專利名稱：用于治療青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病的活性劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于與青光眼相關(guān)的視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病的預(yù)防劑和治療劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青光眼是一組復(fù)雜的疾病，具有類似的臨床特征，包括視神經(jīng)損傷和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的選擇性程序死亡，這導(dǎo)致視野的進(jìn)行性喪失和失明。眼內(nèi)壓(IOP)的異常增加與多種形式的青光眼有關(guān)。唯一可利用的治療方法是通過(guò)藥物或手術(shù)降低IOP。降低的眼內(nèi)壓對(duì)于減慢某些類型青光眼的發(fā)展和延遲其損傷效果是有效的。盡管如此，青光眼患者的視野喪失并不總是與IOP相關(guān)，單獨(dú)降低IOP并不完全終止疾病的進(jìn)程。這暗示著壓力可能不是青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病的唯一原因。其他的機(jī)制可能對(duì)疾病的進(jìn)程發(fā)揮作用。青光眼性視網(wǎng)膜病通常被理解為視網(wǎng)膜的功能性紊亂或病理學(xué)改變，尤其是可見于青光眼患者或動(dòng)物中RGC的死亡。青光眼性視神經(jīng)病指的是RGC的軸突所通過(guò)的視神經(jīng)的功能性紊亂或病理學(xué)改變。
成年人視網(wǎng)膜的橫切面顯示出沿近端或最內(nèi)區(qū)域(玻璃體側(cè))至遠(yuǎn)端或最外區(qū)域(脈絡(luò)膜側(cè))方向所列出的以下各層細(xì)胞內(nèi)界膜，視神經(jīng)纖維層(optic fiber layer)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)從狀層，內(nèi)核層，外從狀層，
外核層，外界膜，桿體和錐體的內(nèi)節(jié)(inner segment of rods and cones)，桿體和錐體的外節(jié)(outer segment of rods and cones)，視網(wǎng)膜色素上皮，和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層。
視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層可見于距脈絡(luò)膜最近的視網(wǎng)膜后部，而內(nèi)界膜距玻璃體腔最近。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層收集光感受輸入，并經(jīng)由有髓鞘的軸突經(jīng)過(guò)視神經(jīng)將輸入發(fā)送至腦部。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是處于青光眼危險(xiǎn)中的細(xì)胞。
所建議的對(duì)RGC死亡起作用的分子機(jī)制包括谷氨酸毒性、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子戒斷、血管異常(局部缺血)、反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生和一氧化氮誘發(fā)的毒性。但是這些所建議的機(jī)制中沒有一個(gè)為本領(lǐng)域研究者廣泛接受。
據(jù)報(bào)道，公開為WO03/051313的Gao等人的PCT專利申請(qǐng)No.PCT/US02/40457提供了在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中通過(guò)萊菔硫烷(sulforaphane，即1-異硫氰基-4R-[甲基亞硫?；鵠丁烷)誘導(dǎo)II期解毒酶。Zhang，Y等人的US專利公開No.2002/0091087通過(guò)報(bào)道提供了經(jīng)由化合物萊菔硫烷對(duì)神經(jīng)變性疾病的治療，所述化合物可提高脊髓組織、阿爾茨海默病和肌萎縮側(cè)索硬化中的谷胱苷肽或II期解毒酶。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的不同在于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是神經(jīng)元而視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞不是神經(jīng)元。此外，眼組織如視網(wǎng)膜對(duì)特定治療劑的生物響應(yīng)不能由脊髓組織和腦組織的生物學(xué)響應(yīng)來(lái)預(yù)期。所引用的申請(qǐng)沒有涉及青光眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)喪失和視神經(jīng)病的保護(hù)和治療。
還沒有廣泛接受的抗青光眼治療方法以控制青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病。鑒于青光眼對(duì)健康的影響和現(xiàn)有治療方法的不足，需要用于青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病的改進(jìn)的治療方法。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性并隨后增加可解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑提供了延遲或預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞喪失和視神經(jīng)的青光眼性損傷的保護(hù)性或治療性效果。本文所用的“對(duì)Nrf2蛋白核易位的刺激活性”意指可增強(qiáng)Nrf2對(duì)核的可用性或Nrf2向核的轉(zhuǎn)運(yùn)的活性劑。Nrf2蛋白向核的易位使得隨后的基因產(chǎn)物的表達(dá)增加，該產(chǎn)物可解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物。本發(fā)明的方法提供了在對(duì)象中治療青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的組合物，該組合物包含對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的活性劑和可接受的載體。所述對(duì)象可處于罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的危險(xiǎn)中或可具有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的癥狀。
本發(fā)明的刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加可解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑可包括米氏加成(Michael Addition)接納體、二酚、硫代氨基甲酸酯(thiocarbamate)、醌、1，2-二硫羥-3-硫酮、丁化羥基苯甲醚、類黃酮、異硫氰酸酯(isothiocyanate)、3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯、乙氧基喹啉、3-羥基香豆素、它們的組合或它們的藥理學(xué)活性衍生物或類似物。在一種實(shí)施方式中，所述活性劑包括異硫氰酸酯/鹽如萊菔硫烷或其藥理學(xué)活性衍生物、在另一種實(shí)施方式中，所述活性劑包含1，2-二硫羥-3-硫酮如吡噻硫酮(oltipraz)或其藥理學(xué)活性衍生物。
刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加可解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑可以通過(guò)眼內(nèi)注射、植入緩釋遞送裝置或局部、口服、鼻內(nèi)施用、系統(tǒng)性注射或其他系統(tǒng)性施用。
在本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方式中，所述對(duì)象被診斷患有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述對(duì)象具有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的癥狀。
附圖
簡(jiǎn)介附圖顯示了在所培養(yǎng)的成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中萊菔硫烷對(duì)谷氨酸誘發(fā)毒性的影響。將細(xì)胞用所示化合物處理三天。通過(guò)計(jì)數(shù)Thy-1-陽(yáng)性健康細(xì)胞分析存活率。星號(hào)*代表通過(guò)組間單尾ANOVA方差分析、然后Dunnett檢驗(yàn)相對(duì)于對(duì)照值具有顯著性差異。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加可解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑在治療青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病的方法中的用途。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療青光眼性視網(wǎng)膜病和視神經(jīng)病”意指延遲或預(yù)防罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病或其癥狀、抑制青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病或其癥狀的進(jìn)展或減輕青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病或其癥狀。刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加可解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物是為了保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和保護(hù)視神經(jīng)。
Nrf2的核易位在暴露于某些親電子劑和氧化劑的細(xì)胞中被誘導(dǎo)。由于Nrf2核易位所誘導(dǎo)的基因產(chǎn)生解毒酶，可增強(qiáng)對(duì)親電子劑的保護(hù)并促進(jìn)損傷蛋白質(zhì)的修復(fù)和降解。這些酶的誘導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)并且通過(guò)特異性增強(qiáng)子介導(dǎo)，即可見于編碼該酶的基因的啟動(dòng)子中的抗氧化響應(yīng)單元或ARE。ARE的序列環(huán)境、化學(xué)誘導(dǎo)劑的性質(zhì)和細(xì)胞類型影響具體基因中增強(qiáng)子的活性。
轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是NF-E2轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，并且負(fù)責(zé)上調(diào)抗氧化響應(yīng)元素(ARE)介導(dǎo)的基因表達(dá)。Nrf2通過(guò)與啟動(dòng)子的ARE(抗氧化響應(yīng)單元)區(qū)域結(jié)合以組成性激活基因轉(zhuǎn)錄或響應(yīng)于氧化應(yīng)激信號(hào)而誘導(dǎo)基因表達(dá)。在正常條件下，認(rèn)為Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中，被阻遏蛋白Keap1所結(jié)合，Keap1是一種固定于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的胞質(zhì)蛋白。不希望被理論所限制，本發(fā)明人相信，對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的活性劑可以與胞質(zhì)因子Keap1的富含半胱氨酸的干擾區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)，與Nrf2相互作用(Dinkova-kostova，A.T.等人，Proc Natl Acad Sci，USA，9911908-11913(2002))。通過(guò)某些化合物如萊菔硫烷分裂Nrf2-Keap1復(fù)合物，可使Nrf2游離，以易位至核，在那里，它可與其他轉(zhuǎn)錄因子(即Maf、c-Jun等)在基因的ARE區(qū)域雜二聚化，導(dǎo)致ARE-介導(dǎo)的基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
由該Nrf2/ARE途徑表達(dá)的酶和蛋白具有化學(xué)上多樣的細(xì)胞保護(hù)特性，并且是對(duì)毒性代謝物和異生素的防御物。已知通過(guò)Nrf2/ARE途徑表達(dá)的酶和蛋白包括谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶、UDP-glucuronosyl轉(zhuǎn)移酶、NADP(H)醌氧化還原酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、蛋白伴侶/應(yīng)激蛋白和泛素/蛋白酶體蛋白。
對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的活性劑包括例如米氏加成接納體(例如α，β-不飽和羰基化合物)，如馬來(lái)酸二乙酯或富馬酸二甲酯；二酚(diphenol)，如白藜蘆醇；丁化羥基苯甲醚，如2(3)-叔丁基-4-羥基苯甲醚，硫代氨基甲酸酯，如吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate)，醌，如叔丁基氫醌，異硫氰酸酯，如萊菔硫烷、其前體芥子油苷、glucoraphanin或異硫氰酸苯乙酯(PEITC)，1，2-二硫羥-3-硫酮，如吡噻硫酮，3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯，乙氧基喹啉，香豆素，如3-羥基香豆素，類黃酮，如槲皮素或姜黃色素，二烯丙基硫醚，吲哚-3-甲醇，表沒食子兒茶精沒食子酸酯(epigallo-3-catechin gallate)，鞣花酸，其組合或其藥學(xué)活性衍生物或類似物。
米氏接納體是在鄰近吸電子基團(tuán)處具有烯結(jié)構(gòu)的分子。吸電子基團(tuán)通常為羰基，但也可以是腈或硝基。這些化合物盡管在化學(xué)上相異，但均為親電子基并具有與親核性巰基反應(yīng)的能力。“藥學(xué)活性衍生物”是這樣一種試劑，其在結(jié)構(gòu)上與任意上述對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的化合物相關(guān)并可從其衍生，可以例如是其酯、酰胺或鹽?！八帉W(xué)活性類似物”是這樣一種試劑，其在結(jié)構(gòu)上與任意上述對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的化合物類似，但在組成上略有差異，如一個(gè)原子被一個(gè)不同元素的原子替代或存在特定的官能團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在用于青光眼性視神經(jīng)病或青光眼性視網(wǎng)膜病的方法中的萊菔硫烷、吡噻硫酮、其藥學(xué)活性類似物或其可藥用的鹽。
萊菔硫烷(產(chǎn)品號(hào)No.S6317，Sigma-Aldrich)已知可誘導(dǎo)例如醌還原酶、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱苷肽還原酶。在各種細(xì)胞系中已觀察到酶誘導(dǎo)，包括成人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Zhang，Y等人，Proc Natl Acad Sci，USA，892399-2403(1992))。萊菔硫烷類似物包括例如6-(異硫氰酰-2-己酮)、外-2-乙?；?6-異硫氰酰降冰片烷、外-2-(異硫氰酰-6-甲基磺?；当?、6-異硫氰酰-2-己醇、1-(異硫氰酰-4-二甲基膦酰基丁烷)、外-2-(1-羥基乙基)-5-)異硫氰酰降冰片烷、外-2-乙?；?5-異硫氰酰降冰片烷、1-(異硫氰酰-5-甲基磺?；焱?、順-3-(甲基磺?；?(環(huán)己基甲基異硫氰酸酯)和反-(甲基磺酰基)(環(huán)己基甲基異硫氰酸酯)。
施用方式本發(fā)明的活性劑可直接遞送至眼(例如局部滴眼劑或軟膏劑；盲管(cul-de-sac)或鄰近鞏膜或眼內(nèi)植入的緩釋裝置；眼周、結(jié)膜、眼球筋膜下(subtenon)、眼房?jī)?nèi)(intracameral)、玻璃體內(nèi)或小管內(nèi)(intracanalicular)注射)或使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)全身遞送(例如口服、靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射；胃腸外、皮或鼻遞送)。進(jìn)一步預(yù)計(jì)本發(fā)明的活性劑可配制于眼內(nèi)插入劑或植入裝置中。
治療對(duì)象本文所述的因青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病而治療的對(duì)象可以是處于罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病危險(xiǎn)中或具有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病癥狀的人或另一種動(dòng)物。
制劑和劑量本發(fā)明的活性劑可以作為適合的眼用載體中的溶液、懸液或乳液(分散體)施用。以下是可能的本發(fā)明制劑實(shí)施方式的實(shí)例。
在另一種實(shí)施方式中，所配制的眼用組合物提供的眼內(nèi)濃度為約0.1至100納摩爾(nM)，或在另一種實(shí)施方式中為1-10nM。對(duì)于系統(tǒng)施用，可以獲得達(dá)20μM的血漿峰濃度。按照熟練醫(yī)師的常規(guī)判斷，局部用組合物每天一至四次遞送至眼表面。制劑的pH應(yīng)該為4-9或4.5至7.4。系統(tǒng)制劑可含有例如約10mg至1000mg、約10mg至500mg、約10mg至100mg或125mg刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑。
“有效量”指的是能夠刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑的量。該基因表達(dá)的誘導(dǎo)提供了對(duì)反應(yīng)性親電子劑以及其他毒性代謝物的毒性的防御。因此，提供了刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑，用于保護(hù)以免于細(xì)胞毒性。這種保護(hù)延遲或防止處于罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病危險(xiǎn)中的對(duì)象中癥狀的發(fā)生。制劑的有效量可取決于各因素，例如包括對(duì)象的年齡、種屬和性別或視神經(jīng)病的嚴(yán)重程度。在一種實(shí)施方式中，活性劑經(jīng)局部遞送至眼并以治療劑量到達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，從而改善視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的疾病進(jìn)程。
盡管具體的方案取決于醫(yī)師的判斷，但所得一種或多種溶液優(yōu)選通過(guò)每天一至四次將一滴每種溶液置于每只眼中或如醫(yī)師所指導(dǎo)而施用。
可接受的載體眼科可接受的載體指的是那些載體，它們引起至多少許至沒有眼刺激性、如果需要的話提供適合的防腐作用并以均一劑量遞送一種或多種本發(fā)明的刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑。對(duì)于眼用遞送而言，刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒和消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑可以與下列聯(lián)合眼科可接受的防腐劑、助溶劑、表面活性劑、增稠劑、滲透增強(qiáng)劑、緩沖劑、氯化鈉或水以形成水性、無(wú)菌眼用懸液、溶液或粘性或半粘性凝膠或其他類型的固體或半固體組合物如軟膏劑。眼用溶液制劑可以通過(guò)將活性劑溶解于生理可接受的等滲水性緩沖液中而制備。進(jìn)一步，眼用溶液可以包括眼科可接受的表面活性劑以幫助溶解活性劑。粘度塑造化合物如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等可以加入本發(fā)明的組合物種，以改善化合物的保持力。
為了制備無(wú)菌眼用軟膏制劑，將刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒并消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑與防腐劑在適當(dāng)?shù)馁x形劑中聯(lián)合，如礦物油、液體羊毛脂或白凡士林。按照本領(lǐng)域就其他眼用制劑已知的方法，通過(guò)將活性劑懸浮于由例如CARBOPOL-940(BF Goodrich，Charlotte，NC)等的組合制成的親水性基質(zhì)中，制備無(wú)菌眼用凝膠制劑。例如VISCOAT(Alcon Laboratories，Inc.，F(xiàn)ort Worth，TX)可以用于眼內(nèi)注射。其他本發(fā)明的組合物可含有滲透增強(qiáng)物質(zhì)如CREMOPHOR(SigmaAldrich，St.Louis，MO)和TWEEN80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯)，如果本發(fā)明的活性劑較少滲透入眼中的話。
實(shí)施例1對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的活性劑使用血管內(nèi)皮細(xì)胞如牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC，VEC Technologies，Renesselaer，NY)測(cè)定對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的那些活性劑。例如，將牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的融合單層在含有1％胎牛血清的Dulbecco’s改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基中暴露于候選活性劑達(dá)24小時(shí)。制備細(xì)胞裂解物、胞質(zhì)萃取物和核萃取物，并如Buckley，B.J.等人所述(Biochem Biophys ResCommun，307973-979(2003))進(jìn)行免疫印跡和定量。然后，在實(shí)施例2所示的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，測(cè)定與不含活性劑的對(duì)照細(xì)胞相比增加了在核部分所檢測(cè)的Nrf2量的活性劑的活性。
實(shí)施例2對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的活性劑對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)使所培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞與刺激Nrf2蛋白核易位的活性劑結(jié)合1至24小時(shí)，然后將該組合暴露于過(guò)氧化物。與不含過(guò)氧化物的對(duì)照培養(yǎng)物相比的神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞存活率提示所述活性劑提供了針對(duì)氧化劑的保護(hù)作用。
如Pang，I-H等人所述(Invest Ophthalmol Vis Sci 401170-1176(1999))分離并培養(yǎng)新生大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞?！吧窠?jīng)視網(wǎng)膜”指的是無(wú)視網(wǎng)膜色素上皮的視網(wǎng)膜。因此，培養(yǎng)物含有混合組群的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型。簡(jiǎn)言之，將2-5天齡的新生Sprague-Dawley大鼠麻醉，在橫竇尾部的頭皮處制造2mm中線開口。用螢光染料Di-I選擇性逆向標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，所述染料為1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚花青高氯酸鹽(1，1′-dioctadecy1-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)，是一種均勻標(biāo)記神經(jīng)元的親脂性示蹤劑(Molecular Probes，Eugene，OR)。將注射針(30ga)的尖端插入頭骨頂部下6mm處，將5μl Di-I溶液注射入上丘。該Di-I溶液在90％乙醇和10％二甲基亞砜中含有3mg/mL Di-I。用撓性火棉膠覆蓋傷口。
在Di-I注射2至4天后，將大鼠麻醉，斷頭處死。摘除它們的眼并置于Delbecco’s改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)混合物F12(1∶1，DMEM/F12，Gibco，Gaithersburg，MD)中。摘下并分離每只眼的視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜細(xì)胞用溶液在37℃解離25分鐘，所述溶液在5ml DMEM/F12中含有10mg木瓜蛋白酶(34單位/mI)、2mg DL-半胱氨酸(3.3mM)和2mg牛血清白蛋白(0.4mg/ml)，然后用5ml RGC培養(yǎng)基(DMEM，添加有10％胎牛血清、4mM谷氨酰胺、100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)洗滌3次。使其通過(guò)一次性吸管若干次，將視網(wǎng)膜碎片搗碎，直至細(xì)胞被分散。將細(xì)胞懸液(約3×105細(xì)胞/mL)置于聚-D-賴氨酸包被的玻璃底培養(yǎng)皿中。用95％空氣/5％CO2在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。
通過(guò)用候選活性劑處理培養(yǎng)物1至24小時(shí)，然后加入300μM H2O2，測(cè)定對(duì)Nrf2蛋白核易位具有刺激活性的活性劑的保護(hù)效應(yīng)。用Di-I熒光鑒定所培養(yǎng)的RGC。通過(guò)用Di-I熒光計(jì)數(shù)剩余細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)RGC的存活率。與對(duì)照相比改善視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率的活性劑被提供用于保護(hù)RGC免受細(xì)胞毒性損害，可用于治療青光眼性視神經(jīng)病。
實(shí)施例3萊菔硫烷保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受谷氨酸誘導(dǎo)的毒性通過(guò)CO2窒息致成年Sprague-Dawley大鼠安樂(lè)死。摘除它們的眼睛并置于NEUROBASALTM培養(yǎng)基中(Gibco，Gaithersburg，MD)。摘下并分離每只眼的視網(wǎng)膜。通過(guò)將20視網(wǎng)膜與5ml木瓜蛋白酶溶液在37℃合并25分鐘，解離視網(wǎng)膜細(xì)胞，所述溶液在5ml NEUROBASALTM培養(yǎng)基中含有10mg木瓜蛋白酶、2mg DL-半胱氨酸和2mg牛血清白蛋白，然后用如實(shí)施例2中所述經(jīng)添加并含有1％胎牛血清的RGC培養(yǎng)基(NEUROBASALTM)洗滌3次。使其通過(guò)火琢一次性吸管若干次，搗碎細(xì)胞，直至細(xì)胞被分散。將細(xì)胞懸液置于聚-D-賴氨酸和昆布氨酸包被的8孔分室培養(yǎng)片中。將谷氨酸和谷氨酸加萊菔硫烷加入指定的孔中。然后將細(xì)胞在95％空氣/5％CO2、37℃培養(yǎng)3天。
在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞固定并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記Thy-1，一種RGC標(biāo)記物。通過(guò)手工計(jì)數(shù)每孔中Thy-1陽(yáng)性健康細(xì)胞量化細(xì)胞存活率。所得數(shù)據(jù)示于附圖中，這些數(shù)據(jù)證明RGC經(jīng)谷氨酸(100μM)處理三天引起存活細(xì)胞減少40-60％。用萊菔硫烷(0.05μM)處理細(xì)胞防止了這種毒性。這些結(jié)果證明萊菔硫烷可保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以免受損害。
逐一引入本文所引用的參考文獻(xiàn)作為參考，引入的程度使得它們能夠提供補(bǔ)充本文所示那些內(nèi)容的示例性工藝或其他細(xì)節(jié)。
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權(quán)利要求
1.在對(duì)象中治療青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的方法，該方法包括向該對(duì)象施用有效量的組合物，該組合物包含對(duì)Nrf2蛋白核異位具有刺激活性的活性劑和可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的對(duì)象處于罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的危險(xiǎn)中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的對(duì)象具有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的癥狀。
4.權(quán)利要求1的方法，其中活性劑包括米氏加成接納體、二酚、硫代氨基甲酸酯、醌、1，2-二硫羥-3-硫酮、丁基化羥基苯甲醚、類黃酮、異硫氰酸酯、3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯、乙氧基喹啉、香豆素、它們的組合或它們的藥學(xué)活性衍生物或類似物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的活性劑包括異硫氰酸酯或其藥理學(xué)活性衍生物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的異硫氰酸酯包括萊菔硫烷或其藥理學(xué)活性衍生物。
7.權(quán)利要求4的方法，其中的活性劑包括1，2-二硫羥-3-硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的1，2-二硫羥-3-硫酮包括吡噻硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
9.權(quán)利要求4的方法，其中的活性劑包括類黃酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的類黃酮包括槲皮素或其藥理學(xué)活性衍生物。
11.權(quán)利要求1的方法，其中的施用是通過(guò)眼內(nèi)注射、植入緩釋遞送裝置或局部、口服或鼻內(nèi)施用。
12.權(quán)利要求1的方法，其中的施用是通過(guò)眼內(nèi)施用。
13.在對(duì)象中治療青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的方法，該方法包括診斷患有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的對(duì)象；和向該對(duì)象施用有效量的組合物，該組合物包含對(duì)Nrf2蛋白核異位具有刺激活性的活性劑和可接受的載體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中的活性劑包括米氏加成接納體、二酚、硫代氨基甲酸酯、醌、1，2-二硫羥-3-硫酮、丁基化羥基苯甲醚、類黃酮、異硫氰酸酯、3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯、乙氧基喹啉、香豆素、它們的組合或它們的藥學(xué)活性衍生物或類似物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中的活性劑包括異硫氰酸酯或其藥理學(xué)活性衍生物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中的異硫氰酸酯包括萊菔硫烷或其藥理學(xué)活性衍生物。
17.權(quán)利要求14的方法，其中的活性劑包括1，2-二硫羥-3-硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的1，2-二硫羥-3-硫酮包括吡噻硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
19.權(quán)利要求13的方法，其中的施用通過(guò)眼內(nèi)注射、植入緩釋遞送裝置或局部、口服或鼻內(nèi)施用。
20.權(quán)利要求13的方法，其中的施用通過(guò)眼內(nèi)施用。
21.有效量的包含對(duì)Nrf2蛋白核異位具有刺激活性的活性劑和可接受載體的組合物在制備用于在對(duì)象中治療青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的藥物中的用途。
22.權(quán)利要求21的用途，其中的對(duì)象處于罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的危險(xiǎn)中。
23.權(quán)利要求21的用途，其中的對(duì)象具有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的癥狀。
24.權(quán)利要求21的用途，其中的活性劑包括米氏加成接納體、二酚、硫代氨基甲酸酯、醌、1，2-二硫羥-3-硫酮、丁基化羥基苯甲醚、類黃酮、異硫氰酸酯、3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯、乙氧基喹啉、香豆素、它們的組合或它們的藥學(xué)活性衍生物或類似物。
25.權(quán)利要求24的用途，其中的活性劑包括異硫氰酸酯或其藥理學(xué)活性衍生物。
26.權(quán)利要求25的用途，其中的異硫氰酸酯包括萊菔硫烷或其藥理學(xué)活性衍生物。
27.權(quán)利要求24的用途，其中的活性劑包括1，2-二硫羥-3-硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
28.權(quán)利要求27的用途，其中的1，2-二硫羥-3-硫酮包括吡噻硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
29.權(quán)利要求24的用途，其中的活性劑包括類黃酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
30.權(quán)利要求29的用途，其中的類黃酮包括槲皮素或其藥理學(xué)活性衍生物。
31.權(quán)利要求21的用途，其中的藥物被制備用于眼內(nèi)注射、用于植入緩釋遞送裝置或用于局部、口服或鼻內(nèi)施用。
32.權(quán)利要求21的用途，其中的藥物被制備用于眼內(nèi)施用。
33.用于在對(duì)象中治療青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的藥物組合物，該組合物包含有效量的對(duì)Nrf2蛋白核異位具有刺激活性的活性劑和可接受的載體。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中的對(duì)象處于罹患青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的危險(xiǎn)中。
35.權(quán)利要求33的組合物，其中的對(duì)象具有青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病的癥狀。
36.權(quán)利要求33的組合物，其中的活性劑包括米氏加成接納體、二酚、硫代氨基甲酸酯、醌、1，2-二硫羥-3-硫酮、丁基化羥基苯甲醚、類黃酮、異硫氰酸酯、3，5-二叔丁基-4-羥基甲苯、乙氧基喹啉、香豆素、它們的組合或它們的藥學(xué)活性衍生物或類似物。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中的活性劑包括異硫氰酸酯或其藥理學(xué)活性衍生物。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中異硫氰酸酯包括包括萊菔硫烷或其藥理學(xué)活性衍生物。
39.權(quán)利要求36的組合物，其中的活性劑包括1，2-二硫羥-3-硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中的1，2-二硫羥-3-硫酮包括吡噻硫酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
41.權(quán)利要求36的用途，其中的活性劑包括類黃酮或其藥理學(xué)活性衍生物。
42.權(quán)利要求41的用途，其中的類黃酮包括槲皮素或其藥理學(xué)活性衍生物。
43.權(quán)利要求33的組合物，其中的藥物被制備用于眼內(nèi)注射、植入緩釋遞送裝置或局部、口服或鼻內(nèi)施用。
44.權(quán)利要求33的組合物，其中的藥物被制備用于眼內(nèi)施用。
全文摘要
本發(fā)明提供了在青光眼性視網(wǎng)膜病或視神經(jīng)病治療方法中的刺激Nrf2蛋白核易位并隨后增加解毒并消除細(xì)胞毒性代謝物的基因產(chǎn)物的活性劑。作用于Nrf2/ARE途徑的結(jié)構(gòu)各異的活性劑誘導(dǎo)酶和蛋白的表達(dá)，所述蛋白和酶具有化學(xué)上多樣的細(xì)胞保護(hù)特性并且是毒性代謝物和異生素的防御物。所述活性劑包括某些親電子劑和氧化劑，如米氏加成接納體、二酚、硫代氨基甲酸酯、醌、1，2－二硫羥－3－硫酮、丁基化羥基苯甲醚、類黃酮、異硫氰酸酯、3，5－二叔丁基－4－羥基甲苯、乙氧基喹啉、香豆素、它們的組合或它們的藥學(xué)活性衍生物或類似物。
文檔編號(hào)A61K31/366GK1897972SQ200480038458
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
發(fā)明者R·A·蘭德斯, 彭玉豪 申請(qǐng)人:愛爾康公司