專利名稱：病毒感染的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗病毒活性的多肽、其衍生物或者類似物，還涉及編碼所述多肽、其衍生物或者類似物的核酸。本發(fā)明還提供了此類多肽、衍生物、類似物或者核酸作為藥物的用途以及在治療方法中的用途。
抗病毒劑可以靶向病毒復(fù)制周期的6個階段之一，這些階段為1.病毒對細(xì)胞的附著；2.滲透(或者病毒膜與細(xì)胞膜的融合)；3.病毒的脫殼；4.病毒核酸的復(fù)制；5.子代病毒顆粒的成熟；和6.子代病毒向細(xì)胞外流體的釋放。
這6個階段中，復(fù)制(上面的階段4)是靶標(biāo)，其通過常規(guī)抗病毒治療可以最有效地影響。然而，可以論證病毒向細(xì)胞的附著是更吸引人的靶標(biāo)，因?yàn)樵噭┎恍枰M(jìn)入宿主細(xì)胞。然而，在該領(lǐng)域中還沒有研發(fā)成功的療法。
因此本發(fā)明的一個目的是提供調(diào)節(jié)病毒向細(xì)胞的附著的治療劑。
脂蛋白(LP)是存在于血清和其他細(xì)胞外流體中的球形大分子復(fù)合體，由脂類和蛋白質(zhì)組成，并且涉及脂類在身體周圍的運(yùn)輸。已經(jīng)將它們根據(jù)它們的密度分類，主要的類別是高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、和極低密度脂蛋白(VLDL)。它們的蛋白質(zhì)稱作載脂蛋白，并且已經(jīng)描述了許多載脂蛋白，包括載脂蛋白A、B、C、D、E、F、G、H和J。此外，已經(jīng)記載了載脂蛋白A、B和C的一些亞型。
已經(jīng)描述了將LP與病毒結(jié)合的多種相互作用。這些相互作用多數(shù)涉及病毒對脂蛋白的結(jié)合，這導(dǎo)致減小的病毒感染性，或者相反地，提供了病毒進(jìn)入細(xì)胞的“搭車”方法。此外，一些病毒利用LP的細(xì)胞受體(例如，LDL受體)作為進(jìn)入細(xì)胞的工具，盡管這些受體也可以被細(xì)胞作為內(nèi)源抗病毒劑釋放(例如，VLDL受體的可溶性形式被HeLa細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中并且抑制人鼻病毒感染)。此外，也已經(jīng)報導(dǎo)了某些載脂蛋白和病毒蛋白質(zhì)之間的直接結(jié)合。例如a.丙型肝炎病毒核心蛋白質(zhì)結(jié)合載脂蛋白AII；b.乙型肝炎病毒表面抗原結(jié)合載脂蛋白H；和c.猿猴免疫缺陷病毒(SIV)gp32蛋白質(zhì)和人免疫缺陷病毒(HIV)gp41蛋白結(jié)合載脂蛋白A1。
在發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的工作表明腦中存在潛伏的1型單純皰疹病毒(HSV1)和具有特定基因的特定等位基因-APOE基因的APOE-e4等位基因增加了患阿爾茨海默氏病(AD)的危險?？紤]到還發(fā)現(xiàn)APOE-e4攜帶者更可能患感冒瘡(其是外周神經(jīng)系統(tǒng)中HSV1的再活化后發(fā)現(xiàn)的病變)，這些結(jié)果提示APOE-e4攜帶者更可能遭受HSV1感染造成的傷害，并且提示在載脂蛋白E和某些病毒之間可能存在相互作用(盡管此類相互作用不必一定涉及抗病毒效應(yīng))。HSV1和apoE之間的一種可能的作用方式涉及如下的獨(dú)立發(fā)現(xiàn)它們都使用細(xì)胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)分子作為它們對細(xì)胞的最初結(jié)合位點(diǎn)，隨后附著到二級受體，其引起在含有LP的HSV1和apoE之間這些HSPG位點(diǎn)發(fā)生競爭的可能性，這將影響病毒進(jìn)入。
已經(jīng)表明載脂蛋白E影響免疫系統(tǒng)(似乎與它在脂類代謝中的角色無關(guān))，包括抑制T淋巴細(xì)胞增殖。已經(jīng)檢查了來自apoE的殘基130-169的許多肽與淋巴細(xì)胞之間的相互作用。(Clay et al.，Biochemistry，3411142-11151(1995))。預(yù)測由apoE殘基141-149組成的區(qū)域尤其重要。已經(jīng)描述了神經(jīng)元細(xì)胞系中此類肽的相似的相互作用。
WO 94/04177公開使用含有脂類和兩親性螺旋肽的顆粒允許清除微生物產(chǎn)生的毒素，并且可以通過對細(xì)菌細(xì)胞膜的影響增加抗細(xì)菌藥物的有效性。然而，沒有提出含有此類apoA衍生的肽的顆?？梢杂米骺共《舅幬铩Ｒ膊磺宄w粒中肽的施用是否將導(dǎo)致有效利用該顆粒的任一組分的抗病毒作用，所述顆粒中的肽是所公開的研發(fā)中的關(guān)鍵成分(所述顆?？梢栽谑褂们靶纬苫蚴莾?nèi)源地形成)。
已經(jīng)表明來自apoA的兩親性螺旋肽(Ananatharamiah在Meth.Enz.，128627-647(1986)中描述)防止病毒膜與細(xì)胞膜的融合，并且還防止受感染的細(xì)胞膜的融合(Srinivas et al.J.Cellular Biochem.，45224-237(1991))。該肽在防止HSV1和HIV的融合方面也是有效的(Owens et al.，JClin.Invest.，861142-1150(1990))。然而，所述肽至少對于HSV1對細(xì)胞的附著是無效的(Srinivas et al.上文)。
Azuma等人已經(jīng)報導(dǎo)與慶大霉素相比，apoE的肽衍生物具有強(qiáng)烈的抗細(xì)菌作用(Peptides，21327-330(2000))。ApoE133-162最有效，apoE134-155幾乎無效。
按照上述研究，發(fā)明人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來評估來自ApoE的肽(其能夠形成螺旋)是否具有抗病毒活性。他發(fā)現(xiàn)ApoE的肽片段apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)(即，2×LRKLRKRLL-SEQ ID No.1)實(shí)際上沒有抗病毒作用。而本發(fā)明人不希望被任何假說束縛，他認(rèn)為該片段防止病毒顆粒對細(xì)胞的附著，導(dǎo)致如通過噬菌斑減小測定技術(shù)測量的病毒的感染性減小。實(shí)施例1闡明了所述肽對諸如HSV1、HSV2和HIV的病毒是多么有效。因此，該肽當(dāng)直接應(yīng)用于病毒，或者當(dāng)在細(xì)胞存在下應(yīng)用于病毒時是有效的，并且因此該肽可以用于在病毒到達(dá)它們的靶細(xì)胞很久前滅活游離的病毒顆粒。
按照對apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)(即2×LRKLRKRLL-SEQ ID No.1)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，發(fā)明人決定研究載脂蛋白的其他片段的抗病毒活性。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了包含SEQ ID No.2的apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)或者其平截的多肽、其衍生物或者類似物，其特征是將SEQ ID No.2的至少一個亮氨酸(L)殘基用具有包含至少4個碳原子和至少一個氮原子的側(cè)鏈的氨基酸替代。
“SEQ ID No.2的apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)”指具有氨基酸序列LRKLRKRLLLRKLRKRLL的肽。串聯(lián)重復(fù)在這里指apoE141-149dp或者apoE141-149r。將該肽也分配代碼GIN1或者GIN1p(其中p表示N末端保護(hù)(例如，通過乙?；?，和C末端保護(hù)(例如，通過酰胺基))。
“其平截”指通過除去氨基酸減小SEQ ID No.2的18聚體的大小。氨基酸的減少可以通過從肽的C或者N末端除去殘基或者可以通過從肽的核心(即，SEQ ID No.2的氨基酸2-17)缺失一個或多個氨基酸來完成。
“其衍生物或類似物”指將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈或者肽主鏈性質(zhì)的殘基(天然氨基酸、非天然氨基酸或者氨基酸模擬物)替代。此外，此類肽的末端可以通過用與乙?；蛘啧０坊邢嗨菩再|(zhì)的N和C-末端保護(hù)基保護(hù)。
本發(fā)明人進(jìn)行了詳盡的實(shí)驗(yàn)來評估來自載脂蛋白的肽和其衍生物的抗病毒活性。來自ApoE的肽和衍生物尤其是焦點(diǎn)。令發(fā)明人驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)所測試的多數(shù)肽幾乎沒有或者沒有抗病毒作用。令人驚奇的例外是根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽。實(shí)施例2-7闡明了與apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)和來自載脂蛋白的其他肽相比，根據(jù)本發(fā)明的肽的功效。
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定色氨酸(W)、精氨酸(R)或者賴氨酸(K)可以代替apoE141-149串聯(lián)重復(fù)中的亮氨酸并且該類肽具有令人驚奇的抗病毒活性。本發(fā)明人明白這些氨基酸具有包含至少4個碳并且還含有氮原子的側(cè)鏈。因此，在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽中用于代替亮氨酸的氨基酸是色氨酸(W)、精氨酸(R)或者賴氨酸(K)或者其衍生物。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中用W替代至少一個L的肽具有獨(dú)特的抗病毒活性。因此最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽包含含有SEQ ID No.2的apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)或者其平截的多肽、其衍生物或者類似物，其特征是通過色氨酸(W)替代SEQ ID No.2的至少一個亮氨酸(L)殘基。
在研發(fā)工作中，發(fā)明人注意到W替代可以預(yù)期增加該肽形成α螺旋的可能性并且想知道這是否可以解釋根據(jù)本發(fā)明的第一方面的化合物的抗病毒功效。然而，他認(rèn)為這不能解釋根據(jù)本發(fā)明的肽的令人驚奇的功效。這是因?yàn)樵S多備選替代將預(yù)計增加α螺旋形成(例如，對于形成α螺旋的多種L取代的肽的可能性計算見表1)。然而，形成螺旋的可能性(表1)不與根據(jù)本發(fā)明的肽的抗病毒活性相關(guān)(見實(shí)施例5)。
表1.在水性0.15M NaCl緩沖液中37℃下形成α螺旋的多種肽分子的預(yù)計比例(％)(使用AGADIR二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件，可以從http//www.embl-heidelberg.de/Services/serrano/agadir/agadir-start.Html得到)。
氨基酸替代 肽序列 ％螺旋E，Glu ERKERKREEERKERKREE 6.24A，Ala ARKARKRAAARKARKRAA 1.85D，Asp DRKDRKRDDDRKDRKRDD 1.59W，Trp WRKWRKRWWWRKWRKRWW 1.47M，Met MRKMRKRMMMRKMRKRMM 1.01Y，Tyr YRKYRKRYYYRKYRKRYY 0.8F，Phe FRKFRKRFFFRKFRKRFF 0.79I，Ile IRKIRKRIIIRKIRKRII 0.6Q，Gln QRKQRKRQQQRKQRKRQQ 0.55無交換 0.51發(fā)明人還注意到1.從W取代的增加非常小(0.51％的GIN 1p分子將形成螺旋，W取代的肽微小地增加到1.47％)；和2.將預(yù)測許多其他替代將增加在任一時刻形成α螺旋的分子比例。例如，用E或A替代L增加形成α螺旋的可能性高于W替代增加形成α螺旋的可能性(分別增加到6.24％和1.87％)。然而，這些替代都實(shí)際上消除了抗病毒活性(例如，見實(shí)施例3或?qū)嵤├?中的肽GIN39)。
因此，形成α螺旋的可能性和根據(jù)本發(fā)明的“L-被替代的”肽的抗病毒活性的強(qiáng)度之間沒有相關(guān)性。
根據(jù)本發(fā)明的肽的功效更加令人驚奇，因?yàn)閷(亮氨酸)用根據(jù)本發(fā)明的第一方面的氨基酸替代將使得肽的兩親性減小。(表2闡明了認(rèn)可的氨基酸的疏水性順序)。技術(shù)人員可能實(shí)際上懷疑使得肽更具兩親性將賦予抗病毒特征。因此，出人意料地，SEQ ID No.2的根據(jù)本發(fā)明的替代導(dǎo)致它們的抗病毒活性的顯著增加。
表2氨基酸的疏水性
Phe＞Leu＝Ile＞Tyr＝Trp＞Val＞Met＞Pro＞Cys＞Ala＞Gly＞Thr＞Ser＞Lys＞Gln＞Asn＞His＞Glu＞Asp＞Arg如下文中更詳細(xì)討論的，可以根據(jù)本發(fā)明的第一發(fā)明用許多不同的替代和缺失操作SEQ ID No.2使得肽具有抗病毒活性。然而，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽具有至少兩個W、R或者K替代，更優(yōu)選地有三個或更多W、R或者K替代。
除了用W、R或者K進(jìn)行一個或多個L替代，還優(yōu)選將至少一個其他氨基酸(優(yōu)選至少一個其他賴氨酸殘基)用天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)、谷氨酰胺(Q)或者組氨酸(H)替代。尤其優(yōu)選此類其他替代是Y或C。
所替代的多肽可以包含18個氨基酸(或者其衍生物)并且從而對應(yīng)于SEQ ID No.2的全長。然而，發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)基于SEQ IDNo.2的截短的肽也具有作為抗病毒劑的功效。因此，優(yōu)選的肽或者其衍生物可以具有小于18個氨基酸。例如，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的一些肽可以長為17、16、15、14、13、12、11、10或者更少的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的肽和其衍生物優(yōu)選具有抑制病毒生長的功效，從而它們的IC50值為30μM或者更小。優(yōu)選IC50值為20μM或者更小，更優(yōu)選IC50值為10μM或者更小。
優(yōu)選的肽在病毒種之間具有相似的IC50。例如，優(yōu)選的肽對于抑制HSV1、HSV2和HIV生長具有相似的IC50值。
將理解可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多氨基酸變體將經(jīng)修飾的氨基酸代替到apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)中。如果該修飾不顯著改變肽的化學(xué)性質(zhì)，那么此類肽將仍然具有抗病毒活性。例如，可以將R或者K的側(cè)鏈胺上的氫用亞甲基(-NH2→-NH(Me)或-N(Me)2)代替。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選的肽具有氨基酸序列(a)WRKWRKRWWWRKWRKRWW(SEQ ID No.3)。該肽對應(yīng)于全長串聯(lián)重復(fù)，其中用色氨酸殘基替代所有亮氨酸。在本文中將該肽稱作GIN7。
(b)WRKWRKRWRKWRKR(SEQ ID No.4)。該肽對應(yīng)于全長串聯(lián)重復(fù)，其中用色氨酸殘基替代所有亮氨酸并通過切除氨基酸9、10、17和18而平截。在本文中將該肽稱作GIN32。
(c)WRKWRKRWWLRKLRKRLL(SEQID No.5)。該肽對應(yīng)于全長串聯(lián)重復(fù)，其中用色氨酸殘基替代一部分亮氨酸。在本文中將該肽稱作GIN34。
(d)WRKWRKRWWRKWRKRWW(SEQ ID No.52)。該肽對應(yīng)于缺失9位的W殘基的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU58。
(e)WRKWRKRWRKWRKRW(SEQ ID No.53)。該肽對應(yīng)于缺失9、10和18位的W殘基的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU59。
(f)WRKWRKRWWFRKWRKRWW(SEQ ID No.54)。該肽對應(yīng)于將10位的W殘基用F替代的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU60。
(g)WRKWRKRWFFRKWRKRFF(SEQ ID No.55)。該肽對應(yīng)于將9、10、17和18位的W殘基用F替代的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU61。
(h)WRKCRKRCWWRKCRKRCW(SEQ ID No.56)。該肽對應(yīng)于將4、8、13和17位的W殘基用C殘基替代的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU68。
(i)LRKLRKRLLWRKWRKRWW(SEQID No.57)。該肽對應(yīng)于將10、13、17和18位的L殘基用W殘基替代的SEQ ID No.2。在本文中將該肽稱作MU111。
(j)LRKLRKRLLLRKLRKRWW(SEQ ID No.58)。該肽對應(yīng)于將17和18位的L殘基用W殘基替代的SEQ ID No.2。在本文中將該肽稱作MU112。
(k)LRKLRKRLLWRKWRKRLL(SEQ ID No.59)。該肽對應(yīng)于將10和13位的L殘基用W殘基替代的SEQ ID No.2。在本文中將該肽稱作MU113。
(l)WRKWRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.60)。該肽對應(yīng)于將1和4位的L殘基用W殘基替代的SEQ ID No.2。在本文中將該肽稱作MU114。
(m)WRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.61)。該肽對應(yīng)于將1位的L殘基用W殘基替代的SEQ ID No.2。在本文中將該肽稱作MU115。
(n)WRKWRKFFFRKWRKRWW(SEQ ID No.62)。該肽對應(yīng)于將8、9和10位的W殘基用F殘基替代并且缺失7位的R殘基的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU116。
(o)WRKWRKRWWFRKFRKRFF(SEQ ID No.63)。該肽對應(yīng)于將10、13、17和18位的W殘基用F殘基替代的SEQ ID No.3。在本文中將該肽稱作MU117。
(p)RRKRRKRRRRKRRKRRR(SEQ ID No.64)。該肽對應(yīng)于全長串聯(lián)重復(fù)，其中所有亮氨酸用精氨酸(R)殘基替代。在本文中將該肽稱作MU16。
(q)KRKKRKRKKKRKKRKRKK(SEQ ID No.65)。該肽對應(yīng)于全長串聯(lián)重復(fù)，其中所有亮氨酸用賴氨酸(K)殘基替代。在本文中將該肽稱作MU18。
發(fā)明人還理解可以根據(jù)本發(fā)明使用的肽可以包含超過僅ApoE141-149的簡單的二聚體串聯(lián)重復(fù)或者其平截。例如，可以將包含三聚體或者更大數(shù)目重復(fù)的肽用作抗病毒劑。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以合成抗病毒肽，其包含如上定義的肽以及向其加入的另外的氨基酸。例如，可以對來自SEQ ID No.2的肽的C或者N末端加入1、2、3或更多氨基酸。備選地，所述肽可以包含大于SEQ ID No.1的9個氨基酸的肽的串聯(lián)重復(fù)。此類肽可以具有加入SEQ ID No.2的N末端、C末端和/或第9和10個氨基酸之間的氨基酸。最優(yōu)選地，向SEQ ID No.2的C末端和第9和10個氨基酸之間加入氨基酸。將理解可以如上述對來自SEQ ID No.2的肽進(jìn)行修飾。作為實(shí)例，WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR(SEQ ID No.66)代表根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選的肽。該肽對應(yīng)于ApoE141-150的全長串聯(lián)重復(fù)(即，LRKLRKRLLR-SEQ ID No.67的串聯(lián)重復(fù))，其中用色氨酸殘基替代所有亮氨酸。在本文中將該肽稱作MU83。
在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)的衍生物的開發(fā)期間，理解SEQ ID No.2的平截，和其變體也具有令人驚奇的抗病毒活性。這些包括LRKLRKRLLLRKLRK(SEQ ID No.7)。該肽對應(yīng)于缺失殘基16、17和18的全長串聯(lián)重復(fù)的截短形式。該肽具有這樣的優(yōu)點(diǎn)該肽短于GIN1并且因此生產(chǎn)更便宜。在本文中將該肽稱作GIN4。
LRKLRKRLRKLRKR(SEQ ID No.8)。該肽對應(yīng)于通過切除氨基酸9、10、17和18截短的全長串聯(lián)重復(fù)。在本文中將該肽稱作GIN8。
LRKLRKLRKLRKLRKLRK(SEQ ID No.9)。該肽對應(yīng)于包含LRK基序重復(fù)的全長串聯(lián)重復(fù)的變體。在本文中將該肽稱作GIN9。
此外，發(fā)現(xiàn)YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No.6)具有抗病毒劑的效果。該肽對應(yīng)于apoE141-149的全長串聯(lián)重復(fù)，其中酪氨酸殘基替代所有亮氨酸殘基。在本文中將該肽稱作GIN41。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽、其衍生物或者類似物或者SEQ ID No.6、7、8或9的肽，它們用作藥物。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽、其衍生物或者類似物或者SEQ ID No.6、7、8或9的肽用于生產(chǎn)治療病毒感染的藥物的用途。
將理解根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽、其衍生物或者類似物的治療效果還可以由增加此類多肽、衍生物或類似物的活性的試劑“間接”介導(dǎo)。本發(fā)明提供了此類試劑的第一種醫(yī)學(xué)用途。
從而，根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了能夠增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽、衍生物或者類似物的生物活性的試劑，其用作藥物。
能夠增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的多肽、衍生物或者類似物的生物活性的試劑可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)它們的效果。例如，此類試劑可以增加此類多肽、衍生物或類似物的表達(dá)。備選地(或者額外地)，此類試劑可以例如通過減小根據(jù)本發(fā)明的多肽、衍生物或者類似物的更新來增加根據(jù)本發(fā)明的多肽、衍生物或者類似物在生物系統(tǒng)中的半壽期。
由于它們的增加的生物學(xué)活性，根據(jù)本發(fā)明的第一三方面的多肽、其衍生物或者類似物可以用作抗病毒劑。
根據(jù)本發(fā)明的第一、二和三方面的多肽、衍生物或者類似物可以用于治療多種病毒感染。所述病毒可以是任意病毒，尤其有包膜的病毒。優(yōu)選的病毒是痘病毒、虹彩病毒、批膜病毒或者環(huán)狀病毒。更優(yōu)選的病毒是線狀病毒、沙粒病毒、布尼病毒或者彈狀病毒。甚至更優(yōu)選的病毒是副黏病毒或者正黏病毒。設(shè)想病毒可以優(yōu)選地包括肝DNA病毒、冠狀病毒、黃病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選地，病毒包括皰疹病毒或者慢病毒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒可以是人類免疫缺陷病毒(HIV)、人2-型單純皰疹病毒(HSV2)，或者人1型單純皰疹病毒(HSV1)。
根據(jù)本發(fā)明的第一、二和三方面的多肽、衍生物或者類似物可以用于作為單一療法(即僅使用該化合物)或者與用于抗病毒治療的其他化合物或治療(例如，無環(huán)鳥苷、gangcylovir、病毒唑、干擾素、抗-HIV藥物，包括逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷、核苷酸或非核苷抑制劑、蛋白酶抑制劑和融合抑制劑)組合用于治療病毒感染。
該多肽、衍生物或類似物可以用作預(yù)防劑(以預(yù)防病毒感染的進(jìn)展)或可以用于治療存在的感染。
根據(jù)本發(fā)明多肽的衍生物可以包括增加或者減小多肽的體內(nèi)半壽期的衍生物。能夠增加根據(jù)本發(fā)明多肽的半壽期的衍生物的實(shí)例包括所述多肽的擬肽衍生物、所述多肽的D-氨基酸衍生物和肽-擬肽雜合分子。
根據(jù)本發(fā)明的多肽可以受到多種方式的降解(如生物系統(tǒng)中的蛋白酶活性)。此類降解可以限制多肽的生物利用率并且因此限制多肽實(shí)現(xiàn)它們的生物功能的能力。有多種成熟的技術(shù)可以設(shè)計和產(chǎn)生在生物背景中具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的肽衍生物。此類肽衍生物由于對蛋白酶介導(dǎo)的降解的抗性增加而具有改善的生物利用率。優(yōu)選地，適于根據(jù)本發(fā)明使用的肽衍生物或者類似物比該它所來源的肽對蛋白酶更有抗性。肽衍生物和它所來源的肽的蛋白酶抗性可以通過公知的蛋白質(zhì)降解測定法評價。然后可以比較肽衍生物和肽的蛋白酶抗性的相對值。
可以從根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽的結(jié)構(gòu)知識容易地設(shè)計本發(fā)明肽的擬肽衍生物。可以用通過商業(yè)途徑可獲得的軟件根據(jù)成熟的方案開發(fā)擬肽衍生物。
反擬肽(Retropeptoid)(其中所有氨基酸都被擬肽殘基以相反順序替代)也能夠模擬來自載脂蛋白的抗病毒肽。預(yù)計與肽或者含有一個擬肽殘基的擬肽-肽雜合分子相比，反擬肽以相反方向結(jié)合在配體結(jié)合溝中。結(jié)果，擬肽殘基的側(cè)鏈能夠指向最初肽中側(cè)鏈相同的方向。
根據(jù)本發(fā)明多肽的修飾形式的另一實(shí)施方案包含多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制備肽極大地減小了正常代謝過程對此類試劑劑的不希望的分解，減小了需要使用的試劑的量，以及它的施用頻率。
本發(fā)明的多肽、類似物或衍生物代表生物細(xì)胞可以有利地表達(dá)的產(chǎn)物。
從而，本發(fā)明在第五方面還提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽、衍生物或類似物的核酸序列。
編碼apoE141-149的核酸具有DNA序列cttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt(SEQID.No.10)，而GIN1具有序列cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt(SEQ ID.No.11)。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面的優(yōu)選的核酸編碼此處鑒定為GIN4、7、8、9、32、34和41的肽，這些核酸各自具有下面的序列cttcgtaaac ttcgtaaact tcgtaaactt cgtaaacttc gtaaacttcg taaa(SEQ ID No.16)；tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggtgg cgtaaatggc gtaaacgttg gtgg(SEQ ID No.12)；cttcgtaaac ttcgtaaacg tcttcgtaaa cttcgtaaac gt(SEQ ID No.17)；cttcgtaaac ttcgtaaact tcgtaaactt cgtaaacttc gtaaacttcg taaa(SEQ ID No.18)；tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggcgtaaa tggcgtaaac gt(SEQ ID No.13)；
tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggctt cgtaaacttc gtaaacgtct tctt，(SEQ ID No.14)；和tatcgtaaat atcgtaaacg ttattattat cgtaaatatc gtaaacgtta ttat(SEQ ID No.15).
技術(shù)人員將理解可以容易地產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的其他優(yōu)選的肽的核酸序列。
將理解，由于遺傳密碼的冗余性，根據(jù)本發(fā)明的第五方面的核酸序列可以從天然存在的ApoE基因改變，只要密碼子編碼根據(jù)本發(fā)明的第一方面的多肽、其衍生物或者類似物。
將理解根據(jù)本發(fā)明的多肽、衍生物和類似物代表通過技術(shù)施用的有利的試劑，所述技術(shù)包括編碼此類分子的核酸序列的細(xì)胞表達(dá)。此類細(xì)胞表達(dá)方法尤其適于醫(yī)學(xué)用途，在所述醫(yī)學(xué)用途中需要所述多肽、衍生物和類似物的長時間的治療效果。
從而，根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的第五方面的核酸序列，其用作藥物。
所述核酸可以優(yōu)選是分離的或純化的核酸序列。核酸序列可以優(yōu)選是DNA序列。
核酸序列可以還包含能夠控制和/或增強(qiáng)其表達(dá)的元件。核酸分子可以包含在適宜的載體中以形成重組載體。該載體可以例如是質(zhì)粒、粘?；蚴删w。此類重組載體可以非常有用地用于本發(fā)明的遞送系統(tǒng)來用核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
重組載體還可以包括其他功能元件。例如，可以設(shè)計重組載體使得該載體將在細(xì)胞中自主復(fù)制。在該情況中，在重組載體中可能需要誘導(dǎo)核酸復(fù)制的元件。備選地，可以設(shè)計重組載體使得載體和重組核酸分子整合到細(xì)胞的基因組中。在該情況中，有利于定位整合(例如，通過同源重組)的核酸序列是理想的。重組載體還可以具有編碼用作克隆過程中的選擇性標(biāo)記的基因的DNA。
如果需要，重組載體可以還包含控制基因表達(dá)的啟動子或調(diào)節(jié)子。
核酸分子可以(但不是必須的)是整合到所治療的受試者的細(xì)胞的DNA中的核酸分子。未分化的細(xì)胞可以被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳修飾的子細(xì)胞(在該情況中，可能需要例如用特定轉(zhuǎn)錄因子或者基因激活子調(diào)節(jié)受試者中的表達(dá))。備選地，可以將遞送系統(tǒng)設(shè)計成有利于在所治療的受試者中分化細(xì)胞的不穩(wěn)定或者瞬時轉(zhuǎn)化。當(dāng)是這種情況時，表達(dá)的調(diào)節(jié)較不重要，因?yàn)楫?dāng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡或者停止表達(dá)蛋白質(zhì)時，所述DNA分子的表達(dá)將停止(理想地，當(dāng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了所希望的治療效果時)。
遞送系統(tǒng)可以對受試者提供核酸分子而不將該核酸分子整合到載體中。例如，核酸分子可以摻入脂質(zhì)體或者病毒顆粒中。備選地，可以通過適宜的方法，如直接胞吞攝入將“裸露”的核酸分子插入受試者的細(xì)胞。
可以通過轉(zhuǎn)染、感染、顯微注射、細(xì)胞融合、原生質(zhì)體融合或者射彈轟擊(ballistic bombardment)將核酸分子轉(zhuǎn)移到受試者的細(xì)胞中。例如，可以通過用包被的金顆粒的射彈轉(zhuǎn)染、含有核酸分子的脂質(zhì)體、病毒載體(例如，腺病毒)和通過直接應(yīng)用核酸分子提供直接核酸攝入(例如，胞吞)的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
將理解根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物可以以單一療法使用(即，僅使用根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物預(yù)防和/或治療病毒感染)。備選地，可以將根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物用作添加劑(adiunct)，或者與已知的療法組合使用。
根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物可以組合在具有許多不同形式的組合物中，這些形式具體取決于組合物使用的方式。從而，例如，組合物可以是粉劑、片劑、膠囊劑、液體、軟膏劑、霜劑、凝膠劑、水凝膠、氣溶膠、噴霧劑、微團(tuán)、透皮貼劑、脂質(zhì)體的形式或者可以施用于人或動物的任意其他適宜的形式。將理解本發(fā)明組合物的載體應(yīng)該是對其施用的受試者良好耐受的，并且優(yōu)選適于能夠?qū)⑺龆嚯?、試劑、核酸或衍生物遞送到靶組織。
包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物的組合物可以以多種方法使用。例如，可能需要經(jīng)口使用，在該情況中化合物可以包含在組合物中，該組合物可以例如以片劑、膠囊劑或液體的形式經(jīng)口攝入。備選地，可以通過注射將組合物施用到血流中。注射可以是靜脈內(nèi)(大丸劑(bolus)或灌注)或者皮下的(大丸劑或灌注)的?？梢酝ㄟ^吸入(例如，鼻內(nèi))施用化合物。
可以配制組合物用于局部使用。例如，可以將軟膏劑應(yīng)用于皮膚、口或生殖器中或者周圍的區(qū)域以治療特定病毒感染。局部應(yīng)用于皮膚對于治療皮膚的病毒感染或者作為經(jīng)皮遞送的工具遞送到其他組織。陰道內(nèi)施用對于治療性傳播疾病(包括艾滋病)尤其有效。
多肽、試劑、核酸或衍生物還可以摻入緩釋或延釋裝置。此類裝置可以例如插入在皮膚上或皮膚下，并且化合物可以在幾周或甚至幾個月內(nèi)釋放。當(dāng)需要用根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物長期治療并且將通常需要頻繁施用(例如，至少每天注射)時，此類裝置尤其有用。
將理解所需的多肽、試劑、核酸或者衍生物的量由它的生物學(xué)活性和生物利用率決定，生物利用率又取決于施用方式、所用多肽、試劑、核酸或者衍生物的理化性質(zhì)和是否將所述多肽、試劑、核酸或者衍生物用作單一療法或者用于組合療法中。施用頻率將也受到上述因素，尤其所述多肽、試劑、核酸或者衍生物在所治療的受試者中的半壽期的影響。
將施用的最佳劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，并且隨著施用的具體多肽、試劑、核酸或者衍生物、制劑的強(qiáng)度、施用方式和疾病狀況的發(fā)展而變。取決于所治療的具體受試者的額外因素將導(dǎo)致需要調(diào)節(jié)劑量，所述額外因素包括受試者年齡、體重、性別、飲食和施用時間。
將理解技術(shù)人員能夠根據(jù)肽的藥物動力學(xué)，尤其實(shí)施例中給出的IC50值計算所需的劑量，和靶組織處肽的最佳濃度。
通常，可以0.01μg/kg體重到0.5g/kg體重的根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物的日劑量可以用于預(yù)防和/或治療病毒感染，這取決于使用哪種特定多肽、試劑、核酸或者衍生物。更優(yōu)選地，日劑量為0.01mg/kg體重到200mg/kg體重，最優(yōu)選地，約1mg/kg到100mg/kg。
已知方法，如制藥工業(yè)通常使用的那些方法(例如，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等等)可以用于建立根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物的特定劑型和精確治療方案(如多肽、試劑、核酸或者衍生物的日劑量和施用頻率)。
日劑量可以作為單次施用(例如，單次每日注射)給予。備選地，所用的多肽、試劑、核酸或者衍生物可能需要一天內(nèi)施用兩次或多次。作為實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物可以作為25mg到7000mg(即，假設(shè)體重70kg)的兩次(或者多次，取決于狀況的嚴(yán)重性)日劑量施用。接受治療的患者可以在醒來時服用第一次劑量然后在傍晚(如果兩次劑量方案)服用第二次劑量，或者之后以3或4小時間隔服用。備選地，可以用緩釋裝置對患者提供最佳劑量，不需要施用重復(fù)劑量。
本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物和任選地可藥用的載體。在一個實(shí)施方案中，所述多肽、試劑、核酸或者衍生物的量為約0.01mg到約800mg。在另一實(shí)施方案中，多肽、試劑、核酸或者衍生物的量為約0.01mg到約500mg。在另一實(shí)施方案中，多肽、試劑、核酸或者衍生物的量為約0.01mg到約250mg。在另一實(shí)施方案中，多肽、試劑、核酸或者衍生物的量為約0.1mg到約60mg。在另一實(shí)施方案中，多肽、試劑、核酸或者衍生物的量為約0.1mg到約20mg。
本發(fā)明提供了制備藥物組合物的方法，其包括將治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或者衍生物與可藥用載體合并?！爸委熡行Я俊笔歉鶕?jù)本發(fā)明第一方面的多肽、試劑、核酸或者衍生物的任何劑量，其當(dāng)施用于受試者時提供了病毒感染的預(yù)防和/或治療?！笆茉囌摺笔羌棺祫游铩⒉溉閯游?、家畜或人。
本文所用的“可藥用載體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于配制藥物組合物的任何生理學(xué)載體。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物載體是液體并且藥物組合物是溶液的形式。在另一實(shí)施方案中，可藥用載體是固體并且組合物是粉末或片劑的形式。在另一實(shí)施方案中，藥物載體是凝膠并且組合物是霜劑等形式。
固態(tài)載體可以包括一種或多種物質(zhì)，其也可以作為調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮助劑、粘合劑或者片劑崩解劑；它還可以是包膠材料。在粉劑中，載體是細(xì)分的固體，其與細(xì)分活性多肽、試劑、核酸或者衍生物混合。在片劑中，活性多肽、試劑、核酸或者衍生物與具有必要壓縮性質(zhì)的載體以適當(dāng)比例混合并且以所希望的形狀和大小壓縮。粉劑和片劑優(yōu)選含有高達(dá)99％活性多肽、試劑、核酸或者衍生物。適宜的固態(tài)載體包括例如，磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點(diǎn)蠟和離子交換樹脂。
液態(tài)載體用于制備溶液、混懸劑、乳劑、糖漿劑、酏劑和壓縮的組合物?；钚远嚯?、試劑、核酸或者衍生物可以溶解或者懸浮在可藥用液態(tài)載體中，所述載體為諸如水、有機(jī)溶劑、水和有機(jī)溶劑的混合物或者可藥用油或脂肪。液態(tài)載體可以含有其他適宜的藥物添加劑，如增溶劑、乳化劑、緩沖劑、防腐劑、增甜劑、調(diào)味劑、懸浮劑、增稠劑、著色劑、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或者滲透調(diào)節(jié)劑。用于經(jīng)口或者腸胃外施用的液態(tài)載體的適宜的實(shí)例包括水(部分含有上面的添加劑，例如，纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如，乙二醇)和它們的衍生物，和油(例如，分餾的椰子油和花生油)。對于腸胃外施用，載體還可以是油酯，如油酸乙酯和十四烷酸異丙酯。無菌液態(tài)載體可用于無菌液體形式的組合物用以腸胃外施用。用于壓縮的組合物的液態(tài)載體可以是鹵代烴或者其他可藥用推進(jìn)劑。
通過例如肌內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和特別是皮下、大腦內(nèi)或腦室內(nèi)注射可以利用液體藥物組合物，其為無菌溶液或混懸劑。可以將所述多肽、試劑、核酸或衍生物制備成無菌固態(tài)組合物，其可以在施用時施用無菌水、鹽水或其他適宜的無菌可注射介質(zhì)溶解或者懸浮。載體意在包括必要的和惰性粘合劑、懸浮劑、潤滑劑、調(diào)味劑、增甜劑、防腐劑、染料和包衣。
根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以以無菌溶液或者懸浮液的形式經(jīng)口施用，所述溶液或懸浮液含有其他溶質(zhì)或懸浮劑(例如，足夠的鹽水或葡萄糖使得溶液等滲)、膽汁鹽、阿拉伯樹膠、明膠、去水山梨糖醇單油酸酯、聚山梨酯80(山梨醇的油酸酯和其與氧化乙烯共聚的酸酐)等等。
根據(jù)本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物還可以以液體或固體組合物形式經(jīng)口施用。適于經(jīng)口施用的組合物包括固體形式，如丸劑、膠囊劑、粒劑、片劑、和粉劑，和液體形式，如溶液、糖漿、酏劑和混懸劑。用于腸胃外施用的形式包括無菌溶液、乳劑和混懸劑。
將僅作為實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，參考下面的實(shí)施例和附圖，在附圖中

圖1顯示了如實(shí)施例1中描述的apoE141-149dp和apoE263-286對HSV1感染性的影響(點(diǎn)為來自多達(dá)4個值的平均值)；圖2顯示了如實(shí)施例1中描述的apoE141-149dp和apoE263-286對HSV2感染性的影響(點(diǎn)為來自多達(dá)4個值的平均值)；圖3圖解如實(shí)施例1中描述的通過ELISA測量的apoE141-149r和apoE263-286在急性感染的U937細(xì)胞中對HIV-1p24產(chǎn)生的抑制(點(diǎn)為三個實(shí)驗(yàn)的平均值)(apoE141-149dp對HIV具有顯著活性(ANOVA，p＜0.001)，而apoE263-286對HIV的活性沒有達(dá)到顯著性(ANOVA；0.06＜p＜0.62))；圖4圖解了如實(shí)施例2中描述的4種肽(GIN1、1p、2和3)對HSV1感染性的影響；圖5圖解了如實(shí)施例2中描述的4種肽(GIN4-7)對HSV1感染性的影響；圖6圖解了如實(shí)施例2中描述的4種肽(GIN8-11)對HSV1感染性的影響；圖7比較并圖解了如實(shí)施例2中描述的肽GIN7、GIN32、GIN34和GIN1p對HSV1感染性的影響；圖8圖解了如實(shí)施例4中描述的肽GIN7對生長在過表達(dá)CCR5共同受體的NP-2神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的HIV分離物SF162的抗HIV作用；圖9顯示了GIN7的典型的質(zhì)譜數(shù)據(jù)并且闡明該肽為＞95％純度；
圖10顯示了GIN7的典型的HPLC數(shù)據(jù)并且闡明該肽為＞95％純度。
實(shí)施例1用apoE141-149進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定該肽是否具有作為抗病毒劑的任何功效。
1.1HSV1圖1和表1顯示了抗-HSV1活性測試的典型結(jié)果。測定法包括對24孔板中的匯合的Vero細(xì)胞用含有病毒和不同量的肽的培養(yǎng)基處理1小時，然后除去該接種物，并加入含有0.2％高粘度羧甲基纖維素的粘性“覆蓋”培養(yǎng)基。覆蓋培養(yǎng)基僅允許感染與受感染的細(xì)胞緊密相鄰的那些細(xì)胞。孵育2天并固定和染色后，可以見到受感染的細(xì)胞的小的斑點(diǎn)(或者“噬斑”)，將它們計數(shù)。這些噬斑的每一個對應(yīng)于1小時孵育期間單個細(xì)胞的感染。apoE141-149dp在約20μM的濃度下將噬斑數(shù)目減少40％。注意到肽僅在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中存在1小時。
表1用含有apoE141.149dp或者apoE263-286的病毒接種后Vero細(xì)胞中HSV1噬斑形成。對未處理的孔的值加下劃線。
1.2HSV2
圖2和表2顯示了抗-HSV2活性測試的典型結(jié)果。如對抗HSV1測定法一樣進(jìn)行該測定法，只是使用Hep-2細(xì)胞而不是Vero細(xì)胞。apoE141-149dp在約20μM的濃度下導(dǎo)致噬斑數(shù)目減小50％。再次注意到肽僅在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中存在1小時。
表2用含有apoE141-149dp或者apoE263-286的病毒接種后HEp-2細(xì)胞中HSV2噬斑形成。對未處理的孔的值加下劃線。
1.3.HIV圖3和表3顯示了抗-HIV活性測試的典型結(jié)果。通過在不同水平的肽存在下孵育HIV感染的U937細(xì)胞7天，然后使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術(shù)測定細(xì)胞中HIV蛋白質(zhì)p24的水平來進(jìn)行該測定法。apoE141-149dp在20μM下導(dǎo)致感染性降低95％。apoE263-286在20μM下導(dǎo)致感染性降低20％，其沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。
對HIV的效果在較低肽濃度下出現(xiàn)，盡管這可能是由于肽與細(xì)胞接觸7天，相比在用皰疹病毒進(jìn)行的噬斑減少測定中肽與細(xì)胞接觸僅1小時。
表3如通過ELISA測定的，在急性感染的U937細(xì)胞中apoE141-149dp和apoE263-286對HIV-1p24產(chǎn)生的抑制。
在1.1-1.3中給出的結(jié)果表明apoE141-149dp比apoE263-286更有效。
按照這些結(jié)果，發(fā)明人繼續(xù)測試從載脂蛋白產(chǎn)生的其他肽以研究此類肽是否具有抗病毒活性(見實(shí)施例2)。
實(shí)施例2給定發(fā)明人按照實(shí)施例1中報導(dǎo)的工作得到的知識，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來評估來自載脂蛋白的許多肽的抗病毒效果。令人驚奇地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)僅少數(shù)測試的肽具有抗病毒效果(見2.2)。此類肽代表根據(jù)本發(fā)明的肽。
2.1材料和方法2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)將非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞保持在含有Earle鹽的Eagle最低限度培養(yǎng)基(EMEM)中，并補(bǔ)加10％胎牛血清(熱失活的)，4mM L-谷氨酰胺，和1％(v/v)非必需氨基酸，加上青霉素和鏈霉素(分別為100IU/mg和100mg/ml)(維持培養(yǎng)基為10％EMEM)。將細(xì)胞在含有5％CO2的潮濕空氣中37℃孵育。
收獲時，將單層在磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌，通過與胰蛋白酶在PBS中孵育30分鐘移去，之后通過加入等體積10％EMEM滅活胰蛋白酶并以500g離心(5分鐘，4℃)。將細(xì)胞沉淀物重懸浮在10％EMEM中，之后對細(xì)胞計數(shù)并接種24孔板。對于抗病毒測定，使用含有僅0.5％FCS的培養(yǎng)基(指0.5％EMEM)。
2.1.2病毒通過感染Vero細(xì)胞制備HSV1病毒的三次單獨(dú)傳代物，并從組織培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解物制備半純的病毒懸浮液，然后在-85℃冷凍病毒的等分試樣。通過對解凍的等分試樣的連續(xù)稀釋液進(jìn)行噬斑測定評估病毒感染性(以pfu/ml表達(dá))。
2.1.3肽從供應(yīng)商(AltaBioscience，University of Birmingham or AdvancedBiomedical)以凍干形式得到肽并將其以5微摩爾規(guī)模產(chǎn)生。加入乙?；Ｗo(hù)N-末端，加入酰胺基保護(hù)C-末端。
使用Finnigan LASERMAT 2000MALDI-飛行時間質(zhì)量分析儀或者Scientific Analysis Group MALDI-TOF質(zhì)譜儀通過激光解吸質(zhì)譜法證實(shí)肽的分子量。使用Vydac分析型C-4反相柱，使用0.1％TFA和0.1％TFA/80％乙腈作為溶劑進(jìn)行肽的HPLC純化，或者對于某些肽，使用ACE C18反相柱，用0.05％TFA和60％乙腈作為溶劑。肽GIN7(SEQ ID No.3)的代表性質(zhì)譜數(shù)據(jù)和高效液相層析(HPLC)跡線(純度＞95％)在圖9和10中顯示。
在無菌Eppendorf管中稱量小量肽，然后加入足夠0.5％EMEM以產(chǎn)生1.5mM貯存液，將其以等分試樣在-20℃冷凍。
2.1.4噬斑減少測定將Vero細(xì)胞以125,000個細(xì)胞/孔接種在10％EMEM中，并過夜孵育，得到匯合的單層。將肽在0.5％EMEM中稀釋得到2×最終目的濃度，并且將100μl等分試樣在96孔板上以用于24孔板的排列方式排列；還準(zhǔn)備含有正常0.5％EMEM的對照孔。將病毒原種(p3)解凍，用0.5％EMEM稀釋使得在100μl中有約100pfu。每個24孔板分開孵育。首先向在96孔板上排列的肽或者對照培養(yǎng)基加入100μl病毒原種。其在接種前在37℃孵育10分鐘。從含有匯合的Vero的24孔板的4個孔除去培養(yǎng)基，將200μl接種物加入到合適的孔中。一旦處理了所有的孔，將該24孔板繼續(xù)孵育60-80分鐘。最后，除去含有肽的接種物，并向每孔加入含有1％羧甲基纖維素的1ml 1％EMEM。將板繼續(xù)孵育22小時或者在一些實(shí)驗(yàn)中孵育40小時，然后除去覆蓋層，加入PBS中的1％甲醛。再孵育1小時后，除去固定劑，將單層用自來水洗滌幾次，用溶解在水中的石炭酸品紅染色。30分鐘后除去染料，并用自來水洗滌板數(shù)次，然后風(fēng)干。用Olympus IX70倒置顯微鏡對噬斑計數(shù)，并將抗病毒效果表示為對于每種肽濃度對照值的百分?jǐn)?shù)。從對肽濃度的抑制效果的曲線計算IC50。
2.1.5毒性測試將Vero細(xì)胞以30,000個細(xì)胞/孔接種在96孔板中的10％ EMEM中，并過夜孵育，得到匯合單層。將GIN肽在0.5％EMEM中稀釋，得到最終目的濃度，并將100μl等分試樣在分開的不含細(xì)胞的96孔板上排列，然后將Vero加入96孔板，除去10％EMEM并加入含有肽的0.5％EMEM。孵育48小時后，每孔加入25μl 1.5mg/ml MTT溶液(0.5％EMEM中)，將板返回到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。最后，從孔中除去培養(yǎng)基，通過加入100μl二甲基亞砜溶解甲 晶體。然后在570nm測量所得溶液的吸收，并將毒性效果表示為對于每種肽濃度對照值的百分?jǐn)?shù)?？赡軙r，從對肽濃度的抑制效果的曲線計算EC50。幸運(yùn)的是，使用暴露于細(xì)胞兩天的40μM的肽沒有發(fā)現(xiàn)對所測試的細(xì)胞系的毒性證據(jù)。
2.2結(jié)果表4總結(jié)了鑒定為GIN1、GIN1p和GIN2-15的16種肽所得數(shù)據(jù)。
表4
圖4表明ApoE141-149dp(標(biāo)記為GIN1)對減小HSV1感染性具有良好的效應(yīng)。相關(guān)的肽GIN 1p(具有N和C末端保護(hù)的GIN1)具有相似功效。
如表4中闡明的，發(fā)明人測試了許多其他相關(guān)的肽(鑒定為GIN2、GIN3、GIN4、GIN5、GIN6、GIN10、GIN11、GIN12、GIN13、GIN14和GIN15)并且發(fā)現(xiàn)它們對于減小病毒感染性沒有功效或者有很弱的功效。
此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)一小組測試的肽(它們是根據(jù)本發(fā)明的肽)可以有效作為抗病毒劑。圖5表明稱作GIN7的肽具有減小HSV-1感染性的功效。
圖6表明稱作GIN8和GIN9的肽也具有減小HSV-1感染性的功效。
表5和圖4a表明與ApoE141-149dp肽相關(guān)或相似的許多肽(在表4a中鑒定為肽GIN17-31)對于減小病毒感染性沒有功效或者有很弱的功效。發(fā)明人合理的設(shè)計了這些分子以期它們具有抗HSV1活性，并且基于表4中給出的數(shù)據(jù)，技術(shù)人員可以預(yù)期此類肽具有與根據(jù)本發(fā)明要求保護(hù)的那些肽具有相似的功效。這些肽具有很小的效果這一事實(shí)使得要求保護(hù)的肽的有用性更加令人驚奇。
表5
實(shí)施例3對擴(kuò)大數(shù)目的肽進(jìn)行另一組實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步評估根據(jù)本發(fā)明的肽對HSV-1的效果。表6證實(shí)稱作GIN1p和GIN7的肽具有抗-HSV-1性質(zhì)，而稱作GIN32、34和41的肽也具有功效?？紤]到所測試的多數(shù)肽有很小或沒有活性，這些肽的功效是令人驚奇的。
圖7比較并圖解了肽GIN7、GIN32、GIN34和GIN1p對HSV1感染件的效果。
表6
實(shí)施例4進(jìn)行與實(shí)施例2中所描述的相似的實(shí)驗(yàn)來測試根據(jù)本發(fā)明的肽對HIV感染的功效。
將過表達(dá)CD4和適宜的共同受體(CCR5或者CXCR4)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系NP2保持在補(bǔ)加10％FCS的DMEM中。感染前對48孔板的每孔接種2×104個細(xì)胞并在37℃生長。然后洗滌細(xì)胞，將其在含有濃度為0.1到10微摩爾的肽濃度的DMEM/FCS中在37℃孵育20分鐘。然后向每孔中加入200個病灶形成單位的HIV-1原種，并將細(xì)胞在37℃繼續(xù)孵育2小時。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌兩次，并用新鮮的培養(yǎng)基替換。生長3天后，將細(xì)胞用冷甲醇丙酮固定，使用單克隆抗-P24然后通過二級抗-小鼠β-半乳糖苷酶綴合物原位染色來研究HIV-1p24的表達(dá)。通過X-Gal染色觀察表達(dá)并通過光學(xué)顯微術(shù)計數(shù)感染性病灶。
發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的肽對HSV-1和HIV具有相似的功效。
圖8圖解了肽GIN 7對生長在過表達(dá)CCR5共同受體的NP-2神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的HIV分離物SF162的抗-HIV作用。
對于其他HIV株，并且在其他宿主細(xì)胞類型中產(chǎn)生了相似數(shù)據(jù)。注意到在該肽對其測試的HIV株和細(xì)胞類型的一種組合中，在這里使用的濃度下(高達(dá)10μM)，沒有可檢測的抗HIV活性。這將表明根據(jù)本發(fā)明的W取代的肽對于HIV比GIN 1p(ApoE141-149dp)更有效。
實(shí)施例5進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)來測試根據(jù)本發(fā)明的肽對HSV1的功效。
5.1方法所用的方法如實(shí)施例1-4中描述，只是將肽制備成磷酸緩沖鹽水(PBS)中的400μM母液。
5.2結(jié)果
5.2.1完全替代亮氨酸的效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來研究用一種氨基酸完全替代apoE141-149串聯(lián)重復(fù)中的L殘基的效果。表7表明根據(jù)本發(fā)明的肽具有抑制HSV1生長的功效(即，W、R或者K替代)。根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽令人驚奇的比apoE串聯(lián)重復(fù)(GIN1/MU10)具更高的功效。
有趣的是注意到用M、Y、F、I、Q、H或N替代具有一定功效(與apoE串聯(lián)重復(fù)相當(dāng))并且同樣根據(jù)本發(fā)明的其他替代可以包含這些氨基酸。
用E、A、D、S、V、T、G或P替代導(dǎo)致抗病毒活性消除。
盡管發(fā)明人不希望被任何假說束縛，但是他們注意到用具有小側(cè)鏈的氨基酸替換傾向于消除抗病毒活性，而用更大側(cè)鏈的氨基酸保持抗病毒效應(yīng)。然而，如本發(fā)明的第一方面定義的用氨基酸替代L賦予令人驚奇的抗病毒活性。
表7
5.2.2其他apoE衍生肽的測試發(fā)明人構(gòu)建了肽的擴(kuò)大文庫來評估什么樣apoE肽衍生物具有抗病毒活性。
表8表明基于SEQ ID No.2但是在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽定義之外的許多肽沒有活性或者有很弱的活性(例如，MU24-46)。有趣的是注意到MU43和MU44分別對應(yīng)于apoE141-149的鼠和牛等價物的串聯(lián)重復(fù)，而MU46對應(yīng)于apoE141-149(SEQ ID No.1)。
在表8關(guān)于MU58-117中給出的數(shù)據(jù)表明這些肽(它們是根據(jù)本發(fā)明的肽)的每一種都具有良好的抗病毒活性，其令人驚奇地優(yōu)于apoE141-149dp(SEQ ID No.2)的抗病毒活性。
表8
實(shí)施例6進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來測試根據(jù)本發(fā)明的肽對HSV2的功效。
6.1方法進(jìn)行噬斑測定法。該方法如前面的實(shí)施例中對HSV1噬斑測定所描述(包括使用Vero細(xì)胞)，只是使用HSV2臨床分離物(由LiverpoolUniversity的Anthony Hart教授提供)。
6.2結(jié)果還測試了發(fā)現(xiàn)對HSV1具有功效的許多肽對HSV2的功效。表9表明根據(jù)本發(fā)明的肽對HSV1和HSV2有效。這表明這些肽將提供對抗病毒的廣譜活性。
表9
實(shí)施例7進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來測試根據(jù)本發(fā)明的肽對人免疫缺陷病毒(HIV)的功效。測試根據(jù)本發(fā)明的肽對在實(shí)施例4中測試的不同的HIV毒株的效果。
7.1方法將肽(如以前描述的制備)在50μl的等分試樣中稀釋并以40,000個細(xì)胞/孔與T細(xì)胞(C8166)混合。接著將HIV-1 1111B以0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)加入，并將混合物在37℃孵育5天。使用倒置顯微鏡通過視覺評估合胞體形成，使用GNA用于抗原捕獲，通過gp120 ELISA評估上清液中的病毒gp120水平。洗滌用50μl GNA(Galanthus nivalis)包被的96孔板，然后用100μl RPMI(10％胎牛血清)處理并放置1小時。進(jìn)一步洗滌后，向孔中加入25μl試樣上清液，以及受感染的對照樣品的稀釋液。通過用0.5％Empigen(用于裂解病毒的去污劑)對所有孔處理3小時裂解，并洗滌后，加入50μl人抗-HIV血清，并過夜孵育平板。進(jìn)一步洗滌后，加入50μl抗人Ig過氧化物酶綴合物的1000×稀釋液，并將平板在37℃孵育90分鐘。最后洗滌后，向每孔加入50μl過氧化物酶底物，并孵育平板10-30分鐘。用25μl 2M H2SO4停止反應(yīng)，并測量A450。
7.2結(jié)果進(jìn)行其他試驗(yàn)來支持實(shí)施例4中給出的數(shù)據(jù)，這些實(shí)驗(yàn)表明根據(jù)本發(fā)明的肽對HIV以及HSV1和HSV2都有效。
GIN32(SEQ ID No.4)對于抑制HIV-1生長的IC50為7.5μM。該有效性與HSV1、HSV2和HIV中的相似。這證明根據(jù)本發(fā)明的肽具有寬的抗病毒效果。
權(quán)利要求
1.包含SEQ ID No.2的apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)或者其平截的多肽、其衍生物或者類似物，其特征是將SEQ ID No.2的至少一個亮氨酸(L)殘基用具有包含至少4個碳原子和至少一個氮原子的側(cè)鏈的氨基酸替代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽、其衍生物或者類似物，其中用于替代亮氨酸的氨基酸是色氨酸(W)、精氨酸(R)或者賴氨酸(K)或者它們的衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽、其衍生物或者類似物，其中用于替代亮氨酸的氨基酸是色氨酸(W)或者其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽、其衍生物或者類似物，其中進(jìn)行至少兩個W、R或K替代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的多肽、其衍生物或者類似物，其中將至少一個另外的氨基酸用天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)、谷氨酰胺(Q)或者組氨酸(H)替代或缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的多肽、其衍生物或者類似物，其具有氨基酸序列WRKWRKRWWWRKWRKRWW(SEQ ID No.3)；WRKWRKRWRKWRKR(SEQ ID No.4)；WRKWRKRWWLRKLRKRLL(SEQ ID No.5)；YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No.6)；WRKWRKRWWRKWRKRWW(SEQ ID No.52)；WRKWRKRWRKWRKRW(SEQ ID No.53)；WRKWRKRWWFRKWRKRWW(SEQ ID No.54)；WRKWRKRWFFRKWRKRFF(SEQ ID No.55)；WRKCRKRCWWRKCRKRCW(SEQ ID No.56)；LRKLRKRLLWRKWRKRWW(SEQ ID No.57)；LRKURKRLLLRKLRKRWW(SEQ ID No.58)；LRKLRKRLLWRKWRKRLL(SEQ ID No.59)；WRKWRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.60)；WRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.61)；WRKWRKFFFRKWRKRWW(SEQ ID No.62)；WRKWRKRWWFRKFRKRFF(SEQ ID No.63)；RRKRRKRRRRKRRKRRR(SEQ ID No.64)；或KRKKRKRKKKRKKRKRKK(SEQ ID No.65)。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物，其中向所述肽加入氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求8的多肽、衍生物或者類似物，其中向SEQ ID No.2的N末端、C末端和/或在第9和10個氨基酸之間加入氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的多肽、衍生物或者類似物，其包含WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR(SEQ ID No.66)。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物，其是擬肽類似物。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物，其是肽/擬肽雜合分子。
12.包含YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No.6)的多肽、其衍生物或者類似物。
13.包含LRKLRKRLLLRKLRK(SEQ ID No.7)的多肽、其衍生物或者類似物。
14.包含LRKLRKRLRKLRKR(SEQ ID No.8)的多肽、其衍生物或者類似物。
15.包含LRKLRKLRKLRKLRKLRK(SEQ ID No.9)的多肽、其衍生物或者類似物。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物，其用作藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物在制備用于治療病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
18.能夠增強(qiáng)根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物的生物學(xué)活性的試劑在制備用于治療病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
19.預(yù)防和/或治療病毒感染的方法，其包括對需要此類治療的受試者施用治療有效量的根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽、衍生物或類似物。
20.核酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽、衍生物或者類似物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的核酸序列，其用作藥物。
22.預(yù)防和/或治療病毒感染的方法，其包括對需要此類治療的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求20或21的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自apoE
文檔編號A61K38/10GK1894281SQ200480037908
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者C·多布森 申請人:Ai2有限公司