專利名稱：新的止痛化合物,含有它的提取物和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有止痛性能的新化合物和含有該新化合物的提取物。這些化合物是從玉蕊屬植物中獲得的。
背景技術(shù)：
玉蕊屬構(gòu)成玉蕊科(Lecythidaceae)家族中最大的植物種屬，廣泛地分布在亞洲熱帶區(qū)域、馬來西亞和太平洋。[1]玉蕊屬是尺寸范圍從2m至超過25m的樹木或灌木。已知在澳大利亞北部有四個(gè)種類出現(xiàn)[2]，其中三個(gè)，即玉蕊[(L.)Spreng]，B.calyptrate[(Mietrs)R.Br.ex Bailey]和濱玉蕊[(L.)Kurtz]已知僅來自北昆士蘭州。第四種澳大利亞種屬，銳棱玉蕊(B.acutangula)[(L.)Gaertn]有廣泛的分布，從北昆士蘭州到西北澳大利亞橫跨北澳大利亞都可發(fā)現(xiàn)。銳棱玉蕊(B.acutangula)進(jìn)一步可分為兩個(gè)亞種，B.acutangula ssp.acutangula和B.acutangula ssp.spicata[1]。后者在玉蕊屬分布區(qū)域內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)，而前者僅限于北澳大利亞。
在其整個(gè)分布區(qū)域內(nèi)，許多玉蕊屬物種已經(jīng)被當(dāng)?shù)厝嗣裼糜诙喾N用途。玉蕊屬物種的一個(gè)常見用途是用作魚毒[2-5]。已經(jīng)報(bào)道有幾種物種用作魚毒，包括銳棱玉蕊(B.acutangula)[2-4，6-11]，B.speciosa[5]，玉蕊[2，3，10-12]，B.asiatrica[2，3，5，10，11]和B.calyptrate[10]。盡管該樹的果實(shí)和樹皮經(jīng)常用作魚毒[2，3，5-12]，但也使用其他幾種植物器官，包括葉[8，11]、根[4，8，9，11]、種子[2，9.10，12]和木質(zhì)部[12]。已知幾種物種的葉、果實(shí)和種子是可食用的[3，9，12-15]。
已經(jīng)報(bào)道玉蕊屬物種還有其他幾種特性和用途。包括由于含有鞣酸，將玉蕊用作鞣劑[3，12，16]以及作為殺蟲劑，據(jù)報(bào)道效力大約為煙堿的一半左右[12，16，17]。玉蕊屬的果實(shí)已經(jīng)被用來給野豬下毒[12]。另外玉蕊的種子和B.asiatica的果實(shí)已經(jīng)被用來自殺，以及具有“殺人意圖”的使用[11，12]，椰子汁是解毒劑。這些有毒的特性是由于具有HCN，已經(jīng)證明在B.asiatica的核中有很高的濃度[11]。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多玉蕊屬物種可廣泛用作中藥，銳棱玉蕊(B.acutangula)的果實(shí)被稱為“保姆水果(Nurse fruit)”[6]。該植物的所有部分都已經(jīng)被使用，并已用于內(nèi)服和外用。應(yīng)用制劑的制備包括干燥和粉化，用熱或冷水、加熱或榨汁提取[3，11，12.16，18]。如所期望地外用方面的應(yīng)用集中在皮膚疾病上。如一般傷口，風(fēng)濕、濕疹、潰瘍、疥瘡、癬、癬菌病、瘙癢、炎癥的疾病，即使是麻風(fēng)病都已經(jīng)使用玉蕊屬物種進(jìn)行治療[3，11，12，16，18]。種子粉末已經(jīng)用作嗅劑來緩解頭痛，而加熱的種子是有香氣的，已經(jīng)在腹痛和分娩中輔助使用[3]。也有報(bào)道外用輔助治療眼炎，支氣管炎和胸痛、哮喘、發(fā)熱、腹痛、胃腸脹氣、非性病性尿道狹窄、咽喉痛和胃痛[3，6，11，12.16，18]。
通常內(nèi)服玉蕊屬用來緩解腹瀉、痢疾和胃痛，作為催吐劑，祛痰劑和緩瀉劑[3，6，8-12，16，18，19]。一些物種的制劑被用作苦補(bǔ)劑使用[3，8，9，11，18，19]，玉蕊的種子被用作驅(qū)蟲劑[18]。
在澳大利亞，玉蕊屬物種、特別是銳棱玉蕊(B.acutangula)[4]被廣泛用作魚毒藥，但與植物分布的其他區(qū)域相比，很少將玉蕊屬物種制成藥物來使用。在澳大利亞，玉蕊屬提取物已經(jīng)被用于皮膚疾病如創(chuàng)傷、燙傷和水痘(玉蕊和銳棱玉蕊(B.acutangula))、胸痛和發(fā)熱(B.calyprata)、眼炎、腹痛、分娩以及催吐(銳棱玉蕊(B.acutangula))[10，11，16，18]。玉蕊屬用途的更詳細(xì)說明可見文獻(xiàn)(例如[3，12，18])。
盡管玉蕊屬過去作為藥用植物廣泛應(yīng)用，但令人驚奇的是其生物活性成分的化學(xué)特性并未引起注意。
B.insingnis、B.vriesei和玉蕊中存在的皂角苷樣糖苷早在1898年就被證實(shí)(在[6]中報(bào)道)。隨后，在1901年，從B.speciosa中分離了一種皂角苷，水解過程中產(chǎn)生了葡萄糖和玉蕊配質(zhì)(barringtogenin)(在[20]中報(bào)道，而[6]報(bào)道該物種為B.spinosa)。同一作者也報(bào)道了存在第二種皂角苷配基，稱為玉蕊精亭(barringtogenitin)。Nozoe從B.asiatica的種子中分離了A1-barrinin和A1-barrigenin，隨后報(bào)道A1-barrinin的皂角苷含有葡萄糖酸、d-葡萄糖、d-半乳糖和甲基戊糖[21，22]。A1-barrigenin的堿解產(chǎn)生了巴豆酸和一種新的皂角苷配基，A1-玉蕊醇[23]。A2-barrigenin的乙?；部煞蛛x到第二種皂角苷配基，A2-玉蕊醇[23]。
據(jù)報(bào)道在銳棱玉蕊(B.acutangula)的種子、葉和樹皮中存在高濃度的皂角苷，并鑒定了三種皂角苷配基[20]。隨后許多研究工作主要目標(biāo)是分離和闡明這些皂角苷的特性。
由Cole等人[24]在1955年首先歸屬的A1-玉蕊醇結(jié)構(gòu)顯示在圖1中。
在二十世紀(jì)五十年代，對(duì)皂角苷和皂角苷配基的興趣不斷增加，出現(xiàn)了大量出版物，主要使用降解技術(shù)來歸屬和修正其結(jié)構(gòu)。在A1-和A2-玉蕊醇后首先從玉蕊屬物種中分離的玉蕊醇(barrigenol)是玉蕊精醇和從玉蕊果實(shí)中分離的玉蕊精酸(barringtogenic acid)[25]，其結(jié)構(gòu)顯示在圖2中。
銳棱玉蕊(Barringtonia acutangula)一直是新皂角苷和皂角苷配基的來源。從該物種的果實(shí)中，還分離了一系列化合物，玉蕊精醇B、C、D和E，其結(jié)構(gòu)已被探明[8，26-34]。
玉蕊精醇C從銳棱玉蕊(B.acutangula)果實(shí)中分離，其結(jié)構(gòu)通過以往所描述的化學(xué)技術(shù)來歸屬(圖4)(例如[8，26，27，31-34])。
玉蕊精醇D也是從銳棱玉蕊(B.acutangula)果實(shí)中分離的，由Barua等人[26]所述，其結(jié)構(gòu)由Chakraborti和Barua提出[29，30](圖5)。
玉蕊精醇E從銳棱玉蕊(B.acutangula)的樹枝中分離，其結(jié)構(gòu)是采用質(zhì)譜和化學(xué)信息來歸屬的(圖6)[8，28]。要注意的是玉蕊精醇E可能是天然分離的三萜苯甲酸酯的第一個(gè)實(shí)例[8，28]。
從銳棱玉蕊(B.acutangula)中分離的其他化合物包括tanginol[8，35，36]如圖7所示，以及在圖8中顯示的barrinic酸[37]。
從銳棱玉蕊(B.acutangula)中還已經(jīng)分離了幾種化合物，其結(jié)構(gòu)部分使用NMR歸屬。它們包括barrigenic酸、barrinic酸(果實(shí))的19β-異構(gòu)體[36]和acutangulic和tangulic酸(葉)(圖9)[38-40]。
直至1991年[41]，來自銳棱玉蕊(B.acutangula)的完整皂角苷結(jié)構(gòu)被公布。光譜和化學(xué)數(shù)據(jù)得到的結(jié)構(gòu)歸屬為2α，3β，19α-三羥基-齊墩果烷(olean)-12-烯-雙酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(圖10)[41]。
其結(jié)構(gòu)公布后不久，同一研究小組公布了來自銳棱玉蕊(B.acutangula)種子的另外三種皂角苷玉蕊皂苷(Barringtoside)A，B和C的全部結(jié)構(gòu)(圖11)[42]。
盡管玉蕊屬物種已經(jīng)用作藥用植物治療許多種疾病，但關(guān)于任何分離的三萜類物質(zhì)生物活性的信息都查不到。但已知三萜類物質(zhì)具有一些抗炎活性(例如[43，44])。玉蕊屬樹皮的收斂特性歸因于鞣酸的存在[16，18]，鞣酸已知也具有抗微生物特性(例如[45])。玉蕊屬物種普遍用作皮膚瘡瘍，創(chuàng)傷和其他皮膚疾患的治療藥劑就是由于這些鞣酸的存在。已報(bào)道的這些樹制品誘導(dǎo)的許多效應(yīng)可由類固醇活性來解釋(例如抗炎，止喘，抗風(fēng)濕等)，玉蕊屬物種提取物中β-和(-谷甾醇和豆甾醇-3β-O-D-糖苷的存在可以解釋其中的一些活性。人們也熟知皂角苷可發(fā)揮廣泛的生物學(xué)活性，許多可以解釋所觀察到的以前概述的藥學(xué)特性(例如[46，47])。
從前面的討論中很顯然，至今在玉蕊屬研究中發(fā)現(xiàn)的化合物的優(yōu)勢基團(tuán)是皂角苷。皂角苷是次級(jí)代謝產(chǎn)物中一個(gè)很重要的類別，廣泛存在于植物和低等海洋生物中。已有報(bào)道所有被調(diào)查的植物中79％含有皂角苷[48]。也有人提出皂角苷是植物作為防御物質(zhì)產(chǎn)生的[48]。盡管從低等海洋生物中分離的皂角苷的數(shù)目不斷增加，但到目前為止已經(jīng)分離的是從棘皮動(dòng)物門中分離的，特別是海參(海參綱)和海星(海星綱)[46]。
皂角苷主要由三種成分構(gòu)成，苷元(配基或皂角苷配基)如三萜；類固醇或甾體生物堿；一條或多條糖鏈，一般為D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖L-阿拉伯糖D-木糖和D-巖藻糖以及有時(shí)一些酸類，如當(dāng)歸酸和巴豆酸[46，47，49]。根據(jù)附著于苷元上糖鏈的數(shù)目皂角苷進(jìn)一步被分為單、雙或三-desmoside[47]。
皂角苷的溶血、殺軟體動(dòng)物和殺魚活性已經(jīng)被確定，并在植物和動(dòng)物提取物生物導(dǎo)向分離中用作檢測技術(shù)(例如[47，48，50，51])。但溶血活性變化很大或可能完全缺失，殺軟體動(dòng)物活性有點(diǎn)依賴于皂角苷的結(jié)構(gòu)[46，47]。如所期望的，關(guān)于皂角苷的生物學(xué)和藥學(xué)特性已經(jīng)有許多出版物，其實(shí)例見[46，47]。
在少量皂角苷中證明具有止痛活性。下面是發(fā)現(xiàn)具有止痛效應(yīng)的一些皂角苷的實(shí)例。使用醋酸刺激扭體試驗(yàn)顯示，barbatoside A(ED5095mg/kg)和B(ED5050mg/kg)，來自五彩石竹的quallic acid的糖苷比乙酰水楊酸更有活性(ED50125mg/kg)[52]。以5mg/kg腹膜內(nèi)注射(Ip)來自鐮果扁豆(Dolichos falcatus)的皂角苷制劑顯示可對(duì)小鼠接觸55℃引起的疼痛產(chǎn)生明顯地止痛作用[53]。當(dāng)以2g/kg的劑量皮下注射(sc)時(shí)，桔梗的提取物也可誘發(fā)小鼠痛覺喪失[54]?；钚猿煞种槐徽J(rèn)為是platicodin，小鼠接受的劑量相當(dāng)于160mg/kg。其作用相當(dāng)于100-200mg/kg阿斯匹林。注射來自田七的總皂角苷制劑(ip，100-250mg/kg)發(fā)現(xiàn)作用比嗎啡和1-延胡索乙素更快，但持續(xù)時(shí)間短，相當(dāng)于氨基比林(150mg/kg)[55]。也要注意皂角苷制劑可誘發(fā)鎮(zhèn)靜作用，降低戊巴比妥對(duì)睡眠誘導(dǎo)的ED50，延長硫噴妥誘導(dǎo)的睡眠，顯示與氯丙嗪有協(xié)同的CNS抑制作用[55]。從長筒瞿麥分離并定性了許多種石竹苷[56-58]。石竹苷A和B發(fā)現(xiàn)以10和30mg/kg皮下注射(sc)可顯著抑制醋酸刺激的扭體反應(yīng)，石竹苷B更有效[56]。此外，Gomes等人[59]對(duì)從Maesa chisa var.augustifolia中獲得的糖苷部分的藥理學(xué)作用進(jìn)行了詳細(xì)的檢驗(yàn)，證實(shí)在小鼠的扭體試驗(yàn)中可引起痛覺喪失。在對(duì)苯醌酮(p-phenylquinonone)誘發(fā)的扭體反應(yīng)中觀察到33％的抑制，相比在醋酸誘發(fā)的扭體反應(yīng)中觀察到52％的抑制。相比較，阿斯匹林可抑制85％對(duì)苯醌酮誘發(fā)的扭體，80％醋酸誘發(fā)的扭體。在加熱電爐和甩尾試驗(yàn)中缺少舉尾現(xiàn)象和不活躍表明糖苷部分產(chǎn)生的痛覺喪失與麻醉藥產(chǎn)生的效果不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，不是以最廣義的形式，提供了分子式(I)的新化合物 其中
R2選自氫、羥基、O-烷基、O-烯基、O-苯甲?；?、O-聯(lián)苯甲?；?、O-烷?；?、O-烯酰基(alkenoyl)，O-芳基、O-雜環(huán)、O-雜芳基或 其中R5和R7各自獨(dú)立地選自氫、烷?；?、烯?；?、聯(lián)苯甲?；?、苯甲?；?、或苯甲酰烷基取代的烷酰基；R3選自羥基、O-烷酰基、O-烯酰基、O-苯甲酰基、O-聯(lián)苯甲?；-烷基、O-烯基、O-芳基、O-雜環(huán)或O-雜芳基；R4選自-CH2OH、COOH、CH2OCOCH3，COO烷基、COO芳基、CH2COO烷基、COO-雜環(huán)、COO-雜芳基、CH2-O芳基、CH2O雜環(huán)或CH2O雜芳基；R6選自氫或 R1選自氫或烷基；或其藥學(xué)可接受的鹽類，條件是當(dāng)R2為OH，R3為OH，R4為CH2OH，R6為吡喃木糖基，R1不能為4。
術(shù)語“烷基”是指線性、支鏈、環(huán)狀和二環(huán)結(jié)構(gòu)及其組合，具有1至18個(gè)碳原子。烷基基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、s-和t-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和類似物。更優(yōu)選地是烷基選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基，s-和t-丁基、戊基和己基。
術(shù)語“烯基”是指不飽和的線性或支鏈結(jié)構(gòu)及其組合，具有1至7個(gè)碳原子。烯基基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、s-和t-丁烯基、戊烯基、己烯基。
“烷酰基”是指直鏈或支鏈構(gòu)型，具有1-8個(gè)碳原子的烷?；鶊F(tuán)。優(yōu)選烷?；x自乙?；?、丙?；?、丁酰基、異丁?；⑽祯；图乎；?。更優(yōu)選烷?；x自乙?；；?、丁?；彤惗□；?。
“烯酰基”是指烯基?；?alkenylcarbonyl)，其中烯基如上所規(guī)定。優(yōu)選烯?；x自戊烯酰基、己烯?；蚋；?。更優(yōu)選烯?；x自戊烯?；?巴豆?；?或己烯?；?當(dāng)歸?；?。
術(shù)語“苯甲酰烷基取代的烷?；庇脕碇赣弥辽僖粋€(gè)苯甲?；椭辽僖粋€(gè)烷基取代的直鏈或支鏈C1-C6烷酰基，其中所述的苯甲?；街谥辨溁蛑ф淐1-6烷基上。優(yōu)選苯甲酰烷基取代的烷酰基是苯甲酰甲基異丁酰基。
“雜環(huán)”是指具有1至4個(gè)雜原子的非芳香環(huán)，所述的環(huán)與第二個(gè)環(huán)分離或稠合，第二個(gè)環(huán)選自含有0至4個(gè)雜原子、芳基和雜芳基的3至7元脂環(huán)，其中所述的雜原子獨(dú)立選自O(shè)、N或S。雜環(huán)的非限制性實(shí)例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、四氫呋喃基、咪唑啉基、硫嗎啉基或類似物。
“芳基”是指含有1-3個(gè)苯環(huán)的6-14元碳環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)。如果存在兩個(gè)或更多個(gè)芳香環(huán)，這些環(huán)則稠合在一起，這樣臨近的環(huán)共用一個(gè)公共鍵。實(shí)例包括苯基和萘基。芳基基團(tuán)可被獨(dú)立地選自鹵素、烷基或烷氧基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代。
術(shù)語“雜芳基”在此使用是代表一個(gè)含有具有1-4個(gè)雜原子的單環(huán)的5-10元芳香環(huán)系統(tǒng)，上述雜原子選自O(shè)、S或N。雜芳基包括但不限于呋喃基、二嗪基(diazinyl)、咪唑基、異噁唑基、吡啶基、吡咯基、噻唑基、三嗪基和類似物。
優(yōu)選R2是氫、苯甲?；⒙?lián)苯甲?；?、巴豆酰基、或 其中所述的R5和R7選自氫、巴豆酰基、苯甲?；?、或苯甲酰烷基取代的烷酰基。
優(yōu)選R3選自羥基、乙?；⒈郊柞；?、聯(lián)苯甲?；?、異丁?；虬投辊；?br> 優(yōu)選R4選自-CH2OH、O-乙?；蛄u基。
優(yōu)選如式(I)的化合物選自a.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?-4-苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C；b.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲酰玉蕊精醇C；c.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲?；?28-O-乙酰玉蕊精醇C；d.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲酰基-22-O-異丁?；袢锞糃；e.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃甲基葡萄糖醛酸基-21，22-O-聯(lián)苯甲酰玉蕊精醇C；f.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21，22-O-聯(lián)苯甲酰玉蕊精醇C；g.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃甲基葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲?；?22-O-巴豆酰玉蕊精醇C；h.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲?；?22-O-巴豆酰玉蕊精醇C；i.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃甲基葡萄糖醛酸基-21，22-O-巴豆酰玉蕊精醇C；j.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21，22-O-巴豆酰玉蕊精醇C；k.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-22-O-苯甲酰玉蕊精醇C；l.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3，4-聯(lián)苯甲酰基-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C；m.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3，4-聯(lián)苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-乙酰玉蕊精醇C；n.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲?；?2-甲基丁酰基)-4-巴豆?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C；o.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-巴豆?；?4-(3-苯甲酰基-2-甲基丁?；?-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C；
p.3-O-β-D-吡喃半乳糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲?；?2-甲基丁酰基)-4-苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C；或q.3-O-β-D吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲?；?2-甲基丁酰基)-4-苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-乙酰玉蕊精醇C。
術(shù)語“藥學(xué)可接受的鹽類”在此使用是指從毒理學(xué)上對(duì)全身使用是安全的。藥學(xué)可接受的鹽類可選自下面的基團(tuán)，包括堿和堿土、銨、鋁、鐵、胺、氨基葡萄糖、膽堿、硫酸鹽、重硫酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、酒石酸氫鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、重碳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、萘磺酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、對(duì)苯二酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯(pectinate)和s-甲基蛋氨酸鹽、哌嗪和類似物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于一種含有一種或多種式(I)化合物的組合物，從玉蕊屬，優(yōu)選銳棱玉蕊(Barringtonia acutangula)的植物或植物部位中提取。植物的部位包括果實(shí)、種子、樹皮、葉、花和木材。優(yōu)選的植物部位選自樹皮、花或葉。更優(yōu)選的植物部位是樹皮。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于治療和/或控制疼痛的藥學(xué)組合物，該組合物含有有效量的一種或多種如式(I)的化合物以及一種藥學(xué)可接受的載體。
劑型包括片劑、分散劑、懸液、注射劑、溶液、糖漿劑、錠劑、膠囊、栓劑、氣霧劑、透皮貼劑和類似物。這些劑型也可包括為專門設(shè)計(jì)或改進(jìn)的注射或植入裝置以用于受控釋放的藥學(xué)組合物。治療藥物的受控釋放可通過在藥物上包被，例如疏水聚合物來實(shí)現(xiàn)，該聚合物包括丙烯酸樹脂、高級(jí)脂肪醇、聚乳酸和聚羥基乙酸和某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素。另外，受控釋放可受其他聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球的影響。
用于全身用藥的藥學(xué)可接受載體也可摻入進(jìn)本發(fā)明的組合物中。
藥學(xué)組合物適合含有一種藥學(xué)可接受的賦形劑?！八帉W(xué)可接受的賦形劑”是指可安全用于全身用藥的固體或液體填充物、稀釋液或包封物質(zhì)。根據(jù)給藥的特殊途徑，可使用本領(lǐng)域中熟知的各種載體。這些載體或賦形劑選自糖類、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石，硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水、或無熱原水。
可采用任何合適的給藥途徑為患者提供本發(fā)明的藥學(xué)組合物。例如，可采用口服、直腸、胃腸外、舌下、頰、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、透皮和類似途徑。
適合給藥的本發(fā)明藥學(xué)組合物可以獨(dú)立單位的形式存在，如瓶、膠囊、小袋或片劑，每個(gè)單位含有預(yù)定量的本發(fā)明的一種或多種藥學(xué)活性化合物，作為粉末或顆粒、或溶液或水性液體、非水性液體的懸液、水包油乳液或油包水乳液的形式。這些組合物可通過任何制藥方法進(jìn)行制備，但所有的方法應(yīng)包括將本發(fā)明的一種或多種藥學(xué)活性化合物與由一種或多種必需成分組成的載體結(jié)合起來的步驟。通常，組合物可均勻地，直接地將本發(fā)明的藥劑與液體載體或磨碎的固體載體，或兩者混合，然后如果需要，將產(chǎn)物加工成形為所需的外觀形式。
本發(fā)明如式(I)的和組合物的活性化合物存在的量足以治療和/或控制疼痛。分子式(I)的化合物和含有該化合物的藥學(xué)組合物的合適劑量很容易通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來確定，但可以在0.002mg/kg至5.0mg/kg的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)。
還是在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種治療和/控制疼痛的方法，包括給需要該種治療的患者提供一種或多種根據(jù)分子式(I)的化合物，其量能有效止痛。
還是在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在制造治療和控制疼痛的藥物過程中使用一種或多種根據(jù)分子式(I)的化合物的應(yīng)用。


圖1顯示了A1-玉蕊醇的結(jié)構(gòu)；圖2顯示了玉蕊精酸和玉蕊精醇；圖3顯示了玉蕊精醇B的(a)原始和(b)修正結(jié)構(gòu)；圖4顯示了玉蕊精醇C的結(jié)構(gòu)；圖5顯示了玉蕊精醇D的結(jié)構(gòu)；圖6顯示了玉蕊精醇E的結(jié)構(gòu)；
圖7顯示了來自銳棱玉蕊(B.acutangula)的化合物；圖8顯示了barrinic酸的結(jié)構(gòu)；圖9顯示了來自銳棱玉蕊(B.acutangula)的化合物包括acutangulic酸、tangulic酸和barringenic酸；圖10顯示了2a，3β，19a三羥基-齊墩果烷-12-烯雙酸28-O-β-D吡喃葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)；圖11顯示了玉蕊皂苷A(Barringtoside A)、玉蕊皂苷B(BarringtosideB)和玉蕊皂苷C(Barringtoside C)的結(jié)構(gòu)；圖12顯示了在福爾馬林實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照的正常梳理(grooming)反應(yīng)；圖13顯示了福爾馬林實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照值 圖14顯示了嗎啡的劑量對(duì)照曲線 圖15顯示了制備粗制皂角苷混合物的示意圖；圖16顯示了水提取物不溶的活性部分酸性和堿性水解示意圖；圖17顯示了銳棱玉蕊(B.acutangula)的花和葉的止痛活性 圖18顯示了粗制水提取物的止痛活性 圖19顯示了水提取物的粗制可溶(n＝9)和不溶(n＝4)部分的止痛活性 圖20顯示了水提取物的劑量反應(yīng)曲線 圖21顯示了制備性凝膠滲透柱；圖22顯示了TSK-4a的劑量反應(yīng)曲線 圖23顯示了TSK-4a的C18分離；圖24顯示了TSK-4a的C18制備性分離；圖25顯示了H2O提取物的制備性C18色譜圖；圖26顯示了關(guān)于化合物F70.2.5.2的不同餾分的編號(hào)系統(tǒng)大綱；圖27顯示了在70％MeOH(F70)洗脫餾分的分離；圖28顯示了餾分70.2(40％MeCN在1％TFA中)的分離；圖29顯示了F.70.2.6的色譜圖；圖30顯示了餾分F.70.2.2在254nm(左)和233nm(右)的分離；圖31顯示了餾分F70.2.5在220nm(左)和233nm(右)的分離；
圖32顯示了餾分F70.3的分離；圖33顯示了F.70.3.5和F70.3.7的色譜圖；圖34顯示了餾分F.70.3.4(主要是單一化合物)的分析性分離；圖35顯示了F70.4的分離；圖36顯示了F70.4.2的分離；圖37顯示了F70.4.3的分離；圖38顯示了F.80.2和F.80.3峰消失的制備性色譜圖；圖39顯示了F.80.4的制備性色譜圖；圖40顯示了使用苯基反相柱分離餾分F.80.6；圖41顯示用于水解步驟中的TLC板，顯示了用于F.70.3.6分離和結(jié)構(gòu)剖析的糖類標(biāo)準(zhǔn)品；圖42顯示了F.70.3.6的紫外線光譜；圖43顯示了F.70.3.6的FRIR光譜；圖44顯示了化合物F.70.3.6的1H-NMR；圖45顯示了化合物F.70.3.6的13C-NMR；圖46顯示了化合物F.70.3.6結(jié)構(gòu)的全部歸屬；圖47顯示了F.70.3.6的陰離子HR-ESMS；圖48顯示了化合物F.70.2.52；圖49顯示了化合物F.70.2.3；圖50顯示了化合物F.70.3.2；圖51顯示了化合物F.70.3.4.2；圖52顯示了化合物F.70.4.3.5.2/F.80.6.7；圖53顯示了化合物F.80.6.4/F.70.4.2.4.2；圖54顯示了化合物F.70.4.3.4.2/F.80.6.6；圖55顯示了化合物F.70.4.2.3/F.80.6.3；圖56顯示了化合物F.70.4.3.2.2；圖57顯示了化合物F.80.6.2；圖58顯示了化合物F.70.3.3.2.2b；圖59顯示了化合物F.70.2.6.2；圖60顯示了化合物F.70.3.4.5；圖61顯示了化合物F.70.3.5a；
圖62顯示了化合物F.70.3.5b；圖63顯示了化合物F.70.3.7.2；圖64顯示了化合物F.80.4.5.2/F.80.5.2；圖65是FCA-大鼠(A)同側(cè)(發(fā)炎)和(B)對(duì)側(cè)(未發(fā)炎)爪子平均(±SEM)縮爪閾值對(duì)時(shí)間曲線的圖表；圖66是FCA-大鼠(A)同側(cè)(發(fā)炎)和(B)對(duì)側(cè)(未發(fā)炎)爪子平均(±SEM)縮爪閾值對(duì)時(shí)間曲線的圖表；圖67是接受單次鹽水靜脈推注的FCA-處理成年雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝3)同側(cè)(發(fā)炎)和對(duì)側(cè)(未發(fā)炎)爪子平均(±SEM)縮爪閾值對(duì)時(shí)間的曲線；圖68是在FCA-大鼠同側(cè)爪子靜脈推注F70.3.2和F70.3.6給藥抗傷害感受效應(yīng)的平均(±SEM)劑量反應(yīng)曲線；和圖69是FCA處理之前和之爪子體積的圖表。
實(shí)驗(yàn)章節(jié)A章-疼痛測定福爾馬林實(shí)驗(yàn)福爾馬林實(shí)驗(yàn)包括皮下注射小量的福爾馬林至大鼠和小鼠的前或后爪，記錄對(duì)注射的行為反應(yīng)作為疼痛反應(yīng)的測量指標(biāo)。對(duì)這種方法的改良見Dubuisson和Dennis[60]的描述，大鼠和貓的行為反應(yīng)被詳細(xì)描述。獨(dú)立產(chǎn)生的疼痛被描述為開始強(qiáng)烈的、尖銳的、針刺樣和燒灼樣的，在標(biāo)準(zhǔn)疼痛調(diào)查表中評(píng)分為3/5。大約4至5分鐘后這種強(qiáng)烈的疼痛改變?yōu)槌掷m(xù)的顫抖式疼痛，30至60分鐘后逐漸消失，在注射部位留下輕微的觸痛[60]。
本研究選擇福爾馬林實(shí)驗(yàn)有幾個(gè)原因。首先和最重要的，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)常在雜志如Pain上報(bào)道，要指出的是已經(jīng)克服了倫理學(xué)問題。也已經(jīng)證明在實(shí)驗(yàn)中觀察到兩個(gè)不同的時(shí)期，反映了兩個(gè)不同的傷害性反應(yīng)階段。第一階段，早期或急性的，在注射福爾馬林后立即開始，持續(xù)大約3-5分鐘。該階段被認(rèn)為是傷害感受器的直接化學(xué)刺激。該初始階段后緊接著是持續(xù)10-15分鐘的輕微活動(dòng)期。隨后，較晚的或緊張性階段開始，持續(xù)20-40分鐘。在早期和晚期顯示的反應(yīng)可使用已知的鎮(zhèn)痛劑來減少，如嗎啡、可待因、奈福泮和orphendarine[61]。晚期可受非類固醇類抗炎化合物，如消炎痛和萘普生，以及類固醇如地塞米松和氫化可的松的影響(例如，[61])。有趣的是，阿斯匹林和撲熱息痛在福爾馬林實(shí)驗(yàn)的兩期都顯示以劑量依賴的方式止痛[61]。
當(dāng)實(shí)施該實(shí)驗(yàn)時(shí)，幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，包括福爾馬林濃度、實(shí)驗(yàn)受試者和注射部位都需要考慮。
使用嗎啡和其它目標(biāo)化合物，如止痛劑在雄性鼠上進(jìn)行福爾馬林實(shí)驗(yàn)，以檢測該實(shí)驗(yàn)作為衡量鼠疼痛反應(yīng)的手段的可行性和可靠性。
方法和材料實(shí)驗(yàn)受試者使用重量為25-35g的雄性Quackenbush鼠。它們飼養(yǎng)在群養(yǎng)籠(400×300×130mm；Wiretainers)中，隨意進(jìn)食(標(biāo)準(zhǔn)大鼠/小鼠丸；NorcoFeeds)和飲水。對(duì)于短期的飼養(yǎng)，每籠最大可飼養(yǎng)15-16只鼠，而更長時(shí)間的飼養(yǎng)該數(shù)目要減少到少于每籠10只鼠。鋪墊材料為木材鋸末或更普通的再生紙片(Breeders Choice)。
在動(dòng)物的保存設(shè)施(holding facility)中保持12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，其中在06:00hr開燈。所有的檢測在光照階段進(jìn)行以盡量減小行為的晝夜變異。實(shí)驗(yàn)室的溫度保持在21℃，濕度范圍是45和65％之間。
在被用于檢測前剛獲得的動(dòng)物在保存設(shè)施(holding facility)中最少飼養(yǎng)兩天。
檢測化合物福爾馬林(AJax)以大約37.5％甲醛溶液提供，含有10％甲醇作為防腐劑。該母液用水稀釋1∶20，得到2％甲醛溶液(5％福爾馬林)用作傷害刺激劑。
嗎啡由Extal，Tasmanian Alkaloids Pty.Ltd.的一個(gè)部門惠贈(zèng)，用無菌等滲鹽水(0.9％)稀釋制成適當(dāng)?shù)臐舛取?br> 檢測方法由于缺少專門的檢測室，所有檢測在周末在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，時(shí)間與保存設(shè)施中光照階段的第一個(gè)小時(shí)一致。在檢測中選擇這些時(shí)間是為了盡量減小干擾，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)室中其他工作者的影響，并盡量減小由于白天的時(shí)間所引起的對(duì)反應(yīng)的任何變化。
至少在檢測前1小時(shí)將鼠帶到實(shí)驗(yàn)室中。隨后每只鼠被單獨(dú)置于空的群養(yǎng)籠中，也稱為觀察室。給它們30分鐘熟悉環(huán)境。在這個(gè)時(shí)間內(nèi)，和檢測中，不能進(jìn)食和進(jìn)水。
在給予福爾馬林前30分鐘以10mL/kg的體積腹腔注射嗎啡和其他目標(biāo)化合物。以最小的限量皮下(sc)注射20μL福爾馬林溶液至右爪子的背面。將鼠重新置于籠中，立即開始觀察。記錄的足底行為反應(yīng)是每5分鐘段記錄的動(dòng)物咬或舔注射足或腿的時(shí)間。每只動(dòng)物僅為檢測使用一次，隨后用C02安樂死。
結(jié)果.-對(duì)照.
進(jìn)行兩個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)可以得到與文獻(xiàn)相比較的結(jié)果。另外，記錄本底梳理行為。該數(shù)據(jù)被記錄為鼠咬或舔雙爪子所用的時(shí)間，所取平均值作為正常的梳理本底值(圖12)。對(duì)于這些觀察給鼠僅腹腔注射鹽水。
圖12表明鼠對(duì)爪子梳理的時(shí)間為每5分鐘4秒。盡管在這個(gè)時(shí)間有一些小的變化，但經(jīng)確定這些值差異不明顯，因此不包含在進(jìn)一步的計(jì)算中。
第二個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)是在腹腔注射等滲鹽水后30分鐘注射福爾馬林。對(duì)照的結(jié)果顯示在圖13中。以前學(xué)者報(bào)道的反應(yīng)二相性的特征(例如[61])在圖13中顯示。
最終進(jìn)行以確保技術(shù)可靠性的對(duì)照實(shí)驗(yàn)是構(gòu)建嗎啡的劑量反應(yīng)曲線。選擇4個(gè)嗎啡劑量，3mg/kg(n＝8)、6mg/kg(n＝7)、9mg/kg(n＝6)和12mg/kg(n＝4)。需要對(duì)總實(shí)驗(yàn)時(shí)間期間的止痛活性進(jìn)行計(jì)算以評(píng)價(jià)作為止痛劑的提取物。要注意在傷害性反應(yīng)急性和緊張期之間觀察到的任何差異。需要對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期(45分鐘)內(nèi)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照疼痛的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行比較。
在對(duì)照動(dòng)物中呈現(xiàn)疼痛反應(yīng)經(jīng)過的總時(shí)間為451±28秒 使用該值可采用下面的公式計(jì)算疼痛抑制的百分比
疼痛反應(yīng)(％)＝(1-反應(yīng)時(shí)間(sec)/對(duì)照時(shí)間)*100＝(1-反應(yīng)時(shí)間(sec)/451)*100當(dāng)在給予目標(biāo)化合物后觀察時(shí)，其中反應(yīng)時(shí)間是45分鐘記錄的平均疼痛反應(yīng)時(shí)間。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的嗎啡劑量反應(yīng)曲線顯示在圖14中(ED50＝4.8mg/kg)。
以前已經(jīng)證明在福爾馬林實(shí)驗(yàn)中嗎啡在較晚的緊張期的作用比較早的急性期強(qiáng)。已經(jīng)有報(bào)道鼠急性期嗎啡的ED50的近似值在4至5mg/kg之間，而在緊張期需要2至3mg/kg的嗎啡(例如，[62])。對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，皮下給予嗎啡得到的ED50值為4.8mg/kg[63]，也已經(jīng)注意到在6mg/kg時(shí)幾乎可引起完全的止痛作用[64]。在本研究中得到的結(jié)果顯示了相似的趨勢。
總結(jié)總之，發(fā)現(xiàn)福爾馬林實(shí)驗(yàn)是可靠的，容易實(shí)施并從最小數(shù)目的實(shí)驗(yàn)受試者就可提供足夠的信息。實(shí)驗(yàn)的對(duì)照結(jié)果可很好地與其它研究者的結(jié)果進(jìn)行比較。該方法與ISAP[65，66]和Griffith大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)(GUECEA)的倫理學(xué)指導(dǎo)方針相符。
B章-從玉蕊屬中分離本發(fā)明的化合物介紹.
使用福爾馬林實(shí)驗(yàn)檢測玉蕊屬的粗提物和餾分對(duì)疼痛抑制的有效性。
皂角苷的分離和隨后的定性，需要使用復(fù)雜的技術(shù)。皂角苷的純化可采用后面討論的許多方法來完成(例如，[67-69])，但通常涉及下面的方法(圖15)。在含水醇(甲醇或乙醇)中提取，之前或之后進(jìn)行脫脂步驟，去掉溶劑，殘余物懸浮在水飽和的正丁醇中。在這個(gè)階段皂角苷可使用二乙醚沉淀，但這個(gè)步驟可被省略。殘余物隨后進(jìn)行色譜。最后這個(gè)步驟涉及幾項(xiàng)技術(shù)，包括單獨(dú)使用或組合使用SephadexLH20、二氧化硅、二醇或反相(C8和C18)色譜。在皂角苷的分離中也發(fā)現(xiàn)有逆流色譜技術(shù)及其變化形式(DCCC，RLCC，CPC)的應(yīng)用。
使用色譜技術(shù)分離皂角苷遇到的主要問題是缺少紫外線檢測的合適發(fā)色基團(tuán)。盡管這些問題可以使用R1，質(zhì)量檢測和通過衍化作用和紫外線檢測來克服，但這些技術(shù)每一種都有其固有的優(yōu)勢和劣勢，這些已經(jīng)在他處有所討論[67]。
但使用生物測定來引導(dǎo)純化，則規(guī)定了所使用的分離方法。本章描述了從銳棱玉蕊(B.acutangula)樹皮的水提取物中分離幾種純?cè)斫擒盏倪^程。
實(shí)驗(yàn).
通用方法和材料如前所述進(jìn)行鼠的福爾馬林實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告為與對(duì)照相比對(duì)疼痛反應(yīng)的抑制百分比(見A章)。
除非另有說明，所有溶劑和試劑均為AR級(jí)。使用純水(ddH2O)(Permutit Australia，導(dǎo)電率＜0.07S/cm)用于所有分離。使用高純度(Omnisolve，EM Science)甲醇(MeOH)和乙腈(MeCN)用于所有分析性HPLC分離中，而蒸餾的AR級(jí)MeOH和HPLC級(jí)MeCN用于半制備和制備性分離中。所有溶劑，包括水在使用前過濾(0.45μm尼龍，Activon)。
NMR的進(jìn)行使用Varian 200MHz(Gemini 200)、400MHz(Unity)、500mHz(Unity Inova)或600MHz(配備Ultra Shims的Unity Inova)系統(tǒng)，使用氘化溶劑(CD3OD，CD5N，d6-DMSO)。當(dāng)僅得到小量的樣品時(shí)，使用D2O或DMSO匹配的Shigemi NMR管(3或5mm)以便為NMR提供更濃縮的樣品。所有化學(xué)位移報(bào)告為百萬分率(ppm)。標(biāo)準(zhǔn)Varian脈沖序列用于所有實(shí)驗(yàn)中。
低分辨率電噴射質(zhì)譜(LR-ESMS)在與Waters 600 HPLC系統(tǒng)(甲醇，流速0.9mL/min)連接的Fisons VG Platform LCMS上進(jìn)行。以陰離子和陽離子模式收集光譜，錐孔電壓的范圍是(±50V，±100V，±150V和±200V)，使用MassLynx軟件進(jìn)行分析。高分辨率ESMS(HR-ESMS)在澳大利亞海洋科學(xué)協(xié)會(huì)，Townsville Queensland進(jìn)行。設(shè)備是一臺(tái)Bruker(Billerica MA，USA)BloApex 47e FTMS，裝備了一臺(tái)Analyticaof Branford(Branford CT，USA)外部電噴射源。在樣品灌注前該設(shè)備以陽性或陰性模式進(jìn)行校準(zhǔn)，分子質(zhì)量報(bào)告在5ppm之內(nèi)。
植物原料植物樣品鑒定為銳棱玉蕊(B.acutangula)(L)Gaetm.ssp.acutangula，憑證放在Queensland Herbarium(#AQ595351)。盡管該樹是在北澳大利亞發(fā)現(xiàn)的，但本項(xiàng)目中使用的樣品是在西北澳大利亞的Kimberley區(qū)采集的。最初從該樹采集樹皮是在1989年7月14日，隨后一次采集是在1994年。為了保證相似的特性，在該年的相同時(shí)間和相同區(qū)域進(jìn)行采集(1994年7月18日)。也得到了花和葉的小量樣品。
銳棱玉蕊(B.acutangula)的花很小，需要大量的花才能為進(jìn)一步研究提供足夠的原料。該樹在雨季開花，在那個(gè)時(shí)候該地區(qū)洪水泛濫，使采集工作很困難。因此不可能進(jìn)一步進(jìn)行采集，花的活性仍然需要進(jìn)一步研究。在最初的采集中獲得了一些樹皮，從這些樹皮中已經(jīng)證明了其活性。因此本研究的目的是對(duì)樹皮中的止痛活性進(jìn)行定性。
由生活在該區(qū)域的土著人從樹上剝下樹皮，以這種方式是為了產(chǎn)生最小的損害，保證樹繼續(xù)生長。樹皮樣品被風(fēng)干或烘干，最高溫度為50℃。干燥的樣品被磨碎成粗粉，粉末樣品在室溫下儲(chǔ)存在密閉的容器中至準(zhǔn)備提取。
小量作為樣品的花和葉被干燥，制成粉末并以與樹皮相似的方式儲(chǔ)存。
植物原料的提取干燥和粉末狀的樹皮以大約10倍體積(w/v)的去礦質(zhì)水(dH2O)浸泡幾小時(shí)。得到的混合物通過幾層軟棉布過濾，離心(Damon IEC DivisionDPR6000，4500g 45min)，上清液凍干(Virtis Freezemobile 12)。干燥的提取物儲(chǔ)存在4℃密閉的容器中。
花(0.25g)和葉(1-35g)以與樹皮的水提取相似的方式進(jìn)行提取。
采用幾種方法分餾樹皮H2O提取物，描述如下。
方法1為測定或進(jìn)一步純化將水提取物再溶解在ddH2O中。很顯著的量(～30％)仍沒有溶解，通過離心去除(Sorvall RC5B Plus，12,000g，20min)，然后過濾(0.45μm尼龍，Activon)。如需要，提取物的H2O不溶解部分作為懸液進(jìn)行檢測。
除了H2O以外，可以使用幾種可選擇的溶劑，隨后測定這些提取物的濾液(0.45μm尼龍，Activon)。可選擇的溶劑包括MeOH、CHCl3、MeOH∶CHCl3(1∶9)、MeOH∶三氟乙酸(TFA，0.5％)、乙酸乙酯(EtOAc)、1％氨水(NH4OH)、二甲亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。H2O不溶部分的乙?；⑺夂吐暡ㄕ袷幟枋鋈缦?。提取物如前所述進(jìn)行檢測。
方法2.
根據(jù)方法1制備的干燥水提取物，溶解在1％氨水(Ajax)中并離心(Sorvall RC5B Plus，12,000g，20min)去掉任何不溶的物質(zhì)(～22％)。上清液置于TSKHW40S柱(見后)以5mL/min用1％NH4OH洗脫。開始時(shí)將水用作流動(dòng)相，但發(fā)現(xiàn)小量的氨水可產(chǎn)生更明顯、更清晰的峰。水提取物溶解在流動(dòng)相中以減小提取物在柱上沉淀產(chǎn)生的任何問題。開始的5個(gè)餾分，標(biāo)記為TSK-1、TSK-2、TSK-3、TSK-4和TSK-5根據(jù)得到的色譜圖進(jìn)行收集。但從TSK-5中持續(xù)分離TSK-4很困難，因此兩個(gè)餾分混合在一起成為TSK-4a。如前所述檢測提取物。
來自凝膠滲透(TSK-4a)柱的活性餾分溶解在MeOH中，過濾(0.45μm尼龍，Activon)，置于制備C18柱(見后)上。使用MeOH的ddH2O不連續(xù)梯度(0、35、70和100％MeOH)洗脫柱，根據(jù)得到的色譜圖收集餾分。
方法3.
在本節(jié)應(yīng)用的方法與方法2的所有方面都相似，僅有的不同是制備C18色譜使用的不連續(xù)梯度。在本例中，采用的不連續(xù)梯度由在ddH2O中以10％量增加的MeOH(0-100％MeOH)組成。
方法4.
在本方法中水提取物直接置于C18制備柱上，省略了對(duì)凝膠滲透步驟的需要。水提取物溶解在dH2O中，離心(Sorval RC5B Plus，12000g20分鐘)，上清液置于C18制備柱(見后)上，柱如方法3進(jìn)行洗脫。
分離活性餾分用于將粗制的、活性餾分分離為純化合物的方法根據(jù)個(gè)例進(jìn)行開發(fā)。用來促進(jìn)分離的柱包括C18、C8、二醇和苯基鍵合硅膠。合適的流動(dòng)相包括MeOH、MeCN、異丙醇(i-PrOH)、己烷、EtOAc，H2O、0.01M的HAc和1％TFA。通常使用的步驟是開始使用C8或C18柱，以及MeOH或MeCN的H2O或1％TFA(早期分離使用0.01 M的HAc)梯度。可對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)直到必須使用不同的柱(例如，苯基或二醇)，重復(fù)該過程以便獲得最佳的分離和溶解。對(duì)每個(gè)餾分采取的方法在結(jié)果和討論章節(jié)相關(guān)的部分進(jìn)行討論。
色譜分析的和半制備的色譜.
半制備和分析色譜使用裝備了光電二極管矩陣檢測器(PDA996)，自動(dòng)采樣器(717plus)和分餾收集器的Waters 600 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行。使用Millennium 2010色譜管理軟件(2.10版本)收集和儲(chǔ)存色譜信息。
分析色譜使用Dynamax柱以兩種尺寸進(jìn)行。反相(C18或苯基)柱為4.6×250mm(8μm不規(guī)則硅，60_孔徑，1mL/min)或4.6×50mm(″短柱″，3μm球型硅，60_孔徑，1mL/min)。相似的是，半制備色譜使用反相(C18或苯基)柱進(jìn)行，該柱為10×250mm(8μm不規(guī)則硅，60_孔徑，4mL/min)或10×50mm(″短柱″，3μm不規(guī)則硅，60_孔徑，4mL7min)。所有分析和半制備色譜使用的溶劑均通過氦噴射脫氣。
制備色譜.
大規(guī)模制備色譜(凝膠滲透和C18-硅)使用裝備了擴(kuò)展流動(dòng)盒的Gilson(Model 303泵，804測壓模塊)或Waters 600 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行。兩套系統(tǒng)都連接于紫外線分光光度檢測器(254nm，吸收模式)(ERMAOptical Works.ERG 7215)，分餾收集器(ISCO Foxy或Waters)以及圖表記錄器(Omniscribe系列D5000或積分儀(C-R6A Chromatopac，Shimadzu)。
凝膠滲透色譜使用TSKHW40S填料(Merck)以49×350mm玻璃柱(Büchi)(流速5mL/mm，4min餾分)進(jìn)行。
C18-硅制備色譜使用26×230mm玻璃柱(Büchi)(流速12.5mL/min)進(jìn)行，根據(jù)得到的色譜圖收集餾分。在操作的早期階段，分離使用實(shí)驗(yàn)室制備的C18-硅包裝來完成。相比較晚的分離使用C18-Davisil(Alitech)包裝材料。C18硅膠的制備如下所述。
為早期制備色譜制備C18-硅膠全部步驟在干燥氮?dú)庀聦?shí)施。甲苯(AR，Ajax)在鈉線上干燥，蒸餾并在鈉線和3_篩(Ajax)上保存。MeOH和二氯甲烷(DCM)被蒸餾并保存在3_篩上。使用干燥甲苯(400mL)和干燥硅凝膠(200g，40-63μm，Merck)制成漿料，向其中加入十八烷基三氯硅烷(40mL，F(xiàn)luka)，混合物攪拌24小時(shí)。隨后所述漿料經(jīng)Büchner漏斗過濾，產(chǎn)物用無水甲苯、無水MeOH和無水DCM每種400mL依次沖洗。最后，未封端的C18-硅產(chǎn)物在37℃干燥24小時(shí)。將未封端的C18-硅膠懸浮在400mL無水甲苯中，加入40mL三甲基氯硅烷(Fluka)，將混合物保持24小時(shí)完成封端。最終的產(chǎn)物依次用400mL無水甲苯和400mL無水DCM沖洗，然后在37℃進(jìn)一步干燥24小時(shí)。
水提取物不溶組分的乙?；崛∥锏牟蝗芩糠值?g樣品加入至5mL無水吡啶中(在鈉線上逆流，在4_篩上保存)?；旌衔锢鋮s至0℃，加入1mL醋酸酐，混合物在室溫下(RT)攪拌過夜。加入冰(1-2g)使反應(yīng)結(jié)束?；旌衔锉环峙渲烈宜嵋阴?25mL ddH2O和25mL乙酸乙酯)中。保留有機(jī)層，依次用1M HCl、ddH2O、飽和NaHCO3，再次用ddH2O，每種10mL沖洗。最后有機(jī)層在Na2SO4上干燥或蒸發(fā)溶劑干燥。
水提取物不溶組分的堿性水解本過程的示意圖在圖16中顯示。水提取物的有活性的、不溶于水的那部分的樣品(0.5g)加入至20mL 0.5M NaOH中，攪拌1hr，然后離心(12,000g，15min)。片狀沉淀(360mg)重復(fù)用ddH2O沖洗直至濾液清亮。一部分該沉淀物(330mg)用20mL DCM提取，如前離心回收片狀沉淀(320mg)。片狀沉淀(100mg)加入10mL 2M NaOH，逆流2小時(shí)，使其冷卻過夜?；旌衔镆来畏峙渲罝CM(20mL)和正丁醇(20mL)中，溶劑真空蒸發(fā)。水層的pH用1MHCl調(diào)整至7。水相再次依次分配至DCM和正丁醇中，真空去除溶劑。最后水相用1MHCl酸化(pH1)，分配至DCM和正丁醇中，溶劑如前去除。水相中殘余的溶劑也真空去除。來自所有步驟的樣品進(jìn)行活性測定。
水提取物不溶組分的酸性水解酸性水解步驟基本遵循堿性水解概述的步驟。水提取物的有活性的、不溶于水的那部分如堿性水解一樣處理，一部分片狀沉淀(100mg)如圖16中所概括的接受酸性水解。
水提取物不溶組分的聲波振蕩有活性的不溶物質(zhì)的樣品在水中被聲波振蕩(20kHz，300W10min)。溶解和不溶的物質(zhì)都進(jìn)行檢測。
結(jié)果和討論.
目的是檢驗(yàn)水提取物的止痛作用，然后純化和定性提供活性的化合物。
花和葉水提取花和葉分別得到了12.8mg和139.6mg花和葉提取物，如前所述用于福爾馬林實(shí)驗(yàn)中。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖17中。
花的活性在5mg/kg時(shí)非常高(～70％抑制)，而在相同劑量下葉產(chǎn)生活性較小(～18％抑制)。
方法1.
粉末狀樹皮在dH2O提取得到粗制水提取物(9.8％)。粗制水提取物溶解在ddH2O中，濃度為10mg/mL/kg，如前所述測定止痛活性。這些結(jié)果可見圖18。
從圖18中很明顯與對(duì)照(見A章)相比該提取物對(duì)疼痛反應(yīng)產(chǎn)生了相當(dāng)大的抑制(78％)。也可以發(fā)現(xiàn)以福爾馬林實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定，疼痛反應(yīng)減少很大，并被限制在急性期。但要注意的是該提取物含有特殊的物質(zhì)，大約為提取物總重量的40％。該懸液被過濾，可溶的和不溶的物質(zhì)都以10mg/mL/kg的劑量分別進(jìn)行測定。發(fā)現(xiàn)不溶物質(zhì)中的止痛活性(66％)較可溶物質(zhì)(45％)高。但兩種情況下，在測定的緊張期都觀察到一些疼痛反應(yīng)，而提取物的水溶部分更明顯(圖18)。
水提取物的有活性的、水不溶的那部分的乙?；瘜⑻弁匆种苹钚詮?6％降低至28％，因此不能證明它是分離有效成分的有用技術(shù)。
如果這些結(jié)果成立，似乎表明大量的活性物質(zhì)不溶于水。已進(jìn)行嘗試使用多種溶劑從樹皮不溶組分中提取活性物質(zhì)(表1)。所有提取物如前所述以10mg/kg/mL進(jìn)行測定。
默克索引(Merck Index)指出DMSO具有抗炎活性，已經(jīng)被推薦為止痛劑，并已經(jīng)用作滲透劑載體以增強(qiáng)化合物的吸收。盡管DMSO提取物被凍干，但仍經(jīng)常有一些DMSO殘余。因此，重要的是確定是否殘余的DMSO會(huì)干擾測定。盡管使用了高劑量(5％)，發(fā)現(xiàn)DMSO仍可減少疼痛反應(yīng)達(dá)57％。因此為了避免任何干擾，在進(jìn)一步提取中不考慮DMSO。因此如表1中所見，水提取物在鼠福爾馬林實(shí)驗(yàn)中至少與其它溶劑一樣是有活性的。由于其它溶劑沒有完成另外的提取作用，決定在水提取物中對(duì)止痛活性進(jìn)行定性。
此時(shí)決定對(duì)水溶的和水不溶的提取物構(gòu)建劑量反應(yīng)曲線，并比較結(jié)果(圖20)。從這些結(jié)果中可以看出減少疼痛反應(yīng)50％(ED50)所需的提取物的量為大約36mg/kg(可溶的)和5mg/kg(不溶的)。這些結(jié)果與利于提取結(jié)合起來，進(jìn)一步支持了將進(jìn)一步的純化集中于水溶物質(zhì)的決定。
方法2.
本方法涉及水溶性提取物的一種制備性凝膠滲透分離。開始收集5個(gè)餾分，對(duì)于起始的H2O提取物獲得了下面的平均產(chǎn)量，TSK-10.4％，TSK-2 15％，TSK-3 23％，TSK-4 0.7％，TSK-5 20％以及不溶部分(22％)。餾分TSK 1至5以粗制水溶等效劑量100mg/kg(即，大約2.5倍ED50)進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。
盡管在餾分2中可見到疼痛反應(yīng)的最大表觀減少量74％)，但需要15.8mg/kg物質(zhì)。相比，餾分4需要0.7mg/kg可抑制31％的疼痛反應(yīng)，表明餾分4的效力大約為餾分2的10倍左右。但洗脫為TSK-4的小峰經(jīng)常被TSK-5密度更高的峰遮蓋。因此，從TSK-5中分離餾分TSK-4被證明是不太合理的，在隨后的分離中它們被混合在一起，命名為TSK-4a。對(duì)于起始的H2O提取物，獲得的平均收率為TSK-1 1.7％，TSK-2 23％，TSK-3 20％，TSK-4a 16％，不溶部分(17％)(圖21)。
因此在這里，為餾分TSK-4a構(gòu)建劑量響應(yīng)曲線(圖22)。該圖顯示該提取物的ED50大約為1.8mg/kg。這代表了全部純化物的止痛活性是樹皮粗制水溶性提取物的30倍。
通過從制備C18柱中以0、35、70和100％MeOH的H2O不連續(xù)梯度洗脫完成了對(duì)活性餾分(TSK-4a)的進(jìn)一步分離。得到的色譜圖顯示在圖23中。
根據(jù)色譜圖的顯示收集餾分，真空干燥和測定。對(duì)于TSK-4a起始原料，得到下面的平均產(chǎn)量，0％-MeOH 54％，35％-MeOH 17％，70％-MeOH 2.4％，100％-MeOH 0.7％，不溶部分2.2％。實(shí)驗(yàn)使用的劑量相當(dāng)于3mg/kg TSK-4a(大約為ED50的兩倍)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在表3中顯示。
這些結(jié)果顯示了從柱上洗脫的所有餾分的活性，盡管與其它餾分相比在0％時(shí)洗脫的活性很小。(使人感興趣的是注意到在70％乙醇洗脫的餾分可使鼠安靜，而其他餾分不能)。進(jìn)一步分離每種餾分的嘗試表明，如所期望的那樣，每個(gè)餾分仍含有很多種化合物。
方法3.
使用制備C18硅膠柱來分離在餾分TSK-4a中證明的活性物質(zhì)，在梯度中梯級(jí)的數(shù)目從4增加至11(10％增加量，0-100％MeOH/H2O)。得到的色譜圖見圖24，對(duì)于TSK-4a起始原料，得到的產(chǎn)量為0％-MeOH(F0)61，5％，10％-MeOH(F10)3.6％，20％-MeQH(F20)3.2％，30％-MeOH(F30)2.9％，40％-MeOH(F40)2.6％，50％-MeOH(F50)1.6％，60％-MeOH(F60)0.9％，70％-MeOH(F70)2.4％，80％-MeOH(F80)0.2％，90％-MeOH(F90)0.1％，100％-MeOH(F100)0.2％和不溶部分3.1％。
每個(gè)餾分再次進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。這些測定的結(jié)果表明，根據(jù)％抑制率/mg提取物，最有效的餾分是在70、80和90％MeOH時(shí)的洗脫物。
但很快就很明顯的，每種餾分仍含有很多種化合物，經(jīng)過本方法獲得的產(chǎn)量仍不足以為進(jìn)一步分析提供足夠純的化合物。推測在分離步驟中的累積丟失導(dǎo)致了低收率。因此通過在C18上直接色譜實(shí)施大規(guī)模檢查，以便為進(jìn)一步分餾獲得較大的數(shù)量。
方法4.
已確定使用70、80和90％MeOH作為流動(dòng)相可從C18柱上洗脫出大部分活性物質(zhì)。因此，凝膠滲透步驟被省略，在通過離心和過濾去掉任何不溶部分后，水溶性提取物被直接置于C18制備柱上。得到的色譜圖在圖25中顯示。
采用本方法首先進(jìn)行的分離使用在實(shí)驗(yàn)室制備的C18硅膠，而后面的分離使用市場上購得的C18包裝材料(Alitech Davisil)進(jìn)行。采用兩種包裝材料獲得產(chǎn)量的比較在下面的表5中顯示。
如以前已經(jīng)決定的那樣，為了盡量減小使用動(dòng)物的數(shù)目，不再進(jìn)一步進(jìn)行止痛活性的檢測。因此從本步驟洗脫的每種餾分的活性沒有進(jìn)行證實(shí)。但應(yīng)該注意的是如果在70、80和90％MeOH/H2O時(shí)，從C18柱洗脫的餾分中存在活性，則可以得出結(jié)論在盡管濃度較低，即便是省略了前面的分離步驟，相同的餾分中也將會(huì)發(fā)現(xiàn)活性成分。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)進(jìn)行研究以調(diào)查從制備性C18柱上用70、80和90％MeOH/H2O洗脫的那些餾分。所有餾分的預(yù)備1H-NMR表明收集的餾分中的主要化合物是皂角苷和鞣酸。鞣酸在以較低濃度MeOH洗脫的餾分中被發(fā)現(xiàn)，而皂角苷趨向于在較高濃度MeOH下從C18柱上洗脫。最初，決定將本研究限制在用70、80和90％MeOH洗脫的那些餾分上。但越來越明顯，在這些餾分的每種中都有很多種化合物存在。
收集餾分的編號(hào)方案為了對(duì)在本研究中收集的餾分和化合物進(jìn)行連貫地鑒定，采用下面的編號(hào)方案。前三位數(shù)字標(biāo)明從C18制備柱上洗脫原始餾分的甲醇百分比。剩余位數(shù)字則標(biāo)明了在隨后分餾中收集的峰。對(duì)于餾分F70.2.5.2以圖表顯示在圖26中。
在70％甲醇(F70)時(shí)洗脫的餾分.
在70％MeOH(F70)時(shí)洗脫的餾分進(jìn)一步在C18半制備(25cm)柱上使用MeOH∶1％三氟乙酸(TFA)梯度進(jìn)行分離。向流動(dòng)相中加入TFA以便在色譜圖上使峰更明顯。在本項(xiàng)目早期的分離中，使用單波長檢測器和圖表記錄器，使用乙酸(0.01 M)提高解析度。但在確定殘余的乙酸比殘余的TFA更難去掉后，則為后面的分離選擇TFA。因此在這里使用光電二極管矩陣檢測器(PDA)的優(yōu)勢是很明顯的。傳統(tǒng)的紫外線分光光度檢測器通常能夠在單個(gè)波長上監(jiān)測分離。但PDA能夠在幾個(gè)波長上同時(shí)監(jiān)測分離。作為實(shí)例考慮，色譜圖顯示在圖27中。通常，皂角苷沒有紫外線發(fā)色基團(tuán)，更有可能在達(dá)到210nm的波長處被檢測到。但發(fā)現(xiàn)在233nm可達(dá)到很高的吸光度。實(shí)際上，在254nm能充分地觀察到提取物的分離，表明皂角苷存在于含有紫外線活性發(fā)色基團(tuán)的提取物中。圖26顯示，在分離所使用的條件下和應(yīng)用所顯示的三種波長，提取物被分離成5種不同的餾分。改變梯度條件并不能進(jìn)一步產(chǎn)生峰的分離，因此收集這5個(gè)峰根據(jù)指示進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟。表6顯示了獲得的產(chǎn)量和初步的1H-NMR結(jié)果，表明在該點(diǎn)沒有分離出純化合物。
餾分F70.2.
餾分F70.1沒有進(jìn)一步被研究，因?yàn)?H-NMR表明餾分F60存在相當(dāng)大的攜帶。嘗試通過改變流動(dòng)相中MeOH的百分比來分離F70.2(C18 25cm)未能進(jìn)一步分離餾分F70.2。流動(dòng)相改變?yōu)橐译?MeCN)1％TFA混合物證明更成功，在1％TFA中40％MeCN的等度運(yùn)行將該餾分分離成8個(gè)峰(圖28和表7)。
預(yù)備1H-NMR顯示餾分F70.2.3、F70.2.4、F70.2.6和F70.2.7主要是單一化合物，采用相同條件重復(fù)進(jìn)行色譜得到的純化合物原料足夠開始進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析。但一經(jīng)靜置就發(fā)現(xiàn)在d6-DMSO中的NMR樣品含有少量的雜質(zhì)。這表明化合物發(fā)生了一些少量的水解，可能是由于在干燥過程中沒有完全被去掉的殘余TFA引起的。由于存在的少量雜質(zhì)不干擾結(jié)構(gòu)剖析，純化合物的量也很小，因此不用進(jìn)一步嘗試去除雜質(zhì)。在220、233和254nm記錄的顯示餾分F70.2.6色譜純度的色譜圖顯示在圖29中。
如前面所提及，所有餾分的純度通過1H-NMR測定，NMR溶劑為d5-吡啶。但當(dāng)溶劑通過凍干去除時(shí)，在餾分內(nèi)的一種或多種化合物發(fā)現(xiàn)已經(jīng)與NMR溶劑反應(yīng)產(chǎn)生一種鮮艷的粉紅色復(fù)合物。這在餾分F70.2.2中特別顯著。復(fù)合體的1H-NMR讓人相信餾分中的化合物沒有改變，但仍殘余了相當(dāng)數(shù)量的吡啶。餾分的再次色譜分析不能去掉粉紅色的顏色，通過延長凍干或?qū)⑦拎づc少量的苯或甲苯共沸去掉殘余吡啶的努力也沒有成功。因此，重復(fù)提取獲得足夠的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析，隨后獲得所有NMR光譜，d6-DMSO作為溶劑。
餾分F70.2.1未被進(jìn)一步分餾，因?yàn)镠-NMR表明它由餾分F70.1攜帶的大量化合物組成。不可能使用MeOH或MeCN的H2O或1％TFA溶液作為流動(dòng)相使用C18或C8柱進(jìn)一步分離餾分F70.2.2。但初步的1H-NMR指出有芳香族信號(hào)存在。使用苯基鍵合硅膠的分離是基于p相互作用。因此，使用苯基柱(5cm)將餾分F70.2.2分離成8個(gè)餾分，顯示在圖30和表8中。盡管從F70.2.2獲得的餾分是混合物，但通過1H-NMR，峰F70.2.2.3、F70.2.2.6和F70.2.2.7主要是單一化合物。然而得到的原料不足不能對(duì)餾分再次進(jìn)行色譜以便獲得足夠的純化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析。
在剩余的峰中，僅有F70.2.5獲得足夠的量進(jìn)行進(jìn)一步的分離。試圖使用C18和C8柱分離F70.2.5沒有成功，同時(shí)使用MeOH的1％TFA梯度，苯基鍵合硅膠(5cm)將F70.2.5分離為8個(gè)峰(圖31和表9)。
該餾分的總收率比以前的分離所預(yù)期的要低。但要注意的是F70.2.5并不能完全溶解在MeOH中，因此在過濾過程中一些原料丟失了。在從F70.2.5獲得的8個(gè)峰中，僅有F70.2.5.2分離的純度和量足夠進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬。峰F70.2.5.3也分離出足夠的量，但通過1H-NMR顯示含有兩種化合物的峰不能進(jìn)一步被分離。盡管由1H-NMR峰顯示的F70.2.5.5和F70.2.5.6主要是單一化合物，但當(dāng)進(jìn)一步試圖分餾時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們含有幾種化合物。因此獲得的原料不足以進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析。
餾分70.3.
由于與F70.2在一起，餾分F70.3不能使用MeOH/1％TFA混合物進(jìn)行滿意地分離。再次使用MeCN的1％TFA梯度，使用半制備C18硅石(25cm)F70.3被分離成7個(gè)餾分(圖32和表10)。再次在233nm成功監(jiān)測到分離過程。
盡管在此階段通過HPLC或1H-NMR沒有化合物是100％純的，但使用相同的條件再次進(jìn)行色譜最終分離到5個(gè)峰(F70.3.2、F70.3.5、F70.3.6和F70.3.7)。圖4.18顯示了餾分F70.3.5和F70.3.7的色譜圖，表明在樣品干燥后立即進(jìn)行1H-NMR顯示的含有純化合物的峰。也應(yīng)該注意的是雖然通過1H-NMR和HPLC的作為F70.3.7分離的峰似乎是純的，但化合物似乎會(huì)分解，產(chǎn)生了在相同保留時(shí)間被洗脫為F70.3.6和F70.3.5(圖33)的峰。
使用MeCN/1％TFA作為流動(dòng)相，在C18柱(25cm)上，F(xiàn)70.3.4被分離成8個(gè)峰，顯示在圖34和表11中。但在收集的所有八個(gè)峰中，僅有化合物F70.3.4.2和F70.3.4.5獲得的量或純度足以進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬。
餾分F70.3.3的1H-NMR顯示它由三種主要的化合物組成。該峰進(jìn)一步進(jìn)行色譜以便分離這些化合物，但沒有獲得進(jìn)一步的解析度。
餾分F70.4.
使用70％MeOH/1％TFA梯度在C18半制備柱(25cm)上完成了F70.4的初步分離(圖35和表12)。如所見到的，在較接近的實(shí)驗(yàn)中由單個(gè)大峰組成的餾分F70.4.2，通過HPLC和1H-NMR發(fā)現(xiàn)由幾種化合物組成。使用MeOH或MeCN梯度在C18或C8柱上沒有獲得對(duì)F70.4.2的進(jìn)一步分離，因?yàn)?H-NMR顯示在F70.4.2中存在芳香基(proton)，因此使用苯基柱(5cm)。35％MeCN/1％TFA的等度流動(dòng)相將F70.4.2分離成4個(gè)主要的峰(圖36和表12A)。
使用相同的條件再次進(jìn)行色譜得到F70.4.2.2、F70.4.2.3和F70.4.2.4，獲得的量和純度足以開始進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬。根據(jù)圖35以及1H-NMR中很顯然的，F(xiàn)70.4.3含有一個(gè)以上的化合物。使用C18或C8反相柱，使用MeOH或MeCN梯度不能提高該餾分的分離，但再次使用苯基柱(5cm)可進(jìn)行分離。盡管使用MeOH或MeCN梯度作為流動(dòng)相可獲得分離，但使用MeCN/1％TFA梯度獲得的分離峰的解析度較好(圖37和表13)。
如從圖37中的色譜圖中所見，F(xiàn)70.4.3.1如所期望的那樣是一種化合物的混合物。在色譜圖上至少觀察到5個(gè)峰，但沒有嘗試對(duì)該餾分進(jìn)行進(jìn)一步的分離。使用相同的條件對(duì)餾分F70.4.3.2、F70.4.3.4和F70.4.3.5再次進(jìn)行色譜可使這些餾分得到足夠量進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析。餾分F70.4.3.3是主要由兩種化合物組成的混合物，但這些化合物不能被成功分離。
餾分F80.
使用C18反相柱可完成對(duì)F80的初步分離(25cm)，色譜圖在圖38中顯示，產(chǎn)量在表14中顯示。盡管開始可收集到6個(gè)峰，但注意到F80.2和F80.3是不穩(wěn)定的，其證據(jù)是在色譜圖上這些峰隨時(shí)間變化而消失(圖38)。所以不可能獲得這些化合物的結(jié)構(gòu)信息。
洗脫為F80.4的峰清晰地含有一個(gè)以上的化合物，可由色譜圖證明，通過1H-NMR證實(shí)。使用MeOH或MeCN梯度使用25cm C18柱沒有進(jìn)一步提高對(duì)該餾分的分離。但改變?yōu)楦痰腃18柱(5cm)，使用MeCN/1％TFA梯度可使該餾分分離成6個(gè)峰(圖39和表15)。在F80.4.5洗脫的峰在相同的條件下進(jìn)一步進(jìn)行色譜，產(chǎn)生了單一的純化合物(F80.4.5.2)。
使用相同的條件(C18 25cm)對(duì)F80.5再次進(jìn)行色譜可純化為單一化合物。
盡管在色譜上F80.6似乎是一個(gè)單一化合物，但1H-NMR表明該餾分是幾種化合物的混合物。在F80.6的1H-NMR中芳香信號(hào)的存在表明可使用苯基鍵合硅膠柱(5cm)。MeOH和MeCN/1％TFA都用作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)使用等度梯度(40％MeCN在1％TFA中)獲得最佳的分離。這就使F80.6分離成8個(gè)餾分(圖40和表16)。從這8個(gè)峰中，可能獲得5個(gè)純化合物(F80.6.2、F80.6.3、F80.6.4、F80.6.6和F80.6.7)，其量足夠嘗試進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬。
總結(jié).
本項(xiàng)目分離了21個(gè)主要和次要的峰，使其成為純的或具有足夠純度以進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)剖析。表17顯示了分離的化合物數(shù)目和重量。在結(jié)構(gòu)剖析開始前，每種化合物用HPLC檢查以便證實(shí)其純度狀態(tài)，其條件與它們分離的條件相同。
如從以前的討論中可見，除了在表17中顯示的化合物以外，在本項(xiàng)目的過程中還分離了大量數(shù)目的餾分。這些餾分中的許多種含有大量數(shù)目的化合物，這可由1H-NMR和色譜圖的表觀證明(即，許多不能解析的峰)。這些峰的幾種似乎僅含有少量的化合物，通過1H-NMR測定，其中一些僅有一種或兩種。但由于植物原料不足不能繼續(xù)純化這些餾分。表18中顯示了關(guān)于這些餾分的一些信息，有益于進(jìn)一步研究，應(yīng)該獲得更多的植物原料以進(jìn)行進(jìn)一步的工作。
C章-化合物結(jié)構(gòu)歸屬介紹.
作為皂角苷結(jié)構(gòu)的歸屬需要對(duì)分子的每個(gè)組成部分和它們存在的序列進(jìn)行鑒定。這些考慮的問題表述如下-真性苷元(genuine aglycone)的結(jié)構(gòu)-糖殘基的數(shù)目-在單糖鏈中糖類的特性和序列-每個(gè)糖單位的端基異構(gòu)構(gòu)型-苷元內(nèi)連接的構(gòu)型和構(gòu)象-糖鏈對(duì)于苷元的附著-分子中任何酸的特性和位置[1，2，6]然而應(yīng)該注意的是盡管可能單獨(dú)使用NMR來獲得皂角苷的全部結(jié)構(gòu)，但對(duì)于歸屬的證實(shí)，如果可能，應(yīng)通過其他的方法來提供。
使用已知的UV、IR、MS和NMR分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析。餾分F70.3.6-化學(xué)剖析從本研究中分離的首批化合物中的一個(gè)是F70.3.6，獲得了相對(duì)大的產(chǎn)量(152.6mg)。下面是用來對(duì)F70.3.6的結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬的技術(shù)和方法的總結(jié)。
材料和方法.
用于F70.3.6分離和結(jié)構(gòu)剖析的材料和方法在B章中已詳細(xì)提供。
通過將1M HCl(Aiax)中的10mg樣品回流完成水解。冷卻溶液，并用3份5mL體積的二氯甲烷(DCM)進(jìn)行提取。水層用Ag2CO3中和并過濾。嘗試使用幾種流動(dòng)相分離糖類和氯仿(CHCl3)∶MeOH∶乙酸(AcOH)∶H2O(7∶3∶1∶0.5)混合物證明在硅膠TLC板上是成功的(圖41)。使用的糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液為β-D-葡萄糖醛酸、β-D-巖藻糖、β-D-葡萄糖、V-L-阿拉伯糖、β-D-半乳糖、α-L-鼠李糖、B-D-半乳糖醛酸和β-D-木糖。
TLC板用酚-硫酸溶液(溶解3g苯酚和5mL97％H2SO4在95mL乙醇中)顯影。這些板浸泡在溶液中，在110℃加熱直至斑點(diǎn)出現(xiàn)(10-15分鐘)。
儀器.
用于NMR和ESMS的方法和儀器在B章中已詳細(xì)提供?；衔颋70.3.6也以陽離子和陰離子模式(Kratos Concept ISQ高分辨率/四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜儀，Central Science Laboratory University of Tasmania)進(jìn)行快原子轟擊(FAB)MS。使用的基質(zhì)為間-硝基苯甲醇(MNBA)。
分析來自70.2.5的亞餾分，通過使用光譜，特別是1H、13C和1H、13C-gHSQC(gHSQC)，與上述餾分70.3.60使用的相似方式歸屬結(jié)構(gòu)。得到的結(jié)構(gòu)屬于三個(gè)類別，苷元、monodesmosides和bidesmosides。這些結(jié)構(gòu)的描述從苷元開始。當(dāng)單-和雙-desmosides中的糖殘基具有相同的結(jié)構(gòu)以及與F70.3.6相關(guān)的立體構(gòu)型時(shí)，也可假設(shè)絕對(duì)立體構(gòu)型是相同的。
紫外線光譜.
從紫外線(圖42)或FTIR(圖43)光譜中測定了很少的結(jié)構(gòu)信息。紫外線光譜顯示了兩種很強(qiáng)的吸光度，205.9nm處(Abs.＝1.78，e＝11226)和229.8nm處(Abs.＝2.28，e＝14430)，以及兩種很弱的吸光度，274.6nm處(Abs.＝0.17，e＝1076)和280.0nm處(Abs.＝0.14，e＝886)(圖41)。這些吸光度與芳香系中的K帶(B→B*轉(zhuǎn)變)和B帶是一致的。
FTIR光譜.
純凈化合物薄膜的FTIR在圖43中顯示。在3400cm-1處集中的寬譜帶表明有O-H伸縮，2820和3000cm-1之間的峰組表明有C-H伸縮。1723和1709cm-1處的強(qiáng)峰顯示了酯羰基(Ester carbonyl)伸縮，而C-O伸縮則見于1275和1039cm-1之間。
NMR法最初決定使用在文獻(xiàn)中報(bào)道的NMR溶劑，主要有甲醇(MeOH-d4)和吡啶-d5。但很快就非常明顯，對(duì)于本研究中分離的皂角苷，兩種溶劑都產(chǎn)生了問題。MeOH-d4遇到的兩個(gè)問題是溶解性和可交換質(zhì)子丟失。分離的幾種皂角苷在MeOH-d4中不可溶，隨著時(shí)間推移它們中的數(shù)個(gè)在NMR管中沉淀。在1H-NMR光譜中大量重疊信號(hào)的存在使許多信號(hào)不能歸屬，特別是碳水化合物部分產(chǎn)生的信號(hào)。
來自可交換質(zhì)子的信號(hào)可能有助于總體的結(jié)構(gòu)信息或使其復(fù)雜化。但在此情況下，確定可交換質(zhì)子有助于最后的結(jié)構(gòu)歸屬，盡管又將更多信息加入到已經(jīng)很復(fù)雜的光譜中。因此研究了吡啶-d5，它似乎是文獻(xiàn)中選擇的溶劑。然而溶劑信號(hào)趨向于覆蓋光譜中的芳香信號(hào)。去掉溶劑也證明是有問題的。通過凍干真空去除溶劑，然而即使幾天后仍有大量殘余。溶劑似乎也與一些化合物反應(yīng)產(chǎn)生一種鮮艷的粉紅色復(fù)合物。從1H-NMR上還不清楚該化合物本身是否經(jīng)歷了何種變化，但可以看見的是有顯著的吡啶殘余。加入少量苯或甲苯與吡啶共沸，通過旋轉(zhuǎn)蒸汽或凍干都不能解決此問題。
最后，決定使用二甲亞砜(DMSO-d6)作為NMR溶劑，盡管很少文獻(xiàn)信息能用于比較。DMSO-d6中，化合物F70.3.6的1H-NMR光譜見圖44。光譜主要分為三個(gè)區(qū)。第一個(gè)最大的遮蔽區(qū)(*0.00-*2.20)主要與甲基信號(hào)相關(guān)。在此區(qū)6個(gè)甲基單峰很明顯，化學(xué)位移為*0.71(3H)，*0.79(3H)，*0.84(3H)，*0,94(3H)，*0.97(6H)和*1.33(3H)。
第二個(gè)區(qū)(*2.20-*6.00)含有緊靠含氧碳的質(zhì)子，主要是四個(gè)雙峰，其特征是在*7.43，*7.52，*7.59，*7.66，*7.89和*7.94的端基異構(gòu)質(zhì)子。最后第三個(gè)，最大的去遮蔽區(qū)(*7.40-*8.00)，顯示了在*7.43，*7.52，*7.59，*7.66，*7.89和*7.94的6個(gè)端基異構(gòu)質(zhì)子。
13C光譜(圖45)不如1H光譜密集，可以很容易地鑒定幾種碳的類型。包括5種羰基碳(*164.2，*164.3，*168.5，*169.6和*171.9)，2種烯碳(*121.6和*141.7)，8種芳香碳(*127.8，*127.9，*128.4，*128.5，*129.1，*129.5，*132.5和*132.8)以及4種端基異構(gòu)碳(*101.8，*102.4，*102.8和*103.4)。
使用1H、1H-dqfCOSY(dqfCOSY)和13C-gHMBC(gHMBC)光譜分析法分析化合物F70.3.6的每個(gè)區(qū)。
化學(xué)結(jié)構(gòu)的歸屬，包括立體構(gòu)型，是基于NMR的，獲得的其他光譜是使用已知的技術(shù)進(jìn)行的。餾分F70.3.6被歸屬為圖46中的結(jié)構(gòu)，顯示如下。
質(zhì)譜分析F70.3.6的結(jié)構(gòu)通過1D和2D NMR技術(shù)進(jìn)行測定，但必須有結(jié)構(gòu)的支持證據(jù)。盡管紫外線和FTIR光譜對(duì)歸屬通過指示分子中存在的功能基團(tuán)提供一些支持，但質(zhì)譜分析(MS)能更好地確認(rèn)歸屬。通過比較高分辨率MS測定的分子質(zhì)量和NMR歸屬的結(jié)構(gòu)，這是可能的。而且MS中產(chǎn)生的片段的質(zhì)量也支持以NMR為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)。
使用電噴射(ES)作為電離源獲得陽離子和陰離子模式的信息。電噴射是一種緩和的電離技術(shù)，使用ES可保證在正常的運(yùn)轉(zhuǎn)條件下發(fā)生最小的分子斷裂。準(zhǔn)確的質(zhì)量測定也可能使用高分辨率ES-MS。發(fā)現(xiàn)在陽離子模式中，分子離子不象陰離子模式中那樣顯著，但在陽離子模式中觀察到更多的斷裂作用。在ES中化合物形成加合物并不罕見，特別是陽離子中有鈉，陰離子中有氯時(shí)。當(dāng)將MS中的任何峰歸屬為碎片時(shí)需要被考慮到。
文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于皂角苷大多數(shù)MS是以陰離子模式，因此這是第一種被研究的模式。陰離子高分辨率(HR)ES-MS將所有峰配對(duì)顯示，指示了單同位素質(zhì)量和含有1個(gè)13C的化合物質(zhì)量(圖47)。母離子顯示為兩個(gè)峰，m/z值為1441.6472和1442.6529。該質(zhì)量與C73H102O29(計(jì)算為1442.6507)的分子式是一致的，支持了NMR法歸屬的結(jié)構(gòu)。
其它餾分的結(jié)構(gòu)剖析以上面F70.3.6相似的方式分析其它的餾分，并解析了下面化合物的結(jié)構(gòu)。
苷元.
化合物F70.2.5.2-本化合物被分離為7.2mg無定形的白色粉末。
與F70.2.5.2，2α，3β，19α-三羥基-齊墩果烷-12-烯-23，28-雙酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷有關(guān)的化合物，以前是從銳棱玉蕊(B.acutangula)中分離的[1]。該化合物與F70.2.5.2不同之處是在C28處的酸有一個(gè)吡喃葡萄糖苷部分。因此，本化合物是2α，3β，19α-三羥基-齊墩果烷-12-烯-23，28-雙酸(圖48)。
在本項(xiàng)目中第二個(gè)苷元(F70.2.5.3)被分離為1.4mg白色物質(zhì)?；衔锏馁|(zhì)量為m/z485.2912([M-1]-)，與分子式C30H46O5(計(jì)算為m/z486.3345)是一致的。這表明從F70.2.5.2中丟失了兩個(gè)羥基基團(tuán)，但不能獲得足夠的原料以提供進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)信息。
Monodesmosides-在下面章節(jié)中描述的monodesmosidic化合物根據(jù)在苷元的C21和C22上的功能基團(tuán)進(jìn)行分組。
C21上的苯甲酸酯和C22上的羥基化合物F70.2.3.2和F70.3.2顯示在C21上有苯甲酸酯部分，在C22上有羥基基團(tuán)。兩者均分離為無定形白色固體，收率很低(分別為8.5和26.3mg)。
在C21上的苯甲酸酯和C22上的異丁酸酯.
化合物F70.3.4.2-本化合物分離為11.7mg的無定形白色粉末。
同時(shí)在C21和C22上的苯甲酸酯本組的化合物在C21和C22上均具有一個(gè)苯甲酸酯功能基團(tuán)。在本項(xiàng)目中分離了4種這樣的化合物。這四種化合物都分離為無定形的白色物質(zhì)，重量為F70.4.3.5.2(2.7mg)，F(xiàn)70.4.2.4.2(4.9mg)，F(xiàn)80.6.4(11.7mg)和F80.6.7(3.9mg)。
在C21上的苯甲酸酯和C22上的巴豆酸酯.-本組的化合物的特征為C21上的苯甲酸酯和C22上的巴豆酸酯。在本項(xiàng)目中分離了4種這樣的化合物，每種都是無定形的白色物質(zhì)，F(xiàn)70.4.2.3-42.7mg；F70.4.3.4.2-6.4mg；F80.6.3-25.8mg；F80.6.6-4.3mg。
同時(shí)在C21和C22上的巴豆酸酯-在本組中分離的兩種化合物，F(xiàn)70.4.3.2.2(2.8mg)和F80.6，2(7.4mg)的特征是在C21和C22上均有巴豆酸酯基團(tuán)。
其它的化合物餾分F70.3.3分離為47.8mg無定形的白色物質(zhì)，1D和2DNMR顯示其含有幾種化合物。幾次嘗試分解這些化合物，結(jié)果收集到了6.6mg餾分F70.3.3.2.2，1D和2DNMR顯示其仍含有三種化合物。但使用其他化合物的相似方式有可能將這些化合物其中一種的結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬。
Bidesmosides-在本項(xiàng)目中分離了幾種在C21上具有糖部分的化合物。所有情況下該糖均被歸屬為阿拉伯糖。
化合物F70.2.6.2與在本項(xiàng)目中分離的其他化合物相比，F(xiàn)70.2.6.2獲得的產(chǎn)量相對(duì)較高。本化合物分離為38.5mg無定形的白色粉末。
化合物F70.3.4.5少量(2.7mg)的F70.3.4.5分離為無定形的白色化合物。F70.3.4.5的結(jié)構(gòu)顯示在圖60中。
化合物F70.3.5.2本化合物分離為12.2mg無定形的白色化合物。
化合物F70.3.7.2化合物F80.4.3.2和F80.5.2這些化合物分離為2.8mg(F80.4.5.2)和20.1mg(F80.5.2)無定形白色物質(zhì)。
總結(jié)本章總結(jié)了本項(xiàng)目中分離的化合物的結(jié)構(gòu)歸屬。在全部的一個(gè)苷元中，分離并定性了10個(gè)monodesmosides和6個(gè)bidesmosides。根據(jù)其結(jié)構(gòu)或分子量搜索現(xiàn)有的文獻(xiàn)沒有發(fā)現(xiàn)任何所述的mono-或bi-desmosides，因此在本文寫作時(shí)被假定為新的結(jié)構(gòu)。所述苷元是所提到的來自銳棱玉蕊(B.acutangula)的已知結(jié)構(gòu)。在提取物中有許多次要的化合物也需要定性(見前章)。收集足量的樹皮和進(jìn)行大規(guī)模制備性色譜有助于該過程。
D章-F70.3.2和F70.3.6的止痛活性初步研究，靜脈給藥待測化合物F70.3.2和F70.3.6是否能在炎性疼痛的大鼠模型中產(chǎn)生疼痛緩解效應(yīng)。
方法動(dòng)物成年雄性Sprague-Dawley大鼠圈養(yǎng)在溫控室內(nèi)(21±2℃)，具有12h/12h光照/黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和進(jìn)水。本研究的倫理學(xué)經(jīng)昆士蘭大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
試劑和方法異氟烷(Forthane_)從Abbott Australasia Pty Ltd(Sydney，Australia)獲得。芐青霉素鈉針劑(600mg)購自CSL Ltd(Melboume，Australia)。正常鹽水安瓿從Detta West Pty Ltd(Perth，Australia)獲得，肝素化鹽水(50IU/5ml)購自Astra Pharmaceutlcals Pry Ltd(Sydney，Australia)。
單腔聚乙烯管(I.D.0.5mm，O.D.1.00mm)購自Auburn Plastics andEngineering Pty Ltd(Sydney， Australia)。無菌硅化絲線(DysilkTM)從Dynek Pty Ltd(Adelaide，South Australia)獲得。
誘發(fā)后爪炎癥足底內(nèi)(i.pl.)注射福式完全佐劑(FCA，0.15mL)誘發(fā)大鼠后爪炎癥，同時(shí)大鼠置于短暫的3％異氟烷∶97％氧吸入麻醉下。使用爪壓力實(shí)驗(yàn)(詳見下)評(píng)價(jià)炎性疼痛。在i.pl.給予FCA后第5天或第6天給藥待測化合物。
爪體積測定采用容積測量器在i.pl.給予FCA前一天，以及給予FCA后5天靜脈注射藥物(或鹽水)之前立即測量左后爪和右后爪每只的體積。
手術(shù)頸靜脈插管進(jìn)行頸靜脈插管，同時(shí)大鼠用3％異氟烷97％O2吸入麻醉，用有刻度的三氯乙烯蒸發(fā)器維持。聚乙烯套管(之前充滿肝素化鹽水)植入進(jìn)右頸總靜脈中以進(jìn)行靜脈藥物給藥。從皮下隧道中抽出套管至肩胛間區(qū)之間做的切口，用不銹鋼彈簧保護(hù)，其基部固定在肩胛骨之間的皮下袋中。無菌絲線封閉切口。手術(shù)后，大鼠單獨(dú)地圈養(yǎng)在代謝籠中，在進(jìn)一步試驗(yàn)前手術(shù)后恢復(fù)最少2小時(shí)。在恢復(fù)期內(nèi)隨意進(jìn)食和進(jìn)水。
給藥化合物F70.3.2和F70.3.6都溶解在無菌鹽水中。目標(biāo)化合物開始給藥的劑量為0.01mg/kg，注射體積0.5ml。在本初步研究中靜脈給藥的其它劑量如下F70.3.2 0.002mg/kg、0.005mg/kg、0.01和0.02mg/kgF70.3.6 0.002mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg和0.05mg/kg對(duì)照大鼠接受靜脈推注鹽水。
抗傷害感受測試爪壓力實(shí)驗(yàn)對(duì)于爪子壓力實(shí)驗(yàn)，大鼠被輕輕地置于毛巾下，在后爪的背面上施加并逐漸增加機(jī)械壓力(最大＝250g)。測定需要使爪縮回的壓力，即爪壓力閾值(PPT)。以10秒為間隔取3次連續(xù)測定的平均值。然后對(duì)對(duì)側(cè)進(jìn)行相同的步驟，兩側(cè)次序輪流進(jìn)行以消除順序效應(yīng)。相似地，大鼠被輕輕地置于毛巾下使用容積測量器對(duì)爪的體積進(jìn)行定量。
數(shù)據(jù)分析在將每種待測化合物(F70.3.2和F70.3.6)靜脈推注用藥后，減去用藥前立即測定的每個(gè)個(gè)體的基線PWT，將縮爪閾值(g)標(biāo)準(zhǔn)化。使用梯形規(guī)則計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化PWT對(duì)時(shí)間曲線下面積(AUC)。將AUC值對(duì)比F70.3.2和F70.3.6中每個(gè)的靜脈用藥劑量作圖制成劑量反應(yīng)曲線。
圖65顯示對(duì)于同側(cè)后爪，F(xiàn)70.3.2抗傷害感受效應(yīng)的增加是劑量相關(guān)性的。相比，在對(duì)側(cè)后爪缺少抗傷害感受效應(yīng)。
圖66顯示對(duì)于同側(cè)后爪，在0.002-0.01mg/kg的劑量范圍內(nèi)，F(xiàn)70.3.6抗傷害感受效應(yīng)的增加是劑量相關(guān)性的。但進(jìn)一步劑量強(qiáng)度的增加會(huì)導(dǎo)致抗傷害感受反應(yīng)下降而不是增加。與化合物F70.3.2相似，在對(duì)側(cè)后爪缺少抗傷害感受效應(yīng)。
在圖67中總結(jié)的僅注射鹽水大鼠的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)步驟本身并不引起明顯的抗傷害感受效應(yīng)。
這是一種獨(dú)特的增加方式，使用上述技術(shù)化合物F70.3.6和F70.3.2抗傷害感受效應(yīng)的平臺(tái)期見圖68。
圖69顯示了給予FCA后5天，同側(cè)后爪的平均(±SEM)體積增加了大約2倍，從3.3(±0.1)mL增加至6.0(+0.1)mL。相比，給予FCA后5天對(duì)側(cè)后爪的平均(±SEM)體積(3.3±0.1ml)與誘發(fā)同側(cè)后爪炎癥前測量的值((3.2)±0.1mL)沒有明顯變化。
觀察到的F70.3.2和F70.3.6副作用的范圍總結(jié)在下面的表19和20中。
在貫穿整個(gè)說明書中，目的一直是為了描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不將本發(fā)明限制于任何一個(gè)實(shí)施方案或特定特征的集合。
在本說明書中，除非文中另有需要，詞“包括”，變化形式如“包含”或“含有”等都應(yīng)理解為包含所述的整體或一組整體或步驟的意思，但并不排除任何其他的整體或一組整體。
在圖70和71，顯示了本發(fā)明更多化合物的結(jié)構(gòu)。圖70顯示了化合物(1)至(7)，其特征是包含了所顯示的A、B、C和D組。這些化合物已經(jīng)從前面所述的銳棱玉蕊(B.acutangula)的干燥樹皮水提取物中制備出來，并已獲得如前所述的結(jié)構(gòu)歸屬。相似的注釋也應(yīng)用于圖71的化合物。
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表1-多種溶劑提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2-TSK餾分-收率和活性

表3-C18初步分離TSK-4a.

表4-TSK-4a C18餾分的活性

表5-H2O提取物的C18制備性色譜。
收率是關(guān)于H2O提取物的起始原料。

表6-餾分F70的分離

表7-餾分F70.2的分離

表8-餾分F70.2的分離(PSC＝主要是單一化合物、)

表9-餾分F70.2.5的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表10-餾分F70.3的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表11-餾分F70.3.4的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表12-餾分F70.4的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表12A-餾分F70.4.2的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表13-餾分F70.4.3的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表14-餾分F70.4.3的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表15-餾分F80.4的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表16-餾分F80.6的分離(PSC＝主要是單一化合物)

表17-在本項(xiàng)目中分離的化合物

表18-在本研究中收集的餾分，含有關(guān)于這些餾分中的化合物的一些信息(M＝混合物，B＝苯甲酸鹽，T＝Tiglate，PSC＝主要是單一化合物，US＝原料不足不能獲得清晰的色譜，PS＝存在增塑劑)

表19F70.3.2的副作用

表20F70.3.6的副作用

權(quán)利要求
1.一種具有分子式(I)的化合物 其中R2選自氫、羥基、O-烷基、O-烯基、O-苯甲?；?、O-聯(lián)苯甲?；?、O-烷酰基、O-烯酰基、O-芳基、O-雜環(huán)、O-雜芳基或 其中R5和R7可獨(dú)立地選自氫、烷酰基、烯?；⒙?lián)苯甲?；⒈郊柞；⒒虮郊柞Ｍ榛〈耐轷；?；R3選自羥基、O-烷?；?、O-烯?；?、O-苯甲?；?、O-聯(lián)苯甲?；?、O-烷基、O-烯基、O-芳基、O-雜環(huán)或O-雜芳基；R4選自-CH2OH，COOH、CH2OCOCH3、COO烷基、COO芳基、CH2COO烷基、COO-雜環(huán)、COO-雜芳基、CH2-O芳基、CH2O雜環(huán)或CH2O雜芳基；R6選自氫或 R7選自氫或烷基；或其藥學(xué)可接受的鹽類，條件是當(dāng)R2為OH，R3為OH，R4為CH2OH，R6為吡喃木糖基，R1不能為4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的R2為氫、苯甲?；?、聯(lián)苯甲?；?、巴豆?；?其中R5和R7選自氫、巴豆酰基、苯甲酰基或苯甲酰烷基取代的烷?；?。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的R3選自O(shè)-乙?；-苯甲?；?、O-聯(lián)苯甲?；?、O-異丁?；騉-巴豆?；?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的R4選自CH2OH、O-乙?；蛄u基。
5.權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的R2是吡喃阿拉伯糖基、3-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?-4-苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基、O-苯甲酰基、O-聯(lián)苯甲酰基、O-巴豆?；?、3，4聯(lián)苯甲?；?L-吡喃阿拉伯糖基、3-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?4-巴豆酰基-α-L-吡喃阿拉伯糖基、3-巴豆?；?4-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?-α-L-吡喃阿拉伯糖基、3-(3-苯甲?；?2甲基丁?；?4-苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基或3-(3-苯甲?；?2-甲基丁酰基)-4-苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的R6是甲基。
7.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲酰基-2-甲基丁?；?-4-苯甲酰基-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C。
8.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲酰玉蕊精醇C。
9.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲?；?28-O-乙酰玉蕊精醇C。
10.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲?；?22-O-異丁酰玉蕊精醇C。
11.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃甲基葡萄糖醛酸基-21，22-O-聯(lián)苯甲酰玉蕊精醇C。
12.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21，22-O-聯(lián)苯甲酰玉蕊精醇C。
13.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃甲基葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲酰基-22-O-巴豆酰玉蕊精醇C。
14.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-苯甲?；?22-O-巴豆酰玉蕊精醇C。
15.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃甲基葡萄糖醛酸基-21，22-O-巴豆酰玉蕊精醇C。
16.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21，22-O-巴豆酰玉蕊精醇C。
17.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-22-O-苯甲酰玉蕊精醇C。
18.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3，4-聯(lián)苯甲?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C。
19.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3，4-聯(lián)苯甲基-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-乙酰玉蕊精醇C。
20.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?-4-巴豆?；?α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C。
21.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-巴豆酰基-4-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C。
22.3-O-β-D-吡喃半乳糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲?；?2-甲基丁?；?-4-苯甲?；鵞-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-22-O-乙酰玉蕊精醇C。
23.3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-O-[3-(3-苯甲酰基-2-甲基丁?；?-4-苯甲酰基-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-乙酰玉蕊精醇C。
24.一種用于治療和/或控制疼痛的藥學(xué)組合物，含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至23任何一項(xiàng)中所述的化合物和藥學(xué)可接受的載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥學(xué)組合物，其中所述的載體是藥學(xué)可接受的賦形劑。
26.一種治療和/或控制疼痛的方法，包括給予需要這種治療的受試者至少一種權(quán)利要求1至23任何一項(xiàng)中的化合物的步驟。
全文摘要
從來源于玉蕊皂苷A(Barringtoside A)和玉蕊皂苷C(Barringtoside C)的玉蕊屬植物中獲得的多種化合物作為前體化合物，該化合物在21位特別地具有吡喃阿拉伯糖基取代基，可進(jìn)一步在3或4位可選擇地使用苯甲?；⒙?lián)苯甲?；?、甲基丁酰基、甲基丁酰基或巴豆?；〈??？蛇x擇的在21位提供巴豆酰，苯甲?；蚵?lián)苯甲酰基取代基。
文檔編號(hào)A61K31/351GK1938326SQ200480039602
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月27日
發(fā)明者R·奎恩, C·米爾斯 申請(qǐng)人:格里菲斯大學(xué), 亞爾瑪當(dāng)哈布魯原住民公司