專利名稱：尼曼－皮克病的基于陪伴分子的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種治療患酸性鞘磷脂酶缺陷型尼曼-皮克病(即A型或B型尼曼-皮克病)個體的方法，是通過施用小分子作為與該病相關(guān)的缺陷酸性鞘磷脂酶(ASM)的特異性分子“陪伴分子”。
背景技術(shù)：
A型和B型尼曼-皮克病(NPD)是由于酸性鞘磷脂酶(ASM)活性缺乏，因此鞘磷脂、膽固醇和其他脂類在患病個體的細胞和組織內(nèi)積累而引起的溶酶體貯積癥(LSD)(Schuchman和Desnick，Niemann-Pickdisease types A and Bacid sphingomyelinase deficiencies.InThemetabolic and molecular bases of inherited disease.Schriver CR，BeaudetAL，Valle D，Sly WS編著；New York.McGraw Hill Inc 3589-36102001)。A型NPD患者通常在嬰兒期早期被診斷為器官巨大癥，接著發(fā)生快速的神經(jīng)變性過程，到大約3歲時導(dǎo)致死亡。相反，B型NPD患者極少或者沒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)累及，通常存活至成年期。但是，B型NPD在臨床上是不均一的，可能出現(xiàn)多種檢查結(jié)果，包括肝脾大、生長遲緩、頻發(fā)呼吸道感染、疲勞和血液學(xué)異常，如高LDL膽固醇和甘油三酯、低HDL膽固醇和低血小板。另外，已經(jīng)報道幾名B型NPD患者具有與神經(jīng)變性相關(guān)的中間表型(Elleder和Cihula，Eur JPediatr 1983；140323-328；Elleder等人，J Inherit Metab Dis 1986；9357-366)。
兩種類型的NPD都是在全部人種中發(fā)生的，但是報道的大多數(shù)A型NPD病例發(fā)生在德裔猶太人個體中。相反，B型NPD似乎在北非、阿拉伯和土耳其人群中更加普遍。迄今為止，已經(jīng)報道在ASM基因中有超過70個突變能夠引起A型或B型NPD(Simonaro等人，AmJ Hum Gen.2002，711413-1419)。其中有少量共同突變預(yù)測有特定表型。例如，在北美和西歐的全部NPD患者的約10-15％中發(fā)現(xiàn)ΔR608突變，其中殘基608處的精氨酸缺失(ΔR608)，并且該突變總是與該疾病的非神經(jīng)形式(即B型NPD)相關(guān)(Levran等人，J Clin Invest.1991；88806-810)。該突變也在北非的約90％的B型NPD患者中發(fā)現(xiàn)(Vanier等人，Hum Genet.1993；92325-330)。與ΔR608突變不同，另外三個突變，即L302P，其中脯氨酸替換了氨基酸殘基302處的亮氨酸，R496L，其中亮氨酸替換了氨基酸殘基496處的精氨酸，和fsP330，其中未成熟終止密碼子被引入氨基酸殘基330處的脯氨酸下游，存在于德裔猶太人群體中90％以上的A型NPD患者中(Levran等人，Proc Natl AcadSci U S A.1991；883748-3752；Levran等人，Blood.1992；802081-2087；Levran等人，Hum Mut.1993；2317-319)。德裔猶太人群體中這三種突變的攜帶頻率為約1∶80至1∶100(Li等人Am J Hum Genet.1997；61(suppl)A24)。
最近，克隆了人ASM基因的三個同種型，并且鑒定了能夠可靠應(yīng)用于診斷評價德裔猶太人群體中A型和B型NPD雜合體的幾個突變(參見Schuchman等人的美國專利5,773,278和5,686,240)。
支持治療是用于大多數(shù)LSD患者的唯一療法。對于幾種LSD，包括戈謝病、法布里病和I型粘多糖貯積病(MPS I)，已經(jīng)開發(fā)了或者當(dāng)前正在開發(fā)酶替代療法(ERT)(Desnick和Schuchman，Nat Rev Genet.2002；3954-966)，但是由于這些酶在靜脈輸注后不能通過血腦屏障，因此不是用于重度神經(jīng)累及(例如A型NPD)患者的有效策略。使用小分子抑制劑來阻止病原性底物合成的底物剝奪療法(Substratedeprivation therapy)也已經(jīng)開發(fā)或者正在評價用于幾種LSD，在歐洲和美國已經(jīng)有條件地批準(zhǔn)銷售用于戈謝病(Butters等人，Philos TransR Soc Lond B Biol Sci.2003；358927-945)。與ERT相比，這一方法的一個優(yōu)點是小分子抑制劑可以通過血腦屏障，從而防止底物在腦中積累。
最近開發(fā)的另外一種小分子方法稱作化學(xué)陪伴分子，或活性部位特異性陪伴分子(ASSC)療法(Fan等人Nat Med.1999；5112-115；Fan，Trends Pharmacol Sci.2003；24355-360)。ASSC使用低濃度的有效酶抑制劑來增加特定LSD中突變蛋白的折疊和活性。該方法首先在法布里病中評價，其中應(yīng)用α-半乳糖苷酶A的小分子抑制劑1-脫氧-半乳糖野尻霉素(DGJ)提高來自法布里病患者的細胞系中的殘余α-半乳糖苷酶活性(參見Fan等人的美國專利6,274,597)。Fan等人的美國專利6,583,158進一步舉例說明了用于大量其他溶酶體貯積癥，包括戈謝病和GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥的ASSC策略，并且證明了使用有效競爭性抑制劑作為化學(xué)陪伴分子來提高患者細胞中殘余酶活性的這種治療策略不僅限于法布里病患者，而可以用于多種酶缺陷疾病，特別是LSD。
現(xiàn)在正在開發(fā)用于包括戈謝病在內(nèi)的幾種LSD的ASSC療法，它與ERT或底物剝奪療法相比具有幾個優(yōu)點。最重要的是，由于在ASSC中使用的活性部位抑制劑是引起疾病的酶特異性的，因此這種療法針對單一蛋白質(zhì)和代謝途徑，這不同于抑制整個合成途徑的底物剝奪療法。同底物剝奪療法一樣，用于ASSC的小分子抑制劑具有通過血腦屏障的能力，因而能夠用于治療神經(jīng)LSD形式。
除了提高與LSD相關(guān)的缺陷酶的活性以外，還證明了ASSC能夠提高相應(yīng)野生型酶的活性(參見，F(xiàn)an等人的美國專利6,589,964)，因此能夠作為酶替代療法的共同治療用于LSD患者。
A型NPD是ASSC的一個重要的候選者。首先，所有A型NPD患者都發(fā)展到大約3歲時導(dǎo)致死亡的嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)表型。對于這種疾病的神經(jīng)學(xué)特征現(xiàn)在還沒有治療方法。但是，使用ASM敲除小鼠模型的研究已經(jīng)表明，將殘余ASM活性提高最多正?；钚缘募s5％能夠完全防止腦病的發(fā)生，并且導(dǎo)致壽命正常，提示低水平的功能性ASM防止了A型NPD患者的神經(jīng)變性(Marthe等人，Hum Mol Genet.2000；91967-1976)。另外，造成大多數(shù)德裔猶太人A型NPD患者的這三個突變中的兩個(L302P和R496L)是可能適合ASSC的點突變。另外，世界上大約15％的B型NPD患者帶有至少一個拷貝的ΔR608突變。因此，實質(zhì)上需要這種形式的小分子療法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種治療A型或B型NPD患者的方法，是通過施用小分子神經(jīng)酰胺類似物或含磷鞘磷脂或核苷酸類似物作為活性部位特異性陪伴分子(ASSC)。
在一個實施方案中，向在人酸性鞘磷脂酶(ASM)基因中具有L302P突變的個體施用ASSC。
在另一個實施方案中，向在人酸性鞘磷脂酶(ASM)基因中具有R496L突變的個體施用ASSC。
在另一個實施方案中，向具有ΔR608突變的個體施用ASSC。
在另一個實施方案中，該小分子是具有下式的鞘磷脂類似物 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3，優(yōu)選2。
在另一個實施方案中，該小分子是具有下式的鞘磷脂類似物 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
在一個優(yōu)選實施方案中，該鞘磷脂類似物具有以下結(jié)構(gòu) 在另外一個實施方案中，該小分子是具有下式的神經(jīng)酰胺類似物 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
在一個特定實施方案中，該ASSC是D-MAPP(見

圖1)。
在另外一個實施方案中，該小分子類似物是磷核苷酸類似物，如下
但是，也包括其他磷核苷酸，例如但不限于腺苷一磷酸、胞苷一磷酸和腺苷二磷酸。
在一個實施方案中，該小分子類似物可以施用作為單一治療。
在另外一個實施方案中，該小分子類似物可以與野生型重組ASM一起施用作為酶替代治療。隨著施用的替代功能性ASM蛋白的穩(wěn)定性提高，內(nèi)源ASM蛋白的穩(wěn)定性，因而活性，將同時提高。
在另外一個實施方案中，該小分子類似物與編碼功能性ASM的重組載體，即基因治療一起施用。
本發(fā)明進一步提供一種提高非哺乳動物宿主細胞產(chǎn)生重組ASM蛋白的方法，是通過將該宿主細胞在含有本發(fā)明的小分子類似物的培養(yǎng)基中接觸。
本發(fā)明還提供含有該小分子類似物和藥物可接受的載體的組合物。
本發(fā)明進一步提供在藥物可接受的載體中含有純化的ASM蛋白和如此處所述的小分子類似物陪伴分子的組合物。
本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療已經(jīng)診斷為或者在遺傳學(xué)上易發(fā)展為NPD的受試者的方法，是通過單獨施用或與酶替代或基因治療聯(lián)合施用小分子類似物。
附圖簡述圖1顯示本發(fā)明的一個優(yōu)選ASSC，即D-MAPP的結(jié)構(gòu)。
圖2A-D。圖2A顯示可以在本發(fā)明中應(yīng)用的神經(jīng)酰胺類似物的結(jié)構(gòu)，而圖2B和2C顯示能夠用于實施本發(fā)明的鞘磷脂類似物的結(jié)構(gòu)。圖2D顯示作為NPD ASCC候選物的鞘磷脂類似物的一個優(yōu)選實施方案的結(jié)構(gòu)。
圖3顯示為ASM的抑制劑和ASSC的一種核苷酸類似物的結(jié)構(gòu)。
圖4證明D-MAPP抑制野生型ASM活性的Ki。
圖5顯示D-MAPP對來自A型NPD個體的細胞中ASM活性的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸類似物作為NPDASSC的應(yīng)用。當(dāng)在D-MAPP(5-50微摩爾)存在下將來自含有兩個拷貝R496L突變的A型NPD患者的培養(yǎng)皮膚成纖維細胞溫育3天時，殘余ASM活性提高最高達3倍，或者提高至正常值的約3％(從不到正常值1％的起始活性起，見圖5)。類似地，當(dāng)鞘磷脂類似物與正常成纖維細胞(20微摩爾)一起培養(yǎng)5天時，正常ASM活性抑制90％，提示它是ASM的有效的陪伴分子。
以前Fan等人(美國專利6,274,597；6,583,158；6,589,964；和6,599,919)所描述的ASSC是葡萄糖和半乳糖的亞胺基糖類似物，它們是公知的糖苷酶抑制劑，與之不同，本發(fā)明描述的小分子類似物不是亞胺基糖。本發(fā)明的化合物在約50-100μM的濃度時抑制ASM。這也不同于Hannun等人在美國專利5,830,916中所述，該專利公開了此處所述的一種神經(jīng)酰胺類似物，即D-MAPP，作為堿性神經(jīng)酰胺酶抑制劑通過抑制神經(jīng)酰胺酶來提高神經(jīng)酰胺積累的應(yīng)用。神經(jīng)酰胺酶是一種催化神經(jīng)酰胺水解為鞘氨醇和脂肪酸的酶。Hannun也披露了D-MAPP對內(nèi)源鞘磷脂水平?jīng)]有作用，反對在全細胞中對鞘磷脂酶(降解鞘磷脂的酶)的作用。β-葡糖苷酶，一種催化芳基和烷基β-D-葡糖苷在體外(使用全細胞)水解的糖苷酶，也發(fā)現(xiàn)類似的作用缺乏。
公開的Dagan等人的美國專利申請2003/0133004也描述了作為各種脂質(zhì)相關(guān)酶的抑制劑的化合物。該申請描述了幾種修飾鞘脂合成或代謝的化合物。具體地，描述了抑制鞘磷脂合成，從而提高細胞中神經(jīng)酰胺的濃度，導(dǎo)致細胞凋亡的鞘磷脂類似物。該申請也涉及使用這些抑制劑通過抑制鞘磷脂治療糖脂貯積病，鞘磷脂是在某些LSD如NPD中積累的病理性脂質(zhì)。這是底物剝奪或減少的一個例子。該申請描述的一種化合物顯示抑制酸性和中性鞘磷脂酶。
定義如此處所用的，術(shù)語“活性部位特異性陪伴分子”(ASSC)是指與蛋白質(zhì)的活性部位可逆地特異性相互作用，并且增強穩(wěn)定的分子構(gòu)象形成的任何分子，包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物等。如此處所用的，“活性部位特異性陪伴分子”不包括細胞ER中存在的內(nèi)源性普通陪伴分子，如Bip、鈣聯(lián)接蛋白或鈣網(wǎng)織蛋白，或普通的非特異性化學(xué)陪伴分子，如重水、DMSO或TMAO。根據(jù)本發(fā)明，ASSC是神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或核苷酸類似物和與ASM相互作用的蛋白質(zhì)。
酸性鞘磷脂酶，或ASM，具有如美國專利6,541,218所述的核苷酸和氨基酸序列。ASM的氨基酸序列顯示在下文的SEQ ID NO1中。該術(shù)語也包括ASM的物種直向同源物和變體。
如此處所使用的，術(shù)語“活性部位”是指與底物或結(jié)合配偶體結(jié)合，并且貢獻直接參與形成和打斷化學(xué)鍵的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，活性部位包括ASM酶的催化結(jié)構(gòu)域。
D-MAPP是指D-赤式-2-(N-肉豆蔻酰氨基)-1-苯基-1-丙醇。D-MAPP在美國專利5,369,030中描述，并在本文的圖1中示出。
術(shù)語“穩(wěn)定正確構(gòu)象”指本發(fā)明的化合物誘導(dǎo)突變ASM蛋白的構(gòu)象使之與野生型ASM蛋白的構(gòu)象功能上相同的能力。術(shù)語“功能上相同”意思是構(gòu)象可能有少量變化(實際上幾乎所有蛋白質(zhì)在其生理學(xué)狀態(tài)下都顯示一定的構(gòu)象柔性)，但是這種構(gòu)象柔性不會導(dǎo)致(1)蛋白質(zhì)聚集，(2)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解途徑清除，(3)ASM功能的損害，和/或(4)不當(dāng)?shù)募毎麅?nèi)轉(zhuǎn)運。該術(shù)語也指野生型或功能性ASM如為ERT產(chǎn)生的ASM的穩(wěn)定。
術(shù)語“野生型活性”是指ASM在細胞內(nèi)的正常生理功能。此種功能性可通過已知的用于確定蛋白質(zhì)功能性的任何方法測試。某些測試可以評價ASM的性質(zhì)，該性質(zhì)可能對應(yīng)于或者可能不對應(yīng)于它的實際體內(nèi)功能，但卻是蛋白質(zhì)功能性的聚集替代物，并且野生型在這樣的試驗中的行為是本發(fā)明的蛋白質(zhì)折疊拯救技術(shù)的可接受的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的一種這樣的活性是ASM從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向溶酶體的適當(dāng)轉(zhuǎn)運。
術(shù)語“功能性ASM蛋白”是指具有以正確構(gòu)象折疊的能力，到達其在細胞中的天然位置，并且具有對鞘磷脂和其他脂質(zhì)底物的催化活性的ASM蛋白。功能性ASM蛋白包括野生型ASM蛋白(見下文的定義)，例如SEQ ID NO1所示，和具有野生型活性的ASM蛋白。
術(shù)語“提高ASM的活性”意思是穩(wěn)定突變ASM蛋白的正確構(gòu)象，使其成為功能性ASM蛋白(即以正確構(gòu)象折疊，到達其在細胞中的天然位置，并且具有對鞘磷脂和其他脂質(zhì)底物的催化活性)。該術(shù)語也指提高外源施用的ASM蛋白的野生型活性，即通過提高野生型ASM的穩(wěn)定性及延長其半壽期，從而延長其活性。
術(shù)語“ASM的抑制劑”是指在低于藥理學(xué)劑量的濃度時，相比其他酶，包括參與鞘磷脂合成的酶，在抑制ASM上表現(xiàn)出更高選擇性的化合物。抑制劑必須特異性抑制ASM。如此處所用的，抑制劑不包括可在活性部位結(jié)合，但是除了在不利于對個體施用的極高濃度下之外本身不具有抑制活性的化合物。
術(shù)語“低于抑制ASM所需的濃度”是指提高ASM活性而不抑制其活性的本發(fā)明化合物的濃度。根據(jù)本發(fā)明，該濃度的范圍為約5-50μM。
如此處所用的，術(shù)語“突變ASM蛋白”是指由含有基因突變的基因翻譯而來的ASM，該基因突變導(dǎo)致在ER中正常存在的條件下不會實現(xiàn)天然構(gòu)象的改變的蛋白質(zhì)序列。不能實現(xiàn)這種構(gòu)象導(dǎo)致ASM降解，而不是通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的正常途徑轉(zhuǎn)運至溶酶體。
在一個實施方案中，用本發(fā)明的方法拯救的ASM突變是R496L(SEQ ID NO2)，即在密碼子核苷酸1487處的G向T的顛換突變。還不清楚堿性精氨酸替換為疏水性更強的亮氨酸殘基是否改變了酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性，或這兩者。
在另外一個特定實施方案中，用本發(fā)明的方法拯救的ASM突變是核苷酸905處T向C的轉(zhuǎn)換，這導(dǎo)致脯氨酸替換了亮氨酸(L302P-SEQ ID NO3)。
在另外一個特定實施方案中，用本方法的ASSC拯救的ASM突變是R608的缺失突變(ΔR608-SEQ ID NO4)。
分子生物學(xué)定義根據(jù)本發(fā)明，可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻中充分描述。參見，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(在此寫為″Sambrook等人，1989″)；DNA CloningAPractical Approach，第I卷和第II卷(D.N.Glover編，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Nucleic AcidHybridization；B.D.Hames和S.J.Higgins編(1985)；TranscriptionAnd Translation；[B.D.Hames和S.J.Higgins，編(1984)；Animal CellCulture；R.I.Freshney，編(1986)；Immobilized Cells And Enzymes；IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
如此處所用的，術(shù)語“分離的”意思是從正常發(fā)現(xiàn)的環(huán)境中除去參考物質(zhì)。因此，分離的生物材料可以沒有細胞成分，即發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生該材料的細胞的成分。對于核酸分子，分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA或限制性酶切片段。在另外一個實施方案中，分離的核酸優(yōu)選從可以發(fā)現(xiàn)它的染色體上切下，更優(yōu)選地不再與非調(diào)節(jié)、非編碼區(qū)連接，或者不再與當(dāng)在染色體中發(fā)現(xiàn)時位于該分離的核酸分子所含基因的上游或下游的其他基因連接。在另外一個實施方案中，分離的核酸缺少一個或多個內(nèi)含子。分離的核酸分子包括插入質(zhì)粒、粘粒、人工染色體等中的序列。因此，在一個特定實施方案中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白質(zhì)可以與在細胞中相結(jié)合的其他蛋白質(zhì)或核酸或這兩種結(jié)合，或者如果是膜結(jié)合蛋白，則與細胞膜結(jié)合。在一個特定實施方案中，分離的ASM蛋白是由表達載體表達的重組ASM蛋白。分離的物質(zhì)可以但不是必須純化。
如此處所使用的術(shù)語“純化的”指在減少或消除無關(guān)材料即污染物的條件下被分離的材料。例如，純化的ASM優(yōu)選地基本上沒有在細胞內(nèi)通常與ASM結(jié)合的其他蛋白質(zhì)或核酸。如此處所使用的術(shù)語“基本上沒有”在材料的分析測試內(nèi)容中可以操作性地使用。優(yōu)選地，基本上不含污染物的純化的ASM為至少50％的純度；更優(yōu)選至少90％的純度，更優(yōu)選至少99％的純度。純度可以通過層析、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物學(xué)試驗和本領(lǐng)域已知的其他方法估計出來。
術(shù)語“大約”和“近似”通常指根據(jù)測量的性質(zhì)和精度而定的測量數(shù)量的可接受的誤差程度。一般，誤差程度的例子為在給定數(shù)值或數(shù)值范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選在10％以內(nèi)，更優(yōu)選在5％以內(nèi)?；蛘?，并且尤其是在生物學(xué)系統(tǒng)中，術(shù)語“大約”和“近似”可指給定數(shù)值的一個數(shù)量級內(nèi)的數(shù)值，優(yōu)選在10倍或5倍以內(nèi)，更優(yōu)選在2倍以內(nèi)。除非另外聲明，此處給出的數(shù)字的量是近似的，意思是當(dāng)未清楚說明時，術(shù)語“大約”或“近似”能夠是推斷的。
術(shù)語“宿主細胞”意思是以任何方式選擇、修飾、轉(zhuǎn)化、生長或使用或操作的任何生物體的任何細胞，用于由該細胞產(chǎn)生物質(zhì)，例如由細胞表達人ASM基因，包括DNA或RNA序列，或ASM酶。宿主細胞可以進一步用于ASSC概念的其他試驗的初步評價?！爸亟MDNA分子”是進行分子生物學(xué)操作或改造的DNA分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，宿主細胞是成纖維細胞。
“基因”是編碼“基因產(chǎn)物”的核苷酸序列。通常，基因產(chǎn)物是蛋白質(zhì)。然而，基因產(chǎn)物還可以是細胞內(nèi)其他類型的分子，例如RNA(例如tRNA或者rRNA)。為了本發(fā)明的目的，基因產(chǎn)物還指在細胞內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)的mRNA序列。如此處所用的，基因是指編碼野生型或突變ASM的核苷酸序列。
“野生型ASM基因”是指編碼在體內(nèi)具有功能性生物活性的ASM蛋白的核酸序列。野生型ASM核酸序列可含有與已知公布的序列如美國專利6,541,218公開的序列不同的核苷酸改變，只要這種改變導(dǎo)致對生物活性影響很小或沒有影響的氨基酸置換。如此處所使用的，術(shù)語“野生型”也可包括經(jīng)改造而編碼相對于內(nèi)源或天然蛋白質(zhì)能夠提高或增強活性的ASM蛋白的ASM核酸序列。
“野生型ASM蛋白”是指由野生型基因編碼的任何蛋白質(zhì)，當(dāng)在體內(nèi)表達或?qū)霑r該蛋白質(zhì)具有功能性生物活性。這種功能性可通過已知的用于確定蛋白質(zhì)功能性的任何方法測試。
術(shù)語“表達”意思是指通過活化與相應(yīng)ASM基因或DNA序列(即編碼ASM的序列)的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的細胞功能而允許或?qū)е翧SM基因或DNA序列中的信息變成表現(xiàn)形式，例如產(chǎn)生RNA(例如rRNA或mRNA)或ASM蛋白。ASM DNA序列由細胞表達，形成諸如ASMRNA(例如mRNA或rRNA)或ASM蛋白的“表達產(chǎn)物”。表達產(chǎn)物本身，例如所得的ASM RNA或蛋白質(zhì)，也可以稱作被細胞“表達的”。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”意思是指將“外來的”，即外部的或細胞外的基因、DNA或RNA序列，導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)，以致宿主細胞表達導(dǎo)入的基因或序列以產(chǎn)生目的物質(zhì)。在本發(fā)明中，該目的物質(zhì)一般是由所導(dǎo)入基因或序列編碼的RNA，以及由所導(dǎo)入基因或序列編碼的酶蛋白質(zhì)。所導(dǎo)入的基因或序列還可以稱作“克隆的”或“外來的”基因或序列，可以包括調(diào)節(jié)或控制序列(例如細胞的遺傳機制所使用的起始、終止、啟動子、信號、分泌或其他序列)?；蚧蛐蛄锌砂ǚ枪δ苄孕蛄谢蛭粗δ苄蛄小＝邮懿⒈磉_所導(dǎo)入DNA或RNA的宿主細胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”了，并且是一個“轉(zhuǎn)化體”或“克隆”。導(dǎo)入宿主細胞的DNA或RNA可以來自于任何來源，包括與宿主細胞同一屬或種的細胞或不同屬或種的細胞。如此處所用的，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化包括編碼功能性ASM的序列向具有突變內(nèi)源ASM基因的個體中的導(dǎo)入。
術(shù)語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”意思是指運載體，通過該運載體可以將ASM DNA或RNA序列(例如外來基因)導(dǎo)入宿主細胞從而轉(zhuǎn)化宿主和促進所導(dǎo)入序列的表達(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)。載體包括任何遺傳元件，如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒體等，當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂圃嚓P(guān)聯(lián)時其能夠復(fù)制，并且能夠在細胞之間轉(zhuǎn)移ASM基因序列。因此，該術(shù)語包括克隆和表達運載體，以及病毒載體。
術(shù)語“表達系統(tǒng)”意思是指在適宜條件下的宿主細胞和相匹配的載體，例如用于表達由載體攜帶的并已導(dǎo)入宿主細胞的外來DNA所編碼的ASM蛋白。常用的表達系統(tǒng)包括大腸桿菌(E.coli)宿主細胞和質(zhì)粒載體、昆蟲宿主細胞例如Sf9、Hi5或S2細胞和桿狀病毒載體和表達系統(tǒng)、以及哺乳動物宿主細胞和載體。
術(shù)語“基因治療”是指通過外源性施用基因，即ASM基因，改變內(nèi)源性基因表達的方法。如此處所使用的，基因治療還指通過將對應(yīng)于缺陷或丟失ASM基因的功能性基因或基因的一部分導(dǎo)入需要的個體的體細胞或干細胞中而對缺陷ASM基因的替代、或者對丟失的基因的替代?；蛑委熆梢酝ㄟ^“來自體內(nèi)”的方法實現(xiàn)，其中分化的或體干細胞從個體的身體中取出，然后使用病毒載體作為基因遞送工具，將缺陷基因的正常拷貝導(dǎo)入所移出的細胞內(nèi)。此外，體內(nèi)轉(zhuǎn)移是為了達到治療的結(jié)果，使用廣泛的病毒載體、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物或裸DNA，將基因原位直接轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。
術(shù)語“重組蛋白”是指由載體攜帶的治療性ASM基因編碼的ASM蛋白(基因產(chǎn)物)。通常，接受載體的細胞會缺乏對應(yīng)于重組蛋白的內(nèi)源性ASM蛋白的表達和/或活性，或者即便存在此種內(nèi)源性ASM蛋白的表達，它也是突變型的或者水平十分低。在一個實施方案中，重組蛋白由細胞在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生，用于實驗和治療目的。在另外一個實施方案中，重組蛋白由載體轉(zhuǎn)化的細胞在體內(nèi)產(chǎn)生，其中該載體或含有該載體的細胞已經(jīng)對受試者施用，即基因治療。在正常個體即該蛋白質(zhì)不缺乏的個體中，重組ASM蛋白和野生型蛋白質(zhì)可能是區(qū)分不開的。
治療應(yīng)用本發(fā)明進一步提供一種預(yù)防或治療A型和B型NPD的方法，該方法包括在需要這種治療的受試者或患者中提高突變ASM酶的表達或活性，或者提高重組野生型替代ASM酶的活性。
“受試者”或“患者”是已經(jīng)發(fā)展或者可能發(fā)展為NPD的人或動物，更特別地是哺乳動物，優(yōu)選嚙齒動物或靈長類動物，最優(yōu)選人類。在一個實施方案中，患者是已經(jīng)診斷為或者已經(jīng)確定為由于ASM基因的遺傳突變而使發(fā)展NPD的危險性提高的德裔猶太人群體的成員。在另外一個實施方案中，患者是新斯科舍的法裔加拿大人群體的成員，北非馬格里布地區(qū)(突尼斯、摩洛哥、阿爾及利亞)的居民(B型)，或新墨西哥州南部和科羅拉多州的西班牙裔美國人群體的成員。然而，尼曼-皮克病是在全部人種中發(fā)生的，術(shù)語受試者包括世界上患有NPD或者在遺傳學(xué)上具有發(fā)展NPD的危險的任何人。
術(shù)語“預(yù)防”是指疾病發(fā)作的預(yù)防，意思是預(yù)防性地干預(yù)導(dǎo)致疾病的病理機制。在本發(fā)明上下文中，這種病理機制可以是突變蛋白折疊和ASM表達的提高。
術(shù)語“治療”意思是治療性地干預(yù)顯示該疾病癥狀的受試者中疾病的發(fā)展。在本發(fā)明的上下文中，這樣的癥狀包括但不限于，例如，網(wǎng)狀內(nèi)皮溶酶體中鞘磷脂的積累，其導(dǎo)致肝脾大、精神運動性阻滯、肺異常、進行性神經(jīng)變性。在一些情況下，治療將防止由NPD引起的死亡。
如此處所使用的術(shù)語“治療有效量”意思是足以使突變ASM表達水平提高例如正常細胞中所見水平的約3-5％，優(yōu)選約10％，更優(yōu)選約30％的ASSC(即鞘磷脂、神經(jīng)酰胺或核苷酸類似物)的量或劑量。優(yōu)選地，治療有效量可以改善或防止受試者ASM活性的臨床顯著的缺乏。或者，治療有效量是足以引起受試者臨床重要狀況的改善，例如B型NPD患者中進行性神經(jīng)變性的改善的量。
根據(jù)本發(fā)明，“治療有效量”也指提高而不抑制ASM蛋白活性的小分子類似物的量，即有效量的提高多于抑制，因此凈效果是提高。該有效量一般處于低于ASM抑制劑的IC50值的某處，或者低于約50μM。
提高突變ASM表達或活性的小分子類似物有利地用藥物可接受的載體配制在藥物組合物中。在上下文中，小分子類似物是活性成分或治療劑。
活性成分的濃度或量取決于需要的劑量和如下文所述的施用方案。小分子類似物的合適的劑量范圍可包括從約1mg/kg至約100mg/kg體重每天。
聯(lián)合治療ASSC和蛋白質(zhì)替代。本發(fā)明的藥物組合物除了鞘磷脂、神經(jīng)酰胺或核苷酸類似物以外還可以含有其他生物活性化合物。例如，在一個實施方案中，可以在替代治療的酶輸注過程中，在含替代野生型(或功能性)重組ASM的溶液中施用小分子類似物。蛋白質(zhì)替代治療通過以輸注方式外源引入野生型或生物功能蛋白質(zhì)提高了蛋白質(zhì)的量。這種治療已經(jīng)開發(fā)用于許多遺傳病，包括戈謝病和法布里病。野生型酶從重組細胞表達系統(tǒng)(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞——見Desnick等人的美國專利號5,580,757；Selden等人的6,395,884和6,458,574；Calhoun等人的6,461,609；Miyamura等人的6,210,666；Selden等人的6,083,725；Rasmussen等人的6,451,600；Rasmussen等人的5,236,838；和Ginns等人的5,879,680)、人胎盤或動物奶(見Reuser等人的美國專利號6,188,045)中純化。
輸注后，預(yù)期外源ASM酶被組織通過非特異性或受體特異性機制吸收。通常吸收效率不高，外源蛋白質(zhì)的循環(huán)時間較短(Ioannu等人，Am.J.Hum.Genet.2001；6814-25)。另外，外源ASM在循環(huán)中不穩(wěn)定，被快速細胞內(nèi)降解。因此，預(yù)期與小分子類似物ASM的ASSC共施用將提高穩(wěn)定性并防止外源施用的ASM的降解。
在另外一個實施方案中，小分子類似物也可以與重組功能性ASM蛋白一起施用，但不必在同一組合物中施用。在該實施方案中，替代ASM蛋白和小分子類似物配制在分別的組合物中。該小分子類似物和替代ASM可以通過相同的途徑施用，例如靜脈輸注，或通過不同的途徑施用，例如靜脈輸注替代蛋白，而經(jīng)口施用ASSC。
ASSC和基因治療。另外，本發(fā)明的小分子類似物組合物可以與編碼野生型或功能性ASM基因的重組載體一起施用，即與基因治療聯(lián)合應(yīng)用。最近，重組基因治療方法正在臨床上或臨床前開發(fā)用于溶酶體貯積病的治療，參見，例如美國專利號5,658,567，關(guān)于法布里病的重組α-半乳糖苷酶A治療；美國專利號5,580,757，關(guān)于生物活性α-半乳糖苷酶A的克隆和表達為融合蛋白；美國專利號6,066,626，關(guān)于治療溶酶體貯積病的組合物和方法；美國專利號6,083,725，關(guān)于轉(zhuǎn)染的表達人α-半乳糖苷酶A蛋白的人細胞；美國專利號6,335,011，關(guān)于利用重組腺伴隨病毒病毒體將DNA遞送至肌細胞內(nèi)治療溶酶體貯積病的方法；Bishop，D.F.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 1986；834859-4863；Medin，J.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；937917-7922；Novo，F(xiàn).J.，Gene Therapy 1997；4488-492；Ohshima，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997；942540-2544；Sugimoto Y.等人，Human Gene Therapy 1995；6905-915；Sly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 2002；99(9)5760-2；Raben等人，Curr.Mol.Med 2002；2(2)145-66；Eto等人，Curr.Mol.Med.2002；2(1)83-9；Vogler等人，Pediatr.Dev.Pathol.2001；4(5)421-33；Barranger等人，Expert Opin.Biol.Ther.2001；1(5)857-67；Yew等人，Curr.Opin.Mol.Ther.2001；3(4)399-406；Caillaud等人，Biomed.Pharmacother.2000；54(10)505-12和Ioannu等人，J.Am.Soc.Nephrol.2000；11(8)1542-7。
重要的是要指出，除了穩(wěn)定所表達的ASM酶以外，小分子類似物還會穩(wěn)定和增強由于阻止在ER內(nèi)正確折疊和加工的突變所導(dǎo)致缺陷的任一內(nèi)源性突變ASM的表達。
制劑和施用短語“藥物可接受的”是指當(dāng)施用于大多數(shù)人時能夠生理性耐受的并且一般不產(chǎn)生變應(yīng)性或類似的不利反應(yīng)如嘈雜、頭暈等的分子和組合物。優(yōu)選地，如此處所使用的，術(shù)語“藥物可接受的”意思是指聯(lián)邦政府或州政府管理局批準(zhǔn)的或者美國藥典或其他用于動物的并且更特別地用于人的公認的藥典中列出的。術(shù)語“載體”指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥用載體可以是無菌液體例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。水或水溶液、鹽溶液和水溶右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別是用于可注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幱幂d體在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中進行了描述。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物，例如D-MAPP，可以腸胃外、經(jīng)粘膜，例如經(jīng)口、經(jīng)鼻或經(jīng)直腸或經(jīng)皮引入。腸胃外途徑包括靜脈內(nèi)、微動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)施用。
關(guān)于與蛋白質(zhì)替代的聯(lián)合治療，在ASCC與替代ASM酶在同一組合物中施用的實施方案中，該制劑優(yōu)選地適合腸胃外施用，包括靜脈內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用，但是，也包括適合其他施用途徑如經(jīng)口(例如包封的酶)、鼻內(nèi)或經(jīng)皮的制劑。
在一個實施方案中，經(jīng)皮施用通過脂質(zhì)體實現(xiàn)。脂雙層囊泡是封閉的、填充流體的微球體，其主要由具有極性(親水性)和非極性(親脂性)部分的各種分子形成。親水性部分可含有磷酸基、甘油磷酸基、羧基、硫酸基、氨基、羥基、膽堿或其他極性基團。親脂性基團的例子有飽和或不飽和烴，如烷基、鏈烯基或其他脂質(zhì)基團。也可以包含固醇類(例如膽固醇)和其他藥物可接受的佐劑(包括抗氧化劑如α-生育酚)以提高囊泡穩(wěn)定性或賦予其他需要的特性。
脂質(zhì)體是這樣的雙層囊泡中的一個亞類，主要由磷脂分子組成，該磷脂分子含有兩條由脂肪酸鏈組成的疏水尾。在暴露于水后，這些分子自發(fā)排列，形成球形雙層膜，各層中分子的親脂末端在膜中心會合，相對的極性末端形成雙層膜的各自的內(nèi)表面和外表面。因此，膜的每一側(cè)都呈現(xiàn)親水表面，而膜的內(nèi)部含有親脂性介質(zhì)。這些膜可以排列為由薄水層隔開的一系列的同心球形膜，其排列方式與圍繞內(nèi)水間隙的洋蔥層沒有不同。通過施加剪切力可以將這樣的多層囊泡(MLV)轉(zhuǎn)化為單層囊泡(UV)。根據(jù)本發(fā)明的方法使用脂質(zhì)體遞送神經(jīng)酰胺和鞘磷脂類似物的優(yōu)點是脂質(zhì)體可以通過血腦屏障。由于A型NPD的特征為鞘磷脂積累引起的神經(jīng)變性，因此向腦部有效靶向是對于A型的任何治療方法的關(guān)鍵。
適合注射使用的藥物制劑包括無菌水溶液(水溶性時)或分散劑和用于即時制備無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。在所有情況下，形式都必須是無菌的，并且必須是易于注射的流體。其在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，并且必須防止微生物如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，它們的適當(dāng)?shù)幕旌衔?，和植物油。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，和通過應(yīng)用表面活性劑，可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。微生物作用的預(yù)防可以用各種抗細菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如對羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等。在許多情況中，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實現(xiàn)注射型組合物延長的吸收。
無菌注射溶液這樣制備，將純化的ASM酶和小分子類似物以需要的量摻入合適的溶劑中，需要時含有上述各種其他成分，然后過濾或最終滅菌。通常，分散劑這樣制備，將各種滅菌的活性成分摻入含有基本分散介質(zhì)和上述所需其他成分的無菌載體中。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，它們由事先無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加需要的任何其他成分的粉末。
優(yōu)選地，該制劑含有賦形劑?？砂谥苿┲械乃幬锟山邮艿馁x形劑是緩沖液，如檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液，氨基酸，尿素，醇，抗壞血酸，磷脂；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、膠原和明膠；鹽，如EDTA或EGTA，和氯化鈉；脂質(zhì)體；聚乙烯吡咯烷酮；糖，如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和丙三醇；丙二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000，PEG-6000)；甘油；甘氨酸或其他氨基酸；和脂類。用于制劑的緩沖系統(tǒng)包括檸檬酸鹽、乙酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液是優(yōu)選實施方案。
制劑優(yōu)選地也含有非離子型去污劑。優(yōu)選的非離子型去污劑包括Polysorbate 20、Polysorbate 80、Triton X-100、Triton X-114、NonidetP-40、辛基α-葡糖苷、辛基β-葡糖苷、Brij 35、Pluronic和Tween 20。
對于ASM酶和小分子ASSC制劑的凍干，酶濃度可以為0.1-10mg/mL。可以向凍干混合物中添加膨脹劑，如甘氨酸、甘露醇、白蛋白和葡聚糖。另外，也可以向凍干混合物中添加可能的冷凍保護劑，如二糖、氨基酸和PEG。也可以添加以上列出的任何緩沖液、賦形劑和去污劑。
用于吸入施用的小分子類似物制劑(含有或不含ASM)可以含有乳糖或其他賦形劑，或者可以是可含有聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨膽酸鹽或脫氧膽酸鹽的水溶液。一種優(yōu)選的吸入氣霧劑的特征在于具有小質(zhì)量密度和大尺寸的粒子。質(zhì)量密度低于0.4克每立方厘米且平均直徑大于5μm的粒子將吸入的治療劑有效遞送到全身循環(huán)中。這樣的粒子被吸入到肺的深部，逃脫了肺的自然清除機制，直到吸入的粒子釋放它們的治療負載(Edwards等人，Science.1997；2761868-1872)。本發(fā)明的替代蛋白質(zhì)制劑可以以霧化形式施用，例如應(yīng)用如美國專利號5,654,007、5,780,014和5,814,607所述的制備方法和制劑，這些專利在此引用作為參考。用于鼻內(nèi)施用的制劑可包括用于以滴鼻劑形式施用或作為鼻內(nèi)施用凝膠的油性溶液。
通過用皮膚病學(xué)可接受的載體，如洗劑、乳膏、軟膏或皂劑分散組合物，可以配制用于向皮膚表面局部施用小分子類似物的制劑。特別有用的是能夠在皮膚上形成膜或?qū)訌亩植客糠蟛⑶曳乐骨宄妮d體。對于內(nèi)組織表面的局部施用，組合物可以分散在液體組織粘合劑或已知能增強組織表面吸收的其他物質(zhì)中?；蛘?，可以使用組織包被溶液，如含膠質(zhì)的制劑。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的制劑在方便施用預(yù)定劑量的制劑的裝置中以液體或粉末制劑的形式提供；這樣的裝置的例子包括用于皮下或肌肉注射的無針注射器，和計量氣霧劑遞送裝置。在其他的例子中，該制劑可以以適合持續(xù)釋放的形式供應(yīng)，例如為了經(jīng)皮施用而對皮膚施用的貼劑或敷劑，或者通過用于經(jīng)粘膜施用的可腐蝕裝置。在以片劑或膠囊形式經(jīng)口施用制劑例如D-MAPP或其他小分子類似物的例子中，該制劑可以在具有可移去的蓋子的瓶中或在泡罩包裝中提供。
在分開施用小分子類似物或者僅施用ASSC作為單一治療的實施方案中，小分子類似物可以是適合任何施用途徑的形式，包括但不限于上述所有形式，例如作為無菌水溶液、鼻吸入、經(jīng)皮或凍干粉，在重新配制過程中或之后立即加入替代蛋白質(zhì)的制劑中，以防止施用前的體外聚集。此外，在一個優(yōu)選實施方案中，小分子類似物為了經(jīng)口施用可以配制為片劑或膠囊形式，其通過常規(guī)方法用藥物可接受的賦形劑如結(jié)合劑(例如預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)制備而成。使用本領(lǐng)域已知的方法可以將片劑進行包衣。
用于經(jīng)口施用小分子類似物的液體制劑可以采用例如溶液、糖漿或混懸液的形式，或者可以是在使用前用水或其他適當(dāng)媒介物進行配制的干產(chǎn)品。此種液體制劑可以用常規(guī)方法使用藥物可接受的添加劑例如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水媒介物(例如杏仁油、油酯類、乙醇或分餾植物油)和防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)來配制。制劑還可以包含適當(dāng)?shù)木彌_鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。用于經(jīng)口施用的制劑可以適當(dāng)配制，以獲得活性化合物的控制釋放。
對于與基因療法的聯(lián)合治療(或者作為單一治療)，小分子類似物ASSC可以分開配制，用于例如經(jīng)口、腸胃外、透皮或經(jīng)粘膜途徑施用，包括但不限于以上所述。在一個優(yōu)選實施方案中，小分子類似物作為通過常規(guī)方法用如上所述的藥物可接受的賦形劑配制的片劑或膠囊經(jīng)口施用?；蛘?，小分子類似物也可以配制成用于通過注射例如快速注射或連續(xù)輸注而進行腸胃外施用。用于注射的制劑可以與添加的防腐劑一起以單位劑量形式存在，例如存在于安瓿或多劑量容器中。組合物可以采用諸如混懸液、溶液或在油或水媒介物中的乳劑的形式，并且可含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配制試劑。在另外一個實施方案中，小分子類似物可能是粉末的形式，在使用前用適當(dāng)?shù)拿浇槲锢鐪缇鸁o熱原水進行配制。
小分子類似物還可配制成直腸組合物例如栓劑或保留灌腸劑，例如它們含有諸如可可脂或其他甘油酯的常規(guī)栓劑基質(zhì)。
除了前面所描述的制劑外，小分子類似物還可以制劑成貯庫制劑(depot preparation)。這種長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或肌肉注射的方法施用。因此，例如小分子類似物可以與適當(dāng)?shù)亩嗑畚锘蚴杷牧?例如可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂配制，或作為微溶的衍生物，例如作為微溶鹽。
時限。當(dāng)替代ASM蛋白和小分子類似物在分別的制劑中時，施用可以同時進行，或者小分子類似物可以在ASM替代蛋白之前或之后施用。例如，當(dāng)ASM替代蛋白靜脈施用時，小分子類似物可以在之后的0-6小時內(nèi)施用?；蛘撸》肿宇愃莆锟梢栽谠摰鞍踪|(zhì)之前0-6小時施用。
在一個優(yōu)選實施方案中，其中小分子類似物和替代蛋白質(zhì)分開施用，并且具有較短的循環(huán)半壽期(例如小分子)，該小分子類似物可以經(jīng)口連續(xù)施用，如每日施用，以維持循環(huán)中的恒定水平。這種恒定水平是已經(jīng)測定對患者無毒并且在施用期間與靶替代蛋白相互作用方面是最佳的水平，以提供非抑制性的治療效果。
在另外一個實施方案中，小分子類似物在替代ASM蛋白周轉(zhuǎn)所需的時間期限內(nèi)施用(施用小分子類似物將延長這個期限)。
無論時限如何，施用都必須使ASM蛋白和小分子類似物的濃度為使得小分子類似物穩(wěn)定但不阻止或抑制該蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性。這也適用于替代ASM蛋白和小分子類似物在同一制劑中施用的情況。
對于小分子類似物和基因治療聯(lián)合治療的時限，根據(jù)本發(fā)明的小分子類似物的施用通常在ASM基因遞送之后進行，以允許靶細胞/組織表達重組ASM酶。由于ASM基因的表達會維持一段時間，所以只要該基因是可表達的，小分子類似物就會作為重組ASM酶的陪伴分子和穩(wěn)定劑保持有效。因此，小分子類似物的施用有必要持續(xù)與基因表達相同的時間。
在一個優(yōu)選實施方案中，由于小分子類似物具有短的循環(huán)半壽期，小分子類似物優(yōu)選連續(xù)經(jīng)口施用，例如每日施用，以維持循環(huán)中的恒定水平。此種恒定水平是已經(jīng)測定對患者無毒并且在與蛋白質(zhì)相互作用方面是最佳的水平，它將是持續(xù)產(chǎn)生的，以便產(chǎn)生非抑制性的治療效果。
根據(jù)本發(fā)明，在治療性ASM基因補償了內(nèi)源性突變ASM基因不足的活性的情況下，因為有效量能夠提高內(nèi)源性突變ASM的活性并且提高治療性ASM基因產(chǎn)物的效果，因此小分子類似物遞送的時限變得不太重要。
對于所施用的ASM基因編碼的ASM酶，其ASSC如D-MAPP的存在有利于提高ER內(nèi)合成過程中的蛋白質(zhì)加工效率(即通過防止聚集)并延長循環(huán)中和組織中ASM酶的半壽期，從而能夠在較長的時間階段內(nèi)維持有效的水平。這會導(dǎo)致臨床上受累組織內(nèi)的表達增強。這會給NPD患者帶來有益的效果，如更好地緩解、減少治療次數(shù)、和/或降低所施用ASM基因的量。它也會減少治療費用。
基因治療。用于與本發(fā)明的ASSC聯(lián)合治療的ASM核酸可以用任何已知的方法施用，包括本領(lǐng)域可用的用于基因治療的方法。于是經(jīng)鑒定和分離的基因可以插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體中。適宜用于基因治療的載體包括病毒，例如腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、牛痘、皰疹病毒、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、細小病毒、慢病毒、噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體和其他在本領(lǐng)域中常用的、已經(jīng)描述用于在多種真核和原核宿主中進行表達的、并且可用于基因治療和簡單蛋白質(zhì)表達的重組載體。
在一個優(yōu)選實施方案中，載體是病毒載體。病毒載體，特別是腺病毒載體，可以和陽離子親水脂分子，例如陽離子脂類、多聚L-賴氨酸(PLL)和二乙氨乙基葡聚糖(DELAE-葡聚糖)復(fù)合，這些陽離子親水脂分子提供了提高的病毒對靶細胞感染的效率(見，例如1997年11月20日提交的PCT/US97/21496，在此引用作為參考)。用于本發(fā)明的優(yōu)選的病毒載體包括從牛痘、皰疹病毒、AAV和逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體。特別是皰疹病毒，特別是諸如在美國專利號5,672,344所公開(其公開內(nèi)容在此引用作為參考)的單純皰疹病毒(HSV)，對于將轉(zhuǎn)基因遞送進入神經(jīng)細胞是特別有用的。諸如在美國專利號5,139,941、5,252,479和5,753,500和PCT公開W097/09441中(其公開內(nèi)容在此引用作為參考)公開的AAV載體也是有用的，因為這些載體整合入宿主染色體，對重復(fù)施用載體具有最低的需求。關(guān)于基因治療中的病毒載體的綜述見Mah等人，Clin.Pharmacokinet.2002；41(12)901-11；Scott等人，Neuromuscul.Disord.2002；12 Suppl 1S23-9。此外，見美國專利號5,670,488。
欲被遞送的基因的編碼序列可以有效地連接于表達控制序列，例如指導(dǎo)基因表達的啟動子。如此處所使用的，短語“有效地連接”’指多核苷酸/基因與核苷酸的調(diào)節(jié)和效應(yīng)序列例如啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點和其他信號序列的功能性關(guān)系。例如，核酸與啟動子有效地連接指多核苷酸和啟動子之間的物理性和功能性的關(guān)系，以致于DNA的轉(zhuǎn)錄被能夠特異性識別和結(jié)合到啟動子上的RNA聚合酶從啟動子處起始，并且其中該啟動子指導(dǎo)著從多核苷酸到RNA的轉(zhuǎn)錄。
在一個實施方案中，使用了其中編碼序列和任何其他需要的序列的側(cè)翼是能夠促進在基因組的預(yù)期部位進行同源重組的區(qū)域的載體，從而提供了由整合到基因組內(nèi)的核酸分子表達該構(gòu)建體(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，868932-8935；Zijlstra等人，Nature 1989，342435-438)。
在一個特定的實施方案中，載體是直接在體內(nèi)施用的，此時載體進入生物體的細胞并且介導(dǎo)構(gòu)建體的表達。這可以通過本領(lǐng)域公知的和下面描述的多種方法中的任何方法實現(xiàn)，例如通過將其構(gòu)建為適當(dāng)表達載體的一部分并且對其進行施用以致于使它變成細胞內(nèi)的，例如使用缺陷型或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體進行感染(見，美國專利號4,980,286)，或者通過直接注射裸DNA，或者使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)，或者用脂類或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑進行包被，用生物聚合物(例如聚-β-1-64-N-乙酰葡糖胺多糖；見美國專利號5,635,493)進行包封，用脂質(zhì)體、微顆?；蛭⒛z囊進行包封；通過連接到已知將進入細胞核的肽或其他配體上進行施用；或者通過連接到能夠發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體上而施用(見，例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.1987，624429-4432)等等。在另一實施方案中，可以形成核酸和配體復(fù)合物，其中配體含有破壞內(nèi)體的致融合病毒肽，從而使核酸免受溶酶體的降解，或者含有例如從觸角(antennapedia)來源的、可用于轉(zhuǎn)移治療性DNA進入細胞的陽離子12mer肽(Mi等，Mol.Therapy 2000，2339-47)。在另一個實施方案中，通過靶向特異的受體可以將核酸在體內(nèi)進行靶向，用于細胞特異的攝入和表達(見，例如PCT公開號WO92/06180，WO 92/22635，WO92/20316和WO 93/14188)。最近，一種叫做磁性轉(zhuǎn)染的技術(shù)已經(jīng)用于將載體遞送進入哺乳動物。該技術(shù)將載體和用于在磁場的影響下進行遞送的超順磁納米顆粒進行結(jié)合。這種應(yīng)用縮短了遞送時間并且提高了載體的效果(Scherer等，Gene Therapy 2002；9102-9)。
在一個特定實施方案中，核酸可以用脂質(zhì)載體施用。脂質(zhì)載體可以與裸核酸(例如質(zhì)粒DNA)結(jié)合，以利于通過細胞膜。陽離子、陰離子或中性脂質(zhì)可以用于此目的。但是，優(yōu)選陽離子脂質(zhì)，因為它們已經(jīng)表現(xiàn)為更好地與通常帶有負電荷的DNA結(jié)合。陽離子脂質(zhì)還顯示能夠介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的細胞內(nèi)遞送(Felgner和Ringold，Nature.1989；337387)。已經(jīng)表明向小鼠內(nèi)靜脈內(nèi)注射陽離子脂質(zhì)-質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致DNA在肺中表達(Brigham等人，Am.J.Med.Sci.1989；298278)。參見，Osaka等人，J.Pharm.Sci.1996；85(6)612-618；San等人，Human Gene Therapy 1993；4781-788；Senior等人，Biochemicaet Biophysica Acta.1991；1070173-179)；Kabanov和Kabanov，Bioconjugate Chem.1995；67-20；Liu等人，Pharmaceut.Res.1996；13；Remy等人，Bioconjugate Chem.1994；5647-654；Behr，J-P.，Bioconjugate Chem.1994；5382-389；Wyman等人，Biochem.1997；363008-3017；Marshall等人的美國專利號5,939,401；Scheule等人的美國專利號6,331,524。
代表性的陽離子脂質(zhì)包括例如在美國專利號5,283,85和如美國專利號5,767,099中公開的那些，其公開內(nèi)容在此引用作為參考。在一個優(yōu)選的實施方案中，陽離子脂質(zhì)是美國專利號5,767,099中公開的N4-精胺膽固醇氨基甲酸酯(GL-67)。另外的優(yōu)選的脂質(zhì)包括N4-亞精胺膽固醇氨基甲酸酯(GL-53)和1-(N4-精胺)-2，3-二月桂基甘油氨基甲酸酯(GL-89)。
優(yōu)選地，對于病毒載體的體內(nèi)施用，采用了一種與病毒載體例如腺病毒載體聯(lián)合使用的適當(dāng)?shù)拿庖咭种铺幚?，以避免病毒載體和所轉(zhuǎn)染細胞的免疫失活。例如，可以施用免疫抑制細胞因子，如白介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)或抗-CD4抗體，以阻斷對病毒載體的體液或細胞免疫應(yīng)答?？紤]到這種情況，采用經(jīng)過工程改造而表達最小數(shù)量抗原的病毒載體是有利的。
劑量有效穩(wěn)定施用的ASM蛋白和/或內(nèi)源性ASM突變蛋白的小分子類似物的量可由本領(lǐng)域技術(shù)人確定?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法得到藥物代謝動力學(xué)和藥效動力學(xué)數(shù)據(jù)，如半壽期(t1/2)、血漿濃度峰值(Cmax)、達到血漿濃度峰值的時間(tmax)、通過曲線下面積(AUC)測量的替代ASM蛋白和小分子類似物的接觸和組織分布、以及關(guān)于小分子類似物與替代ASM蛋白結(jié)合的數(shù)據(jù)(親和常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)和效價)，以確定穩(wěn)定替代ASM蛋白而不抑制其活性，從而提供治療效果的適合的量。
通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法，例如細胞培養(yǎng)測定或使用實驗動物以確定LD50和ED50，可以確定組合物的毒性和治療效果。參數(shù)LD50和ED50在本領(lǐng)域是公知的，分別指對群體的50％是致死的和對群體的50％是治療上有效的化合物的劑量。毒性和療效的劑量比稱為治療指數(shù)，并且可以表達為比值LD50/ED50。治療有效量最初可以從細胞培養(yǎng)測定估計，并且在動物模型中進行公式計算以得到包括IC50在內(nèi)的循環(huán)濃度范圍?；衔锏腎C50濃度是實現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的濃度(例如，像從細胞培養(yǎng)測定中確定的那樣)。然后使用此種信息可以更精確地確定在特定個體例如人類患者中使用的合適劑量。
通過諸如高效液相層析(HPLC)或氣相層析的技術(shù)可以常規(guī)測定個體如患者的血漿中的化合物。
在任何治療中所使用的特定劑量會在該范圍內(nèi)有所變化，其變化依賴于諸如采用的特定劑型、采用的施用途徑、個體(例如患者)的情況等等因素。
根據(jù)現(xiàn)有的方法，替代ASM蛋白的濃度為0.05-5.0mg/kg體重，一般每周或每兩周施用。該蛋白質(zhì)可以在0.1μg/kg至約10mg/kg，優(yōu)選約0.1mg/kg至約2mg/kg的劑量下施用。例如，為了治療法布里病，臨床上批準(zhǔn)的重組α-Gal A的施用劑量一般為0.1-0.3mg/kg，每周或每兩周施用。在患者生命中定期重復(fù)施用蛋白質(zhì)是必要的。皮下注射保持較長時間的對藥物的系統(tǒng)接觸。皮下劑量優(yōu)選為每兩周或每周0.1-5.0mg α-Gal A每千克體重。ASM優(yōu)選靜脈施用，例如快速靜脈注射、慢速靜脈推注或連續(xù)靜脈注射。連續(xù)靜脈輸注(例如在2-6小時內(nèi))使血液中保持特定水平。
小分子類似物的最佳濃度可以根據(jù)穩(wěn)定組織或循環(huán)中體內(nèi)重組ASM蛋白但不阻止其活性所需要的量、小分子類似物在組織或循環(huán)中的生物利用度、和小分子類似物在組織和循環(huán)中的代謝來決定。例如，通過計算D-MAPP對ASM的IC50值確定小分子類似物D-MAPP的濃度，或者低于50μM?？紤]化合物的生物利用度和代謝，在IC50值左右或略高于IC50值的濃度可以根據(jù)對ASM活性的影響進行估計，例如提高ASM活性或延長替代ASM的ASM活性所需要的小分子類似物的量。
實施例通過下面的實施例對本發(fā)明進行進一步的描述。此種實施例的使用只是例證性的并且無論如何也不能限制本發(fā)明或者任何例證性術(shù)語的范圍和意義。同樣，本發(fā)明不限于任何此處描述的特別優(yōu)選的實施方案。的確，在閱讀本說明書后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然可對本發(fā)明進行許多改變和變化，并且可以在不偏離其精神和范圍的情況下進行。因此本發(fā)明僅由后附的權(quán)利要求書和權(quán)利要求書所賦予的等同物的全部范圍進行限制。
實施例1D-MAPP對ASM活性的恢復(fù)一種小分子，稱作D-MAPP的神經(jīng)酰胺類似物(結(jié)構(gòu)見圖1)，作為用于NPD的可能ASSC進行評價。
材料與方法D-MAPP獲自Matreya(Pleasant Gap，PA，目錄號1859)，并且在乙醇中重新配制為2mM的濃度。
重組ASM。為了確定能夠用于陪伴分子ASM的D-MAPP的非抑制濃度范圍，測定純化的野生型ASM的Ki。通過公開的方法(He等人，Biochim et Biophys Acta.1999；1432251-264)，從過量表達中國倉鼠卵巢細胞的培養(yǎng)基中純化重組人ASM(rASM)。簡要地說，包括通過DEAE Sephacel、伴刀豆球蛋白A和Superose 12層析。D-MAPP獲自Matreya Inc(Pleasant Gap，PA目錄號1859)。
抑制測定。對于使用純酶的體外研究，一份母液在氮氣下干燥，然后重懸浮在含有熒光ASM底物BODIPY鞘磷脂(Molecular Probes，Eugene OR)的乙酸鈉緩沖液中。超聲處理該溶液，加入一份純rASM。底物在試驗中的終濃度為100微摩爾(μM)，D-MAPP的濃度為10-500μM。測定如前所述進行(He等人，Biochem.2003；314116-120)。
獲得(知情同意)具有兩個拷貝R496L突變的A型NPD皮膚成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞，并在含有10％熱滅活的胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO)中培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中加入不同濃度的D-MAPP(5-50μM)，將細胞溫育不同的時間。在溫育結(jié)束時，將細胞用胰蛋白酶消化，用乳膠刮刷收獲，用鹽水洗滌，重懸浮在10mMTris緩沖液，pH 7.0中。通過超聲處理制備細胞提取物，將碎片超聲處理，如以前所述(He等人，Biochem.2003；314116-120)，利用BODIPY鞘磷脂用上清液測定ASM的活性。
結(jié)果圖4顯示D-MAPP以約50μM的Ki抑制純ASM的活性。圖5顯示當(dāng)來自含有兩個拷貝R496L突變的A型NPD患者的培養(yǎng)皮膚成纖維細胞在D-MAPP(5-50μM)存在下溫育三天時，殘余ASM活性提高最高達3倍，或者提高至正常值的約3％(從不到正常值1％的起始活性起)。在約10μM時發(fā)現(xiàn)最大提高，在該濃度時對細胞生長或生存力沒有有害作用。因此，D-MAPP，野生型ASM活性的一種小分子抑制劑，可以用作NPD治療的ASSC。
實施例2新鞘磷脂類似物對ASM活性的恢復(fù)材料與方法預(yù)期當(dāng)對NPD成纖維細胞施用時，此處所述的鞘磷脂類似物將提高正常的ASM活性，并且拯救突變ASM的活性，因為這些化合物是競爭性ASM抑制劑(即，它們減少底物結(jié)合——數(shù)據(jù)未示出)。這樣的鞘磷脂類似物顯示在圖2B-D中。一種優(yōu)選的化合物是圖2D所示的類似物。
重組ASM。如上對于D-MAPP所述測定圖2D中鞘磷脂類似物對于野生型重組ASM的Ki。
成纖維細胞測定。也如以上對于D-MAPP在NPD成纖維細胞中所述測定正常皮膚成纖維細胞中ASM抑制的Ki。
另外，具有兩個拷貝的R496L突變的A型NPD皮膚成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞在以上對于D-MAPP所述的條件下用約0.5-50μM的圖2B-D所示的鞘磷脂類似物處理5天。
結(jié)果鞘磷脂類似物以約70μM的Ki抑制純重組ASM的活性，而在20μM時將正常皮膚成纖維細胞中的ASM抑制大約90％。
預(yù)計這些類似物將與以上D-MAPP所示相似地提高野生型活性。也預(yù)計這些類似物將拯救突變成纖維細胞中突變ASM的活性。
實施例3向應(yīng)用酶替代或基因療法治療的尼曼-皮克病小鼠中共施用小分子類似物材料與方法與結(jié)果ASM缺乏小鼠(NPD KO小鼠)以前已經(jīng)產(chǎn)生(Dhami等人，LabInvest.2001；81(7)987-99)。這些小鼠的特征在于至10周齡時它們的肺空隙中的細胞數(shù)顯著高于正常小鼠，主要由增大的和通常多核的巨噬細胞組成。這些小鼠可以在實驗中應(yīng)用，該實驗設(shè)計為用來證明無論單獨應(yīng)用還是與基因療法或酶替代療法聯(lián)合應(yīng)用，小分子神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或核苷酸類似物都能用于治療NPD病。
Genzyme公司以及Transkaryotic Therapies(TKT)已經(jīng)開發(fā)了用于幾種溶酶體貯積病的酶替代療法。預(yù)期向通過輸注替代酶進行治療的ASM敲除小鼠中共施用D-MAPP或其他神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸類似物(即ASSC)，如此處所述的那些，會提高替代酶的體內(nèi)穩(wěn)定性，例如半壽期，因為ASSC穩(wěn)定了酶并且防止降解。按照以前對于法布里病KO小鼠所述(Ioannu等人，Am J Hum Genet.2001；6814-25)類似的方案，在輸注野生型ASM后向KO小鼠經(jīng)口施用小分子類似物。在一段時間之后測定包括心臟、腎臟、脾臟、肝臟和肺在內(nèi)的多種組織和血清中的ASM活性，并且將其與沒有接受ASCC的對照小鼠和只接受小分子類似物但沒有接受酶的小鼠的活性進行比較。延長的時間表明共施用ASSC能夠提高酶替代療法的療效。
向應(yīng)用基因療法治療的ASM KO小鼠中共施用小分子類似物會提高基因治療的療效，因為它顯著地提高治療性基因產(chǎn)物的表達，特別是通過防止在靶細胞的ER中聚集。遵循基因治療方案的KO小鼠接受溶解于飲用水中的如此處所述的D-MAPP或鞘磷脂或核苷酸類似物，并且在一段時間之后測定包括心臟、腎臟、脾臟、肝臟和肺在內(nèi)的多種組織和血清中的小分子類似物活性，并且將其與沒有接受小分子類似物的對照小鼠和接受小分子類似物但沒有接受基因治療的小鼠的活性進行比較。較高的酶活性和較長的保持時間表明共施用小分子類似物能夠提高基因治療的療效。
本發(fā)明不限于此處描述的特定實施方案的范圍。的確，除了此處所描述的那些，從前面的描述和附圖來看，本發(fā)明的多種改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些改變處于后附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
專利、專利申請、出版物、程序等等在整個本申請中被引用，其公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。
序列表SEQUENCE LISTING<110>西奈山醫(yī)學(xué)院Schuchman，Edward H.
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Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro115 120 125Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr245 250 255
Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr275 280 285Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg290 295 300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305 310 315 320Ser Ile Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala355 360 365Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala385 390 395 400Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg405 410 415Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu420 425 430
Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn435 440 445Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu500 505 510Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595 600 605
His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro610 615 620Arg Pro Leu Phe Cys625<210>2<211>629<212>PRT<213>人<400>2Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp20 25 30Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro50 55 60Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro
115 120 125Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr245 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr275 280 285Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg
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465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Leu485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu500 505 510Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595 600 605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro610 615 620Arg Pro Leu Phe Cys625<210>3
<211>629<212>PRT<213>人<400>3Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp20 25 30Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro50 55 60Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro115 120 125Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160
Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr245 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr275 280 285Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Pro Val Arg290 295 300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305 310 315 320Ser Ile Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His325 330 335
Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala355 360 365Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala385 390 395 400Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg405 410 415Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn435 440 445Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu500 505 510
Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595 600 605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro610 615 620Arg Pro Leu Phe Cys625<210>4<211>628<212>PRT<213>人<400>4Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15
Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp20 25 30Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro50 55 60Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro115 120 125Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190
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Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala385 390 395 400Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg405 410 415Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn435 440 445Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu500 505 510Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540
Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys His595 600 605Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro Arg610 615 620Pro Leu Phe Cys62權(quán)利要求
1.一種提高酸性鞘磷脂酶(ASM)蛋白質(zhì)活性的方法，該方法包括將該蛋白質(zhì)在藥物可接受的載體中接觸有效量的一種為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為磷核苷酸類似物的化合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述鞘磷脂類似物化合物具有下式I 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述鞘磷脂類似物化合物具有下式II 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)酰胺類似物化合物具有下式III 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié)構(gòu)代表
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM蛋白是一種突變ASM蛋白。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述突變蛋白是L302P(SEQ ID NO3)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述突變蛋白是R496L(SEQ ID NO2)。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述突變蛋白是ΔR608(SEQ ID NO4)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM蛋白是野生型ASM蛋白。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM是全長ASM。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM是具有酶活性的截短的ASM。
14.一種延長純化ASM蛋白在施用藥物可接受載體中ASM蛋白的個體中的半壽期和體內(nèi)活性的方法，該方法包括將ASM蛋白接觸有效量的一種為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為核苷酸類似物的化合物，其中該化合物是ASM的抑制劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是一種鞘磷脂類似物并且具有下式I 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式II 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且具有下式III 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié)構(gòu)代表
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述ASM蛋白與所述化合物共施用。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述共施用在同一制劑中。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述共施用在分別的制劑中。
23.一種提高宿主細胞產(chǎn)生重組ASM蛋白的方法，其中該宿主細胞包含表達載體，該表達載體包含編碼該重組ASM蛋白的核酸序列，該方法包括在含有有效量的神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物或為核苷酸類似物的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細胞，其中該化合物是ASM的抑制劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式I 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式II 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且具有下式III 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié)構(gòu)代表
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物
29.一種治療患尼曼-皮克病個體的方法，該方法包括向該個體共施用一種組合物，該組合物含有純化的野生型ASM和ASM活性提高量的為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為核苷酸類似物的化合物，其中該化合物是ASM的抑制劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式I 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式II 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且具有下式III 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié)構(gòu)代表
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述個體患有A型尼曼-皮克病。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述個體患有B型尼曼-皮克病。
37.權(quán)利要求29的方法，其中所述個體具有編碼突變ASM蛋白的突變ASM基因。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述突變蛋白是L302P(SEQ ID NO3)。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述突變蛋白是R496L(SEQ IDNO2)。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述突變蛋白是ΔR608(SEQ ID NO4)。
41.一種提高個體細胞中重組ASM蛋白體內(nèi)表達水平的方法，其中該蛋白由已經(jīng)導(dǎo)入細胞內(nèi)的表達載體表達，該方法包括向該個體施用有效量的為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為核苷酸類似物的化合物，其中該化合物是ASM的抑制劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式I 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式II 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且具有下式III 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié)構(gòu)代表
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述載體是病毒載體。
48.權(quán)利要求41的方法，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所述個體具有編碼突變ASM蛋白的突變ASM基因。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述突變蛋白是L302(SEQ ID NO3)。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述突變蛋白是R496L(SEQ IDNO2)。
52.權(quán)利要求48的方法，其中所述突變蛋白是ΔR608(SEQ ID NO4)。
53.一種治療已患尼曼-皮克病或者在遺傳學(xué)上易發(fā)展為尼曼-皮克病的個體的方法，包括向該個體施用一種組合物，該組合物含有ASM活性提高量的為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為核苷酸類似物的化合物，其中該化合物是ASM的抑制劑。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述陪伴分子是下式I的鞘磷脂類似物化合物 其中每一個R如果存在則獨立任選地是取代的C1-10烷基、鹵素、NO2、CN、OH、C1-6烷氧基；R1、R2和R3獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基；n是0-5，m是1-3。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述化合物是下式II的鞘磷脂類似物 其中R1、R2、R3和m如上所述定義，R4是C10-20烷基，R5和R6獨立地是H、C1-10烷基、芳基或芳烷基。
56.權(quán)利要求53的方法，其中所述化合物是下式III的神經(jīng)酰胺類似物 其中Rn如上所述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié)構(gòu)代表
58.權(quán)利要求53的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物
59.權(quán)利要求53的方法，其中所述突變蛋白是L302(SEQ ID NO3)。
60.權(quán)利要求53的方法，其中所述突變蛋白是R496L(SEQ IDNO2)。
61.權(quán)利要求53的方法，其中所述突變蛋白是ΔR608(SEQ ID NO4)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療患酸性鞘磷脂酶缺陷型尼曼－皮克病(即A型或B型尼曼－皮克病)個體的方法，是通過施用小分子作為與該病相關(guān)的缺陷酸性鞘磷脂酶(ASM)的特異性分子“陪伴分子”。該分子是神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸的類似物。
文檔編號A61K31/685GK1897957SQ200480039029
公開日2007年1月17日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者愛德華·H·舒克曼, 羅伯特·J·德斯尼克 申請人:紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院