專利名稱：免疫原性肽載體結(jié)合物及其生產(chǎn)方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求根據(jù)35 U.S.C.§119(e)在2003年12月17日提交的美國臨時(shí)專利申請60/530,480的優(yōu)先權(quán)，其在此整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
適應(yīng)性免疫的實(shí)質(zhì)是生物體對存在對外來物質(zhì)作出反應(yīng)和產(chǎn)生能夠與宿主特異性相互作用并保護(hù)宿主免受侵害的組分(抗體和細(xì)胞)?！翱乖盎颉懊庖咴笔悄芤l(fā)此類免疫應(yīng)答以及能夠與致敏細(xì)胞和產(chǎn)生的針對該抗原的抗體相互作用的物質(zhì)。
抗原或免疫原通常是包含被免疫系統(tǒng)的各種組分識(shí)別和與之相互作用的獨(dú)特抗原性位點(diǎn)或“抗原表位”的大分子。它們可以作為單獨(dú)的分子存在，所述分子由合成的有機(jī)化學(xué)產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、脂蛋白、糖蛋白、RNA、DNA或多糖組成；或者可以是細(xì)胞結(jié)構(gòu)(細(xì)菌或真菌)或病毒的部分(Harlow和泳道1988 a，b，c；Male等，1987)。
小分子樣短肽，盡管通常能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物相互作用，通常不能獨(dú)自引起應(yīng)答。這些肽免疫原或“半抗原”如它們的名稱一樣，實(shí)際上是不完全的抗原，并且，盡管不能夠單獨(dú)導(dǎo)致免疫原性或引發(fā)抗體產(chǎn)生，但是它們可以通過與合適的載體連接而產(chǎn)生免疫原性。載體通常是高分子量蛋白質(zhì)抗原，當(dāng)體內(nèi)施用后能引起免疫應(yīng)答。
在免疫應(yīng)答中，抗體由B-淋巴細(xì)胞連同T-輔助(TH)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。在大多數(shù)半抗原載體系統(tǒng)中，B-細(xì)胞產(chǎn)生對半抗原和載體具有特異性的抗體。在這些情況下，所述T淋巴細(xì)胞具有對載體的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但是不能單獨(dú)識(shí)別半抗原。以一種協(xié)同作用，B和T-細(xì)胞協(xié)作誘發(fā)半抗原特異性抗體應(yīng)答。在發(fā)生這樣的免疫應(yīng)答后，如果宿主隨后僅被所述半抗原攻擊，通常其應(yīng)答方式為從首次免疫后形成的記憶細(xì)胞產(chǎn)生半抗原特異性抗體。
模擬較大的大分子上一些關(guān)鍵的表位結(jié)構(gòu)的合成半抗原通常結(jié)合到載體以產(chǎn)生對更大“母體”分子的免疫應(yīng)答。例如，短肽片段可以從蛋白質(zhì)的已知序列合成并連結(jié)到載體以誘導(dǎo)針對天然蛋白質(zhì)的免疫原性。此類產(chǎn)生免疫原的合成方法已成為許多當(dāng)前疫苗制造研究的基礎(chǔ)。然而，在許多情況下，僅僅通過使用合成肽載體結(jié)合物產(chǎn)生B-細(xì)胞應(yīng)答不能總是保證對于完整抗原的保護(hù)性免疫，盡管設(shè)計(jì)得非常好。通過來自較大的病毒顆?；蚣?xì)菌細(xì)胞的短肽抗原表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可能只夠產(chǎn)生B-細(xì)胞水平的記憶。在這些情況下，目前通常認(rèn)為細(xì)胞毒性T-細(xì)胞應(yīng)答是保護(hù)性免疫更重要的指示。設(shè)計(jì)具有用于B-細(xì)胞和T-細(xì)胞識(shí)別的合適表位結(jié)合位點(diǎn)的肽免疫原是當(dāng)今免疫學(xué)最具挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域之一。
通過將較小或免疫原性差的分子結(jié)合到較大的“載體”分子以增加這些分子的免疫原性的方法已經(jīng)成功使用了幾十年(參見，例如Goebel等(1939)J.Exp.Med.6953)。例如，已經(jīng)描述許多免疫原性組合物，其中純化的莢膜聚合物與載體蛋白結(jié)合以通過利用這種“載體效應(yīng)”產(chǎn)生更有效的免疫原性組合物，Schneerson等(1984)Infect.Immun.45582-591)。結(jié)合作用還顯示規(guī)避通常用自由多糖免疫嬰兒時(shí)觀察到的較弱的抗體應(yīng)答(Anderson等(1985)J.Pediatr.107346；Insel等(1986)J.Exp.Med.158294)。
使用各種交聯(lián)/結(jié)合試劑比如同型雙功能，異型雙功能，或零長度交叉接頭已經(jīng)成功產(chǎn)生了半抗原-載體結(jié)合物。許多這樣的方法目前可適用于糖類、蛋白質(zhì)和肽與肽載體的結(jié)合。大多數(shù)的方法產(chǎn)生胺、酰胺、氨基甲酸乙酯、異硫脲或二硫鍵或有時(shí)產(chǎn)生硫醚。使用結(jié)合試劑的缺點(diǎn)是活性部位如果不被中和則自由地與任何不需要的分子體外(從而對結(jié)合物的功能或穩(wěn)定性造成負(fù)面影響)或者體內(nèi)(從而對用該制劑免疫的人或動(dòng)物帶來負(fù)面事件的潛在危險(xiǎn))反應(yīng)，所述結(jié)合試劑向載體和/或半抗原分子上活性的氨基酸分子側(cè)鏈引入活性部位。這種過量的活性部位可以利用各種已知的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)或“加帽”以使這些位點(diǎn)失活，但是這些反應(yīng)可能破壞結(jié)合物的功能。當(dāng)試圖通過將活性部位引入載體分子中時(shí)可能特別成問題，因?yàn)槠漭^大和更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)(相對于半抗原)可能使其對于化學(xué)處理的破壞性作用更敏感。事實(shí)上，還沒有通過如下方法制備結(jié)合物的已知實(shí)例首先活化載體，然后在結(jié)合反應(yīng)中與半抗原反應(yīng)，最后對剩余的活性部位“加帽”，同時(shí)保留所得到的結(jié)合物作為具有所需的“載體效應(yīng)”性質(zhì)的免疫原性組合物的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)肽免疫原與蛋白質(zhì)/多肽載體的免疫原性結(jié)合物的方法，其中所述肽免疫原通過載體氨基酸殘基比如賴氨酸殘基的衍生官能團(tuán)結(jié)合到載體，其中氨基酸殘基任何未結(jié)合的衍生的官能團(tuán)通過加帽而失活以阻止它們與其它的分子，包括蛋白質(zhì)/多肽的反應(yīng)從而保留載體的功能，使其維持其引發(fā)針對肽免疫原的所需的免疫應(yīng)答，沒有載體則不會(huì)產(chǎn)生該免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明還涉及通過上述方法制備的結(jié)合物和含有這種結(jié)合物的免疫原性組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于通過肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)將肽免疫原與具有一種或者多種官能團(tuán)的蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合的第一種方法，所述方法包括以下步驟(a)衍生蛋白質(zhì)/多肽載體的一個(gè)或者多個(gè)官能團(tuán)以產(chǎn)生具有活性位點(diǎn)的衍生化分子；(b)使步驟(a)的衍生化的蛋白質(zhì)/多肽載體與肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)在滿足以下情況的反應(yīng)條件下反應(yīng)使肽免疫原與衍生的蛋白質(zhì)/多肽載體經(jīng)官能團(tuán)結(jié)合；和(c)進(jìn)一步將結(jié)合物與加帽試劑反應(yīng)以使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上的自由活性官能團(tuán)失活，從而保留載體針對肽免疫原的官能度，沒有載體則不會(huì)產(chǎn)生這一官能度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體選自人血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PAN-DR結(jié)合肽(PADRE多肽)，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎B表面抗原(HBsAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，CalmetteGuerin(BCG)，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)ORF 1224，化膿鏈球菌ORF 1664，化膿鏈球菌ORF 2452，肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)ORF T367，肺炎衣原體ORF T858，破傷風(fēng)類毒素，HIV gp 120 T1，識(shí)別粘性基質(zhì)分子的微生物表面組分(MSCRAMMS)，生長因子/激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
在另一實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體包含T-細(xì)胞抗原表位。
在另一實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體是細(xì)菌類毒素，比如上述的破傷風(fēng)類毒素，霍亂毒素或霍亂菌毒素突變體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體是CRM197。
在另一實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體可以是流感血凝素，PADRE多肽，瘧疾CS蛋白，乙型肝炎表面抗原(HSBAg19-28)，熱休克蛋白65(HSP 65)，或來自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(BCG)的多肽。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體選自鏈球菌的rC5a肽酶，化膿鏈球菌ORF 1224，化膿鏈球菌ORF 1664或化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體ORF T367和肺炎衣原體ORF T858。
在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)/多肽載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽免疫原選自細(xì)菌蛋白，病毒蛋白，和真核生物蛋白。
在另一實(shí)施方案中，所述肽免疫原源自于來自肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphlylococcusepidermidis)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，大腸桿菌(Esherichia coli)，克雷伯腸桿菌(Klebsiella enterobacter)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，產(chǎn)氣夾膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)，肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)，假單孢菌類(Pseudomonas)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，包氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)，鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysentriae)，耳炎差異球菌(Alloiococcus otitidis)和B類鏈球菌(streptococci)的細(xì)菌蛋白抗原。
在另一實(shí)施方案中，所述肽免疫原源自于來自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)的蛋白質(zhì)抗原。
在另一實(shí)施方案中，所述肽免疫原源自于來自念珠菌(Candida)，隱球菌(Cryptococcus)，球孢菌(Coccidioides)，組織漿菌(Histoplasma)和曲霉(Aspergillus)真菌的蛋白質(zhì)抗原。
在另一實(shí)施方案中，所述肽免疫原源自于來自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲的寄生動(dòng)物的蛋白質(zhì)抗原。
在另一實(shí)施方案中，所述肽免疫原源自于真核生物的蛋白質(zhì)抗原。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真核生物是人。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述來自人的肽免疫原來源于惡性腫瘤。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽免疫原來自于腎細(xì)胞癌，乳癌，黑素瘤和前列腺癌的腫瘤抗原。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽抗原源自于腫瘤抗原，癌胚抗原(CEA)。
在一方面，本發(fā)明提供了肽免疫原，包括引發(fā)針對Aβ內(nèi)某些抗原表位的免疫原性應(yīng)答的Aβ肽或其片段或其類似物。本發(fā)明的免疫原性肽包括免疫原性的異源肽。在一些免疫原性肽中，Aβ片段與載體連接形成免疫原性的異源肽，然后使用本發(fā)明的方法將這個(gè)異源肽與載體連接形成結(jié)合物。
在本發(fā)明的另一方面，所述肽免疫原多肽包含至少Aβ1-5位殘基的N-末端片段，Aβ的第一個(gè)殘基是多肽的N-末端殘基，其中多肽沒有Aβ的C-末端片段。在本發(fā)明的另一方面，肽免疫原是包含AβN-末端片段的多肽，該片段起始于Aβ的1-3位殘基并終止于7-11位殘基。在本發(fā)明的一些方面，肽免疫原是一種因子，其誘導(dǎo)針對AβN-末端片段的免疫原性應(yīng)答，所述片段開始于Aβ的1-3位殘基并終止于Aβ的7-11殘基，而不誘導(dǎo)針對Aβ43的12-43位殘基內(nèi)的抗原表位的免疫原性應(yīng)答。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，肽免疫原是異源多肽，包含連接到異源氨基酸序列的Aβ片段，其誘導(dǎo)針對所述異源氨基酸序列的T輔助細(xì)胞的應(yīng)答并從而誘導(dǎo)針對N-末端片段的B-細(xì)胞應(yīng)答。
在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其C-末端連接到異源多肽。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其N-末端連接到異源多肽。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其N-末端和C-末端連接到第一和第二異源多肽。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其N-末端連接到異源多肽，而其C-末端連接到至少一種N-末端片段的另外的拷貝。在一些肽免疫原中，從N-末端到C-末端，所述多肽包括Aβ的N-末端片段，N-末端片段多個(gè)另外的拷貝，和異源氨基酸片段。
在一些上述肽免疫原中，所述多肽還包含N-末端片段至少另外一個(gè)拷貝。在一些上述肽免疫原中，所述片段缺少Aβ43中的至少5個(gè)C-末端氨基酸。
在上述肽免疫原的一些方面，所述片段最多包含來自Aβ的10個(gè)連續(xù)的氨基酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了肽免疫原，包含引發(fā)針對Aβ內(nèi)某些抗原表位的免疫原性應(yīng)答的Aβ肽或Aβ的片段或其類似物，這些肽免疫原可以處于稱為多抗原肽(MAP)構(gòu)象的構(gòu)象。
在本發(fā)明一些上述方面，所述肽免疫原來自Aβ的N-末端部分。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是Aβ片段，選自Aβ1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-10，1-11，1-12，1-16，3-6和3-7。在本發(fā)明一些上述方面，所述肽免疫原來自Aβ的內(nèi)部區(qū)域。在本發(fā)明一些上述方面，所述肽免疫原是選自Aβ13-28，15-24，17-28和25-35的Aβ片段。在本發(fā)明一些上述方面，所述肽免疫原來自Aβ的C-末端。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自Aβ33-42，35-40和35-42的Aβ片段。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自Aβ1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-10，1-11，1-12，1-16，1-28，3-6，3-7，13-28，15-24，17-28，25-35，33-42，35-40和35-42的Aβ片段。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原選自Aβ1-5，Aβ1-7，Aβ1-9和Aβ1-12的Aβ片段。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自Aβ1-5-L，Aβ1-7-L，Aβ1-9-L和Aβ1-12-L的Aβ片段，其中L是接頭。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自Aβ1-5-L-C，Aβ1-7-L-C，Aβ31-9-L-C和Aβ1-12-L-C的Aβ片段，其中C是半胱氨酸氨基酸殘基。
在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自Aβ16-22，Aβ16-23，Aβ17-23，Aβ1 7-24，Aβ18-24和Aβ18-25的Aβ片段。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自Aβ16-22-C，Aβ16-23-C，Aβ17-23-C，Aβ17-24-C，Aβ18-24-C和Aβ18-25-C的Aβ片段，其中C是半胱氨酸氨基酸殘基。在本發(fā)明的一些方面，所述肽免疫原是選自C-Aβ16-22，C-Aβ16-23，C-Aβ17-23，C-Aβ17-24，C-Aβ18-24和C-Aβ18-25的Aβ片段，其中C是半胱氨酸氨基酸殘基。
在一些上述肽免疫原中，所述異源多肽選自具有T-細(xì)胞表位，B-細(xì)胞表位及其組合的肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用交聯(lián)試劑衍生所述蛋白質(zhì)/多肽載體或任選連接的多肽接頭的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸分子的官能團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述衍生試劑是零長度交聯(lián)試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述衍生試劑是同型雙功能交聯(lián)試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述衍生試劑是異型雙功能交聯(lián)試劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異型雙功能試劑是與蛋白質(zhì)/多肽載體的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸分子的伯胺或ε-胺官能團(tuán)反應(yīng)，或與肽免疫原的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸分子的側(cè)基巰基反應(yīng)的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異型雙功能試劑是N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯。
在另一個(gè)實(shí)施方案，所述伯胺或ε-胺官能團(tuán)是賴氨酸。在另外的實(shí)施方案中，用N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯衍生蛋白質(zhì)/多肽載體的賴氨酸的伯胺或ε胺官能團(tuán)導(dǎo)致蛋白質(zhì)/多肽載體上賴氨酸分子的伯胺或ε胺殘基的溴乙酸化。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，側(cè)基巰基是肽免疫原的胞嘧啶殘基，其可以定位在肽免疫原的氨基末端，肽免疫原的羧基末端或肽免疫原內(nèi)部。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述側(cè)基巰基通過巰基化試劑比如N-乙酰同型半胱氨酸巰基內(nèi)酯，Traut氏試劑(2-亞胺基四氫噻吩)SATA(N-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯)，SMPT(4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-甲基2-吡啶基二硫代甲苯)，硫代LC SPDP(硫代琥珀酰亞胺基吡啶基二硫代丙酰氨基己酸酯)，SPDP(琥珀酰亞胺基吡啶基二硫代丙酸酯)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述用于使活化的/多肽載體上的自由活性官能團(tuán)失活的加帽試劑選自半胱胺，N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述用于使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上的自由活性官能團(tuán)失活的加帽試劑選自氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫銨和氨。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)是自由巰基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或者多個(gè)官能團(tuán)位于任選連接到所述蛋白質(zhì)/多肽載體的接頭上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接頭是肽接頭。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽接頭是聚賴氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于將蛋白質(zhì)/多肽的肽免疫原與具有以下結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合的第二方法 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，X是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，其中m是大于0但是小于等于85的整數(shù)，所述方法包括下列步驟(a)衍生蛋白質(zhì)/多肽載體或任選連接的接頭分子的一個(gè)或者多個(gè)官能團(tuán)以產(chǎn)生具有活性位點(diǎn)的衍生化分子；(b)將步驟(a)的衍生化蛋白質(zhì)/多肽載體與肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)結(jié)合的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物；和(C)另外將上述結(jié)合物與加帽試劑反應(yīng)以使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上自由活性官能團(tuán)失活，從而使加帽的基團(tuán)不與其它的分子，包括蛋白質(zhì)/多肽自由地反應(yīng)從而維持載體的官能度，使其維持引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生，從而產(chǎn)生具有以下通式的加帽的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)載體氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)，n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，P是大于0但是小于85的整數(shù)。
上述第一方法的詳細(xì)實(shí)施方案還可以用于根據(jù)第二方法的描述制備的結(jié)合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物，其中的蛋白質(zhì)/多肽載體具有如下通式
其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，X是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基上的可衍生官能團(tuán)，其中m是大于0但是小于等于85的整數(shù)，其中加帽的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物具有如下通式 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體；Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生的官能團(tuán)，以及，其中P是肽免疫原分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)載體氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，由此維持載體的官能度，從而維持其引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生；n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，p是大于0但是小于85的整數(shù)。
所述第一和第二方法的詳細(xì)實(shí)施方案也可用于上面所述的結(jié)合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第二方法產(chǎn)生的具有以下通式的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，以及，其中P是肽免疫原分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)載體氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，從而保持載體的官能度，以便維持其引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生，n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，p是大于0但是小于85的整數(shù)。
所述第二方法的詳細(xì)實(shí)施方案也可用于根據(jù)第二方法產(chǎn)生的結(jié)合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫原性組合物，包含通過本發(fā)明第二方法產(chǎn)生的肽免疫原與蛋白質(zhì)/多肽載體的結(jié)合物，加上一種或者多種藥用賦形劑、稀釋劑和佐劑。
所述第二方法和通過這種方法產(chǎn)生的結(jié)合物的詳細(xì)實(shí)施方案也可用于含有這些結(jié)合物的上述免疫原性組合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物受試者免疫應(yīng)答的方法，其包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物。
可用于含有本發(fā)明結(jié)合物的免疫原性組合物的詳細(xì)實(shí)施方案也可用于涉及這些免疫原性組合物的應(yīng)用方法的本發(fā)明的實(shí)施方案。


圖1顯示了用于將Aβ肽片段與蛋白質(zhì)/多肽載體CRM197結(jié)合形成Aβ/CRM197結(jié)合物的化學(xué)過程的流程圖。
圖2顯示了用于定量測定S-羧基甲基半胱氨酸和S-羧基甲基半胱胺作為肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽結(jié)合物例如Aβ/CRM197結(jié)合物的結(jié)合程度的評價(jià)的流程圖。
圖3該圖顯示了Aβ肽/CRM結(jié)合反應(yīng)的pH依賴性。
圖4該圖顯示了Aβ-肽/CRM結(jié)合對肽CRM比例的依賴性。
圖5Aβ1-7/CRM結(jié)合的加帽過程的驗(yàn)證。反應(yīng)的pH為9.15。與肽的反應(yīng)時(shí)間為16hr，用N-乙酰半胱胺加帽為8hr。
圖6與不同的肽以不同的CRM肽比例進(jìn)行結(jié)合和加帽。反應(yīng)的pH為9.0。與肽的反應(yīng)時(shí)間為16hr，用N-乙酰半胱胺加帽的時(shí)間為8hr。
圖7用Aβ肽結(jié)合物與不同的佐劑免疫靈長類動(dòng)物后第36天的靈長類動(dòng)物血清的效價(jià)。
圖8用Aβ肽結(jié)合物與不同的佐劑免疫靈長類動(dòng)物后第64天的靈長類動(dòng)物的血清效價(jià)。
圖9按天數(shù)和處理組的靈長類動(dòng)物的效價(jià)。靈長類動(dòng)物用Aβ1-7或Aβ1-5CRM197結(jié)合物與明礬或529作為佐劑免疫，在第29、36、57和54天測量抗Aβ抗體的效價(jià)。
圖10利用tris-tricine預(yù)制凝膠使用SDS-PAGE Western印跡表征確定肽蛋白結(jié)合物。泳道排列如下分子量標(biāo)記(泳道1)；L-2837524/01(泳道2)；L-28375 24/02(泳道3)；L-28375 24/03(泳道4)；L-2837524/04(泳道5)；L-28375 24/05(泳道6)；L-28375 24/06(泳道7)；L-28375 24/07(泳道8)；L-28375 24/08(泳道9)；L-28375 24/09(模擬物)(泳道10)和BrAcCRM197(泳道11)。
序列的簡述



發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產(chǎn)生肽免疫原結(jié)合物的方法，其中的載體上在活化過程中產(chǎn)生的未反應(yīng)的活性官能團(tuán)通過使用加帽試劑比如N-乙酰半胱胺失活以阻止它們進(jìn)一步反應(yīng)。本發(fā)明還涉及通過那些方法產(chǎn)生的加帽的載體-肽免疫原結(jié)合物，并涉及包含上述結(jié)合物的免疫原性組合物。
通過結(jié)合作用提高小分子或免疫原性較差的分子比如糖類的免疫原性的方法已經(jīng)成功地使用了幾十年(參見，例如Goebel等(1939)J.Exp.Med.6953)，許多免疫原性組合物已經(jīng)被描述，其中純化的莢膜聚合物已經(jīng)結(jié)合到載體蛋白以通過利用“載體效應(yīng)”產(chǎn)生更有效的免疫原性組合物。例如，Schneerson等(J.Exp.Med.152361-376，1980)描述了產(chǎn)生對由該生物引起的侵襲性疾病的免疫力的流感嗜血桿菌(Haemophilus influetizae)b多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物。PRP(聚核糖基核糖醇磷酸酯，流感嗜血桿菌b的莢膜聚合物)已經(jīng)被證明比僅基于多糖的免疫原性組合物更有效(Chu等，(1983)Infect.Immun.40245；Schneerson等(1984)，Infect.Immun.45582-591)。結(jié)合作用還顯示規(guī)避了通常當(dāng)用自由多糖免疫嬰兒時(shí)觀察到的較弱的抗體應(yīng)答(Anderson等(1985)JPediatr.107346；Insel等(1986)J.Exp.Med.158294)。
使用細(xì)菌毒素或類毒素作為蛋白質(zhì)載體另外的優(yōu)點(diǎn)是在針對與莢膜聚合物有關(guān)的病原體的免疫的同時(shí)誘導(dǎo)了對毒素或類毒素的所需的免疫力，其中針對上述毒素或類毒素的人常規(guī)免疫接種(例如，破傷風(fēng)或白喉)是標(biāo)準(zhǔn)操作。
抗原決定簇/半抗原-載體結(jié)合物還用于產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體，該抗體可識(shí)別結(jié)合的半抗原上不連續(xù)的化學(xué)表位。所得到的單克隆抗體通常用來研究表位的結(jié)構(gòu)和天然蛋白質(zhì)之間的相互作用。在許多情況下，所述用于產(chǎn)生這些單克隆抗體的抗原決定簇/半抗原是代表較大的蛋白質(zhì)表面上重要的抗原性位點(diǎn)的小肽片段。用于產(chǎn)生抗原決定簇/半抗原-載體結(jié)合物的成功的載體的標(biāo)準(zhǔn)是潛在的免疫原性，存在用于與抗原決定簇/半抗原結(jié)合的合適的官能團(tuán)，在衍生后合理的溶解性能和沒有體內(nèi)毒性。
通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的結(jié)合物符合這些標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合物可以是使用此處描述的結(jié)合方法產(chǎn)生的任何穩(wěn)定的肽免疫原-載體結(jié)合物。使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生了所述結(jié)合物，其中具有以下結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)/多肽載體 被共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體，其中C是蛋白質(zhì)/多肽載體，X是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，其中m是大于0但是小于等于85的整數(shù)，被共價(jià)連接到肽免疫原，其中的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物具有如下通式 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體；，Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，p是肽免疫原，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體上的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭上氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基上的衍生官能團(tuán)，從而保持載體的官能度，以便維持其引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生，n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，P是大于0但是小于85的整數(shù)。
載體的選擇一些肽免疫原包含合適的表位用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但是太小而沒有免疫原性。在這個(gè)情況下，所述肽免疫原連接到合適的載體以幫助引發(fā)免疫應(yīng)答。在上述通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的肽免疫原-載體結(jié)合物的示意中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，肽免疫原通過載體自身的氨基酸殘基上的衍生的官能團(tuán)直線結(jié)合到上述載體上，或通過共價(jià)連接到載體的肽接頭上的衍生的官能團(tuán)間接結(jié)合到載體上。合適的蛋白質(zhì)/多肽載體包括，但是不限于，白蛋白(包括人血清白蛋白)，匙孔-血藍(lán)蛋白，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，破傷風(fēng)類毒素或來自其它的病原菌的減毒類毒素，包括突變體，比如白喉，E.coli，霍亂，或幽門螺桿菌(H.pylori)，或減毒的毒素衍生物。一種這樣的載體是與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白(SEQ ID NO.40)。
其它的載體包括結(jié)合到多個(gè)MHC等位基因的T-細(xì)胞表位，如至少全部的人MHC等位基因的75％。這樣的載體有時(shí)在本領(lǐng)域稱作“通用的T-細(xì)胞表位”。具有通用的T-細(xì)胞表位示例的載體包括流感嗜血桿菌HA307-319PKYVKQNTLKLAT(SEQ.ID NO.11)PAN-DR肽(PADRE肽) AKXVAAWTLKAAA(SEQ.ID NO.12)瘧疾CST3表位EKKIAKMEKASSVFNV(SEQ.ID NO.13)乙肝表面抗原HBAg19-28FELLTRILTI(SEQ.ID NO.14)熱休克蛋白65hsp65153-171QSIGDLIAEAMDKVGNEG
(SEQ.ID NO.15)Calmette-Guerin桿菌(BCG)QVHFQPLPPAVVKL(SEQ.ID NO.16)破傷風(fēng)類毒素TT830-844QYIKANSKFIGITEL(SEQ.ID NO.17)破傷風(fēng)類毒素TT947-967NNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ.ID NO.18)HIVgp120T1KQIINMWQEVGKAMY(SEQ.ID NO.19)CRM197參見“序列簡述”(SEQ IDNO.40)白蛋白片段 ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO41)用于刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答并可以與肽免疫原或半抗原結(jié)合的其它載體包括細(xì)胞因子，比如IL-1，IL-1α和β肽，IL-2，γINF，IL-10，GM-CSF和趨化因子，比如MIP1α和β以及RANTES。免疫原性肽還可以連接到增強(qiáng)透過組織的運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)/肽載體，如O′Mahony，WO97/17163和WO 97/17614的描述，其在此全文引作所有目的的參考。
另外的載體包括重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌ORFs 1224，1664和2452，肺炎衣原體ORFs T367和T858，生長因子和激素。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，載體蛋白是CRM197，初級(jí)序列具有一個(gè)氨基酸改變的白喉毒素?zé)o毒性突變體。由于單個(gè)核酸密碼子的改變，所述分子52位的氨基酸甘氨酸被谷氨酸取代。由于這個(gè)改變，所述蛋白質(zhì)缺乏ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性并變成無毒性的。其分子量為58,408Da。根據(jù)美國專利5,614,382的描述，通過重組表達(dá)產(chǎn)生大量的CRM197，上述專利在此引入作為參考。通過經(jīng)過賴氨酸殘基ε氨基連接進(jìn)行糖類以及肽與CRM197的結(jié)合反應(yīng)。通過數(shù)種商品可以確認(rèn)CRM197是B-細(xì)胞表位出色且安全的載體。
免疫原性肽此處使用的術(shù)語“肽免疫原”或“半抗原”是在其給藥到哺乳動(dòng)物后可以引發(fā)、促進(jìn)或被誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的任一蛋白質(zhì)或亞單位結(jié)構(gòu)/片段/類似物。尤其是，所述術(shù)語用來指來自任何來源(細(xì)菌/病毒或真核細(xì)胞)的多肽抗原決定簇，其可以使用此處公開的方法被結(jié)合到載體。這種多肽免疫原/抗原決定簇可以是病毒來源、細(xì)菌來源或真核細(xì)胞來源的決定簇。
來自細(xì)菌細(xì)胞的肽免疫原包括那些來源于細(xì)菌細(xì)胞表面或分泌性蛋白質(zhì)的肽免疫原，其可被用于基于蛋白質(zhì)的免疫原性組合物中。示例的菌株包括肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，克雷伯氏菌，假單孢菌，沙門氏菌，志賀氏菌，耳炎差異球菌和B類鏈球菌。
來自病毒的示例性肽免疫原包括作為例子的來源于人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，愛潑斯坦-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)的那些肽免疫原。
示例性真菌肽免疫原包括那些來源于白假絲酵母(Candidaalbicaiis)，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，組織漿菌和曲霉的肽免疫原。寄生蟲的抗原包括那些來源于瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲，利什曼原蟲等的肽抗原。
可以結(jié)合到載體用作預(yù)防、治療、防疫或改善各種人類疾病的免疫治療劑的示例性的真核生物肽免疫原包括以下的免疫原與腫瘤細(xì)胞有關(guān)的、來源于Aβ的39-43個(gè)氨基酸的肽，優(yōu)選42個(gè)氨基酸，所述Aβ是阿爾茨海默病(AD)特有的斑的主要成份(參見US 4,666,829；Glenner & Wong(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.1201131，Hardy(1984)TINS 201131；Hardy(1977)TINS 20154)，那些來源于糊精的淀粉樣蛋白肽，參與II型糖尿病的胰島細(xì)胞產(chǎn)生的多肽物質(zhì)，來源于低密度脂蛋白基因產(chǎn)物的肽，其已知與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)和來源于炎性細(xì)胞因子和生長因子比如白介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和GDF-8的抗原性肽。這樣的真核生物肽免疫原可以包括T-細(xì)胞(CTL)或B-細(xì)胞表位。
“CTL表位”是一種來源于潛在的靶抗原所選定的表位區(qū)域的表位，比如腫瘤相關(guān)抗原包括但不限于腎細(xì)胞癌，乳癌，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原，和前列腺癌特異性抗原比如前列腺特異性膜抗原(PSMA)和前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)，丙型肝炎抗原，Aβ，也稱作β淀粉樣肽或A4肽(參見，US4,666,829；Glenner &Wong，Biochem.Biophys.Res.Commun.，120，1131(1984))是39-43個(gè)氨基酸的肽，其是阿爾茨海默病特有的斑的主要成份。通過用兩種稱作β和γ分泌酶(secretases)(參見Hardy，TINS 20，154(1997))的酶加工較大的蛋白ABP而產(chǎn)生Aβ。APP中已知與阿爾茨海默病有關(guān)的突變發(fā)生在β或γ分泌酶位點(diǎn)附近或發(fā)生在Aβ內(nèi)。例如，717位點(diǎn)在γ分泌酶切割A(yù)PP加工為Aβ的位點(diǎn)附近，670/671位點(diǎn)在β分泌酶切割位點(diǎn)附近。據(jù)信突變通過與形成Aβ的切割反應(yīng)相互作用以致產(chǎn)生42/43氨基酸形式的Aβ的增加而導(dǎo)致AD。
Aβ具有固定和活化經(jīng)典和旁路補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)獨(dú)特特性。尤其是，其結(jié)合到Clq并最終結(jié)合C3bi。這種關(guān)聯(lián)促進(jìn)與導(dǎo)致B-細(xì)胞活化的巨噬細(xì)胞的結(jié)合。此外，C3bi外降解然后以T-細(xì)胞依賴的方式結(jié)合到B-細(xì)胞上的CR2，導(dǎo)致這些細(xì)胞的活化增加10,000倍。這種機(jī)制促使Aβ產(chǎn)生免疫應(yīng)答超過其它抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
Aβ具有數(shù)個(gè)天然存在的形式。人的Aβ形式涉及Aβ39，Aβ40，Aβ41，Aβ42和Aβ43。這些肽的序列和其與APP前體的關(guān)系如Hardy等，TINS 20，155-158(1997)的圖1所示。例如Aβ42具有如下序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH(SEQ ID NO.21)。
Aβ41，Aβ40和Aβ39與Aβ42的區(qū)別在于從C-末端分別缺失了Ala，Ala-Ile和Ala-Ile-Val。Aβ43與Aβ42的區(qū)別在于C-末端存在蘇氨酸殘基。
Aβ片段肽免疫原相對于完整的分子在用于本發(fā)明方法時(shí)出于數(shù)個(gè)原因是有利的。首先，因?yàn)橹挥蠥β內(nèi)部的某些表位誘導(dǎo)用于治療阿爾茨海默病有用的免疫原性應(yīng)答，含有這種表位的相等劑量片段比完整Aβ的劑量提供更大摩爾濃度的有用的免疫原性表位。其次，Aβ的某些肽免疫原產(chǎn)生針對淀粉狀沉積的免疫原性應(yīng)答，而不產(chǎn)生針對作為Aβ起源的APP蛋白質(zhì)的顯著的免疫原性應(yīng)答。第三，Aβ的肽免疫原比完整的Aβ制造更簡單，因?yàn)槠溟L度較短。第四，Aβ的肽免疫原不以與完整的Aβ相同的方式聚集，簡化了具有載體的結(jié)合物的制備。
一些Aβ肽免疫原具有來自天然肽的至少2，3，5，6，10或20個(gè)連續(xù)的氨基酸序列。一些肽免疫原只有來自Aβ的不超過10，9，8，7，5或3個(gè)連續(xù)的殘基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，來自Aβ的N-末端部分的肽免疫原被用于制備結(jié)合物。優(yōu)選的肽免疫原包括Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-11，3-7，1-3和1-4。例如Aβ1-5的命名指包含Aβ的1-5位殘基的N-末端片段。在N-末端開始而終止于Aβ的7-11位之內(nèi)的殘基的Aβ片段是特別優(yōu)選的。Aβ1-12片段也可以使用但是較不優(yōu)選。在一些方法中，所述片段是Aβ1-10以外的N-末端片段。其它的優(yōu)選片段包括Aβ13-28，15-24，1-28，25-35，35-40，35-42及其他內(nèi)部片段和C-末端片段。
本發(fā)明的一些Aβ肽是免疫原性肽，將其給藥到人患者或動(dòng)物后產(chǎn)生特異性結(jié)合到Aβ16和25位殘基之間的一種或者多種表位的抗體。優(yōu)選的片段包括Aβ16-22，16-23，17-23，17-24，18-24和18-25。特異性結(jié)合到16和25位殘基之間的表位的抗體特異性結(jié)合到可溶的Aβ而不結(jié)合到Aβ的斑。這些類型的抗體可以特異性結(jié)合到在患者或動(dòng)物模型的循環(huán)循環(huán)系統(tǒng)的可溶性Aβ，而不特異性結(jié)合到患者或模型腦中的Aβ沉積的斑?？贵w與可溶性Aβ的特異性結(jié)合抑制Aβ被引入到斑中，從而或者抑制患者斑的發(fā)展，或者如果這種斑在給藥治療之前已經(jīng)發(fā)展的話，則抑制斑的尺寸或頻率的進(jìn)一步增加。
優(yōu)選地，給藥的Aβ片段缺乏產(chǎn)生針對該片段的T-細(xì)胞應(yīng)答的表位。通常，T-細(xì)胞表位大于10個(gè)連續(xù)氨基酸。因此，優(yōu)選的Aβ片段大小為5-10或優(yōu)選7-10個(gè)連續(xù)氨基酸，或最優(yōu)選7個(gè)連續(xù)的氨基酸；即足以產(chǎn)生抗體應(yīng)答而不產(chǎn)生T-細(xì)胞應(yīng)答的長度。缺少T-細(xì)胞表位是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些表位不是片段的免疫原性活性所需的，并可能在一部分患者中導(dǎo)致不希望的炎性應(yīng)答(Anderson等，(2002)J.Immunol.168，3697-3701；Senior(2002)Lancet Neurol.1，3)。
片段Aβ15-25和其7-8個(gè)連續(xù)氨基酸的子片段是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些肽一致性地產(chǎn)生針對Aβ肽的高度免疫原性應(yīng)答。這些片段包括Aβ16-22，Aβ16-23，Aβ16-24，Aβ17-23，Aβ17-24，Aβ18-24和Aβ18-25。特別優(yōu)選的Aβ15-25亞片段長度為7個(gè)連續(xù)氨基酸。例如Aβ15-21的名稱表示包含Aβ的15-21位殘基并缺乏Aβ的其它殘基的片段。并優(yōu)選7-10個(gè)連續(xù)的氨基酸。這些片段可以產(chǎn)生包含末端特異性抗體的抗體應(yīng)答。
Aβ的肽免疫原需要篩選清除或阻止類淀粉物沉積的活性(參見WO 00/72880，其在此處全文引作所有目的的參考)。Aβ的N-末端片段的給藥在體內(nèi)和在體外誘導(dǎo)識(shí)別Aβ沉積的抗體的產(chǎn)生。缺乏存在于天然形式Aβ的至少1個(gè)，和有時(shí)至少5或10個(gè)C-末端氨基酸的片段被用于一些方法中。例如，缺乏Aβ43 C-末端的5個(gè)氨基酸的片段包含來自Aβ的N-末端的最初38個(gè)氨基酸。
除非另有陳述，所指的Aβ包含上述指明的天然的人氨基酸序列以及包括等位基因、物種的和誘發(fā)突變體的類似物。類似物通常和天然存在的肽由于保守性取代在一個(gè)、兩個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)存在差異。類似物通常顯示出與天然的肽至少80或90％的序列同一性。一些類似物還包括非天然氨基酸或N-或C-末端氨基酸在一個(gè)、兩個(gè)、或幾個(gè)位置的修飾。例如，Aβ的位點(diǎn)1和/或7的天然的天冬氨酸殘基可被異天冬氨酸取代。
非天然氨基酸的例子是D，α，α二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，4-羥脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基賴氨酸，ε-N-乙?；嚢彼?，氧-磷酸絲氨酸，N-乙酰絲氨酸，N-甲?；琢虬彼?，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，ω-N-甲基精氨酸，β-丙氨酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，甲狀腺素，γ-氨基丁酸，高絲氨酸，瓜氨酸和異天冬氨酸。免疫原性肽還包括Aβ類似物及其片段。本發(fā)明的一些治療性劑是全-D肽，例如，全-DAβ，全-DAβ片段或全-DAβ或全-DAβ片段的類似物。可以與未經(jīng)治療的或安慰劑對照組比較，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中篩選片段和類似物的預(yù)防或治療效力，，如WO00/72880的描述。
肽免疫原還包括較長的多肽，其包括例如，連同其它氨基酸的免疫原性的Aβ肽。例如，優(yōu)選的免疫原性肽包括包含連接到異源氨基酸序列的Aβ片段的融合蛋白，所述異源氨基酸序列誘導(dǎo)針對該異源氨基酸序列的輔助性T-細(xì)胞應(yīng)答，并從而誘導(dǎo)針對Aβ片段的B-細(xì)胞應(yīng)答。
可以與未經(jīng)治療的或安慰劑對照組比較，在動(dòng)物模型中篩選這種多肽的預(yù)防或治療效力，如WO 00/72880的描述。
Aβ肽，類似物，免疫原性片段或其它的多肽可以解聚或聚合的形式給藥。解聚Aβ或其片段表示單體的肽單元。解聚Aβ或其片段通常是可溶的，并且能夠自聚集以形成可溶的寡聚體，原纖維和ADDLs。Aβ和其片段的寡聚體通常是可溶的并主要以α-螺旋或無規(guī)卷曲的形式存在。聚集的Aβ或其片段指連接成不溶性的β折疊的Aβ或其片段的寡聚體。聚集的Aβ或其片段還表示原纖維聚合物。原纖維通常是不溶性的。一些抗體結(jié)合到可溶性Aβ或其片段或聚集的Aβ或其片段。免疫原性肽還包括單體免疫原性肽的多聚物。Aβ肽之外的免疫原性肽應(yīng)該誘導(dǎo)針對一種或者多種上面列舉的優(yōu)選Aβ片段(例如，Aβ1-3，1-7，1-10和3-7)的免疫原性應(yīng)答。
使用本發(fā)明方法將本發(fā)明的免疫原性肽與載體連接形成結(jié)合物。所述免疫原性肽可以在其氨基末端，其羧基末端，或以上兩者連接到載體以形成結(jié)合物。任選地，結(jié)合物中可以存在免疫原性肽的多個(gè)重復(fù)。
Aβ的N-末端片段可以在其C-末端連接到載體肽以形成結(jié)合物。在這樣的結(jié)合物中，Aβ片段的N-末端殘基構(gòu)成了結(jié)合物的N-末端殘基。因此，這種結(jié)合物可有效誘導(dǎo)結(jié)合到要求AβN-末端殘基處于自由形式的抗體。本發(fā)明的一些免疫原性肽包括在C-末端連接到一個(gè)或多個(gè)載體肽拷貝以形成結(jié)合物的Aβ的N-末端片段的多個(gè)重復(fù)。引入到這種結(jié)合物的AβN-末端片段有時(shí)在Aβ1-3開始并在Aβ7-11終止。Aβ1-7，1-3，1-4，1-5和3-7是優(yōu)選的N-末端片段。一些結(jié)合物包括串連的不同Aβ的N-末端片段。例如，結(jié)合物可以包括后面跟著連接到載體的Aβ1-3的Aβ1-7。
一些結(jié)合物中，Aβ的N-末端片段在其N-末端連接到載體肽。同樣多樣的Aβ的N-末端片段可以與C-末端連接一樣使用。一些結(jié)合物包括連接到N-末端片段的N-末端的載體肽，其反過來串連連接到一個(gè)或多個(gè)另外的AβN-末端片段。優(yōu)選地，這樣的免疫原性Aβ片段，一旦結(jié)合到合適的載體，誘導(dǎo)特異性針對Aβ片段而針對Aβ的其它片段的免疫原性應(yīng)答。
本發(fā)明的免疫原性肽包括免疫原性的異源肽。在一些免疫原性肽中，Aβ片段連接到載體以形成免疫原性的異源肽。這種異源肽使用本發(fā)明的方法連接到載體形成結(jié)合物。一些免疫原性的異源肽包括連接到破傷風(fēng)類毒素表位的Aβ片段，比如描述在US5,196,512，EP378,881和EP427,347。任選地，免疫原性的肽可以連接到一個(gè)或多個(gè)載體拷貝，例如在所述載體的N和C-末端形成免疫原性的異源肽。其它這些免疫原性異源肽包括連接到US5,736,142描述的載體肽的Aβ片段。例如，免疫原性的異源肽可以包括Aβ1-7，繼之以Aβ1-3，緊接著載體。這種免疫原性異源肽的例子包括線性構(gòu)象的Aβ1-7/破傷風(fēng)類毒素 830-844+947-967DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SFQ ID NO.24)US5,736,142描述的肽(全為線性構(gòu)象)PADRE/Aβ1-7AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD(SEQ ID NO.26)Aβ1-7x3/PADREDAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ IDNO.27)PADRE/Aβ1-7x3AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO.28)Aβ1-7/PADRE
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO.29)Aβ1-7/白蛋白片段DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.30)Aβ4-10/白蛋白片段FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.31)Aβ3-9/白蛋白片段EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.32)HA307-319/Aβ1-7x3PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO.33)Aβ1-7/HA307-319/Aβ1-7DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD(SEQ ID NO.34)Aβ1-7x3/HA307-319DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQIDNO.35)Aβ1-7x2/HA307-319DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO.36)Aβ1-7/HA307-319/瘧疾CS/TT830-844/TT947-967/Aβ1-7DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ IDNO.37)
Aβ1-7x3/TT830-844/C/TT947-967DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.38)Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.39)Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967/Aβ1-7DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ ID NO.20)一些免疫原性的異源肽包括通式2x代表的免疫原性肽的多聚體，其中x是1-5的整數(shù)。優(yōu)選x是1，2或3，2為最優(yōu)選的。當(dāng)x為2時(shí)，這種多聚體具有四個(gè)免疫原性肽連接為稱作MAP4的優(yōu)選構(gòu)象(參見US 5,229,490)。然后使用本發(fā)明方法將這樣的免疫原性肽與載體連接以形成結(jié)合物。
MAP4構(gòu)象顯示如下，其中通過引發(fā)N-末端以及賴氨酸的側(cè)鏈胺的肽合成產(chǎn)生分支結(jié)構(gòu)。根據(jù)賴氨酸被引入到序列中的次數(shù)和產(chǎn)生分支，所得到的結(jié)構(gòu)將呈現(xiàn)多個(gè)N-末端。在這個(gè)例子中，在分支的含有賴氨酸的核心已經(jīng)產(chǎn)生了四個(gè)相同的N-末端。這種多重性大大增強(qiáng)了同源B-細(xì)胞的反應(yīng)性。

這種免疫原性異源肽的例子包括MAP4構(gòu)象的Aβ1-7/破傷風(fēng)類毒素830-844DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO.22)MAP4構(gòu)象的Aβ1-7/破傷風(fēng)類毒素947-967DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.23)MAP4構(gòu)象的Aβ3-9/破傷風(fēng)類毒素830-844EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO.25)2分支樹脂上的DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL Aβ肽，類似物，活性片段或其它的多肽可以連接的或多聚形式或以解聚形式給藥。治療劑還包括單體免疫原性劑的多聚體。Aβ肽以外的試劑應(yīng)該誘導(dǎo)針對上面列舉的一種或者多種優(yōu)選Aβ片段的免疫原性應(yīng)答(例如1-10，1-7，1-3和3-7)，還可以使用本發(fā)明的方法結(jié)合到載體。優(yōu)選這種試劑一旦結(jié)合到合適的載體，就誘導(dǎo)特異性針對這些片段之一的免疫原性應(yīng)答而不涉及其它的Aβ片段。為促進(jìn)肽免疫原與載體的結(jié)合作用，可以向抗原決定簇的末端添加另外的氨基酸。所述另外的殘基還可以用于修飾所述肽免疫原的物理或化學(xué)特性。氨基酸比如酪氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酸或天冬氨酸等可以被引入到所述肽免疫原的C-或N-末端。另外，還可以引入含有氨基酸比如甘氨酸和丙氨酸的肽接頭。此外，抗原決定簇可以通過末端NH2-基團(tuán)酰化修飾與天然的序列相區(qū)別，例如通過烷?；?C1-C20)或硫代乙醇酰乙?；?，末端羧基酰胺化，例如氨，甲胺，等等。在一些情況下，這些修飾可以提供連接到支持物或其它分子的位點(diǎn)。
用于使用此處公開的方法產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合物的肽免疫原可以通過連接形成聚合物(多聚體)，或可以不連接而配制在免疫原性組合物中作為摻合物而進(jìn)行組合。其中肽連接到相同的肽，從而形成同聚體，存在多個(gè)重復(fù)表位單位。例如，多抗原肽(MAP)技術(shù)用來構(gòu)成含有CTL和/或抗體肽和肽的聚合物。當(dāng)所述肽不同時(shí)，提供了例如代表不同病毒亞型，同一亞型的不同表位，不同的HLA限制特異性，或包含T輔助細(xì)胞表位的肽，具有重復(fù)單元的異聚物的混合物。除共價(jià)鍵之外，還預(yù)期包括可以形成分子間和結(jié)構(gòu)內(nèi)鍵的非共價(jià)連接。
這樣的肽免疫原和它們的類似物通過固相肽合成或重組表達(dá)合成，或來自天然來源。自動(dòng)肽合成儀是可以從許多的廠商，比如AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，California購買到的。
重組表達(dá)可以在細(xì)菌(比如大腸桿菌)，酵母，昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。用于重組表達(dá)的方法參見Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，NY，第2版，1989)的描述。一些免疫原性肽是可以商業(yè)購得(例如，American PeptidesCompany，Inc.，Sunnyvale，CA，和California Peptide Research，Inc.，Napa，CA)。
還可以篩選肽或其它化合物的隨機(jī)庫中作為肽免疫原的適合性?？梢援a(chǎn)生許多類型化合物的組合庫，其可以通過逐步的方式合成。這種化合物包括多肽，β-折疊模擬物，激素，寡聚的N-取代的甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯等等?；衔锏妮^大組合庫可以通過WO 95/12608，WO 93/06121，WO 94/08051，WO 95/35503和WO 95/30642(各自在此處引作所有目的的參考)描述的編碼合成庫(ESL)的方法進(jìn)行構(gòu)建。肽庫還可以通過噬菌體展示法產(chǎn)生(參見，如，Devlin，WO 91/18980)。
免疫原性肽的衍生以及與蛋白質(zhì)載體的結(jié)合肽免疫原與蛋白質(zhì)/多肽載體的連接位點(diǎn)和用于將肽免疫原連接到載體的交聯(lián)劑的性質(zhì)對于得到的針對其的抗體的特異性來說都是重要的。為了正確識(shí)別，肽免疫原必須以合適的定向與載體連接。為了抗體識(shí)別隨后沒有載體的自由肽免疫原，肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物必須以暴露且可接近的形式呈遞肽免疫原。常常通過將交聯(lián)反應(yīng)引導(dǎo)到肽免疫原上的特異性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)最佳的定向。用肽免疫原獲得這種定向的一種方法是通過在肽合成過程中連接末端半胱氨酸殘基。這在肽的一端提供了用于結(jié)合載體的巰基。通過這個(gè)基團(tuán)的交聯(lián)提供了肽免疫原僅僅在一端的連接，從而保證了一致的定向。
在肽免疫原-載體結(jié)合作用中，目標(biāo)不是保持載體的天然狀態(tài)或穩(wěn)定性，而是以最可能的方式將半抗原遞呈到免疫系統(tǒng)。在實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的過程中，結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的選擇可以控制得到的針對半抗原產(chǎn)生的抗體的效價(jià)、親合性和特異性。有時(shí)選擇含有足以不受限制的方式呈遞抗原的長間隔臂的交聯(lián)劑是很重要的?？刂戚d體表面上肽免疫原的密度可能也是重要的。太少的肽免疫原取代可能導(dǎo)致很少或沒有反應(yīng)。肽免疫原密度過高實(shí)際上可能導(dǎo)致免疫抑制和降低應(yīng)答。此外，交叉接頭本身可能產(chǎn)生不希望的免疫應(yīng)答。在選擇合適的交聯(lián)試劑以及合適的蛋白質(zhì)/多肽載體和肽免疫原的比例時(shí)均需要考慮到這些問題。
將蛋白質(zhì)/肽載體連接到肽免疫原的多種方法是可能的?？梢酝ㄟ^末端或通過賴氨酸的ε-氨基實(shí)現(xiàn)離子相互作用。殘基的側(cè)基和肽免疫原之間的氫鍵也是可能的。最后，蛋白質(zhì)/肽載體和免疫原性肽之間的構(gòu)象相互作用可能產(chǎn)生穩(wěn)定的連接。
已經(jīng)使用多種交聯(lián)劑比如零長度，同型雙功能或異型雙功能交聯(lián)劑成功產(chǎn)生了肽免疫原-載體結(jié)合物。用于生物結(jié)合的最小的有效試劑系統(tǒng)是所謂的零長度交叉接頭。這些化合物介導(dǎo)通過形成不含有另外的原子的鍵而介導(dǎo)兩個(gè)分子的結(jié)合作用。因此，分子的一個(gè)原子是間隔臂。在許多結(jié)合方案中，最終的復(fù)合物通過向被交聯(lián)的物質(zhì)添加外來結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分而彼此結(jié)合。在一些應(yīng)用中，這些插入接頭的存在可能目的用途是有害的。例如，在制備肽免疫原-載體結(jié)合物時(shí)，以產(chǎn)生對所連接的半抗原的免疫應(yīng)答為目的形成復(fù)合物。有時(shí)，通過這個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的抗體的一部分對用于結(jié)合過程的交聯(lián)試劑具有特異性。零長度交聯(lián)劑通過介導(dǎo)兩個(gè)物質(zhì)之間的直接連接而排除了此類交叉反應(yīng)活性的可能性。
作為用于大分子修飾和結(jié)合的第一種交聯(lián)劑的同型雙功能劑，由在兩個(gè)末端含有同樣官能團(tuán)的雙反應(yīng)性化合物組成(Hartman和Wold，1966)。這些試劑可以與兩個(gè)分子上相同的常見基團(tuán)共價(jià)反應(yīng)將一個(gè)蛋白共價(jià)連接到另一個(gè)蛋白。因此，一種蛋白的賴氨酸ε-胺或N-末端胺可以在存在同型雙功能試劑的情況下通過將二者簡單混和而交聯(lián)到第二蛋白質(zhì)上的相同官能團(tuán)。
異型雙功能結(jié)合劑包含兩個(gè)不同的活性基團(tuán)，其可以連接到蛋白質(zhì)和其它大分子上兩個(gè)不同功能性靶。例如，交叉接頭的一個(gè)部分可以包含胺反應(yīng)基團(tuán)，而另一個(gè)部分可能由巰基反應(yīng)性基團(tuán)組成。結(jié)果是能夠?qū)⒔宦?lián)反應(yīng)引導(dǎo)到靶分子的選定部分，從而收集對于結(jié)合過程更好的控制。
異型雙功能試劑用來以兩步驟或三步驟方法交聯(lián)蛋白質(zhì)和其它分子，所述方法限制了通常使用同型雙功能交叉接頭獲得的聚合度。
目前許多方法可用于利用零長度、同型雙功能或異型雙功能交聯(lián)劑將肽免疫原與蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合。大多數(shù)的方法產(chǎn)生胺，酰胺，氨基甲酸乙酯，異硫脲或二硫鍵或有時(shí)產(chǎn)生硫醚。更通用的將蛋白質(zhì)或肽連接到肽的方法利用雙功能交聯(lián)劑。這些交聯(lián)劑是小間隔臂分子，在各末端具有活性基團(tuán)。間隔臂分子可以在各末端具有相同的或不同的活性基團(tuán)。最常見的活性官能團(tuán)，連接基團(tuán)和形成的鍵是
1.醛-氨基→仲胺2.馬來酰亞胺-巰基→硫醚3.琥珀酰亞胺-氨基→酰胺4.Imidate酯-氨基→酰胺5.疊氮基苯-氨基→苯基胺6.酰鹵-巰基→硫醚7.吡啶基二硫化物-巰基→二硫化物8.異硫氰酸酯-氨基→異硫脲給定載體蛋白的反應(yīng)性，就其通過交聯(lián)劑的修飾使其可以結(jié)合到肽免疫原的能力而言，通過其氨基酸組成和單獨(dú)的氨基酸在分子三維結(jié)構(gòu)中的序列位置以及通過肽免疫原的氨基酸組成來進(jìn)行測定。
就蛋白質(zhì)/肽載體和其它肽(例如，蛋白質(zhì)/肽載體和肽免疫原)之間的接頭(“L”)而論，間隔臂通常選自Ala，Gly或非極性氨基酸或中性極性氨基酸的其它中性間隔臂。在某些實(shí)施方案中，中性間隔臂是Ala。應(yīng)該理解，任選存在的間隔臂沒必要由相同的殘基組成，并因此可以是異型或同型寡聚物。示例性的間隔臂包括Ala的同型寡聚體。當(dāng)存在是，間隔臂通常是至少一個(gè)或兩個(gè)殘基，更通常三到六個(gè)殘基。在其它的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合到肽免疫原，優(yōu)選蛋白質(zhì)/肽載體位于氨基末端。肽可以通過中性接頭，比如Ala-Ala-Ala等接頭連接，并優(yōu)選另外包含連接到Lys殘基((PAM)2Lys)的α和ε氨基的脂殘基比如棕櫚酸等，其通常通過Ser-Ser鍵等連接到肽結(jié)合物的氨基末端。
在本發(fā)明一些方面，肽免疫原是Aβ片段，選自Aβ1-5-L，Aβ1-7-L，Aβ1-9-L和Aβ1-12-L。在本發(fā)明的一些方面所述接頭是GAGA(SEQ ID NO10)。
為促進(jìn)肽免疫原與載體的結(jié)合，可以向抗原決定簇的末端添加另外的氨基酸。所述另外的殘基還可以用于修飾所述肽免疫原的物理或化學(xué)性質(zhì)。氨基酸比如酪氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，等等，可以被引入到所述肽免疫原的C-或N-末端。另外，還可以引入含有氨基酸比如甘氨酸和丙氨酸的肽接頭。此外，抗原決定簇可以通過末端NH2-基團(tuán)?；揎椂煌谔烊坏男蛄?，例如例如通過烷醇基(C1-C20)或硫代乙醇酰乙酰化，末端羧基酰胺化，例如氨，甲胺等等。在一些情況下，這些修飾可以提供連接到支持物或其它分子的位點(diǎn)。
在本發(fā)明一些方面，肽免疫原是Aβ片段，選自Aβ1-5-C，Aβ1-7-C，Aβ1-9-C和Aβ1-12-C，其中C是半胱氨酸氨基酸殘基。在本發(fā)明的一些方面，肽免疫原是Aβ片段，選自Aβ1-5-L-C，Aβ1-7-L-C，Aβ1-9-L-C和Aβ1-12-L-C。
肽免疫原直接或者通過肽免疫原氨基或羧基末端的接頭連接到蛋白質(zhì)/肽載體。肽免疫原或蛋白質(zhì)/肽載體的氨基末端可以被酰基化。此外，肽免疫原-蛋白質(zhì)/肽載體結(jié)合物可以通過一個(gè)或多個(gè)連接殘基比如如下所述的Gly，Gly-Gly，Ser，Ser-Ser連接到某些alkanyol(C1-C20)脂。其它有用的脂部分包括膽固醇，脂肪酸等。
肽免疫原可以通過化學(xué)交聯(lián)連接到載體。用于將免疫原連接到載體的技術(shù)包括使用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson，J等(1978)Biochem J，173723，)和琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羰酸酯(SMCC)形成二硫鍵(如果肽缺乏巰基，可以通過向半抗原添加半胱氨酸殘基而提供)。這些試劑通過賴氨酸上的ε氨基或其它氨基酸中的自由氨基在它們自身以及一種蛋白質(zhì)的肽半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵和酰胺鍵。二硫化物/酰胺的多種形成試劑描述在Immune Rev.6285(1982)中。其它的雙功能偶聯(lián)劑形成硫醚而非二硫鍵。形成硫醚的試劑包括6-馬來酰亞胺基己酸，2-溴乙酸和2-碘乙酸，4-(N-馬來酰亞胺基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸的活性酯。羧基可以通過將其與琥珀酰亞胺或1-羥基-2-硝基-4-磺酸鈉鹽組合而進(jìn)行活化。
最常見的，賴氨酸殘基是載體蛋白上發(fā)現(xiàn)的最豐富的氨基酸殘基，這些殘基使用交聯(lián)試劑修飾以產(chǎn)生隨后連接到半抗原的親核性位點(diǎn)。這種連接是通過化學(xué)活性的半抗原分子上任何親水的側(cè)鏈來實(shí)現(xiàn)的。這些包括精氨酸的胍基，谷氨酸和天冬氨酸的羧基，半胱氨酸的巰基和賴氨酸的ε-氨基等。使用交聯(lián)劑修飾蛋白質(zhì)使其可以連結(jié)到其它的部分，這些交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)載體或半抗原分子上的任何側(cè)鏈起化學(xué)反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，有或者沒有接頭分子的載體蛋白被試劑官能化(衍生化)，該試劑向載體蛋白分子引入活性部位，該載體蛋白分子可以進(jìn)行進(jìn)一步的修飾引入親核基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體與鹵?；噭┓磻?yīng)，其優(yōu)先與蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的大量官能團(tuán)反應(yīng)，比如半胱氨酸的巰基，賴氨酸殘基的伯ε胺基，α胺的α末端，甲硫氨酸的硫醚和組氨酸的兩個(gè)咪唑基側(cè)鏈氮(Gurd，1967)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，載體蛋白的賴氨酸殘基上的伯ε胺基用b N-羥基琥珀酰亞胺基溴乙酸酯衍生以產(chǎn)生溴乙?；妮d體。通過向含有肽免疫原的溶液緩慢添加活化載體進(jìn)行肽免疫原和活化的蛋白質(zhì)載體的結(jié)合。
通過使本發(fā)明的方法，上述B部分論述的肽免疫原可以結(jié)合到上述A部分論述的任何載體。從本發(fā)明方法所得到的結(jié)合物被用作產(chǎn)生用于被動(dòng)/主動(dòng)免疫治療的針對Aβ的抗體的免疫原。此外，連接到載體的Aβ或Aβ片段可以給藥到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生針對Aβ的單克隆抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，結(jié)合物選自Aβ1-7-CRM197，(Aβ1-7x3)-CRM197和(Aβ1-7x5)-CRM197。在本發(fā)明的一個(gè)方面，結(jié)合物選自CRM197-Aβ1-5，CRM197-Aβ1-7，CRM197-Aβ1-9，和CRM197-Aβ1-12。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，結(jié)合物選自Aβ1-5-C-CRM197，Aβ1-7-C-CRM197，Aβ1-9-C-CRM197，和Aβ1-12-C-CRM197，Aβ16-23-C-CRM197，Aβ17-24-C-CRM197，Aβ18-25-C-CRM197，CRM197-C-Aβ16-23，CRM197-C-Aβ17-24，CRM197-C-Aβ18-25，Aβ16-22-C-CRM197，Aβ17-23-C-CRM197，Aβ1 8-24-C-CRM197，CRM197-C-Aβ16-22，CRM197-C-Aβ17-23和CRM197-C-Aβ18-24。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，結(jié)合物選自Aβ1-5-L-C-CRM197，Aβ1-7-L-C-CRM197，Aβ1-9-L-C-CRM197和Aβ1-12-L-C-CRM197。
加帽使用偶聯(lián)劑的缺點(diǎn)是活性部位如果不被中和就會(huì)自由地與任何的不需要的分子體外或體內(nèi)反應(yīng)，所述偶聯(lián)劑向載體和/或半抗原分子上活性氨基酸分子的側(cè)鏈上引入活性位點(diǎn)。在本發(fā)明的方法中，未反應(yīng)的官能團(tuán)的加帽伴隨有具有側(cè)基活性基團(tuán)的結(jié)合物與滅活/加帽活性基團(tuán)的試劑的反應(yīng)。用于本發(fā)明結(jié)合方法的示例性的失活/加帽試劑包括半胱胺，N-乙酰半胱胺和乙醇胺?；蛘撸用蓖ㄟ^與氨或碳酸氫銨的反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，這二者都將鹵乙?；D(zhuǎn)變位氨基乙?；?。加帽也在堿性pH(9.0-9.8)使用氫氧化鈉或碳酸鈉完成，其將鹵乙酰基轉(zhuǎn)變位羥乙?；Ｅc和半胱胺衍生物，乙醇胺等的反應(yīng)相反，將鹵乙?；D(zhuǎn)變?yōu)榘被阴；蛄u乙?；囊粋€(gè)潛在優(yōu)點(diǎn)是通過與氨或氫氧化物/碳酸鹽反應(yīng)引入相對小的化學(xué)官能團(tuán)。所得到的加帽的官能團(tuán)，例如氨基乙?；蛄u基乙酰基提供了結(jié)合物的載體蛋白部分相對較少的干擾。根據(jù)需要使用已知的方法純化加帽的肽免疫原-載體蛋白，比如層析(凝膠過濾，離子交換作用，疏水性相互作用或親和)，透析，超濾-透濾，使用硫酸銨或醇選擇性沉淀等。
免疫原性結(jié)合物和組合物加帽的肽免疫原載體蛋白結(jié)合物以免疫原性組合物的形式給藥到哺乳動(dòng)物，特別是人用于預(yù)防和/或治療目的。本發(fā)明的結(jié)合物用來引發(fā)和/或增強(qiáng)針對免疫原的免疫應(yīng)答。例如，CTL-載體結(jié)合物用來治療和/或預(yù)防病毒感染，淀粉樣蛋白引起的疾病，癌癥等?；蛘撸彩褂谜T導(dǎo)抗體應(yīng)答的多肽免疫原-載體結(jié)合物。可以使用本發(fā)明結(jié)合物治療的疾病的例子包括各種細(xì)菌感染，病毒感染，真菌感染，寄生蟲感染和癌癥。
在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的結(jié)合物被給藥到已經(jīng)患有淀粉樣蛋白引起的疾病比如阿爾茨海默病、癌癥，或感染上病原微生物的患者個(gè)體。那些處于疾病的潛伏期或急性期的患者可以用本發(fā)明的結(jié)合物單獨(dú)治療或連同其它合適的治療一起進(jìn)行治療。
在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的免疫原性組合物以足以引發(fā)針對微生物、淀粉樣蛋白斑或表達(dá)在癌細(xì)胞上的腫瘤抗原的有效CTL應(yīng)答或體液應(yīng)答，以及治愈或至少部分制止疾病的發(fā)展、癥狀和/或并發(fā)癥的量被給藥到患者。足以實(shí)現(xiàn)這種效果的量被定義為“治療有效劑量”。用于該用途的有效量將部分依賴于肽免疫原性組合物，給藥的方式，被治療的疾病的階段和嚴(yán)重程度，患者的體重和一般健康狀態(tài)，以及處方醫(yī)生的判斷。
本發(fā)明的免疫原性組合物用于治療或預(yù)防給藥的首次免疫的治療有效量對于70kg的患者而言通常范圍為從大約0.1μg到大約10,000μg的肽，通常從大約0.1μg到大約8000μg，優(yōu)選從大約0.1μg到大約5000μg，最優(yōu)選從大約0.1μg到大約1000μg。這些劑量之后，是依據(jù)加強(qiáng)免疫方案根據(jù)患者的應(yīng)答和通過測量特異性免疫應(yīng)答獲得的條件在數(shù)周至數(shù)月后進(jìn)行的從大約0.1μg到大約1000μg肽的加強(qiáng)劑量。
另外，預(yù)防性使用本發(fā)明以預(yù)防和/或改善細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生蟲感染、淀粉樣蛋白引起的疾病或癌癥。有效量如上所述。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也將知道如何根據(jù)需要調(diào)整或修改預(yù)防性治療，例如通過加強(qiáng)免疫和調(diào)整劑量以及劑量給藥方案。
治療性給藥可以從疾病的第一病征或檢測或外科摘除腫瘤或就急性感染而言診斷后不久開始。這隨后是通過加強(qiáng)劑量，直到疾病發(fā)展被中止或逆轉(zhuǎn)或癥狀被基本上緩解并持續(xù)此后的一段時(shí)期。在慢性感染中，可能需要初始的高劑量繼之以加強(qiáng)劑量。
用本發(fā)明的組合物治療感染的個(gè)體可以促進(jìn)急性感染的個(gè)體感染的消散。對于那些容易(或傾向于)發(fā)展慢性感染的個(gè)體而言，所述組合物可尤其用于阻止從急性發(fā)展成慢性感染的方法。例如在此描述的，在感染前或感染期間鑒定易感的個(gè)體時(shí)，所述組合物可以靶向到他們，對較大群體給藥的需求最小化。
本發(fā)明的結(jié)合物還被用來治療慢性感染和刺激免疫系統(tǒng)以消除潛伏性感染個(gè)體中病毒感染的細(xì)胞。重要的是以足夠有效引發(fā)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的制劑和給藥方式提供適量的本發(fā)明的免疫原性組合物。因此，對于慢性感染的治療，對于70kg的患者每劑量的代表性劑量范圍從大約0.1μg到大約10,000μg肽，通常從大約0.1μg到大約8000μg，優(yōu)選大約0.1μg到大約5,000μg，最優(yōu)選大約0.1μg到大約1,000μg。免疫劑量，繼之以在給定間隔時(shí)間的加強(qiáng)劑量，例如從一到四周，可能是需要的，可能需要持續(xù)一段時(shí)間以有效免疫個(gè)體。就慢性感染而論，給藥應(yīng)該持續(xù)到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室檢驗(yàn)顯示病毒感染已經(jīng)被消除或基本上緩解并持續(xù)此后的一段時(shí)期。
本發(fā)明的用于治療或預(yù)防治療的免疫原性組合物可以通過胃腸外、局部、靜脈內(nèi)、口服、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻或肌內(nèi)的方法給藥用于預(yù)防性和/或治療性治療。免疫原性試劑的一種典型給藥途徑是皮下給藥，盡管其它的途徑可以同樣地有效。另外常見的途徑是肌內(nèi)注射。這種注射最通常在手臂或腿肌肉上進(jìn)行。在一些方法中，試劑被直接注射到沉積物聚集的特定組織中，例如顱內(nèi)注射。肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)輸液可優(yōu)選用于抗體給藥。在一些方法中，將具體的治療抗體直接注射進(jìn)入顱內(nèi)。由于給藥方便，本發(fā)明的免疫原性組合物特別適于口服。本發(fā)明另外提供了用于腸胃外投藥的免疫原性組合物，其包含溶解或懸浮在可接受的載體，優(yōu)選含水載體中的肽或結(jié)合物的溶液。
可以使用多種稀釋劑、賦形劑和緩沖液，例如水，緩沖水，磷酸鹽緩沖鹽水，0.3％甘氨酸，透明質(zhì)酸等。這些免疫原性組合物可以通過常規(guī)、公知的滅菌技術(shù)滅菌，或可以無菌過濾。所得到的水溶液可以如其包裝形式使用，或凍干，凍干的制劑在給藥前與無菌溶液組合。所述免疫原性組合物可以根據(jù)需要包含藥物可接受的助劑以接近生理?xiàng)l件，比如緩沖劑，浸透壓調(diào)節(jié)劑，潤濕劑等，例如，乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，單月桂酸山梨糖醇酯20，油酸三乙醇胺等等。
對于固體組合物，可以使用常規(guī)無毒的固體載體。這些可以包括，例如，藥品級(jí)的甘露糖醇，乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖，碳酸鎂等。對于口服給藥，通過摻入任何通常采用的賦形劑，比如那些前面所列舉的載體，和通常10-95％的活性成分，即本發(fā)明的一種或者多種結(jié)合物，更優(yōu)選濃度為25-75％而形成藥物可接受的無毒組合物。
藥物制劑中本發(fā)明免疫原性組合物的濃度可以廣泛地變化，即，從按重量計(jì)小于大約0.1％，通常處于或小于大約2％到直至20％到50％或更多，并通?？梢灾饕鶕?jù)流體體積、粘性等，根據(jù)所選擇的具體給藥模式而進(jìn)行選擇。
本發(fā)明的結(jié)合物還可以通過脂質(zhì)體給藥，其用來將結(jié)合物靶向到特定組織，比如淋巴組織，或選擇性靶向到受感染細(xì)胞，以及增加肽組合物的半壽期。脂質(zhì)體包括乳劑，泡沫，膠束，不溶性單層，液晶，磷脂分散系，片狀層等等。在這些制劑中，待遞送的免疫原性組合物單獨(dú)或連同結(jié)合到例如淋巴樣細(xì)胞常見的受體的分子一起被引入作為脂質(zhì)體的一部分。這些分子將包括其結(jié)合到CD45抗原的單克隆抗體，或其它的治療性或免疫原性的免疫原性組合物。因此，填充有所需的本發(fā)明的組合物的脂質(zhì)體可以被定向到淋巴樣細(xì)胞的位點(diǎn)，然后脂質(zhì)體遞送所選定的治療性/免疫原性肽組合物。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體由標(biāo)準(zhǔn)的形成泡囊的脂質(zhì)形成，其通常包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和甾醇，比如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通?？紤]脂質(zhì)體的大小，血流中脂質(zhì)體對酸的敏感性和穩(wěn)定性。多種方法可有效用于制備脂質(zhì)體，描述于，例如，Szoka，等，Ann.Rev.Biophys.Bioelig.9467(1980)，美國專利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369，在此處引入作為參考。
為靶向到免疫細(xì)胞，待引入脂質(zhì)體中的配體可以包括對于所需的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面決定簇具有特異性的抗體或其片段。含有本發(fā)明組合物的脂質(zhì)體懸液可以靜脈內(nèi)、局部、體表等等方式給藥。劑量根據(jù)給藥方式，遞送的組合物和治療的疾病的階段的變化而變化。
對于氣溶膠給藥，本發(fā)明的組合物優(yōu)選以精細(xì)粉碎的形式與表怖活性劑和揮發(fā)劑一起提供。通常的組合物的百分比為按重量計(jì)0.01-20％，優(yōu)選1-10％。當(dāng)然表面活性劑是無毒的，優(yōu)選可溶于揮發(fā)劑。這種試劑的代表是含有從6到22個(gè)碳原子的脂肪酸的酯或偏酯，比如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric和油酸與脂肪族多元醇或其環(huán)酸酐的酯?？梢圆捎没旌硝ィ热缁旌匣蛱烊坏母视王?。表面活性劑可以占按重量組合物的0.1-20％，優(yōu)選0.25-5％。組合物的余量通常是揮發(fā)劑。如果需要還可以包括載體，如對于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。
本發(fā)明的免疫原性組合物還可以用于制備單克隆抗體。這種抗體可以有效用作潛在的診斷或治療劑。
本發(fā)明的免疫原性組合物還可以用作診斷劑。例如，本發(fā)明的組合物可用于測定特定個(gè)體對治療方案的敏感度，所述方案使用多肽免疫原，并因此可能有助修飾現(xiàn)有的治療方案或測定受感染個(gè)體的預(yù)后。此外，本發(fā)明的組合物還可以用于預(yù)測基本上處于發(fā)展慢性感染的危險(xiǎn)的個(gè)體。
本發(fā)明的結(jié)合物可以任選的連同其它的試劑一起給藥，所述試劑可至少部分有效治療和/或改善疾病和/或其癥狀。就阿爾茨海默和唐氏綜合癥而論，其中淀粉樣沉積發(fā)生在腦中，本發(fā)明的結(jié)合物可以連同其它加強(qiáng)本發(fā)明的藥劑通過血腦屏障的試劑一起給藥。
所述免疫原性組合物通常包含佐劑。佐劑是當(dāng)連同免疫原或抗原一起給藥時(shí)加強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。許多細(xì)胞因子或淋巴因子已經(jīng)顯示具有免疫調(diào)節(jié)活性，因此可以用作佐劑，上述因子包括然而并非限于白介素1-α，1-β，2，4，5，6，7，8，10，12(參見，例如美國專利5,723,127)，13，14，15，16，17和18(及其突變形式)，干擾素-α，β和γ和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(參見，例如，美國專利5,078,996)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞集落刺激因子，GSF和腫瘤壞死因子α和β。用于本發(fā)明其它的佐劑包括趨化因子，包括而不限于MCP-1，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。粘附分子，比如選擇蛋白，例如，L-選擇蛋白，P-選擇蛋白和E-選擇蛋白也可以用作佐劑。另外有用的佐劑包括而不限于粘蛋白樣分子，例如CD34，GlyCAM-1和MadCAM-1，整合蛋白家族的成員例如LFA-1，VLA-1，Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族的成員例如PECAM，ICAMs，例如，ICAM-1，ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3，共刺激分子例如CD40和CD40L，生長因子包括血管生長因子，神經(jīng)生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子，表皮生長因子，B7.2，PDGF，BL-1和血管內(nèi)皮生長因子，受體分子包括Fas，TNF受體，F(xiàn)lt，Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP，Apo-3，AIR，LARD，NGRF，DR4，DR5，KILLER，TRAIL-R2，TRICK2和DR6。另外的佐劑分子包括Caspase(ICE)。還參見國際專利公開W098/17799和W099/43839，其在此以全文引作所有目的的參考。
用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的合適的佐劑包括而不限于MPLTM(3-O-脫?；鶈瘟柞ヵＶ珹；Corixa，Hamilton，MT)，其描述于美國專利4,912,094中，其在此以全文引作用于所有目的的參考。其他適合用作佐劑的是合成的脂A類似物和氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或其衍生物或類似物，可以從Corixa(Hamilton，MT)購得，并描述于美國專利6,113,918，其在此引作參考。這種AGP之一是2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]乙基2-脫氧-4-O-膦?；?3-O-[(S)-3-四癸酰氧基四癸酰]-2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，其名稱為529(也稱作RC529；Corixa)。該529佐劑被配制成水性形式(529 AF)或穩(wěn)定的乳劑形式(529SE)。
其它的佐劑包括礦物油和水乳劑，鈣鹽比如磷酸鈣，鋁鹽(明礬)，比如氫氧化鋁，磷酸鋁等，Amphigen，Avridine，L121/角鯊浠，D-丙交脂-聚丙交酯/葡萄糖苷，pluronic酸，多元醇，胞壁酰二肽，殺死的Bordetella，皂甙，例如StimulonTMQS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham，MA)，描述于美國專利5,057,540中，其在此引作參考，以及從其產(chǎn)生的顆粒例如ISCOMS(免疫刺激復(fù)合物)，結(jié)核分支桿菌，細(xì)菌脂多糖，合成多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸(美國專利6,207,646，其在此引作參考)，百日咳毒素(PT)，或大腸桿菌熱敏感毒素(LT)，具體是LT-K63，LT-R72，PT-K9/G129；例如，參見國際專利公開WO93/13302和WO 92/19265，其在此引作多功能的參考。
還可以用作佐劑的是霍亂毒素和其突變體，包括描述于國際專利公開號(hào)WO 00/18434(其中第29位的氨基酸谷氨酸被另外的氨基酸取代(非谷氨酸，優(yōu)選組氨酸)。類似的CT毒素或其突變體描述于國際專利公開WO 02/098368(其中第16位的氨基酸異亮氨酸被另外的氨基酸取代，單獨(dú)地或者與第68位的氨基酸絲氨酸被另一氨基酸取代一起發(fā)生；和/或其中第72位的氨基酸纈氨酸被另一氨基酸取代)。其他的CT毒素描述于國際專利公開WO 02/098369(其中第25位的氨基酸置精氨酸被另一氨基酸取代；和/或在第49位的氨基酸插入氨基酸；和/或在第35和36位氨基酸插入兩個(gè)氨基酸)。
應(yīng)當(dāng)理解整個(gè)說明書中參考任何理論解釋所描述的結(jié)果并非限制本發(fā)明的范圍。不依賴于在本發(fā)明中起作用的方法，此處描述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)可以通過參考以下本發(fā)明的實(shí)施例而完成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以清楚地了解可以進(jìn)行許多改變和修飾只要不偏離權(quán)利要求的精神和范圍。本說明書提到的所有公開物，專利和專利申請均整體引作多功能的參考，正如每個(gè)單獨(dú)的公開物，專利或?qū)＠暾埍痪唧w和單獨(dú)地指明引入?yún)⒖家粯印?br> 實(shí)施例1CRM197與Aβ肽的結(jié)合通過將具有39個(gè)賴氨酸殘基的活化載體CRM197與具有側(cè)基巰基的半抗原/抗原性肽使用如下所述的方法(圖1)反應(yīng)進(jìn)行半抗原/抗原性肽的結(jié)合作用。所有Aβ肽在羧基末端包含半胱氨酸殘基以促進(jìn)這些肽通過半胱氨?；鶐€基與載體蛋白結(jié)合。這些肽通過固相合成產(chǎn)生。
I.活化CRM197的自由氨基通過與過量溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)而被溴乙?；?Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(Bernatowicz和Matsueda，1986)。向冰冷的CRM197(約15mg)溶液中，添加10％(v/v)的1.0M NaHCO3(pH8.4)。將與使用的CRM197等重量的溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯溶解在200μL的二甲基甲酰胺(DMF)中，緩慢添加到CRM197中，并在室溫下暗處溫和攪拌1小時(shí)。將得到的溴乙?；?活化)的蛋白通過經(jīng)過脫鹽(P6-DG)柱使用PBS/1mM EDTA(pH7.0)作為洗脫劑而進(jìn)行純化。純化后，收集對應(yīng)于活化的CRM197的級(jí)分，并通過BCA蛋白分析估計(jì)蛋白濃度。蛋白質(zhì)的氨基，在用溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯處理前后都與2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSA)反應(yīng)，其用作溴乙?；闹甘?Means等，1972)。
II.結(jié)合在結(jié)合前，肽與5，5′-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)[Ellman試劑]反應(yīng)以驗(yàn)證自由-SH基的含量(62-88％被還原)。對于最先的四種Aβ肽(不具有接頭的氨基酸1-7，具有GAGAC接頭的氨基酸1-12，具有GAGAC接頭的氨基酸1-9，和具有GAGAC接頭的氨基酸1-7)，大約8.0-10.0mg的肽溶解在無菌蒸餾水中至濃度為大約20mg/ml。將肽以1∶1(w/w)比例緩慢添加到冷活化的CRM197中，通過添加20-36μL的1N NaOH將pH調(diào)整到大約7.0-7.2。將得到的材料在4℃暗處溫和攪拌過夜，隨后在暗處對兩次更換1L，pH7.2的PBS，進(jìn)行透析。對于隨后的四種肽(沒有接頭的氨基酸1-5，沒有接頭的氨基酸1-9，沒有接頭的1-12，和沒有接頭的氨基酸1-5)與Ellman試劑反應(yīng)用來驗(yàn)證自由-SH基。CRM197被如前所述溴乙?；兓⑴cTNBSA反應(yīng)。將各肽的pH通過添加2.2倍各溶解肽體積的0.1M NaPO4(pH8.5)而調(diào)整到7.0。肽以比例1∶1(w/w)被緩慢添加到冷活化的CRM197中，在4℃暗處反應(yīng)過夜。透析得到的材料。將最終的對照肽(1-12mer反向)使用除了如下改進(jìn)的如前所述的方法與CRM197結(jié)合。并非將肽的pH調(diào)整到7.0，而是通過添加20％(v/v)的0.5M NaPO4(pH 8.0)將活化的CRM197的pH調(diào)整到大約7.5。將透析后的各結(jié)合物轉(zhuǎn)移到無菌的15mL聚丙烯管中，用鋁箔包裹儲(chǔ)存在4℃。然后使用質(zhì)譜驗(yàn)證載體上活性氨基殘基的活化。
結(jié)合物 免疫原性肽Aβ1-5-C-CRM197DAEFR-C(SEQ.ID.NO.1)Aβ1-7-C-CRM197DAEFRHD-C(SEQ.ID NO.2)Aβ1-9-C-CRM197DAEFRHDSG-C(SEQ ID NO3)Aβ1-12-C-CRM197DAEFRHDSGYEV-C(SEQ ID NO4)Aβ1-5-L-C-CRM197DAEFR-GAGA-C(SEQ ID NO.5)Aβ1-7-L-C-CRM197DAEFRHD-GAGA-C(SEQ ID NO.6)Aβ1-9-L-C-CRM197DAEFRHDSG-GAGA-C(SEQ ID NO.7)Aβ1-12-L-C-CRM197DAEFRHDSGYEV-GAGA-C(SEQ ID NO.8)
Aβ12-1-C-CRMI97(-VE對照) VEYGSDHRFEAD-C(SEQ ID NO.9)L＝接頭(GAGA)(SEQ ID NO.10)實(shí)施例2Aβ肽-CRM197結(jié)合物的制備和通過超濾純化CRM197的溴乙?；疌RM197(100mg)的0.01M磷酸鈉緩沖液，0.9％NaCl，pH7.0溶液與溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(在DMSO中溶解至20mg/mL)以重量比1∶1在氬氣氛圍下反應(yīng)。按需要滴定反應(yīng)以維持pH在7.0?；旌衔镌诎堤幨覝叵聰嚢?.5小時(shí)。反應(yīng)混合物經(jīng)1.2μm過濾器過濾到UF/DF系統(tǒng)(Millipore Labscale TFF，Billerica，MA)的保留物貯存器中。使用10K或30K UF膜通過0.01M磷酸鈉緩沖液/0.9％NaCl，pH7.0中透濾(30-倍)完成純化。溴乙酰化的CRM197通過經(jīng)過0.2μm濾膜而進(jìn)行過濾。溴乙?；某潭韧ㄟ^將活化的CRM197與半胱氨酸反應(yīng)，隨后通過氨基酸分析和對得到的羧甲基半胱氨酸(CMC)進(jìn)行定量而進(jìn)行測定。
Aβ肽和溴乙酰化CRM197的結(jié)合和用N-乙酰半胱胺進(jìn)行加帽將溴乙?；疌RM197(50mg)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中。向所述保持在2-8℃的攪拌溶液，添加1M的碳酸鈉/碳酸氫鹽。在氬氣氛下進(jìn)行滴定以獲得目標(biāo)pH9.0。分別稱出50mg的Aβ肽并溶解在注射用水(WFI)中至20mg/mL。向這種溶液添加1M的碳酸鈉/碳酸氫鈉直到達(dá)到pH9.0。將肽溶液加到溴乙?；腃RM197溶液中，混合物在2-8℃攪拌14-18小時(shí)。對剩余的溴乙酰基用過量20倍摩爾數(shù)的N-乙酰半胱胺在2-8℃加帽3-6小時(shí)。
反應(yīng)混合物通過1.2μm濾器而過濾進(jìn)入U(xiǎn)F/DF系統(tǒng)(MilliporeXL)的保留物貯存器，將所述結(jié)合物在室溫下10K或30K MWCO膜(Millipore)上通過經(jīng)0.01M磷酸鈉緩沖液/0.9％NaCl，pH 7.0進(jìn)行30倍透濾而進(jìn)行純化。收集保留物，進(jìn)行0.2μm過濾，分析蛋白質(zhì)含量(Lowry或微量BCA比色分析)，經(jīng)SDS-PAGE，經(jīng)氨基酸分析，并分析在小鼠中的免疫原性。
實(shí)施例3通過對未反應(yīng)的溴乙酰基團(tuán)加帽而轉(zhuǎn)化為氨基乙?；鶎磳?shí)施例2的描述制備的溴乙酰化CRM197(50mg)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中。向維持在2-8℃的攪拌溶液加入1M的碳酸鈉/碳酸氫鈉。在氬氣氛下進(jìn)行滴定以獲得目標(biāo)pH9.0。分別稱重50mg Aβ肽，并溶解在WFI中至20mg/mL。向該溶液中添加1 M碳酸鈉/碳酸氫鈉直至獲得pH9.0。向溴乙?；腃RM197溶液中添加肽溶液，混合物在2-8℃攪拌14-18小時(shí)。使用8％碳酸氫銨溶液在2-8℃對剩余的溴乙?；用?個(gè)小時(shí)。
反應(yīng)混合物通過1.2μm濾器過濾進(jìn)入U(xiǎn)F/DF系統(tǒng)(Millipore XL)的保留物貯存器，在室溫下在10K或30K MWCO膜(Millipore)上通過經(jīng)0.01M磷酸鈉緩沖液/0.9％NaCl，pH7.0進(jìn)行30倍的透濾而純化所述結(jié)合物。收集保留物，進(jìn)行0.2μm過濾，分析蛋白質(zhì)含量(Lowry或微量BCA比色分析)，通過SDS-PAGE，通過氨基酸分析，并分析在小鼠中的免疫原性。
實(shí)施例4定量測定S-羧甲基半胱氨酸和S-羧甲基半胱胺進(jìn)行結(jié)合以及肽免疫原-蛋白/多肽結(jié)合物的加帽程度的評估使用溴乙?；罨瘜W(xué)性質(zhì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)-肽結(jié)合物的酸水解導(dǎo)致在結(jié)合物位點(diǎn)從半胱氨酸形成酸穩(wěn)定的S-羧甲基半胱氨酸(CMC)以及在加帽位點(diǎn)從半胱胺形成酸穩(wěn)定的S-羧甲基半胱胺(CMCA)(圖2)。所有結(jié)合的和加帽的賴氨酸被轉(zhuǎn)變回賴氨酸并照此檢測。所有其它的氨基酸被水解回到游離氨基酸，除被水解條件破壞的色氨酸和半胱氨酸之外。天冬酰胺和谷氨酰胺被分別地變?yōu)樘於彼岷凸劝彼帷?br> 用去離子水稀釋結(jié)合物樣品到總數(shù)蛋白質(zhì)濃度小于1mg/mL。干燥每種結(jié)合物的兩個(gè)10微克等份并重懸浮在100μL的6N HCl[Pierce]，5μL熔化的酚[Sigma-Aldrich]，和1μL的2-巰基乙醇[Sigma-Aldrich]中。在真空(100mT)下在110℃溫育然后樣品22小時(shí)。所得到的水解產(chǎn)物被干燥，重懸浮在250μL Beckman Na-S檸檬酸鈉樣品稀釋緩沖液(pH2.2)中[Beckman Instruments，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA]，并使用Whatman 0.2μm尼龍注射器頭過濾器和1mL注射器進(jìn)行過濾。
然后將每種樣品上樣到Beckman 6300氨基酸分析儀樣品環(huán)管并放入到分析儀中。使用離子交換層析分析分離各水解的樣品和對照組的氨基酸，隨后與Beckman茚三酮NinRX溶液在135℃反應(yīng)。然后在570nm和440nm可見光范圍內(nèi)檢測衍生的氨基酸(參見表1)。對各組分析而言，含有500皮摩爾的每種氨基酸的一組標(biāo)準(zhǔn)氨基酸[Pierce氨基酸標(biāo)準(zhǔn)H]與樣品和對照組一起進(jìn)行運(yùn)行。S-羧甲基半胱氨酸[Sigma-Aldrich]被加到所述標(biāo)準(zhǔn)品中。
表1在Beckman 6300氨基酸分析儀上使用梯度程序1的氨基酸保留時(shí)間

各標(biāo)準(zhǔn)峰面積用作成比例評估各樣品的定量等價(jià)物。從440nm測定脯氨酸，并使用谷氨酸，最接近的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)樵?70nm的等價(jià)物。
使用皮摩爾賴氨酸與存在于蛋白質(zhì)中的理論賴氨酸值的比較，將這些皮摩爾值的每一個(gè)轉(zhuǎn)化為氨基酸殘基的摩爾比率?；谫嚢彼峁矁r(jià)連接到半胱氨酸和半胱胺，以及預(yù)期相似的水解，挑選賴氨酸用于這種評估。然后將所得到的氨基酸摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)氨基酸組成相比較，與CMC和CMCA的值一起報(bào)道。CMC值被直接用于評估結(jié)合程度，CMCA值被直接用于評估加帽的程度。
實(shí)施例5Aβ-CRM197肽結(jié)合物的表征和優(yōu)化為了驗(yàn)證結(jié)合作用，通過氨基酸分析和基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時(shí)間(MALDI TOF)質(zhì)譜對所有的肽-CRM197結(jié)合物進(jìn)行分析。對于各結(jié)合物，對每摩爾CRM197的肽結(jié)合物的摩爾數(shù)通過氨基酸分析(S-羧甲基半胱氨酸殘基的數(shù)量)和MALDI-TOF質(zhì)譜測定。各種方法測定的值通常是一致的。
I.大小排阻層析從儲(chǔ)料取出一批濃縮的樣品并溫?zé)岬绞覝?。溫和地混合Aβ肽結(jié)合物樣品以保證得到均勻的制劑。在Eppendorf微量離心機(jī)中離心Aβ肽結(jié)合物樣品以除去所有顆粒?；厥丈锨逵糜赥osoHaas TSK-GelG3000SW層析(TosoHaas，Stuttgart，Germany)。TosoHaasTSK-GelG3000SW柱連接到HPLC系統(tǒng)，壓力上限設(shè)定為1.4Mpa。用至少30mL PBS(10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.2±0.1)以流速0.75mL/min對柱進(jìn)行平衡。使用下列參數(shù)將Aβ肽結(jié)合物上樣到TosoHaasTSK-Gel G3000SW柱Aβ肽結(jié)合物樣品的濃度1.5±1.0mg/mL流速0.75mL/min樣品體積0.1mL運(yùn)行時(shí)間30分鐘在280nm和210nm監(jiān)測吸收值。對長時(shí)間儲(chǔ)存而言，用至少50mL20％乙醇以流速0.5-1.0mL/分鐘對TosoHaas TSK-Gel G3000SW柱進(jìn)行平衡。
II.PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)
將活化的(溴乙?；?CRM197和Aβ肽-CRM197結(jié)合物通過SDS-凝膠使用NuPAGE Bis-Tris電泳(Novex，F(xiàn)rankfurt，Germany)以中性pH，預(yù)制聚丙烯酰胺微型凝膠系統(tǒng)和NuPAGE MES SDS電泳緩沖液進(jìn)行檢測。將8μg等分的各活化CRM或結(jié)合物與還原性樣品緩沖液混合并在100℃加熱5分鐘。將結(jié)合物和分子量(MW)標(biāo)準(zhǔn)品(Invitrogen，Carlsbad，CA)上樣到基于Bis-Tris-HCl緩沖系統(tǒng)的10％(w/v，丙烯酰胺)NuPage凝膠(Novex)上并在MES SDS電泳緩沖液-PAGE(Laemmli)中進(jìn)行電泳。在SDS-PAGE之后，用Pierce Gel CodeBlue(Pierce，Roclcford，IL)對凝膠染色。Aβ肽-CRM197結(jié)合物由天然CRM條帶之上的66kDa左右的主帶以及大約120kDa的二聚體條帶所代表，伴隨一些次要的多聚體條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。
III.肽-CRM197結(jié)合物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析質(zhì)譜被用于比較精確地(immediate)估計(jì)結(jié)合的程度。使用3，5-二甲氧基-4-羥基-肉桂酸(芥子酸)作為基質(zhì)通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析合適的等分的活化的CRM197和結(jié)合物樣品。通過MALDI-TOF質(zhì)譜測定(Finnigan MAT Lasermat 2000質(zhì)譜儀，Ringoes，NY)活化的CRM197的分子量被發(fā)現(xiàn)位于60.5kDa左右，而且根據(jù)結(jié)合程度(數(shù)據(jù)未顯示)對不同的結(jié)合物分子量從65kDa到74kDa變化。CRM197中多至22個(gè)賴氨酸(約50％)被發(fā)現(xiàn)以1∶1的比率被修飾。
IV.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)活化和結(jié)合的程度是試劑蛋白質(zhì)比例，反應(yīng)溫度和反應(yīng)緩沖液pH的函數(shù)。下面給出一些例子來示例用于鑒定最適pH條件以具有對于結(jié)合反應(yīng)而言可重復(fù)的過程控制參數(shù)所進(jìn)行的最佳結(jié)合條件。結(jié)果(圖3)顯示對Aβ5mer(DAEFRC)(SEQ ID NO1)以及Aβ7mer(DAEFRHDC)(SEQ ID NO2)的結(jié)合反應(yīng)是pH依賴性的，并當(dāng)反應(yīng)條件的pH提高時(shí)產(chǎn)生更高程度的修飾/結(jié)合。使用5mer和7mer肽的TFA鹽，以不同的肽上樣量在pH9.0評估結(jié)合的程度(圖4)。從這些結(jié)果可以顯見每個(gè)CRM分子具有限定數(shù)目的肽拷貝的肽結(jié)合物可以通過改變結(jié)合過程中肽/活化的CRM的比例而產(chǎn)生。使用Aβ7mer肽的乙酸鹽完成相似的實(shí)驗(yàn)。
對于Aβ1-7/CRM結(jié)合而言，通過每CRM的CMCA摩爾數(shù)與每CRM的CMC摩爾數(shù)的比較而評估加帽過程。由于對檢測的各肽CRM比率而言總CMC和CMCA是恒定的，假定加帽過程是完整的(圖5)。結(jié)合物的總修飾保持在19到21之間，可以與溴乙?；馁嚢彼岬臄?shù)目相比較(圖5)。這些實(shí)驗(yàn)通過以TFA作為肽的反離子進(jìn)行。使用肽的乙酸鹽而非TFA鹽重復(fù)Aβ1-7/CRM的結(jié)合，這些數(shù)據(jù)顯示在圖5和6中。隨著各點(diǎn)的總CMC和CMCA保持在20和22之間，加帽過程看起來將完成。Aβ-CRM結(jié)合反應(yīng)的條件被優(yōu)化為在pH9.0，結(jié)合程度通過反應(yīng)中肽與CRM的比率來進(jìn)行控制。通過將比率從0.1變?yōu)?.5，可以改變結(jié)合程度(圖6)。
活化和結(jié)合的程度是試劑蛋白質(zhì)比率，反應(yīng)溫度和反應(yīng)緩沖液pH的函數(shù)。各結(jié)合物修飾(結(jié)合作用)的程度通過從各結(jié)合物的質(zhì)量值減去活化的CRM197的質(zhì)量值并除以用于制備結(jié)合物的肽的質(zhì)量值而進(jìn)行計(jì)算。所有結(jié)合物的修飾(結(jié)合作用)程度描述在表2中。
結(jié)合的程度還與通過由每摩爾CRM197形成的S-羧甲基半胱氨酸殘基的估計(jì)量測定的值相比較(也顯示在表2中)。
表2修飾程度MALDI-TOF和AAA數(shù)據(jù)的比較

實(shí)施例6Aβ肽結(jié)合物的免疫原性研究各自結(jié)合到CRM197的跨越Aβ的N-末端殘基1-5，1-7，1-9和1-12的肽(有和沒有接頭序列GAGAC)和對應(yīng)于從氨基酸12到氨基酸1的反向序列的Aβ的N-末端(1-12mer反向序列)的肽被用于與STIMULONTMQS-21制劑中未結(jié)合的Aβ1-12mer肽一起免疫小鼠。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)一開始(第0周)和隨后在第3和6周皮下免疫與20μg佐劑STIMULONTMQS-21一起配制的30μg或5μg劑量的免疫樣品之一。該研究方案示例在表3中。
如表3所示，結(jié)合到CRM197的跨越Aβ的N-末端殘基1-5，1-7，1-9和1-12的肽(有和沒有接頭序列GAGAC)和對應(yīng)于從氨基酸12到氨基酸1的反向序列的Aβ的N-末端(1-12mer反向序列)的的肽，被用于與QS-21一起配制的制劑中未結(jié)合的Aβ1-12mer肽一起免疫小鼠。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)一開始(第0周)和隨后在第3和6周皮下免疫與20μg的佐劑QS-21配制在一起的30μg或5μg劑量的免疫樣品之一。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用Swiss Webster小鼠，每組5只小鼠。
注射體積＝100μl；B＝放血；V＝免疫；E＝取血。
通過下面描述的針對Aβ和CRM197的ELISA測定抗-Aβ的效價(jià)。簡單地說，Costar 96孔板(#3591)在室溫下用2μg/mL Aβ1-42的無菌碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液pH9.6包被過夜。傾空板并在室溫用200μl/孔的0.05％BSA的1X PBS/0.05％Tween 20溶液封閉2個(gè)小時(shí)。傾空封閉的板并用含有TBS，0.1％Brij-35(沒有疊氮化物)的洗滌緩沖液的洗板機(jī)洗滌。所有的原始抗血清用0.05％BSA的含0.05％Tween20/0.02％疊氮化物的1X PBS溶液梯度稀釋，并將100μL各稀釋物轉(zhuǎn)移到合適的板孔中，并在室溫孵育2小時(shí)。然后如上所述傾空/洗滌板。用0.05％BSA的含0.05％Tween 20/0.02％疊氮化物的PBS溶液1∶1000稀釋來自Southern Biotech(city，state)的堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗小鼠二級(jí)抗體，并向每孔加入100μL并在室溫下孵育1小時(shí)。然后如上所述傾空/洗滌板，最后以100μL/孔的在二乙醇胺/MgCl2，pH9.8中制備的1mg/mL的p-硝基苯基磷酸鹽底物的溶液在室溫下孵育1小時(shí)。通過添加50μL/孔3N NaOH而終止顏色反應(yīng)。在405nM讀取板并以690nM作為參考。在O.D.0.1 AU計(jì)算終點(diǎn)效價(jià)。
表3小鼠免疫研究方案


CRM197ELISAGreiner96孔板(#650011)用5.0μg/mL(100μ1/孔)的CRM197的無菌碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6在37℃包被90分鐘。傾空板并用含有1×TBS，0.1％Brij-35洗滌緩沖液的洗板機(jī)洗滌板。所有的初級(jí)抗血清用含有0.3％Tween20/EDTA的1XPBS梯度稀釋，各稀釋度的100μL溶液被轉(zhuǎn)移到合適的板孔內(nèi)，并在37℃孵育1小時(shí)。然后如上所述傾空/洗滌板。用含0.05％Tween 20/0.02％疊氮化物的1×PBS以1∶1000稀釋來自Southern Biotech的堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗小鼠IgG二級(jí)抗體，向每孔加入100μL并在室溫下孵育1小時(shí)。然后如上所述傾空/洗滌板，最后以100μL/孔的在二乙醇胺/MgCl2，pH9.8中制備的1mg/mL p-硝基苯基磷酸鹽底物的溶液在室溫下孵育1小時(shí)。通過添加50μL/孔的3N NaOH而終止顯色。在405nM讀取板并以690nM作為參考。在O.D為0.1AU計(jì)算終點(diǎn)效價(jià)。
表4-6示例了針對Aβ的終點(diǎn)ELISA效價(jià)。在初次免疫之后，全部8種結(jié)合物(排除陰性對照)誘導(dǎo)可測量的抗AβIgG免疫應(yīng)答。然而，30μg劑量，而非5μg劑量的Aβ在初次免疫后第3周產(chǎn)生陽性應(yīng)答。在所有結(jié)合物中，看起來有沒有接頭的Aβ1-7肽引發(fā)了與研究中的其他結(jié)合物一樣好或更好的應(yīng)答。在5μg劑量，Aβ1-5C在第8-16周有較好的應(yīng)答。Aβ1-7C在30μg劑量達(dá)到最佳。以5μg劑量或30μg劑量進(jìn)行的第二和第三次免疫后的抗體效價(jià)分析顯示對大多數(shù)結(jié)合物而言，在第二次免疫后看到針對Aβ的最大免疫應(yīng)答。至少在小鼠中，第三次免疫不顯示增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。然而Aβ肽需要以30μg劑量免疫三次以達(dá)到針對該肽的最大免疫應(yīng)答(表5)。就抗體隨時(shí)間延長而退化而言，用結(jié)合物免疫組的抗體水平與該組內(nèi)最高水平相比降低2到3倍。對各組而言分析第6周和第8周的單個(gè)樣品以計(jì)算針對Aβ的GMTs(表6)以觀察是否任一的結(jié)合物組都基本上由于其它組。來自第6周Aβ1-5C，Aβ1-7C和Aβ1-9C結(jié)合物的統(tǒng)計(jì)分析表明Aβ1-7結(jié)合物誘導(dǎo)顯著更高的效價(jià)。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)還明顯看出接頭序列GAGAC對于增強(qiáng)針對肽的免疫應(yīng)答沒有貢獻(xiàn)。
表4.

表4.使用來自5μg劑量的跨越淀粉樣Aβ肽N-未端不同長度的肽結(jié)合物的抗血清針對Aβ在第0，3，6，8，13和16周的ELISA終點(diǎn)效價(jià)，參考Elan超免疫多克隆抗體#592＝3,073,307。
終點(diǎn)在O.D.0.1AU。
用與20μgSTIMULONTMQS-21配制的5μg上述抗原在第0，3，和6周SC-N免疫SwissWebster小鼠。
表5.

表5.使用來自30μg劑量的跨越淀粉樣Aβ肽N-未端不同長度的肽結(jié)合物的抗血清針對Aβ在第0，3，6，8，13和16周的ELISA終點(diǎn)效價(jià)，參考Elan超免疫多克隆抗體#592＝3,073,307。
終點(diǎn)在O.D.0.1AU。
用與20μgSTIMULONTMQS-21配制的30μg上述抗原在第0，3和6周SC-N免疫Swiss Webster小鼠。
表6.

表6.使用來自30μg劑量的跨越淀粉樣Aβ肽N-末端不同長度的肽結(jié)合物的抗血清針對Aβ在第6和8周的ELISA終點(diǎn)GMTs。
參考Elan超免疫多克隆抗體#592＝3,073,307。
終點(diǎn)在O.D.0.1 AU。
用與20μg STIMULONTMQS-21配制的30μg上述抗原在第0，3和6周SC-N免疫Swiss Webster小鼠。
a.使用Tukey-Kramer對來自1-5C，1-7C和1-9C的第6周效價(jià)的統(tǒng)計(jì)分析顯示只在1-5C和1-7C之間存在統(tǒng)計(jì)差異，而使用Student′sT-檢驗(yàn)的分析顯示在1-5C和1-7C以及1-5C和1-9C之間存在統(tǒng)計(jì)差異。
b.對來自1-5C，1-7C和1-9C的第8周效價(jià)的統(tǒng)計(jì)分析未顯示在這三個(gè)組之間存在統(tǒng)計(jì)差異。然而，顯示在1-5C和1-7C之間有存在差異的趨勢。
PDABP小鼠腦組織染色PDABP腦組織染色分析提供了Aβ肽結(jié)合物和/或Aβ1-42抗血清功能的指示。來自單獨(dú)的小鼠組的血清樣品被單獨(dú)分析它們識(shí)別含有淀粉樣肽的PDABP小鼠腦組織斑的能力。結(jié)果顯示在表7A和7B中。除Aβ5mer結(jié)合物抗血清之外，在識(shí)別斑時(shí)具有劑量相關(guān)的應(yīng)答。與接頭無關(guān)，30μg結(jié)合物誘導(dǎo)的抗血清具有與5μg結(jié)合物抗血清比較更好的反應(yīng)性模式。然而，Aβ5mer結(jié)合物抗血清，似乎具有對于5μg組相似的或更好的反應(yīng)性。比較所有這些結(jié)果，可以得出結(jié)論由Aβ1-5mer至Aβ1-9mer制備的結(jié)合物足夠在小鼠中引發(fā)識(shí)別斑的免疫應(yīng)答，而接頭的存在不是必要的。從這個(gè)研究可以得出以下結(jié)論(a)所有肽結(jié)合物誘導(dǎo)高效價(jià)的針對載體蛋白CRM197的抗血清，其水平等于或略超過與未結(jié)合的CRM197對照組的水平(未顯示)。(b)具有GAGAC接頭的結(jié)合物與無接頭的結(jié)合物相比不增強(qiáng)免疫原性或功能。(c)免疫原性數(shù)據(jù)和PDABP腦組織染色(功能性抗體的初始指示)顯示Aβ1-5mer和Aβ1-7mer結(jié)合物似乎是對于進(jìn)一步研究開發(fā)的優(yōu)選免疫原。
表7A.PDABP小鼠腦組織染色

所有的抗血清以1∶1000稀釋用于染色過程。
表7B.PDABP小鼠腦組織染色

所有的抗血清以1∶1000稀釋用于染色過程。
實(shí)施例7猴子中的免疫原性研究在第0，29和58天6只猴的組接受30ug的7mer結(jié)合物(總結(jié)合物)，佐劑為STIMULONTMQS-21，明礬或RC 529SE制劑。其他組包括以明礬(Al(OH)3)或RC529SE作為佐劑的30ug 5mer結(jié)合物，以75和300μgAβ和STIMULONTMQS-21作為陽性對照。每兩周免疫陽性對照。在第36和64天測定抗Aβ抗體效價(jià)(圖7-9)。在第36天，連同STIMULONTMQS-21，明礬和RC 529SE的7mer/CRM結(jié)合物分別引發(fā)的GMT效價(jià)為10110，13330和17090(圖7)。比較起來，Aβ1-42加上STIMULONTMQS-21在75和300μg劑量水平分別引發(fā)223和1734效價(jià)的GMTs。Aβ5mer結(jié)合物以明礬作佐劑產(chǎn)生的效價(jià)為2134，以RC 529SE為佐劑產(chǎn)生的效價(jià)為15980。在第64日，即在3次劑量結(jié)合物加上STIMULONTMQS21或RC-529 SE作為佐劑誘導(dǎo)比第二次劑量后顯著高的效價(jià)(對于7mer/RC-529 SE，GMTs效價(jià)為69910；對于Aβ5mer/RC-529 SE為21640和對于Aβ7mer/STIMULONTMQS-21為30310)(圖8)。以明礬作為佐劑的結(jié)合物在第3次免疫后引發(fā)比第2次免疫后降低的效價(jià)?？雌饋鞟β7mer結(jié)合物與Aβ5mer結(jié)合物相比引發(fā)更好的應(yīng)答。在猴子中，用RC-529 SE或STIMULONTMQS-21作為佐劑使Aβ7mer結(jié)合物引發(fā)最高水平的應(yīng)答(圖9)。對以明礬為佐劑的Aβ7mer結(jié)合物的應(yīng)答為中等程度，并與以STIMULONTMQS-21為佐劑的300μg Aβ1-42的應(yīng)答相似。
從這個(gè)實(shí)施例可以得出數(shù)個(gè)結(jié)論。首先，在靈長類中兩種結(jié)合物都具有較好的免疫原性。第二，免疫制劑中存在佐劑會(huì)顯著影響免疫應(yīng)答。第三，除鋁佐劑之外，RC-529SE和STIMULONTMQS-21增強(qiáng)各劑量免疫后的免疫應(yīng)答至少直至3個(gè)劑量(圖9)?？傮w而言，Aβ7mer結(jié)合物在529，隨后STIMULONTMQS-21存在的情況下誘導(dǎo)更高的抗體應(yīng)答(參見圖9)。
實(shí)施例8多重抗原性肽(MAP)結(jié)合物的制備及其免疫原性研究多個(gè)方法可有效用于產(chǎn)生載體上的多抗原性位點(diǎn)。在前面的實(shí)施例中，各抗原性位點(diǎn)通過規(guī)定的結(jié)合作用和加帽化學(xué)反應(yīng)與載體分別結(jié)合。在這個(gè)實(shí)施例中，多抗原性位點(diǎn)通過固相合成串聯(lián)Aβ1-7mer重復(fù)而構(gòu)造?；蛘撸@些串聯(lián)重復(fù)可以通過別處描述的賴氨酸核心的連接或者不通過這種連接與T-細(xì)胞表位結(jié)合。這些多抗原肽以另外的半胱氨?；鶜埢糜诮Y(jié)合到所述載體蛋白而合成。合成在羧基端具有另外的半胱氨?；鶜埢暮幸粋€(gè)重復(fù)單位(1-7)，三個(gè)重復(fù)單位(1-7)3和五個(gè)重復(fù)單位(1-7)5的肽。這些肽通過它們的C-末端半胱氨酸殘基過夜共價(jià)連接到溴乙?；腃RM。反應(yīng)在pH9.0-9.2以表8列出的添加的肽CRM比率進(jìn)行。不與肽反應(yīng)的溴乙?；鶊F(tuán)用N-乙酰半胱胺加帽。這些批次分別代表含有一個(gè)單拷貝，三個(gè)串聯(lián)拷貝和五個(gè)串聯(lián)拷貝的結(jié)合到CRM的Aβ1-7肽的結(jié)合物。表8簡要列出樣品的性質(zhì)。
表8多抗原性肽(MAP)結(jié)合物樣品

肽上樣量(每種載體Aβ1-7肽的平均數(shù))和加帽數(shù)(表9)是通過氨基酸分析測定的每種載體的特定氨基酸(CMC或CMCA)的數(shù)目。CMC和CMCA值參考賴氨酸。
表9各結(jié)合物的結(jié)合和加帽程度

Swiss-Webster小鼠(每組10只)被皮下免疫1或0.1μgAβ/CRM結(jié)合的肽。半數(shù)的小鼠用與100μg佐劑Al(OH)3配制的組合物免疫，另一半不用佐劑而進(jìn)行免疫。免疫安排在第0周和第3周。安排在第0，3和6周取血。分析血清樣品針對Aβ-42mer肽的抗體應(yīng)答。結(jié)果顯示在表10中。
表10多抗原性肽(MAP)結(jié)合物的抗-Aβ終點(diǎn)效價(jià)

所有的結(jié)合物在初次免疫后誘導(dǎo)抗-Aβ1-42抗體效價(jià)，而在加強(qiáng)劑量后該水平顯著提高。在沒有鋁佐劑的情況下，劑量應(yīng)答的差異在第3周和第6周取血時(shí)都是明顯的。劑量越高引發(fā)的抗體應(yīng)答效價(jià)越高。在第3周，在兩個(gè)劑量水平(0.1和1μg)鋁佐劑引發(fā)與無佐劑組相比顯著更高的抗體應(yīng)答。在第二次免疫后，結(jié)合物在1μg劑量引發(fā)的抗體水平增加5到10倍。在這個(gè)劑量水平，具有3和5個(gè)重復(fù)的肽結(jié)合物誘導(dǎo)比含單個(gè)重復(fù)的結(jié)合物更高水平的抗體應(yīng)答。還測定了針對CRM載體的效價(jià)，這些效價(jià)列在表11中。
表11多抗原性肽(MAP)結(jié)合物的抗CRM終點(diǎn)效價(jià)

在第0和3周免疫動(dòng)物，在第0，3和6周取血。
佐劑100μg Al(OH)3或沒有佐劑。
ND＝未測定。
表11的數(shù)據(jù)表明無佐劑組在1μg和0.1μg劑量水平即使在兩次免疫后也都誘發(fā)非常低水平的抗CRM抗體應(yīng)答。然而，與氫氧化鋁佐劑的結(jié)合物在1μg劑量水平誘導(dǎo)顯著水平的抗CRM抗體應(yīng)答，而在0.1μg劑量水平誘導(dǎo)低得多的應(yīng)答。在佐劑存在下，對單重復(fù)結(jié)合物而言CRM效價(jià)最高，對三重復(fù)結(jié)合物而言為中等，對五重復(fù)結(jié)合物而言為最低。這與預(yù)期是一樣的，因?yàn)槊侩膭┝康腃RM劑量對于Aβ(1-7)5/CRM而言最低，而對于Aβ(1-7)1/CRM而言最高。對0.1μg劑量而言差別僅在第6周是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
本發(fā)明的目的是引發(fā)針對抗原性半抗原而不必需針對載體蛋白的高效價(jià)的免疫原性應(yīng)答。在某些情況下，需要的是引發(fā)針對半抗原抗原決定簇的最佳免疫應(yīng)答，而針對載體蛋白的免疫應(yīng)答最小或不產(chǎn)生。用于這種應(yīng)用，無佐劑制劑的具有串聯(lián)重復(fù)的多個(gè)抗原決定簇的結(jié)合物將滿足這種需要。
實(shí)施例9具有多種載體蛋白的Aβ-肽結(jié)合物的制備及其免疫原性本實(shí)施例使用六種不同的載體蛋白比較結(jié)合物的免疫原性。以1∶1的重量比在pH9將Aβ1-7的乙酸鹽添加到溴乙?；妮d體。除了Aβ1-7/rC5Aβ外所有的結(jié)合物用N-乙酰半胱胺加帽。所有可替代的載體為重組細(xì)菌蛋白，包括CRM(白喉類毒素)，重組C5a肽酶(rC5ap；克隆自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，包括D130A和S512A突變)，ORFs 1224，1664，2452(全部克隆自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes))以及T367，T858(各自克隆自肺炎衣原體(Chlamydiapneumoyaiae))。使用的載體的概述可以在表12中找到。各Aβ1-7結(jié)合物與這些載體的結(jié)合和加帽程度顯示在表13中。
這個(gè)研究顯示重組C5a肽酶結(jié)合物比測試的大多數(shù)其他載體誘導(dǎo)針對Aβ更高的效價(jià)，所述其他載體包括CRM。這個(gè)差異對于接受氫氧化鋁的組的第6周效價(jià)而言是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。此外，在沒有佐劑的情況下，Aβ1-7/T858結(jié)合物比大多數(shù)其他結(jié)合物的免疫原性更顯著。相對于CRM對照結(jié)合物而言效果較差的唯一結(jié)合物是Aβ1-7/T367，該結(jié)合物也不與Aβ特異性的單克隆抗體通過Western印跡反應(yīng)。該研究證實(shí)了許多其他的載體可以成功用于針對Aβ肽的免疫。
表12載體和結(jié)合物性質(zhì)的列表

表13各結(jié)合物的結(jié)合和加帽程度

結(jié)合結(jié)果肽上樣量(每個(gè)載體Aβ1-7肽的平均數(shù))和加帽數(shù)是通過氨基酸分析測定的每個(gè)載體的獨(dú)特氨基酸(CMC或CMCA)的數(shù)目。CMC和CMCA值參考賴氨酸。
免疫結(jié)果本研究中各組效價(jià)的幾何平均值列在表14中。在第3周，無論是否存在佐劑，Aβ1-7/rC5Aβ誘導(dǎo)比用化膿鏈球菌ORFs1224，1664，2452或肺炎衣原體ORFs T367和T858制備的相應(yīng)的結(jié)合物明顯更高的抗-Aβ效價(jià)。在第3周，缺乏佐劑的情況下，Aβ1-7/rC5ap也比其他的結(jié)合物更具免疫原性，除了Aβ1-7/T858。無Al(OH)3的T858結(jié)合物誘導(dǎo)比沒有佐劑的ORF1224，ORF1664，ORF2452和CRM結(jié)合物更高的效價(jià)。免疫原性顯著低于Aβ1-7/CRM的唯一結(jié)合物為Aβ1-7/T367(p＜0.00002)。T367載體在第3和6周有或沒有載體的情況下應(yīng)答都較差。在第6周，連同氫氧化鋁的rC5ap結(jié)合物比其他結(jié)合物更具免疫原性(p＜0.04)，除了Aβ1-7/ORF2452。在沒有佐劑的情況下，Aβ1-7/rC5ap和Aβ1-7/T858誘導(dǎo)比ORF1224，ORF1664或T367結(jié)合物顯著更高的效價(jià)。沒有氫氧化鋁的Aβ1-7/CRM誘導(dǎo)比Aβ1-7/ORF1664或Aβ1-7/T367更高的效價(jià)。
表14抗-Aβ1-42終點(diǎn)效價(jià)

在第0和3周免疫動(dòng)物，并在第0，3和6周取血。劑量基于結(jié)合物的總量。佐劑100μg Al(OH)3或沒有佐劑。
實(shí)施例10其他Aβ肽-蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備I.活化將凍融的CRM197(8mL，59.84mg，7.48mg/mL)溶解在0.1M硼酸鹽緩沖液(pH9，3.968mL)中以使?jié)舛葹?mg/mL。在冰浴下將溶液冷卻至0-5℃。將溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺(59.9mg)(Aldrich-Sigma)溶解在DMF(100μL)(Aldrich-Sigma)中并逐滴添加到CRM197的溶液中。在添加溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺后，觀察到沉淀。檢查pH，降低到pH6。反應(yīng)混合物的pH通過添加更多0.1M的硼酸鹽緩沖液而恢復(fù)到pH9。然后在4℃攪拌反應(yīng)混合物1hr，溫和震蕩。使用YM-10centriprep離心濃縮而純化和濃縮混合物，并在Sephadex G-25上使用10mM硼酸鹽作為洗脫劑而重提純。集中對Bradford試劑呈陽性的級(jí)分，并使用centriprep YM-10濃縮。通過Bradford分析(線性)測定溴乙?；某潭?。濃度為5.36mg/mL(產(chǎn)量30mg)。然后將終濃度調(diào)整為5mg/mL并存儲(chǔ)在冰箱中5％蔗糖中直至使用。
II.結(jié)合對于各結(jié)合作用而言，使用融化的溴乙酰化CRM197。將肽溶解在硼酸鹽緩沖液(2.5mg的125ml的0.1M硼酸鹽緩沖液)中。觀察到Aβ肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)，CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)，CKLVFFAED(SFQ ID NO48)和LVFFAEDC(SEQ ID NO50)的輕微不溶性。用肽溶液/懸浮液處理溴乙?；腃RM197(5mg/mL)?；旌衔镏须暮偷鞍踪|(zhì)的比例是1∶2。在具有肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)，CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)，CKLVFFAED(SEQ ID NO48)和KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)的結(jié)合物混合物中觀察到混濁。然后檢查混合物pH(pH9)并在4℃溫育過夜，同時(shí)緩慢渦旋。在溫育以前混合物的終濃度被調(diào)整至3mg/mL。具有肽CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)和LVFFAEDC(SEQ ID NO50)的結(jié)合物混合物的混濁在溫育后消失。然而，KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)和CKLVFFAED(SEQ ID NO48)仍然是微混濁的。還以與半胱胺比例為1∶1(w/w)制備了可溶性模擬蛋白質(zhì)結(jié)合物。從BIOSOURCE獲得純度大約95％的合成肽。
八聚體
LVFFAEDVC(SEQ ID NO44)KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)VFFAEDVGC(SEQ ID NO43)CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)CKLVFFAED(SEQ ID NO48)CVFFAEDVG(SEQ ID NO46)七聚體VFFAEDVC(SEQ ID NO49)LVFFAEDC(SEQ ID NO50)III.蛋白質(zhì)上未反應(yīng)的賴氨酸基團(tuán)的加帽未反應(yīng)的賴氨酸用N-乙酰半胱胺(CMCA；Aldrich-Sigma)以比例1/1(w/w)在4℃保持在暗處渦旋加帽4hr。通過使用Slide-A-Lyzer盒(Mw截留范圍10,000)(Pierce)對PBS緩沖液(2L)透析過夜(13hr)而從結(jié)合物中除去未反應(yīng)的肽和加帽試劑。進(jìn)行兩次緩沖液更換和透析(2×14hr)。在具有肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)和CKLVFFAED(SEQ ID NO48)的結(jié)合物中觀察到輕微的不溶性。然后將所有的結(jié)合物存儲(chǔ)在4℃冰箱內(nèi)的防腐劑中。
IV.蛋白質(zhì)載體的表征MALDI-TOF MS被用于測定溴乙?；腃RM197和模擬的結(jié)合物N-乙酰半胱胺-CRM197的質(zhì)量。
基于CRM197和溴乙酰化的CRM197的質(zhì)量，修飾了11個(gè)賴氨酸殘基。
(59941.46-58590.29)/122＝11其中CRM197的Mw為58624.29溴乙酰化的CRM197的Mw為59941.46
溴乙酸酯的Mw為122溴乙?；潭瘸^28％。(CRM197中賴氨酸的總數(shù)為39)。從這11個(gè)修飾的賴氨酸殘基中，10個(gè)與半胱胺偶聯(lián)。所述偶聯(lián)率為90％。
(61143-59941)/119＝10其中溴乙?；腃RM197的Mw為59941.46模擬結(jié)合物的Mw為61143N-乙酰半胱胺的Mw為119(10/11)×100＝90V.通過SDS-PAGE Western印跡表征肽-蛋白質(zhì)結(jié)合物用Tris-Tricine預(yù)制凝膠分析通過Western印跡分析所述蛋白質(zhì)-肽結(jié)合物。泳道如下分子量標(biāo)記(泳道1)；L-28375 24/01(泳道2)；L-28375 24/02(泳道3)；L-28375 24/03(泳道4)；L-28375 24/04(泳道5)；L-28375 24/05(泳道6)；L-28375 24/06(泳道7)L-28375 24/07(泳道8)；L-28375 24/08(泳道9)；L-28375 24/09(模擬物)(泳道10)；和BrAcCRM(泳道11)。來自小鼠的肽特異性單克隆抗體(248-6H9-806Aβ17-28)用作初級(jí)抗體(抗血清)(發(fā)現(xiàn)1∶3000的稀釋度是最好的)。山羊-抗小鼠IgG(H+L)-HPR是第二抗體(1∶1000的稀釋度)。觀察到初級(jí)抗體識(shí)別除模擬的結(jié)合物和活化的CRM197之外的所有結(jié)合物(參見圖10)。
蛋白濃度通過Pierce BCA分析測定結(jié)合物樣品的蛋白質(zhì)濃度(參見表15)。
氨基酸分析進(jìn)行氨基酸分析以測定結(jié)合程度。基于在結(jié)合物中發(fā)現(xiàn)的CMCA(羧甲基半胱胺)殘基計(jì)算出結(jié)合的T程度。CMCA被用于在與肽結(jié)合后使未反應(yīng)的活化位點(diǎn)加帽(參見表15)。
表15肽與BrAcCRM197的結(jié)合程度

使用微板分光光度計(jì)和SOFTmax Pro進(jìn)行全部的比色分析實(shí)施例11Swiss Webster小鼠中Aβ肽結(jié)合物的免疫原性研究用各自結(jié)合到CRM197的VFFAEDVG-C(SEQ ID NO43)，LVFFAEDV-C(SEQ ID NO44)，KLVFFAED-C(SEQID NO45)，C-VFFAEDVG(SEQID NO46)，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO47)，C-KLVFFAED(SEQ ID NO48)，VFFAEDV-C(SEQ ID NO49)，LVFFAED-C(SEQ ID NO50)或Aβ1-7CRM197免疫雜交的SwissWebster小鼠，全部用佐劑RC 529 SE配制。在研究的開始(第0周)以及隨后在第4周用Aβ肽結(jié)合物之一皮下免疫每組10只動(dòng)物的9個(gè)組。在免疫的同一天收集血清，但收集時(shí)間在免疫之前。
近交的Balb/c小鼠中Aβ肽結(jié)合物的免疫原性研究如前段所述免疫近交的Balb/c小鼠，但是還在第12周用結(jié)合物和佐劑加強(qiáng)免疫。
結(jié)果收集兩個(gè)研究中的血清用于分析Aβ13-28肽特異性的IgG抗體效價(jià)。還收集第12周加強(qiáng)免疫的前一天和此后一周來自Balb/c小鼠的血清用于分析。評價(jià)來自實(shí)施例11使用的動(dòng)物的脾細(xì)胞對用跨越Aβ1-42，全長Aβ1-42，CRM197的重疊肽庫或多克隆活化劑刺激的體外應(yīng)答的潛力。分析包括對白介素4和5以及干擾素-γ的Elispot讀數(shù)。在完成后，如上所述和實(shí)施例6的描述評價(jià)Aβ結(jié)合物。
實(shí)施例12PSABP小鼠中Aβ肽結(jié)合物的免疫原性研究用VFFAEDVG-C(SEQ ID NO43)，LVFFAEDV-C(SEQ ID NO44)，KLVFFAED-C(SEQ ID NO45)，C-VFFAEDVG(SFQ ID NO46)，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO47)，C-KLVFFAED(SEQ ID NO48)，VFFAEDV-C(SEQ ID NO49)，LVFFAED-C(SEQ ID NO50)免疫PSABP小鼠。PSABP小鼠，雙重轉(zhuǎn)基因小鼠(PSABP)過量表達(dá)的突變體ABP和PS1轉(zhuǎn)基因描述于Holcomb等的(1998)Nature Medicine 497-11。
PDAPP小鼠中Aβ肽結(jié)合物的免疫原性研究用VFFAEDVG-C(SEQ ID NO43)，LVFFAEDV-C(SEQ ID NO44)，KLVFFAED-C(SEQ ID NO45)，C-VFFAEDVG(SEQ ID NO46)，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO47)，C-KLVFFAED(SEQ ID NO48)，VFFAEDV-C(SEQ ID NO49)，LVFFAED-C(SEQ ID NO50)免疫PDAPP小鼠。PDAPP小鼠表達(dá)人APP(AppV71F)的突變形式并在年輕時(shí)發(fā)展阿爾茲海默病(Bard，等(2000)Nature Medicine 6916-919；Masliah E，等(1996)J Neurosci.15；16(18)5795-811)。
結(jié)果收集來自兩個(gè)研究的血清用于分析Aβ13-28肽特異性IgG的抗體效價(jià)。在完成后，如上所述以及如實(shí)施例6和11所述，以及關(guān)聯(lián)恐懼條件反射(contextual fear conditioning)(CFC)分析評價(jià)Aβ肽結(jié)合物。
關(guān)聯(lián)恐懼條件反射是在大多數(shù)動(dòng)物中，例如哺乳動(dòng)物非?？煽亢涂焖佾@得的常見的學(xué)習(xí)形式。試驗(yàn)動(dòng)物由于將中性刺激和/或環(huán)境與負(fù)面的經(jīng)歷相聯(lián)系從而學(xué)會(huì)害怕以前的中性刺激和/或環(huán)境(參見，例如，F(xiàn)anselow，Anim.Learn.Behav.18264-270(1990)；Wehner等，NatureGenet.17331-334.(1997)；Caldarone等，Nature Genet.17335-337(1997))。
關(guān)聯(lián)恐懼條件反射可尤其有效用于測定認(rèn)知的正常功能或例如，作為疾病或紊亂的結(jié)果的功能障礙，所述疾病例如神經(jīng)退行性疾病或紊亂，Aβ-相關(guān)疾病或紊亂，淀粉樣蛋白引起的疾病或紊亂，存在影響認(rèn)知功能的不需要的遺傳改變(例如，基因突變，基因斷裂或非所需的基因型)，和/或試劑的效力，例如Aβ結(jié)合劑或認(rèn)知能力。因此，CFC分析提供了獨(dú)立地檢驗(yàn)和/或確認(rèn)用于防止或治療認(rèn)知疾病或紊亂的試劑的治療效果的方法，尤其是影響腦的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的疾病或紊亂，例如，海馬，腦下腳，具環(huán)帶的皮質(zhì)，前額皮質(zhì)鼻周皮層，感覺皮層和中央顳葉。
通常，使用標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物腔和采用包含溫和刺激的條件訓(xùn)練進(jìn)行CFC分析(例如，0.35mA足部刺激)，與聽覺(例如，一段85db的白噪聲)，嗅覺(例如，杏仁或檸檬提取物)，觸覺(例如，籠舍底部網(wǎng)紋)和/或視覺線索(閃光)等刺激相結(jié)合。根據(jù)所選定的試驗(yàn)動(dòng)物，對負(fù)面經(jīng)歷(刺激)的應(yīng)答通常是突然停止運(yùn)動(dòng)(除呼吸之外缺少移動(dòng))但是還可以包括眨眼或瞬膜反射的改變。通常分別在訓(xùn)練的第一天表征負(fù)面應(yīng)答以測定本能的恐懼基線，而在隨后的試驗(yàn)日測定負(fù)面應(yīng)答結(jié)果，例如存在環(huán)境和/或線索但是缺少負(fù)面經(jīng)歷的情況下的突然停止運(yùn)動(dòng)被鑒定作為環(huán)境和線索條件恐懼。為提高可信度，試驗(yàn)用動(dòng)物通常由獨(dú)立的技術(shù)術(shù)人員單獨(dú)試驗(yàn)并隨時(shí)間的延長而進(jìn)行評分。在現(xiàn)有技術(shù)中存在另外的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，例如，在Crawley JN，What′s Wrong with Wrong with myMouse；Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice，Wiley-Liss，NY(2000)。
顯示淀粉樣蛋白引起的紊亂例如阿爾茲海默病特征性的明顯癥狀或病理狀況的示例試驗(yàn)動(dòng)物(如，模式動(dòng)物)包括哺乳動(dòng)物(如嚙齒累累或非人的靈長類)。模式動(dòng)物可以根據(jù)需要通過選擇性近交產(chǎn)生或者使用本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)遺傳工程化改造產(chǎn)生，從而使與癡呆紊亂相關(guān)的基因中靶向的遺傳變化(如基因突變，基因斷裂)導(dǎo)致靶向基因的錯(cuò)誤表達(dá)或錯(cuò)誤地發(fā)揮功能。例如，若干轉(zhuǎn)基因小鼠株系可以過量表達(dá)APP和發(fā)展淀粉狀斑病變和/或發(fā)展為阿爾茨海默病的特征的認(rèn)知障礙(參見，例如，Games等，上文，Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941550(1997)；Masliah E和Rockenstein E.(2000)J NeuralTransm Suppl.；59175-83)。
或者，可以通過使用化學(xué)化合物(例如神經(jīng)毒素，麻醉劑)或外科手術(shù)(例如立體定位切除，axotomization，橫切，吸引術(shù))切除或干擾解剖學(xué)上與淀粉樣蛋白引起的紊亂的特征性癥狀或病理狀態(tài)相關(guān)的腦區(qū)域(例如，海馬，扁桃體，鼻周皮層，中央間隔核，藍(lán)斑，mammalary bodies)或特定神經(jīng)元(例如，血清素能的，膽堿能或多巴胺能的神經(jīng)元)的正常功能，產(chǎn)生模式動(dòng)物。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物模型顯示出除了與淀粉樣蛋白引起的紊亂相關(guān)的神經(jīng)退行性病變之外顯著的與學(xué)習(xí)或者記憶相關(guān)的認(rèn)知障礙。更優(yōu)選地，所述認(rèn)知障礙隨年齡的增長而進(jìn)行性惡化，使得模式動(dòng)物中疾病發(fā)展與患淀粉樣蛋白引起的紊亂的個(gè)體的疾病發(fā)展相平行。
檢驗(yàn)此處描述的結(jié)合物官能性的關(guān)聯(lián)恐懼條件反射和其它體內(nèi)分析可以使用野生型小鼠或者具有某種導(dǎo)致?lián)p害記憶的遺傳變化的小鼠或者神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茲海默病的小鼠模型來進(jìn)行，所述小鼠模型包括在腦脊液(CSF)或血漿中顯示高水平可溶性Aβ的小鼠模型。例如阿爾茨海默病的動(dòng)物模型包括過量表達(dá)人淀粉狀前體蛋白(hAPPswe；Tg2576)的“Swedish”突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠顯示年齡依賴的記憶障礙和斑(Hsiao等(1996)，Science 27499-102)。此處描述的結(jié)合物的體內(nèi)官能性還可以使用PS-1突變小鼠進(jìn)行檢驗(yàn)，描述在Duff等(1996)Nature 383，710-713中。阿爾茨海默病其它的遺傳學(xué)改變的轉(zhuǎn)基因模型描述在Masliah E和Rockenstei E.(2000)J NeuralTransm Suppl.59175-83中。
在各個(gè)方面，本發(fā)明的方法包括給藥能夠改善受試者認(rèn)知的Aβ結(jié)合物，其中Aβ結(jié)合物已經(jīng)在使用適合預(yù)測受試者的免疫原性效力的分析中被鑒定。在示例性的實(shí)施方案中，該分析是至少部分基于與合適的對照組相比，在對動(dòng)物給藥試驗(yàn)的免疫試劑后來自關(guān)聯(lián)恐懼條件反射研究測定的比較認(rèn)知的模式動(dòng)物分析。CFC分析評價(jià)了在用潛在的治療性化合物處理后動(dòng)物(通常是小鼠或者大鼠)認(rèn)知的改變。在某些實(shí)施方案中，評價(jià)的認(rèn)知的變化是記憶損害狀態(tài)的改善或者記憶障礙的恢復(fù)。因此，CFC分析提供了用于測定防止或者治療認(rèn)知疾病的試劑的治療效果的直接方法，所述認(rèn)知疾病尤其是，影響腦的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的疾病或者紊亂， 如海馬，腦下腳，具環(huán)帶的皮質(zhì)，前額皮質(zhì)鼻周皮層，感覺皮層和中央顳葉。這種CFC分析在未決的2004年12月15日提交的美國專利申請60/XXX,XXX，標(biāo)題為“關(guān)聯(lián)恐懼條件反射用于預(yù)測免疫治療效力”(“Contextual Fear Conditioning forPredicting Immunotherapeutic Efficacy”)(專利律師文件號(hào)ELN-058-1)以及美國專利申請60/XXX,XXX，標(biāo)題為“關(guān)聯(lián)恐懼條件反射用于預(yù)測免疫治療效力”(“Contextual Fear Conditioning for PredictingImmunotherapeutic Efficacy”)(專利律師文件號(hào)ELN-058-2)中有討論，在此全文引入作為參考。
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1 510<210>7<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gly Ala Gly Ala Cys1 5 10<210>8<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Cys<210>9<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Val Glu Tyr Gly Ser Asp His Arg Phe Glu Ala Asp Cys1 5 10<210>10
<211>4<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Gly Ala Gly Ala1<210>11<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10<210>12<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>12Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>13<211>16<212>PRT
<213>Homo sapiens<400>13Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val1 5 10 15<210>14<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>14Phe Glu Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile1 5 10<210>15<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly1 5 10 15Asn Glu Gly<210>16<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>16
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<210>22<211>22<212>PRT<213>Homo sapiens<400>22Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>23<211>28<212>PRT<213>Homo sapiens<400>23Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp1 5 10 15Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu20 25<210>24<211>43<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu20 25 30Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu35 40<210>25<211>22<212>PRT<213>Homo sapiens<400>25Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>26<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc feature<222>(3)..(3)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>26Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu1 5 10 15
Phe Arg His Asp20<210>27<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>27Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala20 25 30Ala Ala<210>28<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>28
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg20 25 30His Asp<210>29<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>29Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu1 5 10 15Lys Ala Ala ALa20<210>30<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>31<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>31Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>32<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>32Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>33<211>34<212>PRT
<213>Homo sapiens<400>33Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg20 25 30His Asp<210>34<211>27<212>PRT<213>Homo sapiens<400>34Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp20 25<210>35<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<400>35Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15
Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu20 25 30Ala Thr<210>36<211>27<212>PRT<213>Homo sapiens<400>36Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys1 5 10 15Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr2025<210>37<211>79<212>PRT<213>Homo sapiens<400>37Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser20 25 30Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile35 40 45
Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro50 55 60Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp65 70 75<210>38<211>58<212>PRT<213>Homo sapiens<400>38Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly20 25 30Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg35 40 45Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu50 55<210>39<211>44<212>PRT<213>Homo sapiens<400>39Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp20 25 30Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu35 40<210>40<211>535<212>PRT<213>Homo sapiens<400>40Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn1 5 10 15Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln20 25 30Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp35 40 45Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly50 55 60Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val65 70 75 80Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu100 105 110Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly115 120 125Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser130 135 140Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser145 150 155 160Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp165 170 175Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg180 185 190Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val195 200 205Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly210 215 220Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu225 230 235 240Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu245 250 255
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420 425 430Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr435 440 445His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile450 455460Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly465470 475 480Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser485 490 495Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu500 505 510Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser515 520 525Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser530 535<210>41<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>41Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly1 5 10 15
Arg<210>42<211>42<212>PRT<213>Mus musculus<400>42Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>43<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
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<213>Artificial<220>
<223>A-beta 17-24+C<400>44Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 16-23+C<400>45Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys1 5<210>46<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 18-25+C<400>46Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly1 5<210>47<211>9
<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 18-25<400>47Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val1 5<210>48<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 16-23<400>48Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp1 5<210>49<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 18-24+C<400>49Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys1 5<210>50
<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 17-23+C<400>50Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys1 5<210>51<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 16-22+C<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>CRM 197 added via terminal cysteine<400>51Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Cys1 5<210>52<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 18-24
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>CRM 197 added via N-terminal cysteine<400>52Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val1 5<210>53<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 17-23<400>53Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp1 5<210>54<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 16-22+C<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>CRM 197 added via N-terminal cysteine<400>54
Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu1 權(quán)利要求
1.一種通過肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)將肽免疫原與具有一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合的方法，該方法包括以下步驟(a)衍生蛋白質(zhì)/多肽載體的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)或任選衍生連接于蛋白質(zhì)/多肽載體的多肽接頭的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，以產(chǎn)生具有活性位點(diǎn)的衍生的載體；(b)將步驟(a)的衍生的蛋白質(zhì)/多肽載體與肽免疫原的氨基酸的活性基團(tuán)在使肽免疫原通過官能團(tuán)與衍生的蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)；和(c)另外將結(jié)合物與加帽試劑反應(yīng)以使衍生的蛋白質(zhì)/多肽載體上自由活性的未反應(yīng)的官能團(tuán)失活，從而保留載體的官能度，以便保持其引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，這種免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的載體選自人血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)ORF1224，化膿鏈球菌ORF1664，化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體(Chlafnydia pneumoniae)ORFT367，肺炎衣原體ORFT858，破傷風(fēng)類毒素，HIVgp120 T1，識(shí)別微生物表面粘附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)的組分，生長因子，激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的載體包含T-細(xì)胞表位。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的載體是細(xì)菌類毒素。
5.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是流感血凝素。
6.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是PADRE多肽。
7.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白。
8.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
9.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是熱休克蛋白65(HSP 65)。
10.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是來自結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(BCG)的多肽。
11.權(quán)利要求4的方法，其中的載體是破傷風(fēng)類毒素。
12.權(quán)利要求4的方法，其中細(xì)菌類毒素是CRM197。
13.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是重組鏈球菌C5a肽酶。
14.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1224。
15.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1664。
16.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF2452。
17.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是肺炎衣原體ORFT367。
18.權(quán)利要求3的方法，其中的載體是肺炎衣原體ORFT858。
19.權(quán)利要求1的方法，其中的載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的生長因子或激素選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
21.權(quán)利要求1的方法，其中的肽免疫原選自細(xì)菌蛋白、病毒蛋白和真核生物的蛋白。
22.權(quán)利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自來自細(xì)菌的蛋白抗原。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的細(xì)菌選自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphlylococcus epidermidis)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，大腸桿菌(Esherichia coli)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)，肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)，Pseudomonas aerations，鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)，包氏疏螺旋體Borrelia burgdorferi，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)，鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysentriae)，耳炎差異球菌(Alloiococcus otitidis)和B類鏈球菌。
24.權(quán)利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自來自病毒的蛋白抗原。
25.權(quán)利要求24的方法，其中的病毒選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
26.權(quán)利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自來自真菌的蛋白抗原。
27.權(quán)利要求26的方法，其中的真菌選自白假絲酵母(Candidaalbicaiis)，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，組織漿菌，和曲霉。
28.權(quán)利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自來自寄生蟲的蛋白抗原。
29.權(quán)利要求28的方法，其中的寄生蟲選自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲。
30.權(quán)利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自來自真核生物的蛋白抗原。
31.權(quán)利要求30的方法，其中的真核生物是人。
32.權(quán)利要求31的方法，其中來自人的肽免疫原衍生自惡性腫瘤。
33.權(quán)利要求32的方法，其中的腫瘤抗原選自腎細(xì)胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺癌特異性抗原。
34.權(quán)利要求31的方法，其中的肽免疫原來自人Aβ多肽。
35.權(quán)利要求34的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域。
36.權(quán)利要求34的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端區(qū)域。
37.權(quán)利要求34的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的內(nèi)部區(qū)域。
38.權(quán)利要求35的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ31-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
39.權(quán)利要求34的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
40.權(quán)利要求34的方法，其中的Aβ肽免疫原的一個(gè)或多個(gè)片段與另一肽免疫原融合。
41.權(quán)利要求40的方法，其中的Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原分子的N-末端。
42.權(quán)利要求40的方法，其中的Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同的另一個(gè)Aβ肽免疫原分子的C-末端。
43.權(quán)利要求40的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
44.權(quán)利要求40的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
45.權(quán)利要求41，42，43或44的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
46.權(quán)利要求41，42，43或44的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
47.權(quán)利要求40的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子連接到一個(gè)或多個(gè)異源肽分子。
48.權(quán)利要求47的方法，其中的Aβ多肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
49.權(quán)利要求47的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
50.權(quán)利要求47的方法，其中的異源肽選自T-細(xì)胞表位，B-細(xì)胞表位及其組合。
51.權(quán)利要求40的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)構(gòu)象連接在一起。
52.權(quán)利要求40的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子與一個(gè)或多個(gè)不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
53.權(quán)利要求51或52的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
54.權(quán)利要求51或52的方法，其中Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
55.權(quán)利要求1的方法，其中使用交聯(lián)劑衍生蛋白質(zhì)/多肽載體或任選連接的多肽接頭的一個(gè)或多個(gè)氨基酸分子的官能團(tuán)。
56.權(quán)利要求55的方法，其中的衍生試劑是零長度交聯(lián)劑。
57.權(quán)利要求55的方法，其中的衍生試劑是同型雙功能交聯(lián)劑。
58.權(quán)利要求55的方法，其中的衍生試劑是異型雙功能交聯(lián)劑。
59.權(quán)利要求55的方法，其中的蛋白質(zhì)/多肽載體與鹵乙酰化試劑反應(yīng)。
60.權(quán)利要求58的方法，其中的異型雙功能試劑是與蛋白質(zhì)/多肽載體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的伯胺或ε-胺官能團(tuán)以及肽免疫原的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的側(cè)基硫醇基反應(yīng)的試劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中的異型雙功能試劑選自N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯，N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羰酸酯(SMCC)。
62.權(quán)利要求61的方法，其中的伯胺或ε-胺官能團(tuán)是賴氨酸。
63.權(quán)利要求60的方法，其中的側(cè)基硫醇基是肽免疫原的半胱氨酸殘基。
64.權(quán)利要求63的方法，其中的半胱氨酸殘基位于肽免疫原的氨基末端。
65.權(quán)利要求63的方法，其中的半胱氨酸殘基位于肽免疫原的羧基末端。
66.權(quán)利要求63的方法，其中的半胱氨酸殘基位于肽免疫原的內(nèi)部。
67.權(quán)利要求63的方法，其中的側(cè)基硫醇基由硫醇化試劑產(chǎn)生。
68.權(quán)利要求67的方法，其中硫醇基化試劑是N-乙酰基同型半胱氨酸硫內(nèi)酯。
69.權(quán)利要求1的方法，其中用于使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上的自由活性官能團(tuán)失活的加帽試劑選自半胱胺、N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
70.權(quán)利要求1的方法，其中用于使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上自由活性官能團(tuán)失活的加帽試劑選自氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫銨和氨。
71.權(quán)利要求1的方法，其中肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)是自由巰基。
72.權(quán)利要求1的方法，其中一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)位于接頭上，其任選連接到蛋白質(zhì)/多肽載體。
73.權(quán)利要求72的方法，其中的接頭是肽接頭。
74.權(quán)利要求73的方法，其中的肽接頭是聚賴氨酸。
75.一種將肽免疫原與具有以下結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合的方法 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，X是蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，其中m是大于0但小于等于85的整數(shù)，所述方法包括以下步驟(a)衍生蛋白質(zhì)/多肽載體或任選連接的多肽接頭的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，以產(chǎn)生具有活性位點(diǎn)的衍生的分子；(b)將步驟(a)的衍生的蛋白質(zhì)/多肽載體與肽免疫原的氨基酸殘基的活性基團(tuán)反應(yīng)，以形成共價(jià)結(jié)合的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物；和(c)將所述結(jié)合物與加帽試劑進(jìn)一步反應(yīng)以使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上自由活性官能團(tuán)失活，以便加帽的基團(tuán)不與其他分子自由反應(yīng)，從而保留載體的官能度，使其保持引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，這種免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生，從而產(chǎn)生具有以下通式的加帽的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體；Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，以及p是大于0但是小于85的整數(shù)。
76.權(quán)利要求75的方法，其中的載體選自血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，結(jié)核分枝桿菌，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組的鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌ORF1224，化膿鏈球菌ORF1664，化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體ORFT367，肺炎衣原體ORFT858，破傷風(fēng)類毒素，HIVgp120 T1，識(shí)別微生物表面粘附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)的組分，生長因子，激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
77.權(quán)利要求76的方法，其中的載體包含T-細(xì)胞表位。
78.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是細(xì)菌類毒素。
79.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是流感血凝素。
80.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是PADRE多肽。
81.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白。
82.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
83.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是熱休克蛋白65(HSP65)。
84.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是來自結(jié)核分支桿菌(BCG)的多肽。
85.權(quán)利要求78的方法，其中的載體是破傷風(fēng)類毒素。
86.權(quán)利要求78的方法，其中細(xì)菌類毒素是CRM197。
87.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是鏈球菌rC5a肽酶。
88.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1224。
89.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1664。
90.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF2452。
91.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是肺炎衣原體ORFT367。
92.權(quán)利要求77的方法，其中的載體是肺炎衣原體ORFT858。
93.權(quán)利要求75的方法，其中的載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
94.權(quán)利要求93的方法，其中的生長因子或激素選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1，MIP-1β和RANTES。
95.權(quán)利要求75的方法，其中的肽免疫原選自細(xì)菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
96.權(quán)利要求95的方法，其中的肽免疫原衍生自來自細(xì)菌的蛋白抗原。
97.權(quán)利要求96的方法，其中的細(xì)菌選自肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，大腸桿菌，克雷伯氏腸桿菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，霍亂弧菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，肉毒梭狀芽孢桿菌，假單胞菌，鼠傷寒沙門菌，包氏疏螺旋體，弗氏志賀氏菌，鮑氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，耳炎差異球菌和B類鏈球菌。
98.權(quán)利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自來自病毒的蛋白抗原。
99.權(quán)利要求98的方法，其中的病毒選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
100.權(quán)利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自來自真菌的蛋白抗原。
101.權(quán)利要求100的方法，其中的真菌選自白假絲酵母(Candidaalbicaiis)，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，組織漿菌和曲霉。
102.權(quán)利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自來自寄生蟲的蛋白抗原。
103.權(quán)利要求102的方法，其中的寄生蟲選自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲。
104.權(quán)利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自來自真核生物的蛋白抗原。
105.權(quán)利要求104的方法，其中的真核生物是人。
106.權(quán)利要求105的方法，其中來自人的肽免疫原衍生自惡性腫瘤。
107.權(quán)利要求106的方法，其中的腫瘤抗原是腎細(xì)胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺癌特異性抗原。
108.權(quán)利要求105的方法，其中的肽免疫原來自人Aβ多肽。
109.權(quán)利要求108的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域。
110.權(quán)利要求108的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端區(qū)域。
111.權(quán)利要求108的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的內(nèi)部區(qū)域。
112.權(quán)利要求108的方法，其中的肽免疫原是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
113.權(quán)利要求108的方法，其中的肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
114.權(quán)利要求108的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原的分子與另一肽免疫原融合。
115.權(quán)利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到另一相同Aβ肽免疫原分子的N-末端。
116.權(quán)利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到另一相同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
117.權(quán)利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
118.權(quán)利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
119.權(quán)利要求115，116，117或118的方法，其中Aβ片段衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
120.權(quán)利要求115，116，117或118的方法，其中的Aβ片段是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
121.權(quán)利要求114的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子融合到一個(gè)或多個(gè)異源肽分子。
122.權(quán)利要求121的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
123.權(quán)利要求121的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
124.權(quán)利要求121的方法，其中異源肽選自T-細(xì)胞表位，B-細(xì)胞表位及其組合。
125.權(quán)利要求114的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
126.權(quán)利要求114的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子與一個(gè)或多個(gè)不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
127.權(quán)利要求125或126的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
128.權(quán)利要求125或126的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
129.權(quán)利要求75的方法，其中使用交聯(lián)劑衍生蛋白質(zhì)/多肽載體或任選連接的多肽接頭的一個(gè)或多個(gè)氨基酸分子的官能團(tuán)。
130.權(quán)利要求129的方法，其中的衍生試劑是零長度交聯(lián)劑。
131.權(quán)利要求129的方法，其中的衍生試劑是同型雙功能交聯(lián)劑。
132.權(quán)利要求129的方法，其中的衍生試劑是異型雙功能交聯(lián)劑。
133.權(quán)利要求129的方法，其中的蛋白質(zhì)/多肽載體與鹵乙酰化試劑反應(yīng)。
134.權(quán)利要求133的方法，其中的異型雙功能試劑是與蛋白質(zhì)/多肽載體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的伯胺或ε-胺官能團(tuán)以及肽免疫原的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的側(cè)基硫醇基反應(yīng)的試劑。
135.權(quán)利要求134的方法，其中的異型雙功能試劑是N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯，N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羰酸酯(SMCC)。
136.權(quán)利要求134的方法，其中的伯胺或ε-胺官能團(tuán)是賴氨酸。
137.權(quán)利要求136的方法，其中用N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯衍生蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基賴氨酸的伯胺或ε-胺官能團(tuán)導(dǎo)致蛋白質(zhì)/多肽載體上賴氨酸殘基的伯胺或ε-胺官能團(tuán)的溴乙?；?。
138.權(quán)利要求134的方法，其中的側(cè)基硫醇基是肽免疫原的半胱氨酸殘基。
139.權(quán)利要求138的方法，其中的半胱氨酸殘基位于肽免疫原的氨基末端。
140.權(quán)利要求138的方法，其中的半胱氨酸殘基位于肽免疫原的羧基末端。
141.權(quán)利要求138的方法，其中的半胱氨酸殘基位于肽免疫原的內(nèi)部。
142.權(quán)利要求138的方法，其中的側(cè)基硫醇基由硫醇化試劑產(chǎn)生。
143.權(quán)利要求142的方法，其中的硫醇化試劑是N-乙酰同型半胱氨酸硫內(nèi)酯。
144.權(quán)利要求75的方法，其中用于使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上自由活性官能團(tuán)失活的加帽試劑選自半胱胺、N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
145.權(quán)利要求75的方法，其中用于使活化的蛋白質(zhì)/多肽載體上自由活性官能團(tuán)失活的加帽試劑選自氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫銨和氨。
146.權(quán)利要求75的方法，其中的肽免疫原氨基酸殘基的活性基團(tuán)是自由巰基。
147.權(quán)利要求75的方法，其中的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)位于接頭上，所述接頭任選連接到蛋白質(zhì)/多肽載體上。
148.權(quán)利要求147的方法，其中的接頭是肽接頭。
149.權(quán)利要求148的方法，其中的肽接頭是聚賴氨酸。
150.一種肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物，其中的蛋白質(zhì)/多肽載體具有如下通式的結(jié)構(gòu) 其中C是蛋白質(zhì)/多肽載體，X是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的可衍生官能團(tuán)，其中m是大于0但小于等于85的整數(shù)，并且，其中的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物具有如下通式的結(jié)構(gòu) 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體上氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，從而保持載體的官能度，以便維持其引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)是不會(huì)發(fā)生，n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，p是大于0但是小于85的整數(shù)。
151.權(quán)利要求150的結(jié)合物，其中的載體選自血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，結(jié)核分枝桿菌，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌ORF1224，化膿鏈球菌ORF1664，化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體ORFT367，肺炎衣原體ORFT858，破傷風(fēng)類毒素，HIVgp120 T1，識(shí)別微生物表面粘附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)的組分，生長因子，激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
152.權(quán)利要求150的結(jié)合物，其中的載體包含T-細(xì)胞表位。
153.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是細(xì)菌類毒素。
154.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是流感血凝素。
155.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是PADRE多肽。
156.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白。
157.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
158.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是熱休克蛋白65(HSP65)。
159.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是來自結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(BCG)的多肽。
160.權(quán)利要求153的結(jié)合物，其中的載體是破傷風(fēng)類毒素。
161.權(quán)利要求153的結(jié)合物，其中的細(xì)菌類毒素是CRM197。
162.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是鏈球菌rC5a肽酶。
163.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1224。
164.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1664。
165.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF2452。
166.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是肺炎衣原體ORFT367。
167.權(quán)利要求152的結(jié)合物，其中的載體是肺炎衣原體ORFT858。
168.權(quán)利要求150的結(jié)合物，其中的載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
169.權(quán)利要求168的結(jié)合物，其中的生長因子或激素選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
170.權(quán)利要求150的結(jié)合物，其中的肽免疫原選自細(xì)菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
171.權(quán)利要求170的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自細(xì)菌的蛋白抗原。
172.權(quán)利要求171的結(jié)合物，其中細(xì)菌選自肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，大腸桿菌，克雷伯氏腸桿菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，霍亂弧菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，肉毒梭狀芽孢桿菌，假單胞菌，鼠傷寒沙門菌，包氏疏螺旋體，弗氏志賀氏菌，鮑氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，耳炎差異球菌和B類鏈球菌。
173.權(quán)利要求170的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自病毒的蛋白抗原。
174.權(quán)利要求173的結(jié)合物，其中的病毒選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
175.權(quán)利要求170的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自真菌的蛋白抗原。
176.權(quán)利要求175的結(jié)合物，其中的真菌選自白假絲酵母，新型隱球菌，球孢菌，組織漿菌，和曲霉。
177.權(quán)利要求170的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自寄生蟲的蛋白抗原。
178.權(quán)利要求177的結(jié)合物，其中的寄生蟲選自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲。
179.權(quán)利要求170的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自真核生物的蛋白抗原。
180.權(quán)利要求179的結(jié)合物，其中的真核生物是人。
181.權(quán)利要求180的結(jié)合物，其中來自人的肽免疫原衍生自惡性腫瘤。
182.權(quán)利要求181的結(jié)合物，其中的腫瘤抗原選自腎細(xì)胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺特異性膜抗原(PSMA)。
183.權(quán)利要求180的結(jié)合物，其中的肽免疫原來自人Aβ多肽。
184.權(quán)利要求183的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域。
185.權(quán)利要求183的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端區(qū)域。
186.權(quán)利要求183的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的內(nèi)部區(qū)域。
187.權(quán)利要求183的結(jié)合物，其中的肽免疫原是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
188.權(quán)利要求183的結(jié)合物，其中的肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
189.權(quán)利要求183的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ分子與另一肽免疫原的一個(gè)或多個(gè)分子融合。
190.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原的另一個(gè)分子的N-末端。
191.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到另一相同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
192.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原的分子的C-末端。
193.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原的分子的C-末端。
194.權(quán)利要求190，191，192或193的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
195.權(quán)利要求190，191，192或193的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
196.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子連接到一個(gè)或多個(gè)異源肽分子。
197.權(quán)利要求196的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
198.權(quán)利要求196的結(jié)合物，其中的Aβ片段是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
199.權(quán)利要求196的結(jié)合物，其中的異源肽選自T-細(xì)胞表位，B-細(xì)胞表位及其組合。
200.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
201.權(quán)利要求189的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子與一個(gè)或多個(gè)不同的Aβ肽免疫原拷貝以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接。
202.權(quán)利要求200或201的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
203.權(quán)利要求200或201的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
204.根據(jù)權(quán)利要求75的方法產(chǎn)生的肽免疫原-蛋白質(zhì)/多肽載體結(jié)合物，其具有通式如下的結(jié)構(gòu) 其中，C是蛋白質(zhì)/多肽載體，Xd是蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選為共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，R是加帽分子，其共價(jià)連接到蛋白質(zhì)/多肽載體的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，或任選共價(jià)連接到與蛋白質(zhì)/多肽載體共價(jià)連接的肽接頭的氨基酸殘基的衍生官能團(tuán)，從而保持載體的官能度，以便維持其引發(fā)所需的針對肽免疫原的免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答在沒有載體時(shí)不會(huì)發(fā)生，n是大于0但是小于等于85的整數(shù)，p是大于0但是小于85的整數(shù)。
205.權(quán)利要求204的結(jié)合物，其中的載體選自人血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，結(jié)核分枝桿菌，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)ORF1224，化膿鏈球菌ORF1664，化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體(Chlafnydiapneumoniae)ORFT367，肺炎衣原體ORFT858，破傷風(fēng)類毒素，HIVgp120 T1，識(shí)別微生物表面粘附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)的組分，生長因子，激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
206.權(quán)利要求204的結(jié)合物，其中的載體包含T-細(xì)胞表位。
207.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是細(xì)菌類毒素。
208.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是流感血凝素。
209.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是PADRE多肽。
210.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白。
211.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
212.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是熱休克蛋白65(HSP65)。
213.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是來自結(jié)核分支桿菌(BCG)的多肽。
214.權(quán)利要求207的結(jié)合物，其中的載體是破傷風(fēng)類毒素。
215.權(quán)利要求207的結(jié)合物，其中細(xì)菌類毒素是CRM197。
216.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是鏈球菌rC5a肽酶。
217.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1224。
218.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1664。
219.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF2452。
220.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是肺炎衣原體ORFT367。
221.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是肺炎衣原體ORFT858。
222.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
223.權(quán)利要求222的結(jié)合物，其中的生長因子或激素選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
224.權(quán)利要求206的結(jié)合物，其中的肽免疫原選自細(xì)菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
225.權(quán)利要求224的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自細(xì)菌的蛋白抗原。
226.權(quán)利要求225的結(jié)合物，其中的細(xì)菌選自其中細(xì)菌選自肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，大腸桿菌，克雷伯氏腸菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，霍亂弧菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，肉毒梭狀芽孢桿菌，假單胞菌，鼠傷寒沙門菌，包氏疏螺旋體，弗氏志賀氏菌，鮑氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，耳炎差異球菌和B類鏈球菌。
227.權(quán)利要求224的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自病毒的蛋白抗原。
228.權(quán)利要求227的結(jié)合物，其中的病毒選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
229.權(quán)利要求224的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自真菌的蛋白抗原。
230.權(quán)利要求229的結(jié)合物，其中的真菌選自白假絲酵母，新型隱球菌，球孢菌，組織漿菌和曲霉。
231.權(quán)利要求224的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自寄生蟲的蛋白抗原。
232.權(quán)利要求231的結(jié)合物，其中的寄生蟲選自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲。
233.權(quán)利要求224的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自來自真核生物的蛋白抗原。
234.權(quán)利要求233的結(jié)合物，其中的真核生物是人。
235.權(quán)利要求234的結(jié)合物，其中來自人的肽免疫原衍生自惡性腫瘤。
236.權(quán)利要求235的結(jié)合物，其中的腫瘤抗原選自腎細(xì)胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤抗原和前列腺癌特異性抗原。
237.權(quán)利要求234的結(jié)合物，其中的肽免疫原來自人Aβ多肽。
238.權(quán)利要求237的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域。
239.權(quán)利要求237的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端區(qū)域。
240.權(quán)利要求237的結(jié)合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的內(nèi)部區(qū)域。
241.權(quán)利要求237的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
242.權(quán)利要求237的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
243.權(quán)利要求237的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原的分子與另一肽免疫原融合。
244.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原的另一分子的N-末端。
245.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原的另一分子的C-末端。
246.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
247.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
248.權(quán)利要求244，245，246或247的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
249.權(quán)利要求244，245，246或247的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
250.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ片段連接到一個(gè)或多個(gè)異源肽分子。
251.權(quán)利要求250的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
252.權(quán)利要求250的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
253.權(quán)利要求250的結(jié)合物，其中的異源肽選自T-細(xì)胞表位，B-細(xì)胞表位及其組合。
254.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
255.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子與一個(gè)或多個(gè)拷貝的不同的Aβ肽免疫原以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接。
256.權(quán)利要求254或255的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
257.權(quán)利要求254或255的結(jié)合物，其中Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
258.權(quán)利要求243的結(jié)合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子連接到一個(gè)或多個(gè)異源肽分子。
259.權(quán)利要求258的結(jié)合物，其中的異源肽選自T-細(xì)胞表位，B-細(xì)胞表位及其組合。
260.權(quán)利要求258的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
261.權(quán)利要求258的結(jié)合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
262.一種免疫原性組合物，包括通過權(quán)利要求75的方法產(chǎn)生的肽免疫原與蛋白質(zhì)/多肽載體的結(jié)合物，連同一種或多種可藥用的賦形劑，稀釋劑和/或佐劑。
263.權(quán)利要求262的免疫原性組合物，其中的載體選自人血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，結(jié)核分枝桿菌，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌ORF1224，化膿鏈球菌ORF1664，化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體ORFT367，肺炎衣原體ORFT858，破傷風(fēng)類毒素，HIVgp120 T1，識(shí)別微生物表面粘附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)的組分，生長因子，激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
264.權(quán)利要求262的免疫原性組合物，其中的載體包含T-細(xì)胞表位。
265.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是細(xì)菌類毒素。
266.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是流感血凝素。
267.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是PADRE多肽。
268.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白。
269.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
270.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是熱休克蛋白65(HSP65)。
271.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是來自結(jié)核分支桿菌(BCG)的多肽。
272.權(quán)利要求265的免疫原性組合物，其中的細(xì)菌類毒素是破傷風(fēng)類毒素。
273.權(quán)利要求265的免疫原性組合物，其中細(xì)菌類毒素是CRM197。
274.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是鏈球菌rC5a肽酶。
275.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1224。
276.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1664 。
277.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是化膿鏈球菌ORF2452。
278.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是肺炎衣原體ORFT367。
279.權(quán)利要求264的免疫原性組合物，其中的載體是肺炎衣原體ORFT858。
280.權(quán)利要求262的免疫原性組合物，其中的載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
281.權(quán)利要求280的免疫原性組合物，其中的生長因子或激素選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
282.權(quán)利要求262的免疫原性組合物，其中的肽免疫原選自細(xì)菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、寄生蟲蛋白和真核生物蛋白。
283.權(quán)利要求282的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自來自細(xì)菌的蛋白抗原。
284.權(quán)利要求283的免疫原性組合物，其中的細(xì)菌選自肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，大腸桿菌，克雷伯氏腸桿菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，霍亂弧菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，肉毒梭狀芽孢桿菌，假單胞菌，鼠傷寒沙門菌，包氏疏螺旋體，弗氏志賀氏菌，鮑氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，耳炎差異球菌和B類鏈球菌。
285.權(quán)利要求282的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自來自病毒的蛋白抗原。
286.權(quán)利要求285的免疫原性組合物，其中的病毒選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
287.權(quán)利要求282的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自來自真菌的蛋白抗原。
288.權(quán)利要求287的免疫原性組合物，其中的真菌選自白假絲酵母，新型隱球菌，球孢菌，組織漿菌和曲霉。
289.權(quán)利要求282的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自來自寄生蟲的蛋白抗原。
290.權(quán)利要求289的免疫原性組合物，其中的寄生蟲選自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲。
291.權(quán)利要求282的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自來自真核生物的蛋白抗原。
292.權(quán)利要求291的免疫原性組合物，其中的真核生物是人。
293.權(quán)利要求292的免疫原性組合物，其中來自人的肽免疫原衍生自惡性腫瘤。
294.權(quán)利要求293的免疫原性組合物，其中的肽免疫原選自腎細(xì)胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺癌特異性抗原。
295.權(quán)利要求292的免疫原性組合物，其中的肽免疫原來自人Aβ多肽。
296.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域。
297.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端區(qū)域。
298.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的內(nèi)部區(qū)域。
299.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并且是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
300.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
301.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原另一分子的N-末端。
302.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原另一分子的C-末端。
303.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
304.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
305.權(quán)利要求301，302，303或304的免疫原性組合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
306.權(quán)利要求301，302，303或304的免疫原性組合物，其中的的Aβ片段是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
307.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子連接到一個(gè)或多個(gè)異源肽分子。
308.權(quán)利要求307的免疫原性組合物，其中Aβ肽免疫原衍生自Aβ肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
309.權(quán)利要求307的免疫原性組合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
310.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
311.權(quán)利要求295的免疫原性組合物，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子與一個(gè)或多個(gè)不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接。
312.權(quán)利要求310或311的免疫原性組合物，其中Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
313.權(quán)利要求310或311的免疫原性組合物，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
314.權(quán)利要求262的免疫原性組合物，其中一種或多種佐劑選自GM-CSF，529SE，IL-12，磷酸鋁，氫氧化鋁，結(jié)核分支桿菌，百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)，細(xì)菌脂多糖，氨基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物，MPLTM(3-O-脫?；鶈瘟柞ヵＶ珹)，多肽，Quil A，STIMULONTMQS-21，百日咳毒素(PT)，大腸桿菌熱敏感毒素(LT)，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，干擾素-α，干擾素-β，干擾素-γ，G-CSF，TNF-α和TNF-β。
315.權(quán)利要求314的免疫原性組合物，其中的肽免疫原是Aβ，載體是CRM197，佐劑是529SE。
316.一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物受試者免疫應(yīng)答的方法，包括給所述受試者給藥有效量的權(quán)利要求262的免疫原性組合物。
317.權(quán)利要求316的方法，其中的載體選自人血清白蛋白，匙孔-血藍(lán)蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，熱休克蛋白(HSP)65，結(jié)核分枝桿菌，霍亂毒素，減毒的霍亂毒素突變體，白喉毒素，與白喉毒素交叉反應(yīng)的CRM197蛋白，重組鏈球菌C5a肽酶，化膿鏈球菌ORF1224，化膿鏈球菌ORF1664，化膿鏈球菌ORF2452，肺炎衣原體ORFT367，肺炎衣原體ORFT858，破傷風(fēng)類毒素，HIVgp120 T1，識(shí)別微生物表面粘附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)的組分，生長因子，激素，細(xì)胞因子和趨化因子。
318.權(quán)利要求316的方法，其中的載體包含T-細(xì)胞表位。
319.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是細(xì)菌類毒素。
320.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是流感血凝素。
321.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是PADRE多肽。
322.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白。
323.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是乙肝表面抗原。
324.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是熱休克蛋白65(HSP65)。
325.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是來自結(jié)核分支桿菌(BCG)的多肽。
326.權(quán)利要求319的方法，其中的細(xì)菌類毒素是破傷風(fēng)類毒素。
327.權(quán)利要求319的方法，其中細(xì)菌類毒素是CRM197。
328.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是鏈球菌rC5a肽酶。
329.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1224。
330.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF1664。
331.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是化膿鏈球菌ORF2452。
332.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是肺炎衣原體ORFT367。
333.權(quán)利要求318的方法，其中的載體是肺炎衣原體ORFT858。
334.權(quán)利要求316的方法，其中的載體是生長因子或激素，其刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
335.權(quán)利要求334的方法，其中的生長因子或激素選自IL-1，IL-2，γ-干擾素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
336.權(quán)利要求316的方法，其中的肽免疫原選自細(xì)菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
337.權(quán)利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自來自細(xì)菌的蛋白抗原。
338.權(quán)利要求337的方法，其中的細(xì)菌選自肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，大腸桿菌，克雷伯氏腸桿菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，霍亂弧菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，肉毒梭狀芽孢桿菌，假單胞菌，鼠傷寒沙門菌，包氏疏螺旋體，弗氏志賀氏菌，鮑氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，耳炎差異球菌和B類鏈球菌。
339.權(quán)利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自來自病毒的蛋白抗原。
340.權(quán)利要求339的方法，其中的病毒選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)，單純皰疹病毒(HSV)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠狀病毒，牛痘病毒，輪狀病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
341.權(quán)利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自來自真菌的蛋白抗原。
342.權(quán)利要求341的方法，其中的真菌選自白假絲酵母(Candidaalbicaiis)，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，組織漿菌和曲霉。
343.權(quán)利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自來自寄生蟲的蛋白抗原。
344.權(quán)利要求343的方法，其中寄生蟲選自瘧原蟲，錐蟲，血吸蟲和利什曼原蟲。
345.權(quán)利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自來自真核生物的蛋白抗原。
346.權(quán)利要求345的方法，其中的真核生物是人。
347.權(quán)利要求347的方法，其中來自人的肽免疫原衍生自惡性腫瘤。
348.權(quán)利要求347的方法，其中的肽免疫原衍生自腎細(xì)胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE-1)抗原和前列腺癌特異性抗原。
349.權(quán)利要求346的方法，其中的肽免疫原來自人Aβ多肽。
350.權(quán)利要求349的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域。
351.權(quán)利要求349的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端區(qū)域。
352.權(quán)利要求349的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的內(nèi)部區(qū)域。
353.權(quán)利要求350的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并且是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
354.權(quán)利要求349的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
355.權(quán)利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原另一分子的N-末端。
356.權(quán)利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原另一分子的C-末端。
357.權(quán)利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
358.權(quán)利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一個(gè)分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
359.權(quán)利要求355，356，357或358的方法，其中Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
360.權(quán)利要求355，356，357或358的方法，其中Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
361.權(quán)利要求349的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子連接到一個(gè)或多個(gè)異源肽拷貝。
362.權(quán)利要求361的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
363.權(quán)利要求361的方法，其中的Aβ肽免疫原選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42。
364.權(quán)利要求349的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接在一起。
365.權(quán)利要求349的方法，其中一個(gè)或多個(gè)Aβ肽免疫原分子與一個(gè)或多個(gè)不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的構(gòu)象連接。
366.權(quán)利要求364或365的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端區(qū)域，并是選自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
367.權(quán)利要求364或365的方法，其中的Aβ肽免疫原是選自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
368.權(quán)利要求262的方法，其中一種或多種佐劑選自GM-CSF，529SE，IL-12，磷酸鋁，氫氧化鋁，結(jié)核分支桿菌，百日咳博德特氏菌，細(xì)菌脂多糖，氨基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物，MPLTM(3-O-脫?；鶈瘟柞ヵＶ珹)，多肽，Quil A，STIMULONTMQS-21，百日咳毒素(PT)，大腸桿菌熱敏感毒素(LT)，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，干擾素-α，干擾素-β，干擾素-γ，G-CSF，TNF-α和TNF-β。
369.權(quán)利要求368的方法，其中的肽免疫原是Aβ，載體是CRM197，佐劑是529SE。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有蛋白質(zhì)/多肽載體分子的肽免疫原結(jié)合物的方法，所述蛋白質(zhì)/多肽載體分子可有效用作免疫原，其中肽免疫原通過載體或任選連接的接頭分子的氨基酸殘基上的活化官能團(tuán)結(jié)合到蛋白質(zhì)載體上，其中氨基酸殘基上任何未結(jié)合的活性官能團(tuán)通過加帽而失活，從而維持載體分子的免疫功能，但降低發(fā)生使結(jié)合物安全性或效果降低的不希望的反應(yīng)的傾向。此外，本發(fā)明還涉及這樣的免疫原性產(chǎn)品和含有通過這種方法制備的這種免疫原性產(chǎn)品的免疫原性組合物。
文檔編號(hào)A61K39/38GK1984676SQ200480037802
公開日2007年6月20日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者拉薩帕·G·阿魯穆格哈姆, A·克利須那·普拉薩德 申請人:惠氏公司