的血清(試驗組分1)，和(ii)將懸浮液以10.000×g離心3分鐘后的100mg/ml生物活性血清的水懸液的上清(試驗組分2)。
細(xì)胞培養(yǎng)在塑料組織培養(yǎng)板(Nunc或Falcon)中于含10％胎牛血清(FCS，Gibco)、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的1640-RPMI培養(yǎng)基(Sigma)中，在37℃和5％CO2含量和95％濕度下培養(yǎng)Jurkat和Raji細(xì)胞系細(xì)胞以及人外周血的細(xì)胞。如上培養(yǎng)細(xì)胞系Bro、HeLa、MCF-7、Mg63、HT1080、IMR-32和HepG2，然而，使用DMEM培養(yǎng)基(Sigma)代替1640-RPMI培養(yǎng)基。
根據(jù)Boyum的方法分離單核白細(xì)胞(ML)根據(jù)Boyum A描述的方法分離單核白細(xì)胞(Isolation of mononuclear cells andgranulocytes from human blood，1968，Cand.J.Lab.Clin.Invest.，120(97)9-18)。
將15ml Ficoll-pack-solution放置在兩個圓錐形試管(Falcon)的每個中，接著將25ml兩倍稀釋于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的血液加到Ficoll上。之后在Baket-Rotor中將試管以400×g于20℃離心30分鐘。不使用含血漿的上相。
小心地用移液管吸取濃縮于血漿和分離介質(zhì)之間界面的單核白細(xì)胞(ML)，并收集在離心管中。隨后，通過以250×g離心10分鐘用PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后將它們懸浮在培養(yǎng)基中，該組分包含10-30％的單核細(xì)胞和80-90％的淋巴細(xì)胞，將其在下文中稱為“淋巴細(xì)胞”。淋巴細(xì)胞的一部分用于研究本發(fā)明的生物活性血清的促有絲分裂活性，另一部分用于研究增殖。為了該目的，將植物血凝素(Phytohemaglutinine)以20mg/ml的濃度加入到細(xì)胞懸液中。
細(xì)胞中脫氧核糖核酸合成(DNA)量的評價為了評價DNA的合成，將3H-胸腺嘧啶加入到細(xì)胞中，評價酸不溶性組分摻入的計數(shù)。簡而言之，在96孔細(xì)胞板中用包含200至800×103個細(xì)胞的200μl培養(yǎng)基培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，向每孔中加入不同濃度的本發(fā)明的生物活性血清。在培養(yǎng)結(jié)束前兩小時，加入3H-胸腺嘧啶(1μCi/孔，40mCi/mmol/l)。為了放射性分析試驗，用自動收集細(xì)胞的裝置將細(xì)胞收集在過濾器上。用5％三氟乙酸(H2O)洗除酸溶性產(chǎn)物，用閃爍測量儀測定保留物質(zhì)的放射性。以計數(shù)/分鐘測量DNA生物合成的量。
使用MTT試驗確定與不同物質(zhì)一起培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率。
如Mosmann T.描述的方法進(jìn)行MTT試驗(Rapid colorimetric assay forcellular growth and survivalapplication to proliferation and cytotoxicity assays(1983)J Immunol.Meth.6555-63)。
收集對數(shù)期的細(xì)胞(當(dāng)它們充滿了約一半的細(xì)胞培養(yǎng)板時，收集貼壁的細(xì)胞)進(jìn)行試驗。將它們放置在Gorjaew-chamber中的生長培養(yǎng)基中，計數(shù)并以50-100×106/ml的濃度重新懸浮于培養(yǎng)基中。在加入總量為100μl的多種濃度的試驗組分后，將細(xì)胞溶液置入96孔板中。為了計數(shù)活細(xì)胞，在培養(yǎng)結(jié)束后，將3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)的培養(yǎng)基溶液加入到每個不同的96孔板中。為了制備MTT溶液，將1ml MTT貯液與4ml培養(yǎng)基混合。MTT貯液的制備是將MTT以5mg MTT/ml的濃度溶于PBS(PBS含0.01mmol/l磷酸鈉緩沖溶液，pH 7.4，和0.15mmol/l NaCl)中，之后用孔徑為0.45μm的過濾器過濾。該貯液可儲存在+4℃下長達(dá)1月。在加入MTT溶液后，在恒溫箱中于相同條件下進(jìn)一步培養(yǎng)組織培養(yǎng)板4小時。下一步是用泵吸取移除培養(yǎng)基，向每孔中加入150μl二甲基亞砜(DMSO)以溶解已經(jīng)形成的藍(lán)色甲臜(formazan)晶體，用微板閱讀儀用多通道分光光度計在540nm波長下(Labsystem)檢測每孔中溶液的光密度。與加入的試驗組分1和2的濃度分別相關(guān)的細(xì)胞存活率以對照細(xì)胞的存活百分率標(biāo)出。用計算機(jī)軟件″Origin″處理數(shù)據(jù)。
結(jié)果和討論結(jié)果描述于圖1-8。根據(jù)這些結(jié)果，可得出以下內(nèi)容高濃度(2.5-20mg/ml)的本發(fā)明的生物活性血清對所有細(xì)胞系具有抑制作用，然而，來自不同組織類型的細(xì)胞對試驗組分1和2的反應(yīng)分別是不同的。在細(xì)胞系之間IC50劑量(導(dǎo)致50％的細(xì)胞抑制的物質(zhì)濃度)基本上不同，試驗物質(zhì)1為2.2(Jurkat)至＞20mg/ml(Mg63)，本發(fā)明的血清的可溶性組分(試驗組分2)為3.6(外周血淋巴細(xì)胞)至＞20mg/ml(Mg63和HeLa)。對于所有的細(xì)胞系，起始物質(zhì)(試驗組分1)的毒性都高于可溶性物質(zhì)(試驗物質(zhì)2)的毒性。然而，應(yīng)當(dāng)提及的是對于兩種試驗組分在各細(xì)胞系中觀察到的毒性幾乎相同(Mg63、Rajii、外周血淋巴細(xì)胞)，而對于另一些(Jurkat、MCG-7、IMR-32)IC50值卻存在2-3倍的差別。相對于常規(guī)的癌癥藥多柔比星而言，細(xì)胞對試驗組分的敏感度描述于表7中。
表7受試細(xì)胞系對多柔比星的敏感度

備注*-mmol/l＝0.58mg/ml**-沒有檢測對多柔比星的敏感度。
此外，觀察到在0.3至3mg/ml濃度范圍內(nèi)根據(jù)細(xì)胞系和物質(zhì)形式(即試驗組分1或試驗組分2)所述藥劑對一些細(xì)胞有刺激效應(yīng)。已觀察到本發(fā)明的血清對Jurkat、Raji、Bro B-19、Mg63、HT1080和HepG2細(xì)胞的刺激效應(yīng)。對于兩種形式的試驗物質(zhì)，該刺激效應(yīng)不顯著(10，20，40％)，但都存在。對于細(xì)胞系HeLa、MCF-7、JMR-32的細(xì)胞和對于外周血淋巴細(xì)胞沒有觀察到刺激。與可溶性組分(試驗組分2)相比，在更低的濃度下觀察到第一種形式的受試物質(zhì)的刺激效應(yīng)。這種刺激的可能原因并不是刺激增殖，而是增加了細(xì)胞呼吸，這也可用評價細(xì)胞存活率的MTT方法檢測到。觀察得到的刺激效果是由于刺激增殖還是由于呼吸增加的問題還需要進(jìn)一步的研究。
當(dāng)研究不同的物質(zhì)與免疫活性細(xì)胞之間相互作用時，通常至少必須討論兩個問題1.受試物質(zhì)是否具有促有絲分裂活性，即其是否具有刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力(在這種情況下，所述物質(zhì)量的增加通常導(dǎo)致淋巴細(xì)胞DNA生物合成的增加，這可通過摻入3H-胸腺嘧啶來評價)？2.受試物質(zhì)是否具有毒性(這個問題通常通過淋巴細(xì)胞增殖抑制來確定，如通過摻入3H-胸腺嘧啶的量或使用MTT類型的活體染料對預(yù)先用絲裂原刺激的淋巴細(xì)胞來測試)？而且，必須提及未活化的淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)中不增殖，增殖量僅隨著加入到培養(yǎng)基中絲裂原的增加量而增加。這反映為放射性標(biāo)記DNA的增加。
與給藥劑量相關(guān)的絲裂原對淋巴細(xì)胞的這種效應(yīng)可通過所謂的″鐘形曲線″來描述(參見圖9)。鐘形曲線的第一部分反映出絲裂原濃度的范圍，其中絲裂原增加導(dǎo)致增殖增加(通過DNA生物合成測定)，因而存在絲裂原濃度和增殖之間的直接相關(guān)性。曲線的第二部分(2)顯示飽和效應(yīng)，其中絲裂原濃度的進(jìn)一步增加不導(dǎo)致增殖的進(jìn)一步增加，即絲裂原已經(jīng)表現(xiàn)出了最大作用。沒有觀察到細(xì)胞毒活性。第3部分顯示絲裂原濃度的范圍，其中絲裂原對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生逐漸增加的毒性作用。
在兩個實驗中評價試驗組分1和2的促有絲分裂活性1.本實驗的主題是確定試驗組分對人外周血未活化的淋巴細(xì)胞的影響。就此來說確定增殖活性(即作用)與給藥劑量之間的關(guān)系。
2.本實驗的主題是確定第二階段中試驗物質(zhì)對由植物血凝素(FHA 20g/ml)活化的淋巴細(xì)胞的DNA合成量的影響。
當(dāng)檢查物質(zhì)時，沒有觀察到促有絲分裂活性，即在物質(zhì)濃度范圍為0.1-100mg/ml內(nèi)，沒有觀察到對外周血淋巴細(xì)胞DNA生物合成的刺激(圖10)。
當(dāng)試驗組分的劑量增加時，外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量沒有顯著改變。當(dāng)評價試驗組分對隨后已經(jīng)用20mg/ml FHA活化的淋巴細(xì)胞的影響時，觀察到試驗組分對活化淋巴細(xì)胞的抑制。
在實驗中確定0.3mg/ml濃度的試驗組分抑制受刺激的淋巴細(xì)胞的DNA生物合成(圖11)。然而，仍舊需要確定作用機(jī)理。因此，闡明細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞毒效應(yīng)的進(jìn)一步試驗是重要的。
為了確定在細(xì)胞培養(yǎng)中得到的結(jié)果與治療人對象的相關(guān)性如何，在動物實驗中確定在不同的器官或組織中物質(zhì)的濃度是重要的。在本文中，重要的是研究本發(fā)明的生物活性血清的哪些不同濃度能影響參與淋巴生成的器官的DNA合成。因此，重要的是確定生物活性血清的濃度，尤其是在小鼠的骨髓、脾臟和胸腺中的濃度。
除了淋巴細(xì)胞外，也使用鋪展成單細(xì)胞層的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞來研究本發(fā)明血清的細(xì)胞毒活性。因為接觸抑制，沒有觀察到這些細(xì)胞增殖。在這樣的模型中，物質(zhì)的毒性效應(yīng)可以確定，可以區(qū)分細(xì)胞毒效應(yīng)和細(xì)胞生長抑制效應(yīng)。當(dāng)使用該模型時，確定2.5mg/ml的本發(fā)明血清具有細(xì)胞毒效應(yīng)，而不依賴于本發(fā)明血清的不溶性組分是否除去，即不依賴于是使用試驗組分1還是使用試驗組分2。
應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)本發(fā)明血清與增殖細(xì)胞一起培養(yǎng)時，毒性作用顯著降低，這可能與以下事實相關(guān)對于增殖細(xì)胞而言在給藥后24小時而非在給藥后72小時測定這種效應(yīng)(延長培養(yǎng)單層細(xì)胞可導(dǎo)致對照細(xì)胞死亡)。
上述結(jié)果表明本發(fā)明的生物活性血清具有細(xì)胞生長抑制效應(yīng)和細(xì)胞毒活性。雖然在相同濃度下觀察到細(xì)胞毒和細(xì)胞生長抑制活性，然而細(xì)胞毒活性沒有那么明顯。
總體來說，與對照組相比，來自用II-III級電擊處理的動物的血清和隨后制備的生物活性物質(zhì)導(dǎo)致人細(xì)胞系Jurkat、Raji、Bro B-19、Mg63、HT1080和HepG2的增殖增加10-40％。在HeLa、MCF-7、JMR-32和外周血淋巴細(xì)胞中，本發(fā)明生物活性血清在更高劑量(2.5-20mg/ml)下表現(xiàn)出對所有測試的人癌細(xì)胞系增殖的顯著抑制。這些細(xì)胞對本發(fā)明的生物活性血清的敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對廣泛使用的抗癌藥多柔比星的敏感度。而且，當(dāng)使用通過3H-胸腺嘧啶摻入評價的DNA生物合成作為標(biāo)記物時，本發(fā)明的物質(zhì)具有細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞毒效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.制備生物活性血清的方法，包括下列步驟a)電刺激非人類動物，b)從所述動物抽取血液，c)從所述血液中分離血清，和d)γ照射所述血清。
2.權(quán)利要求1的方法，其中非人類動物選自哺乳動物和鳥類。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述鳥類選自雞、鴨、鵝、鴕鳥和鵪鶉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中在步驟a)中電刺激的是頭、頸、軀干和/或一個或多個肢體，優(yōu)選頭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中實施電刺激的時間段為1至60秒，優(yōu)選1至30秒，更優(yōu)選2至10秒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中實施電刺激的電壓為50V至150V，優(yōu)選80V至120V，更優(yōu)選110V至120V。
7.根據(jù)權(quán)利要1至6中任一項的方法，其中實施電刺激的電流為0.01A至0.4A，優(yōu)選0.02A至0.1A，更優(yōu)選0.04A至0.06A。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其中實施電刺激的頻率為10至200Hz，優(yōu)選20至100Hz，更優(yōu)選45至55Hz。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中給予所述γ照射的吸收照射劑量為15至35kGy，優(yōu)選為20至30kGy。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其中γ照射源選自60Co、137Cs、67Cu、67Ga、111In、192Ir、99mTc和170Tm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中該方法還包括在步驟c)之前孵育所述血液的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其中所述方法還包括在步驟d)之前冷凍干燥所述血清的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其中所述血液為動脈和/或靜脈血。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的方法生產(chǎn)的血清。
15.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求14的血清和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑；載體；賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑；和/或防腐劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中該組合物配制成糖漿、輸注液或注射液、片劑、膠囊、囊片、錠劑、脂質(zhì)體、栓劑、硬膏劑、繃帶、緩釋膠囊、粉劑或緩釋制劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的藥物組合物，其中稀釋劑為水、緩沖液、緩沖鹽溶液或鹽溶液。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17的藥物組合物，其中所述載體選自可可脂和vitebesole。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的血清或根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項的藥物組合物在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，所述疾病或病癥可受需要治療的患者腦中環(huán)單磷酸腺苷含量增加的影響。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的血清或根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項的藥物組合物在制備用于改善認(rèn)知和/或?qū)W習(xí)能力、尤其是改善長期記憶的藥物中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的血清或根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項的藥物組合物在制備用于治療發(fā)作、尤其是癲癇發(fā)作的藥物中的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求14的血清或根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項的藥物組合物在制備用于治療神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求14的血清或根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項的藥物組合物在制備用于治療增殖性疾病和中風(fēng)的藥物中的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述增殖性疾病選自胃腸道或結(jié)腸直腸道、肝臟、胰、腎、膀胱、甲狀腺、前列腺、子宮內(nèi)膜、宮頸、卵巢、子宮、睪丸、皮膚、口腔的癌變；黑素瘤；口腔粘膜發(fā)育異常；侵入性口腔癌；小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌；乳房腫瘤，尤其是激素依賴性乳腺癌和非激素依賴性乳腺癌；移行細(xì)胞癌和扁平細(xì)胞癌；神經(jīng)惡性腫瘤，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、骨肉瘤、腦膜瘤；軟組織肉瘤；血管瘤和內(nèi)分泌腫瘤，尤其是垂體腺瘤；嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、血液癌變，尤其是淋巴瘤和白血病。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中增殖性疾病包括與以下細(xì)胞系相似的細(xì)胞人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raj、人黑素瘤細(xì)胞系Bro、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人腺癌細(xì)胞系MCF-7、骨肉瘤細(xì)胞系Mg63、纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和肝癌細(xì)胞系HepG2。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25的用途，其中給予需要治療的患者的藥物量為50至150mg/kg體重，優(yōu)選90至100mg/kg體重。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備血清產(chǎn)品的方法、血清產(chǎn)品和包含所述血清產(chǎn)品的藥物組合物，以及其在治療包括癲癇發(fā)作和中風(fēng)的多種疾病和病癥中的用途。
文檔編號A61P25/00GK1893961SQ200480037682
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者維塔利·A·舍斯塔科夫 申請人:歐文控股有限公司