專利名稱：血管炎治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管炎的新型預(yù)防和/或治療劑。
背景技術(shù)：
血管炎是自體免疫疾病中公認的難治性疾病中的一種，在用自過去以來一直使用的類固醇或免疫抑制劑的治療中顯示出抗性的例子很多，因此一直希望建立新的治療方法。血管炎綜合征在各種大小的動脈中產(chǎn)生炎癥，產(chǎn)生發(fā)熱和肌肉/關(guān)節(jié)的疼痛、血管閉塞和皮膚潰瘍、多發(fā)性單神經(jīng)炎。血管炎中包括結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎和主動脈炎綜合征等難治性血管炎綜合征。結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎的病變是由中膜和外膜的部分壞死性炎癥所給予的特征，主動脈炎通常是主動脈的三層也就是內(nèi)膜、中膜和外膜都呈現(xiàn)炎癥。
主動脈炎，也稱為高安動脈炎(Takayasu′s arteritis)。血管炎的病情中提示有IL-6的參與。例如，由Noris等人報道了，在病情處于活性期的高安動脈炎的患者中，血清中的IL-6濃度與正常人相比提高了(Circulation.1999 Jul 6；100(1)55-60)。然而，在同一文獻中，報道了在處于同時期的患者中作為趨化因子的RANTES在血清中的濃度也升高了。此外，Noris等人還提示這些細胞因子在高安動脈炎的患者中有可能引起血管損傷(vasculitic lesion)。

發(fā)明內(nèi)容
但是，文獻中完全沒有公開通過抑制IL-6有可能治療高安動脈炎。因此，本發(fā)明提供了以IL-6的拮抗劑作為有效成分的動脈炎的預(yù)防和/或治療劑。
本發(fā)明人進行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6是血管炎的病理形成所不可缺少的，清楚了IL-6的拮抗劑具有血管炎治療效果。更令人驚訝的是，通過本發(fā)明人的積極研究，發(fā)現(xiàn)在血管炎中通過IL-6受體抗體抑制IL-6與受體結(jié)合時，血中的IL-6本身減少。也就是，不僅清楚了IL-6抑制治療對血管炎有抗炎癥作用，而且清楚了其作用于血管炎的根本，治療血管炎本身。
因此，本發(fā)明提供了由含有白介素-6(IL-6)的拮抗劑作為有效成分而構(gòu)成的血管炎的預(yù)防和/或治療劑。
本發(fā)明另外提供了對類固醇和/或免疫抑制劑耐藥的血管炎的預(yù)防和/或治療劑，由含有白介素-6(IL-6)的拮抗劑作為有效成分而構(gòu)成。
上述血管炎是例如結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、主動脈炎綜合征和伴隨免疫異常的血管炎。主動脈炎綜合征也稱為高安動脈炎。作為伴隨免疫異常的血管炎，可以列舉有，例如伴隨風(fēng)濕病的血管炎或伴隨全身性紅斑狼瘡(SLE)的血管炎。
上述IL-6拮抗劑是例如針對IL-6的抗體或針對IL-6受體的抗體，優(yōu)選是針對IL-6受體的單克隆抗體。上述針對IL-6受體的抗體，特別優(yōu)選的是針對人IL-6受體的單克隆抗體，例如PM-1抗體，或者針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體，例如MR16-1抗體。上述針對IL-6受體的抗體，優(yōu)選是重組抗體。
上述針對IL-6受體的抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的抗體是人源化PM-1抗體。
此外，本發(fā)明還可以采取以下形態(tài)。
(1)白介素-6(IL-6)拮抗劑用于制備血管炎的預(yù)防和/或治療劑的用途。
(2)白介素-6(IL-6)拮抗劑的用途，其用于制備對類固醇和/或免疫抑制劑耐藥的血管炎的預(yù)防和/或治療劑。
(3)上述(1)或(2)的用途，其中上述血管炎是結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎。
(4)上述(1)或(2)的用途，其中上述血管炎是主動脈炎綜合征。
(5)上述(1)或(2)的用途，其中上述血管炎是伴隨免疫異常的血管炎。
(6)上述(1)-(5)中任一項記載的用途，其中上述IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
(7)上述(6)的用途，其中上述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的單克隆抗體。
(8)上述(6)的用途，其中上述針對IL-6受體的抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
(9)上述(6)的用途，其中上述針對IL-6受體的抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
(10)上述(6)-(9)任一項的用途，其中上述針對IL-6受體的抗體是重組抗體。
(11)上述(8)的用途，其中上述針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
(12)上述(9)的用途，其中上述針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
(13)上述(6)-(12)任一項的用途，其中上述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
(14)上述(13)的用途，其中上述針對IL-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
(15)血管炎的預(yù)防和/或治療方法，其包括以白介素-6(IL-6)拮抗劑給藥。
(16)對類固醇和/或免疫抑制劑耐藥的血管炎的預(yù)防和/或治療方法，其包括以白介素-6(IL-6)拮抗劑給藥。
(17)上述(15)或(16)的方法，上述血管炎是結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎。
(18)上述(15)或(16)的方法，上述血管炎是主動脈炎綜合征。
(19)上述(15)或(16)的方法，上述血管炎是伴隨免疫異常的血管炎。
(20)上述15-19中任一項記載的方法，上述IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
(21)上述(20)的方法，上述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的單克隆抗體。
(22)上述(20)的方法，上述針對IL-6受體的抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
(23)上述(20)的方法，上述針對IL-6受體的抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
(24)上述(20)-(23)任一項的方法，上述針對IL-6受體的抗體是重組抗體。
(25)上述(22)的方法，上述針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
(26)上述(23)的方法，上述針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
(27)上述(20)-(26)任一項的方法，上述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
(28)上述(27)的方法，上述針對IL-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。


圖1是表示在血管炎綜合征的人源化IL-6R抗體療法中，CT結(jié)果的圖。上部的箭頭表示升主動脈，下部箭頭表示降主動脈。
圖2是表示在血管炎綜合征的人源化IL-6R抗體療法中，CT結(jié)果的圖。箭頭表示主動脈弓。
圖3是表示在血管炎綜合征的人源化IL-6R抗體療法中，CT結(jié)果的圖。上部的箭頭表示升主動脈，下部箭頭表示降主動脈。
圖4是表示在血管炎綜合征的人源化IL-6R抗體療法中，CT結(jié)果的圖。上部的箭頭表示升主動脈，下部箭頭表示降主動脈。
圖5是表示在血管炎綜合征的人源化IL-6R抗體療法中，CT結(jié)果的圖。箭頭表示主動脈弓。
圖6是表示在血管炎綜合征的人源化IL-6R抗體療法中，CT結(jié)果的圖。上部的箭頭表示升主動脈，下部箭頭表示降主動脈。
具體實施例方式
IL-6是被稱為B細胞刺激因子2(BSF2)或者干擾素β2的細胞因子。IL-6作為與B淋巴細胞系細胞的活化相關(guān)的分化因子而被發(fā)現(xiàn)(Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76)，此后，清楚了其是對各種細胞的功能產(chǎn)生影響的多功能細胞因子(Akira，S.等人，Adv.inImmunology(1993)54，1-78)。據(jù)報道，IL-6誘導(dǎo)T淋巴細胞系細胞的成熟(Lotz，M.等人，J.Exp.med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在細胞上由兩種蛋白質(zhì)介導(dǎo)，傳達它的生物學(xué)活性。一個是結(jié)合IL-6的分子量約為80kD的配體結(jié)合性蛋白質(zhì)-IL-6受體(Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.等人，Science(1987)241，825-828)。IL-6受體以通過貫通細胞膜在細胞膜上表達的膜結(jié)合型存在，除此之外還以主要由細胞外區(qū)域構(gòu)成的可溶性IL-6受體型存在。
另一個是非配體結(jié)合性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中涉及的分子量約為130kD的膜蛋白質(zhì)gp130。IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復(fù)合物，接著通過與gp130結(jié)合，向細胞內(nèi)傳遞IL-6的生物學(xué)活性(Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗劑是抑制IL-6生物學(xué)活性傳遞的物質(zhì)。迄今為止，已知有針對IL-6的抗體(抗IL-6抗體)、針對IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、針對gp130的抗體(抗gp130抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體部分肽等。
有幾個與抗IL-6受體抗體相關(guān)的報道(Novick，D.等人，Hybridoma(1991)10，137-146，Huang，Y.W.等人，Hybridoma(1993)12，621～630，國際專利申請公開號WO 95-09873，法國專利申請公開號FR 2694767，美國專利號US 521628)。通過將其中之一的小鼠抗體PM-1抗體(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互補決定區(qū)域(CDR；complementarity determining region)移植到人抗體中獲得的人源化PM-1抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)。
上述IL-6拮抗劑優(yōu)選是針對IL-6受體的抗體，優(yōu)選是針對人IL-6受體的單克隆抗體或針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。作為上述針對人IL-6受體的單克隆抗體可例示有PM-1抗體，或者作為針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體可舉例有MR16-1抗體。上述抗體優(yōu)選是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，例如人源化PM-1抗體。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑只要是可用作血管炎的預(yù)防或治療劑的活性成分的成分即可，不追究其來源、種類和形狀。
IL-6拮抗劑是阻斷依賴于IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。IL-6拮抗劑優(yōu)選是對IL-6、IL-6受體和gp130任一項的結(jié)合具有抑制作用的物質(zhì)。作為IL-6拮抗劑，可以舉例有例如抗IL-6受體抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6變異體、IL-6或IL-6受體的部分肽，以及與這些物質(zhì)顯示出相同活性的低分子物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，可以是使用公知的方法獲得的多克隆抗體或單克隆抗體。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，特別優(yōu)選來源于哺乳動物的單克隆抗體。作為來源于哺乳動物的單克隆抗體，有由雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體，以及通過基因工程方法以含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的抗體。這種抗體通過與IL-6結(jié)合，抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合，從而阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細胞內(nèi)的傳遞。
作為這種抗體，可以列舉有MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)和SK2抗體(Sato，K.等人，第21屆日本免疫學(xué)會總會，學(xué)術(shù)記錄(1991)21，166)等。
基本上使用公知技術(shù)，按以下方式制備產(chǎn)生抗IL-6抗體的雜交瘤。即，使用IL-6作為致敏抗原，按照常規(guī)的免疫方法進行免疫，通過常規(guī)的細胞融合法使所得免疫細胞與公知的親本細胞融合，通過用常規(guī)的篩選法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細胞來進行制備。
具體地說，制備抗IL-6抗體時也可以按以下方式進行。例如，為獲得抗體而用作致敏抗原的人IL-6可以通過使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550，J.Immunol.(1988)140，1534-1541，或Agr.Boil.Chem.(1990)54，2685-2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列獲得。
在公知的表達載體中插入IL-6的基因序列，使之轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，從該宿主細胞中或從培養(yǎng)上清中用公知的方法純化目的IL-6蛋白質(zhì)，可以使用這種純化的IL-6蛋白質(zhì)作為致敏抗原。此外，也可以使用IL-6蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，可以是使用公知的方法獲得的多克隆抗體或單克隆抗體。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，特別優(yōu)選來源于哺乳動物的單克隆抗體。作為來源于哺乳動物的單克隆抗體，有由雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體，以及通過基因工程方法以含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的抗體。這種抗體通過與IL-6受體結(jié)合，抑制IL-6向IL-6受體的結(jié)合，從而阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細胞內(nèi)的傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MR16-1抗體(tamura，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗體(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)等。其中，作為特別優(yōu)選的抗體可以列舉PM-1抗體。
并且，產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤細胞株，作為PM-1，根據(jù)布達佩斯條約，于1989年7月12日國際保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城筑波市東1-1-1中央第6號)，保藏號FERM BP-2998。此外，產(chǎn)生MR16-1抗體的雜交瘤細胞株，作為大鼠-小鼠雜交瘤MR16-1，根據(jù)布達佩斯條約，于1997年3月13日國際保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城筑波市東1-1-1中央第6號)，保藏號FERM BP-5875。
產(chǎn)生抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤，可以基本上使用公知技術(shù)，按以下方式制備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原，按照常規(guī)的免疫方法進行免疫，通過常規(guī)的細胞融合法使所得免疫細胞與公知的親本細胞融合，通過用常規(guī)的篩選法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細胞來進行制備。
具體地說，制備抗IL-6受體抗體也可以按以下方式進行。例如，作為獲得抗體的致敏抗原使用的人IL-6受體可以通過使用歐洲專利申請公開號EP 325474中公開的IL-6受體基因/氨基酸序列獲得，作為獲得抗體的致敏抗原使用的小鼠IL-6受體可以通過使用日本特許出愿公開號特開平3-155795中公開的IL-6受體基因/氨基酸序列獲得。
IL-6受體蛋白質(zhì)有在細胞膜上表達的和從細胞膜脫離的(可溶性IL-6受體)(Yasukawa，K.等人，J.Biochem(1990)108，673-676)這兩種類型?？扇苄訧L-6受體抗體是由與細胞膜結(jié)合的IL-6受體的實質(zhì)性細胞外區(qū)域構(gòu)成的，在缺少跨細胞膜區(qū)域或跨細胞膜區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域這一點上，與膜結(jié)合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質(zhì)，只要可作為制備本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的致敏抗原使用，可以使用任何IL-6受體。
在公知的表達載體系統(tǒng)中插入IL-6受體的基因序列，使之轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，從該宿主細胞中或從培養(yǎng)上清中用公知的方法純化目的IL-6受體蛋白質(zhì)，可以使用這種純化的IL-6受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原。此外，也可以使用IL-6受體蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原。
含有帶有編碼人IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌(E.coli)，作為HB101-pIBIBSF2R，根據(jù)布達佩斯條約，于1989年1月9日國際保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城筑波市東1-1-1中央第6號)，保藏號FERM BP-2232。
本發(fā)明中使用的抗gp130抗體可以是使用公知的方法獲得的多克隆抗體或單克隆抗體。作為本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，特別優(yōu)選來源于哺乳動物的單克隆抗體。作為來源于哺乳動物的單克隆抗體，有由雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體，以及通過基因工程方法以含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的抗體。這種抗體通過與gp130結(jié)合，抑制IL-6/IL-6受體復(fù)合物與gp130的結(jié)合，從而阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細胞內(nèi)的傳遞。
作為這種抗體，可以列舉有AM64抗體(特開平3-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US 5571513)、B-S12抗體和B-P8抗體(特開平8-291199)等。
產(chǎn)生抗gp130單克隆抗體的雜交瘤，可以基本上使用公知技術(shù)，按以下方式制備。即，使用gp130作為致敏抗原，按照常規(guī)的免疫方法以其免疫，通過常規(guī)的細胞融合法使所得免疫細胞與公知的親本細胞融合，通過用常規(guī)的篩選法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細胞來進行制備。
具體地說，可以按以下方式制備單克隆抗體。例如，作為獲得抗體的致敏抗原使用的gp130可以通過使用歐洲專利申請公開號EP411946中公開的gp130基因/氨基酸序列獲得。
在公知的表達載體中插入gp130的基因序列，使之轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，從該宿主細胞中或從培養(yǎng)上清中用公知的方法純化目的gp130蛋白質(zhì)，可以使用這種純化的gp130受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原。此外，也可以使用表達gp130的細胞或gp130蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原。
作為經(jīng)致敏抗原免疫的哺乳動物，沒有特別的限定，優(yōu)選考慮與細胞融合中使用的親本細胞的適應(yīng)性進行選擇，一般而言使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。
以致敏抗原免疫動物時，按照公知的方法進行。例如，作為一般的方法，通過在哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原來進行。具體地說，用PBS(磷酸緩沖鹽)或生理鹽水等適量稀釋致敏抗原，根據(jù)需要將懸浮液與常規(guī)的佐劑例如弗氏完全佐劑適量混合，乳化后，優(yōu)選以每4～21天對哺乳動物給藥數(shù)次。此外，致敏抗原免疫時可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。
按這種方式免疫，在確認出血清中期望的抗體水平上升后，從哺乳動物中取出免疫細胞，以用于細胞融合。作為用于細胞融合的優(yōu)選的免疫細胞，可以列舉有特別是脾細胞。
作為與上述免疫細胞融合的其它的親本細胞的哺乳動物的骨髓瘤細胞，可以適當(dāng)使用已經(jīng)公知的各種細胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人，J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.，Eur.J.Immnol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.等人，J.Immnol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可以基本按照公知的方法進行，例如Milstein等人的方法(Kohler.G and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等。
更為具體的是，上述細胞融合，可以在例如存在細胞融合促進劑的常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施。作為融合促進劑，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，進而也可以根據(jù)需要，為了提高融合效率而添加二甲基亞砜等輔助劑。
免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例，優(yōu)選例如免疫細胞是骨髓瘤細胞的1～10倍。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，可以使用例如上述骨髓瘤細胞株的增殖中最適的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，此外還有可在這種細胞培養(yǎng)中使用的常規(guī)的培養(yǎng)液，進而還可以與胎牛血清(FCS)等血清添加液并用。
進行細胞融合時，可通過在上述培養(yǎng)液中充分混合所定量的上述免疫細胞與骨髓瘤細胞，通常以30～60％(w/v)的濃度添加預(yù)先加熱到37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量1000～6000左右的PEG溶液，通過混合，以形成目的融合細胞(雜交瘤)。接著，逐次添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，通過反復(fù)離心除去上清的操作可以除去對雜交瘤生長不利的細胞融合劑等。
通過在常規(guī)的選擇培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來選擇出該雜交瘤。連續(xù)進行足夠時間的在該HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)以使作為目的的雜交瘤之外的細胞(非融合細胞)死亡，通常連續(xù)培養(yǎng)數(shù)日～數(shù)周。接著，實施常規(guī)的極限稀釋法，篩選和克隆產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤。
此外，對人以外的動物免疫抗原獲得上述雜交瘤之外，在體外以期望的抗原蛋白質(zhì)或抗原表達細胞致敏人淋巴細胞，使致敏的B淋巴細胞與人骨髓瘤細胞例如U266融合，也可以獲得與期望的抗原或抗原表達細胞具有結(jié)合活性的期望的人抗體(參照特公平1-59878)。進而，對攜帶有人抗體基因文庫的轉(zhuǎn)基因動物給予抗原或抗原表達細胞，按照上述方法也可以獲得期望的抗原(參見國際專利申請公開號WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
這樣制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在常規(guī)的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，此外還可以在液氮中長期保存。
為了從該雜交瘤中獲得單克隆抗體，可以采用按照常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤來獲得其培養(yǎng)上清的方法，或者將雜交瘤給予到與其相適應(yīng)的哺乳動物中使雜交瘤增殖，獲得其腹水的方法等方法。前一種方法適于獲得高純度的抗體，另一方面，后一種方法適于抗體的大量生產(chǎn)。
例如，產(chǎn)生抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備可以通過特開平3-139293中公開的方法進行?？梢韵駼ALB/c小鼠的腹腔內(nèi)注入產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤，所述雜交瘤根據(jù)布達佩斯條約，于1989年7月12日國際保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城筑波市東1-1-1中央第6號)，保藏號為FERM BP-2998，以此獲得腹水，從腹水中純化出PM-1抗體的方法，或者在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基例如含有10％胎牛血清，5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制造)的RPMI1640培養(yǎng)基，雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)等中培養(yǎng)該雜交瘤，從其培養(yǎng)上清中純化PM-1抗體的方法。
本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用從雜交瘤中克隆抗體基因，重組到適當(dāng)?shù)妮d體中，將其導(dǎo)入到宿主中，用基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組抗體(例如參見Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTICMONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom BYMACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具體地說，從產(chǎn)生目的抗體的細胞例如雜交瘤中分離編碼抗體可變(V)區(qū)域的mRNA。對于mRNA的分離，可通過公知的方法例如胍超速離心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P，et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制備總RNA，使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)制備mRNA。此外，通過使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)可以直接制備mRNA。
用逆轉(zhuǎn)錄酶從獲得的mRNA中合成抗體V區(qū)域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶First-Strand cDNA合成試劑盒等進行。此外，進行cDNA的合成和擴增時可以使用采用5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制造)和使用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。從獲得的PCR產(chǎn)物中純化出目的DNA片段，與載體DNA連接。進而，由其制備出重組載體，導(dǎo)入到大腸桿菌等中，選擇出克隆，制備期望的重組載體。通過公知的方法例如脫氧法確認目的DNA的堿基序列。
如果獲得了編碼目的抗體的V區(qū)域的DNA，將其與編碼期望的抗體的恒定區(qū)域(C區(qū)域)的DNA連接，將其重組到表達載體中?；蛘?，也可以在含有抗體C區(qū)域的DNA的表達載體中重組編碼抗體V區(qū)域的DNA。
在制備本發(fā)明中使用的抗體時，可以向基于表達控制區(qū)域例如增強子、啟動子的控制下可表達的表達載體中重組入下述抗體基因。接著，通過以該表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，使抗體表達。
在本發(fā)明中，可以使用以降低對人的異種抗原性為目的的人為改良的基因重組抗體，例如嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、人(human)抗體?？梢允褂靡阎姆椒ㄖ苽溥@些改良抗體。
嵌合抗體可以通過以下方法獲得將上述獲得的編碼抗體V區(qū)域的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連接，將其整合到表達載體中導(dǎo)入到宿主中使之產(chǎn)生(參照歐洲專利申請公開號EP 125023，國際專利申請公開號WO 92-19759)。使用這種已知的方法，可以獲得用于本發(fā)明中的嵌合抗體。
例如，含有編碼嵌合PM-1抗體的L鏈和H鏈的V區(qū)域的DNA的質(zhì)粒分別命名為pPM-k3和pPM-h1，帶有這種質(zhì)粒的大腸桿菌根據(jù)布達佩斯條約，于1991年2月12日國際保藏于國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Coilections of Industrial and MarineBacteria Limited)(大不列顛及北愛爾蘭聯(lián)合王國，蘇格蘭，阿伯丁，AB2，1RY 23st.Machar Drive)中，保藏號分別為NCIMB40366和NCIMB40362。
人源化抗體也稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體，是將人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的互補性決定區(qū)域(CDR)移植到人抗體的互補性決定區(qū)域而構(gòu)成的抗體，其常規(guī)基因重組方法是已知的(參照歐洲專利申請公開號EP 125023，國際專利申請公開號WO 92-19759)。
具體地說，是由制備成在末端帶有重疊部分這樣的多個核苷酸中通過PCR法合成按將小鼠抗體的CDR與人抗體的框架區(qū)域(FR；framework region)連接這樣設(shè)計的DNA序列。通過將獲得的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連接，接著重組入表達載體中，將其導(dǎo)入宿主使之產(chǎn)生，從而獲得所述抗體(參照歐洲專利申請公開號EP239400，國際專利申請公開號WO 92-19759)。
由CDR連接的人抗體的FR，可選擇互補性決定區(qū)域形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。根據(jù)需要，為了使重構(gòu)人抗體的互補性決定區(qū)域形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位，也可以取代抗體的可變區(qū)域的框架區(qū)域的氨基酸(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗體、人源化抗體中可以使用人抗體C區(qū)域。作為人抗體C區(qū)域，可以列舉有Cγ，例如可以使用Cγ1，Cγ2，Cγ3或Cγ4。此外，為了改善抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性，也可以修飾人抗體C區(qū)域。
由于嵌合抗體由人以外的哺乳動物來源的抗體的可變區(qū)域和人抗體來源的C區(qū)域構(gòu)成，人源化抗體由人以外的哺乳動物來源的抗體的互補性決定區(qū)域和人抗體來源的框架區(qū)域以及C區(qū)域構(gòu)成，降低了在人體內(nèi)的抗原性，因此可用作本發(fā)明中使用的抗體。
作為本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選的具體例子，可以舉例有人源化PM-1抗體(參照國際專利申請公開號WO 92-19759)。
此外，作為人抗體的獲得方法除了上述方法之外，已知還有使用人抗體文庫，通過淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，還可以通過噬菌體展示法使人抗體的可變區(qū)域在噬菌體表面表達為單鏈抗體(scFv)，選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。如果分析選擇出的噬菌體的基因，就可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)域的DNA序列。如果清楚了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，就可以將該序列重組到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，獲得人抗體。這些方法是已經(jīng)公知的，可以參照WO 92/01047，WO92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。
通過公知的方法使按上述方式構(gòu)建的抗體基因表達，可以獲得抗體。哺乳類細胞的情況下，通過功能性結(jié)合了常規(guī)使用的啟動子、要表達的抗體基因、其3’側(cè)下游poly A信號的DNA或含有該DNA的載體可以使之表達。例如，作為啟動子/增強子，可以列舉有人巨細胞病毒早期啟動子/增強子(human cytomegalovirus immediate earlypromotor/enhancer)。
此外，作為本發(fā)明中使用的抗體表達中可以使用的其它啟動子/增強子，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒的啟動子/增強子或人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳動物來源的啟動子/增強子。
例如，使用SV 40啟動子/增強子時，如果按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等人，Nature(1979)277，108-114)或者使用HEF1α啟動子/增強子時如果按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地實施。
大腸桿菌的情況下，通過功能性結(jié)合常規(guī)使用的啟動子、用于抗體分泌的信號序列、要表達的抗體基因可以使之表達。例如，作為啟動子，可以列舉有l(wèi)acZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，可以按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等人，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人，F(xiàn)ASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用araB啟動子時可以按照Better等人的方法(Better，M.等人，Science(1988)240，1041-1043)。
作為用于抗體分泌的信號序列，使之在大腸桿菌的周質(zhì)產(chǎn)生時，可以使用pelB信號序列(Lei，S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分離在周質(zhì)產(chǎn)生的抗體后，適當(dāng)重新折疊(refold)抗體的結(jié)構(gòu)，進行使用(例如，參照WO 96/30394)。
作為復(fù)制起點，可以使用源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的復(fù)制起點，進一步為了擴增宿主細胞系中基因拷貝數(shù)，表達載體可以含有氨基糖苷磷?；D(zhuǎn)移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。
可以使用任意的生產(chǎn)系統(tǒng)用來制備本發(fā)明中使用的抗體。用于抗體制備的生產(chǎn)系統(tǒng)有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為體外的生產(chǎn)系統(tǒng)，可以列舉有使用真核細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)和使用原核細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。
使用真核細胞時，有使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為動物細胞，已知有(1)哺乳類細胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa、Vero等，(2)兩棲類細胞，例如瓜蟾卵親本細胞，或(3)昆蟲細胞，例如sf9，sf21，Tn5等。作為植物細胞，已知有來源于煙草(Nicotiana tabacum)的的細胞，可以對其進行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細胞，已知有酵母例如酵母(Saccharomyces)屬，例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，絲狀菌，例如曲霉屬(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核細胞時，有使用細菌細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為細菌細胞，已知有大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
通過轉(zhuǎn)化向這些細胞中導(dǎo)入目的抗體基因，通過在體外培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞可以獲得抗體。按照公知的方法進行培養(yǎng)。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以與胎牛血清(FCS)等血清添加液并用。此外，也可以通過將導(dǎo)入抗體基因的細胞轉(zhuǎn)移到動物的腹腔中，在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。
另一方面，作為體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)，可以列舉使用動物的生產(chǎn)系統(tǒng)和使用植物的生產(chǎn)系統(tǒng)。使用動物時有使用哺乳類動物、使用昆蟲的生產(chǎn)系統(tǒng)等。
作為哺乳類動物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(VickiGlaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。此外，作為昆蟲可以使用蠶。使用植物時，例如可以使用煙草。
在這些動物或植物中導(dǎo)入抗體基因，使之在動物或植物的體內(nèi)產(chǎn)生抗體，回收抗體。例如在編碼山羊β酪蛋白這樣的乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因中插入抗體基因制備為融合基因。在山羊的胚胎中注射含有插入有抗體基因的融合基因的DNA片段，將該胚胎導(dǎo)入到雌性山羊中。從由接納胚胎的山羊產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因山羊或其子孫產(chǎn)生的乳汁中獲得期望抗體。為了增加由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有期望抗體的乳汁量，也可以在轉(zhuǎn)基因山羊中使用適當(dāng)?shù)募に?Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
此外，在使用蠶時，使插入有目的抗體基因的桿狀病毒感染蠶，從該蠶的體液中獲得期望的抗體(Maeda，S.等人，Nature(1985)315，592-594)。進而，使用煙草時，用于在植物中表達的載體例如pMON530中插入目的抗體基因，將該載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)這樣的桿菌中。使該桿菌感染煙草例如Nicotiana tabacum，從該煙草的葉中獲得期望的抗體(Julian，K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述在體外或體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)抗體時，也可以在表達載體中分別插入編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA，使其同時轉(zhuǎn)化宿主，或者也可以在單一表達載體中插入編碼H鏈和L鏈的DNA，使其轉(zhuǎn)化宿主(參照國際專利申請公開號WO 94-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體，只要是本發(fā)明中可以適宜地使用的，可以是抗體的片段或其修飾物。例如，作為抗體的片段，可以列舉有Fab、F(ab’)2、Fv或以適當(dāng)?shù)倪B接子連接的H鏈和L鏈的Fv的單鏈Fv(scFv)。
具體地說，以酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理抗體，使之產(chǎn)生抗體片段，或者構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達載體后，使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎斜磉_(例如參照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976.Better，M & Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methodsin Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通過連接抗體的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域可以獲得scFv。在這種scFv中，H鏈V區(qū)域與L鏈V區(qū)域由連接子優(yōu)選由肽連接子介導(dǎo)連接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。在scFv中的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域也可以是來源于上述記載的抗體的任一種。作為連接V區(qū)域的連接子，可以使用例如由12-19個氨基酸殘基構(gòu)成的任意單鏈肽。
編碼scFv的DNA可以通過以下方式獲得以編碼上述抗體的H鏈或H鏈的V區(qū)域的DNA以及編碼上述抗體的L鏈或L鏈的V區(qū)域的DNA作為模板，通過PCR法用指定其兩端的引物對，對這些序列中編碼期望的氨基酸序列的DNA部分進行擴增，接著，進而擴增編碼肽連接子部分的DNA，并且通過組合一對指定為使編碼肽連接子部分的DNA的兩端分別與H鏈、L鏈連接的引物進行擴增。
此外，如果一旦制備編碼scFv的DNA，就可以按照常規(guī)方法獲得含有這些DNA的表達載體，以及由該載體轉(zhuǎn)化的宿主。此外，使用其宿主按照常規(guī)方法可以獲得scFv。
這些抗體的片段，可以以與上述方法相同的方式獲得其基因，使之表達，由宿主產(chǎn)生。本發(fā)明中所稱“抗體”中還包括這些抗體的片段。
作為抗體的修飾物，還可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。本發(fā)明中所稱“抗體”中還包括這些抗體的修飾物。為了獲得這樣的抗體修飾物，可以通過對所得抗體實施化學(xué)修飾，由此獲得。這些方法是在本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)建立的方法。
按上述這樣產(chǎn)生、表達的抗體可以從細胞內(nèi)外、宿主中分離純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離，純化可以通過親合層析進行。作為親合層析中使用的柱，可以列舉有例如蛋白質(zhì)A柱、蛋白質(zhì)G柱。作為蛋白質(zhì)A柱中使用的載體，可以列舉有例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外只要使用常規(guī)的蛋白質(zhì)中使用的分離純化方法即可，沒有任何限定。
例如，如果對上述親合層析之外的層析，過濾，超濾，鹽析，透析等進行適當(dāng)選擇，組合，可以分離純化出本發(fā)明中使用的抗體。作為層析，可以列舉有例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等。這些層析可以適用于HPLC(高效液相色譜)。此外，也可以使用反相HPLC(反相高效液相色譜)。
以上獲得的抗體的濃度可通過吸光度的測定或者ELISA等方法來測定。即，當(dāng)以吸光度的測定來測定抗體濃度時，將樣品用PBS(-)適當(dāng)?shù)叵♂?，然后測定280nm的吸光度，以1mg/ml相當(dāng)于1.35OD計算出濃度。此外，當(dāng)使用ELISA進行濃度測定時，按以下方法進行測定。即，將100μl經(jīng)0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制造)加至96孔板(Nunc制造)中，4℃溫育過夜以固定抗體。封閉后，每孔加入100μl適當(dāng)稀釋的本發(fā)明的抗體或包含抗體的樣品，或100μl作為標準品的人IgG(CAPPEL制造)，室溫下溫育1小時。
洗滌后，加入稀釋了5000倍的經(jīng)堿性磷酸酯酶標記的抗人IgG(BIO SOURCE制造)100μl，在室溫下溫育1小時。洗滌后，加入底物溶液溫育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制造)測定405nm的吸光度，算出目的抗體的濃度。
本發(fā)明中使用的IL-6變異體，具有和IL-6受體的結(jié)合活性、且為不傳遞IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，雖然IL-6變異體與IL-6競爭對IL-6受體的結(jié)合，但是由于不傳遞IL-6的生物學(xué)活性，故阻斷了IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
IL-6變異體是通過取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基、引入變異而制備的。雖然不考慮作為IL-6變異體原料的IL-6的來源，但是若考慮到抗原性等，優(yōu)選人IL-6。
具體地說，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52～56)來預(yù)測其二次結(jié)構(gòu)，通過進一步評價被取代的氨基酸殘基對總體的影響來進行選擇。確定適當(dāng)?shù)娜〈被釟埢?、以含有編碼IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，按照通常使用的PCR法引入變異使氨基酸被取代，可以得到編碼IL-6變異體的基因。按照需要，將其整合入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，按照上述重組抗體的表達、產(chǎn)生及純化方法可以得到IL-6變異體。
作為IL-6變異體的具體實例，在Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86～93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357～1367、WO 96-18648、WO 96-17869中已有公開。
本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，分別具有與IL-6受體或IL-6的結(jié)合活性，且為不傳遞IL-6生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，IL-6部分肽或IL-6受體部分肽與IL-6受體或IL-6結(jié)合，通過捕捉它們可特異地阻斷IL-6與IL-6受體的結(jié)合。其結(jié)果表明，由于不傳遞IL-6的生物學(xué)活性，因此阻斷了依賴于IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是由在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中與IL-6和IL-6受體的結(jié)合相關(guān)區(qū)域的一部分或全部的氨基酸序列組成的肽。這種肽通常由10～80、優(yōu)選為20～50、更優(yōu)選為20～40個氨基酸殘基組成。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，可通過特別指定在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中與IL-6和IL-6受體的結(jié)合相關(guān)的區(qū)域，將其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法來制備。
通過基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可將編碼期望的肽的DNA序列整合入表達載體中，按照上述重組抗體的表達、產(chǎn)生及純化方法來得到。
通過肽合成法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以使用在肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體地說，也可以按照續(xù)醫(yī)藥品的開發(fā)，第14卷，肽合成，監(jiān)修矢島治明，廣川書店，1991年的方法進行。作為固相合成法，可以使用使與要合成的肽的C末端對應(yīng)的氨基酸與例如在有機溶劑中不溶性的支持體結(jié)合，通過交互重復(fù)進行將用適當(dāng)?shù)谋Ｗo基團保護了α-氨基及側(cè)鏈官能團的氨基酸按從C末端到N末端方向的順序逐一縮合氨基酸的反應(yīng)、和使樹脂上結(jié)合的氨基酸或肽的α-氨基的保護基團脫離的反應(yīng)，使肽鏈延長的方法。固相肽合成法根據(jù)使用的保護基團種類，可大致分為Boc法和Fmoc法。
這樣合成目的肽后，進行脫保護反應(yīng)以及將肽鏈從支持體切下的反應(yīng)。與肽鏈的切下反應(yīng)中，在Boc法中通常可以使用氟化氫或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氫中，在苯甲醚存在的情況下處理上述保護肽樹脂。然后，進行保護基團的脫離與從支持體的切下、回收肽。通過將其凍結(jié)干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以進行與上述相同的操作，進行脫保護反應(yīng)以及從支持體切下肽鏈的反應(yīng)。
得到的粗肽，通過應(yīng)用于HPLC，可以進行分離、純化。洗脫時，可以使用在蛋白質(zhì)的純化中通常使用的水-乙腈系溶劑在最適條件下進行。分別取得相當(dāng)于所得色譜法的曲線峰的級分、將其冷凍干燥。對于這樣純化的肽級分、通過根據(jù)質(zhì)譜分析的分子量解析、氨基酸組成分析、或氨基酸序列解析等來鑒定。
IL-6部分肽及IL-6受體部分肽的具體實例，在特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及美國專利公報US 5210075中公開。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制活性，可以用通常使用的方法評價。具體地說，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)，人Lennert T淋巴瘤細胞株KT3或IL-6依賴性細胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同時使IL-6拮抗劑共存，由此可以測定IL-6依賴性細胞的3H-胸苷的攝取。
另外，培養(yǎng)IL-6受體表達細胞U266、加入125I標記的IL-6，同時加入IL-6拮抗劑，由此測定與IL-6受體表達細胞結(jié)合的125I標記的IL-6。在上述分析體系中，如果除了使IL-6拮抗劑存在的組以外、還設(shè)置不含IL-6拮抗劑的陰性對照組，可以比較兩者得到的結(jié)果評價IL-6拮抗劑的IL-6抑制活性。
如下述實施例所示，由于確認了由抗IL-6受體抗體產(chǎn)生的對血管炎的治療效果，故而提示抗IL-6受體抗體等IL-6拮抗劑可用作血管炎的治療劑。
本發(fā)明中的治療對象為哺乳動物。作為治療對象的哺乳動物優(yōu)選為人。
本發(fā)明的血管炎的預(yù)防或治療劑可以口服或非口服地在全身或局部給藥。例如，可以選擇點滴等靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，根據(jù)患者的年齡、癥狀來選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法。有效給藥量，每次在每1kg體重0.01mg～100mg的范圍內(nèi)選擇。或者，也可以選擇給每個患者1～20mg、優(yōu)選2～8mg的給藥量。
優(yōu)選的給藥量、給藥方法，在例如在抗IL-6受體抗體的情況下，以血中存在游離抗體的程度的量為有效給藥量，作為具體的實例，體重每1kg為1個月(4周間)中給藥1mg～20mg，優(yōu)選2～8mg，分1次或多次給藥，例如按2次/周，1次/周，1次/2周，1次/4周等給藥方案用點滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法給藥的方法等。給藥方案也可以一邊觀察癥狀和血液檢察值的趨勢，一邊從2次/周或1次/周調(diào)整成1次/2周，1次/3周，1次/4周這樣延長給藥間隔。
本發(fā)明的血管炎的預(yù)防或治療劑，也可以同時含有依照給藥途徑而在藥學(xué)上所允許的載體或添加物。作為這種載體及添加物的例子，可以列舉有水、藥學(xué)上所允許的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、雙甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為允許的藥品添加物的表面活性劑等。使用的添加物，按照劑型可以從上述中適宜選擇或組合使用，但不限于這些。
實施例以下，通過實施例及參考例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不局限于這些例子。
實施例1臨床試驗方法以對以往的治療方法耐藥的難治性的血管炎綜合征(結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、主動脈炎綜合征)患者為對象，通過人源化抗IL-6受體抗體進行治療。在大阪大學(xué)附屬醫(yī)院先進醫(yī)療審查會的許可下，對兩例患者使用人源化的抗IL-6受體抗體-人源化PM-1抗體(MRA)。以用核磁共振成像(MRI)和計算機斷層攝影術(shù)(CT)的成像評價的改善、皮膚癥狀的改善、C反應(yīng)性蛋白(CRP)等炎癥標記的改善、QQL(疼痛、關(guān)節(jié)痛、倦怠感)的改善作為終點。此外，進行了對外周血細胞常規(guī)生物化學(xué)、止血功能、IL-6、可溶性IL-6受體、血中人源化抗IL-6受體抗體濃度、腫瘤壞死因子α(TNFα)、白介素-1b(IL-1b)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的評價。
結(jié)果病例119歲女性。1996年被診斷為主動脈炎綜合征。并發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎。開始以60mg/天氫化強的松(PSL)療法。即使與環(huán)孢菌素合用，PSL也不能減量至20mg/天以下。1998年，針對惡化除了甲基氫化強的松療法(mPSL)之外還合用了環(huán)磷酰胺150mg/天，即使如此PSL也難以減少至30mg以下。追加1mg/天的倍他米松，之后繼續(xù)進行7次白細胞去除療法也無效。2000年以后，即使在間歇使用mPSL脈沖療法的同時，還合用100mg/天硫唑嘌呤，2g/天麥考酚酸酯，17.5mg/周氨甲喋呤，仍然無效。
如圖1～6所示，用CT發(fā)現(xiàn)了在升主動脈、主動脈弓3個分支，降主動脈中有顯著的血管壁肥大。在左鎖骨下動脈(1t.SCA)中注意到了狹窄。CRP為12.6mg/dl，確認為強炎癥，由于產(chǎn)生強持續(xù)性胸痛，1個月中體重減少5kg，發(fā)生意識喪失，因此使用點滴靜脈注入MRA200mg/周。約2周后CRP轉(zhuǎn)為陰性。1個月后胸痛有所改善，除此之外，如圖1～6所示，用CT發(fā)現(xiàn)了在升主動脈、主動脈弓3個分支，降主動脈中肥大有所改善并且血管內(nèi)腔擴大，進而還確定了頸動脈血流的改善。此外，糞便血紅蛋白也轉(zhuǎn)為陰性，潰瘍性大腸炎的癥狀也消失。MRA治療中確認出了血中TNFα的增加，但是沒有發(fā)現(xiàn)癥狀的惡化。即使在MRA治療后經(jīng)過兩年時間都維持了主動脈壁的肥大的改善和血管內(nèi)腔的擴大。高安動脈炎別名也稱為無脈病，即使這種患者中最初在橈骨/尺骨動脈中無法診到脈，但是通過治療后用指尖就可以觸摸到橈骨/尺骨動脈的搏動。此外，通過長期使用MRA，血中IL-6由1720pg/ml降至100pg/ml以下。
病例242歲男性。1986年結(jié)節(jié)性動脈炎(皮膚炎)發(fā)病，即使以PSL、硫唑嘌呤、秋水仙素、抗凝血劑進行治療，癥狀反復(fù)緩解、惡化。自1995年以來，即使在mPSL脈沖療法之外還合用環(huán)磷酰胺150mg/天也沒有效果，自1997年以來，即使進行硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、γ-球蛋白大劑量療法也無效，自2000年以來即使進行環(huán)磷酰胺脈沖療法，白細胞去除療法也無效。對由于血管炎而產(chǎn)生的皮膚潰瘍進行植皮也無效果，由于惡化而切除右側(cè)腓骨，還施行了膝下切除。壞死性血管炎進一步惡化，下肢的潰瘍也有擴大趨勢。以200mg/周用人源化抗IL-6受體抗體開始治療后，發(fā)現(xiàn)原本已經(jīng)確認的發(fā)熱和皮膚的紅斑、肌肉痛有所改善。不得已進行了右大腿部位的切除，不過伴隨血中IL-6的降低，白細胞數(shù)也趨于正常，之后也沒有發(fā)現(xiàn)皮膚潰瘍惡化。
思考由于MRA對以往的治療中不可能控制的難治性血管炎患者有效，因此顯示出IL-6抑制治療可以成為血管炎的新型治療方法。這顯示IL-6是血管炎病理形成所不可缺少的。此外，由于任一病例中都發(fā)現(xiàn)在治療過程中IL-6本身降低，因此清楚了IL-6抑制治療不僅有抗炎癥作用，而且作用于血管炎本身。
參考例1人可溶性IL-6受體的制備按照Yamasaki等人的方法(Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828)獲得的含有編碼IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pBSF2R.236，通過PCR法制備可溶性IL-6受體。用限制酶Sph I消化質(zhì)粒pBSF2R.236，得到IL-6受體cDNA、將其插入mp18(Amersham制造)中。使用設(shè)計為以便在IL-6受體cDNA中導(dǎo)入終止密碼子的合成寡引物，通過體外突變形成系統(tǒng)(Amersham制造)、用PCR法在IL-6受體cDNA中導(dǎo)入突變。通過該操作終止密碼子被導(dǎo)入氨基酸345的位置，可得到編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細胞中表達可溶性IL-6受體，使其與質(zhì)粒pSV(Pharmacia制造)連接，得到質(zhì)粒pSVL344。在含有dhfr的cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr中插入用Hind III-SalI切下的可溶性IL-6受體cDNA，得到CHO細胞表達質(zhì)粒pECEdhfr344。
通過磷酸鈣沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745～2751)向dhfr-CHO細胞株DXB-11(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216～4220)轉(zhuǎn)染10μg的質(zhì)粒pECEdhfr344。將轉(zhuǎn)染的CHO細胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的不含核苷的αMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3周。
被選擇的CHO細胞用極限稀釋法篩選，得到單一的CHO細胞克隆。用20nM～200nM濃度的氨甲喋呤擴增該CHO細胞克隆，得到產(chǎn)生人可溶性IL-6受體的CHO細胞株5E27。用含有5％FBS的Iscov改良Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM、Gibco制造)培養(yǎng)CHO細胞株5E27?；厥张囵B(yǎng)上清液，用ELISA測定培養(yǎng)上清液中的可溶性IL-6受體的濃度。其結(jié)果表明，可以確認在培養(yǎng)上清液中存在可溶性IL-6受體。
參考例2.抗人IL-6抗體的制備用10μg的重組型IL-6(Hirano，T.et al.，I mmunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐劑一起免疫BALB/c小鼠，每周連續(xù)進行免疫至血清中能檢出抗IL-6抗體為止。從局部淋巴節(jié)中取出免疫細胞，用聚乙二醇1500使其與骨髓瘤細胞株P(guān)3U1融合。按照使用HAT培養(yǎng)液的Oi等的方法(Selective Methodsin Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，351，1980)選擇雜交瘤，建立產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤。
產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤如下所示進行IL-6結(jié)合分析。即，將柔軟的聚乙烯制的96孔板(Dynatech Laboratories，Inc制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氫鹽-碳酸鹽緩沖溶液(pH9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10-g/ml，Cooper Biomedical，Inc制，Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，將板用含有100μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室溫下處理2小時。
將其用PBS洗滌后，在各孔中加入100μl的雜交瘤培養(yǎng)上清液、在4℃下溫育一夜。洗滌該板后、在各孔中加入125I標記的重組型IL-6使其達到2000cpm/0.5ng/孔，洗滌后用γ計數(shù)器(Beckman Gamma9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測定各孔的放射活性。通過IL-6結(jié)合分析，在216個雜交瘤克隆中有32個雜交瘤克隆為陽性。在這些克隆中可得到最終穩(wěn)定的MH166.BSF2。該雜交瘤產(chǎn)生的抗IL-6抗體MH166具有IgG1κ型的亞型。
然后，使用IL-6依賴性小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2研究與MH166抗體導(dǎo)致的雜交瘤增殖相關(guān)的中和活性。將MH60.BSF2細胞分別注入小孔中達到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗體的試樣，培養(yǎng)48小時，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，再連續(xù)培養(yǎng)6小時。將細胞放置在玻璃濾紙上，用自動采集機(Labo Mash Science Co.，Tokyo，Japan)處理。作為對照使用兔抗IL-6抗體。
其結(jié)果，MH166抗體劑量依賴性地抑制由IL-6誘導(dǎo)的MH60.BSF2細胞的3H胸苷的攝取。由此可知，MH166抗體具有中和IL-6的活性。參考例3.抗人IL-6受體抗體的制備使按Hirata等人的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900～2906)制備的抗IL-6受體抗體MT18與通過CNBr活化的瓊脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制造，Piscataway，NJ)按照附上的配方結(jié)合，純化IL-6受體(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825～828)。將人骨髓瘤細胞株U266用含有1％毛地黃皂苷(WakoChemicals制造)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M NaCl的1mM對氨基苯基甲磺酰氟鹽酸鹽(Wako Chemicals制造)(毛地黃皂苷緩沖液)溶解，和與瓊脂糖4B珠結(jié)合的MT18抗體混合。然后，將該珠用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次，作為用于免疫的部分純化IL-6受體。
用由3×109個U266細胞得到的上述部分純化IL-6受體每隔10天免疫BALB/c小鼠1次，共4次，然后用常規(guī)方法制備雜交瘤。用下述方法研究來自陽性孔的雜交瘤培養(yǎng)上清液對IL-6受體的結(jié)合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)標記的5×107個U266細胞，用上述毛地黃皂苷緩沖液使之溶解。將溶解的U266細胞和0.04ml容量的與瓊脂糖4B珠結(jié)合的MT18抗體混合，然后，用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次，使用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)使35S-蛋氨酸標記的的IL-6受體洗脫，用0.025ml的1M Tris(pH 7.4)中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)上清液和0.01ml的蛋白質(zhì)GSepharose(Phramacia制造)混合。洗滌后，將Sepharose和上述制備的0.005ml35S標記的IL-6受體溶液一起溫育。用SDS-PAGE分析免疫沉淀物，研究與IL-6受體反應(yīng)的雜交瘤培養(yǎng)上清液。其結(jié)果確立了反應(yīng)陽性雜交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。產(chǎn)生于雜交瘤PM-1的抗體具有IgG1κ型的亞型。
用人骨髓瘤細胞株U266研究雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體對于人IL-6受體的IL-6的結(jié)合抑制活性。由大腸桿菌制備人重組型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41～45)、用Bolton-Hunter試劑(New Engl and Nuclear，Boston，MA)進行125I標記(Taga，T.etal.，J.Exp.Med.(1987)166，967～981)。
將4×105個U266細胞與70％(v/v)雜交瘤PM-1的培養(yǎng)上清液和14000cpm的125I標記的IL-6一起培養(yǎng)1小時。將70μl樣品鋪到400μl的聚乙烯微量離心管中的300μl的FCS上，離心后，測定細胞上的放射活性。
結(jié)果表明，雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合。參考例4.抗小鼠IL-6受體抗體的制備通過Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168～173記載的方法，制備針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
在含有10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)產(chǎn)生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細胞，從其培養(yǎng)上清液使用將抗小鼠IL-6受體抗體RS12(參照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝膠(Biorad制造)的親合層析柱純化小鼠可溶性IL-6受體。
將得到的小鼠可溶性IL-6受體50μg與弗氏完全佐劑混合，注射到Wistar大鼠的腹部。2周后開始用弗氏不完全佐劑追加免疫。第45天采集大鼠脾臟細胞，使2×108個脾臟細胞按照常規(guī)方法與1×107個小鼠骨髓瘤細胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制造)細胞融合后，在HAT培養(yǎng)基中篩選雜交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗體(Cappel制造)的板上加入雜交瘤培養(yǎng)上清液后，使小鼠可溶性IL-6受體反應(yīng)。然后，通過使用兔抗小鼠IL-6受體抗體和堿性磷酸酯酶標記的的綿羊抗兔IgG的ELISA法篩選可產(chǎn)生針小可溶性IL-6受體抗體的雜交瘤。對已確認產(chǎn)生抗體的雜交瘤克隆進行2次亞篩選，得到單一的雜交瘤克隆。此克隆被命名為MR16-1。
以MH60.BSF2細胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951～956)用3H胸苷的攝取研究該雜交瘤產(chǎn)生的抗體在小鼠IL-6的信息傳遞中的中和活性。在96孔板上制備MH60.BSF2細胞至1×104個/200μl/孔。在該板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR16-1抗體或RS12抗體12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)44小時后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小時后測定3H胸苷的攝取。結(jié)果表明，MR16-1抗體抑制MH60.BSF2細胞的3H胸苷攝取。
因此表明，雜交瘤MR16-1(FERM BP-5875)產(chǎn)生的抗體，能阻礙IL-6與IL-6抗體的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.血管炎的預(yù)防和/或治療劑，其含有白介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
2.對類固醇和/或免疫抑制劑耐藥的血管炎的預(yù)防和/或治療劑，其含有白介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
3.權(quán)利要求1或2的預(yù)防和/或治療劑，其中所述血管炎是結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎。
4.權(quán)利要求1或2的預(yù)防和/或治療劑，其中所述血管炎是主動脈炎綜合征。
5.權(quán)利要求1或2的預(yù)防和/或治療劑，其中所述血管炎是伴隨免疫異常的血管炎。
6.權(quán)利要求1-5中任一項記載的預(yù)防和/或治療劑，其中所述白介素-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
7.權(quán)利要求6的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求6的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
9.權(quán)利要求6的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求6～9中任一項記載的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對IL-6受體的抗體是重組抗體。
11.權(quán)利要求8的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
12.權(quán)利要求9的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
13.權(quán)利要求6～12任一項的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
14.權(quán)利要求13的預(yù)防和/或治療劑，其中所述針對IL-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
15.白介素-6(IL-6)拮抗劑用于制備血管炎的預(yù)防和/或治療劑的用途。
16.白介素-6(IL-6)拮抗劑的用途，其用于制備對類固醇和/或免疫抑制劑耐藥的血管炎的預(yù)防和/或治療劑。
17.權(quán)利要求15或16的用途，其中所述血管炎是結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎。
18.權(quán)利要求15或16的用途，其中所述血管炎是主動脈炎綜合征。
19.權(quán)利要求15或16的用途，其中所述血管炎是伴隨免疫異常的血管炎。
20.權(quán)利要求15～19中任-項記載的用途，其中所述IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的單克隆抗體。
22.權(quán)利要求20的用途，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
23.權(quán)利要求20的用途，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
24.權(quán)利要求20～23任一項的用途，其中所述針對IL-6受體的抗體是重組抗體。
25.權(quán)利要求22的用途，其中所述針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
26.權(quán)利要求23的用途，其中所述針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
27.權(quán)利要求20～26任一項的用途，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述針對IL-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
29.血管炎的預(yù)防和/或治療方法，其包括對有此需要的對象施用白介素-6(IL-6)拮抗劑。
30.對類固醇和/或免疫抑制劑耐藥的血管炎的預(yù)防和/或治療方法，其包括對有此需要的對象施用白介素-6(IL-6)拮抗劑。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其中所述血管炎是結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎。
32.權(quán)利要求29或30的方法，其中所述血管炎是主動脈炎綜合征。
33.權(quán)利要求29或30的方法，其中所述血管炎是伴隨免疫異常的血管炎。
34.權(quán)利要求29～33中任一項記載的方法，其中所述IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的單克隆抗體。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
38.權(quán)利要求34～37中任一項記載的方法，其中所述針對IL-6受體的抗體是重組抗體。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
41.權(quán)利要求34～40任一項的方法，其中所述針對IL-6受體的抗體是針對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述針對IL-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了血管炎，例如結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、主動脈炎綜合征和伴隨免疫異常的血管炎的預(yù)防和/或治療劑，其含有白介素－6(IL－6)拮抗劑，例如針對IL－6受體(IL－6R)的抗體。
文檔編號A61P9/00GK1893979SQ20048003788
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者西本憲弘, 岸本忠三, 中原英子 申請人:中外制藥株式會社