專利名稱：具有改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)的Fc－促紅細(xì)胞生成素融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常提供了具有改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)的新的高度唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。具體而言，F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)具有延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。與其它細(xì)胞系如NS/0細(xì)胞中所產(chǎn)生的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，在BHK細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有顯著延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。本發(fā)明還涉及Fc-EPO，其中為了獲得具有進(jìn)一步改善特性的各個(gè)分子已經(jīng)在Fc部分內(nèi)和EPO部分內(nèi)進(jìn)行了幾種修飾。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素是祖紅細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞所必需的糖蛋白激素。它在腎臟中產(chǎn)生并且在調(diào)節(jié)循環(huán)紅細(xì)胞的水平方面是必需的。以低水平組織氧信號為標(biāo)志的情況增加促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，這反過來刺激紅細(xì)胞生成。循環(huán)中促紅細(xì)胞生成素水平受到嚴(yán)格調(diào)控以保證僅在對長期氧缺乏時(shí)作出反應(yīng)而產(chǎn)生紅細(xì)胞。70％的促紅細(xì)胞生成素是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用清除的。當(dāng)促紅細(xì)胞生成素結(jié)合至其受體時(shí)，復(fù)合體被內(nèi)吞并降解，從而限制信號范圍。剩余的促紅細(xì)胞生成素通過腎臟過濾入尿液而清除。結(jié)果，促紅細(xì)胞生成素具有相對較短的血清半壽期。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的天然人促紅細(xì)胞生成素或重組促紅細(xì)胞生成素包含3個(gè)N-連接寡糖鏈和1個(gè)O-連接寡糖鏈。N-連接糖基化發(fā)生在位置24、38和83上的天冬酰胺殘基，而O-連接糖基化發(fā)生在位置126上的絲氨酸殘基(Lai等人，(1986)J.Biol.Chem.2613116；Broudy等人，(1988)Arch.Biochem.Biophvs.265329)。已經(jīng)表明，寡糖鏈的末端用唾液酸殘基進(jìn)行了修飾。N-連接鏈一般為每條鏈具有多達(dá)4個(gè)唾液酸而O-連接鏈具有多達(dá)2個(gè)唾液酸。因此促紅細(xì)胞生成素多肽可以包含總共多達(dá)14個(gè)唾液酸。已經(jīng)表明，對于促紅細(xì)胞生成素從細(xì)胞分泌、增加促紅細(xì)胞生成素的溶解性和促紅細(xì)胞生成素的體內(nèi)生物學(xué)活性而言需要糖類(Dube等人，(1988)J.Biol.Chem.26317516；DeLorme等人，(1992)Biochemistry 319871-9876)。
已經(jīng)顯示重組人促紅細(xì)胞生成素的施用對治療造血障礙或缺陷是有效的，造血障礙或缺陷如不同形式的貧血癥，包括與腎衰竭、HIV感染、失血和慢性病相關(guān)的那些貧血癥。促紅細(xì)胞生成素一般通過靜脈注射施用。由于促紅細(xì)胞生成素具有相對較短的血清半壽期，因此需要頻繁的靜脈注射以維持循環(huán)中促紅細(xì)胞生成素的治療有效水平。包含天然或重組人促紅細(xì)胞生成素的藥物組合物一般每周施用三次，劑量為大約25-100單位/kg。盡管這種促紅細(xì)胞生成素治療形式相當(dāng)有效但非常昂貴且不方便，因?yàn)殪o脈施用通常需要患者必須找醫(yī)生或到醫(yī)院就診。目前，可以獲得一種用于治療貧血癥超糖基化的重組人促紅細(xì)胞生成素類似物，即一種新的紅細(xì)胞生成刺激蛋白質(zhì)(NESP)，其商標(biāo)為Aranesp(Amgen Inc.，Thousand Oaks，California)。Aranesp能夠以比常規(guī)促紅細(xì)胞生成素更少的頻率施用而獲得相同的生物學(xué)反應(yīng)。
備選的施用途徑是皮下注射。該種施用形式可以由患者在家里進(jìn)行，并且更適合于緩釋制劑，緩釋制劑減慢從施用位點(diǎn)的吸收，從而引起持續(xù)釋放效應(yīng)。然而，通過皮下注射所獲得的循環(huán)水平顯著較低，因此，為了獲得預(yù)期治療效果需要頻繁注射。而且，蛋白質(zhì)藥物的皮下施用通常比靜脈施用具有更強(qiáng)的免疫原性，因?yàn)槠つw作為對感染的主要屏障是一種免疫器官，其具有豐富的樹突狀細(xì)胞并具有對磨損和外來物進(jìn)行鑒定和作出反應(yīng)的敏感機(jī)制。Casadevall等人最近報(bào)道了皮下接受促紅細(xì)胞生成素的患者產(chǎn)生了抗促紅細(xì)胞生成素抗體(Casadevall等人，(2002)N Engl.J.Med.346(7)469-75)。
因此，需要施用頻率更低的更有效的促紅細(xì)胞生成素治療。
發(fā)明簡述在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與野生型或天然產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素、重組促紅細(xì)胞生成素或超糖基化促紅細(xì)胞生成素類似物NESP(PCT公布號WO 00/24893)相比具有改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的促紅細(xì)胞生成素融合蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的目的是簡化促紅細(xì)胞生成素治療和降低與治療患有造血障礙或缺陷或適于促紅細(xì)胞生成素施用的其它適應(yīng)癥的人或其它哺乳動(dòng)物相關(guān)的費(fèi)用。
具體而言，本發(fā)明提供具有延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能的生物活性Fc-促紅細(xì)胞生成素(Fc-EPO)融合蛋白質(zhì)。
如文中所使用，“Fc-EPO融合蛋白質(zhì)”指包含具有Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分的多肽的蛋白質(zhì)。如文中所使用，“Fc部分”包括來自免疫球蛋白、優(yōu)選人免疫球蛋白恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，包括恒定區(qū)的片段、類似物、變體、突變體或衍生物。如文中所使用，“促紅細(xì)胞生成素部分”包括人或其它物種的野生型或天然產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素、重組促紅細(xì)胞生成素和促紅細(xì)胞生成素樣分子，包括的生物活性促紅細(xì)胞生成素片段、類似物、變體、突變體或促紅細(xì)胞生成素衍生物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供在BHK細(xì)胞內(nèi)合成的Fc-EPO蛋白質(zhì)。已經(jīng)證明，與其它細(xì)胞系如NS/0、PerC6或293細(xì)胞中產(chǎn)生的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，在BHK細(xì)胞內(nèi)合成的所發(fā)明的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的血清半壽期顯著延長且體內(nèi)潛能顯著增加。本發(fā)明還提供一群適宜施用于哺乳動(dòng)物的高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。在多種實(shí)施方案中，與野生型或天然產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素、重組促紅細(xì)胞生成素、超糖基化促紅細(xì)胞生成素類似物NESP或NS/0、PerC6或293細(xì)胞中合成的相同氨基酸序列的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有更長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)可以包含F(xiàn)c部分內(nèi)的氨基酸修飾，該修飾通常延長Fc融合蛋白質(zhì)的血清半壽期。例如，此類氨基酸修飾包括基本上降低或消除Fc受體結(jié)合活性或補(bǔ)體結(jié)合活性的突變。另外，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)還可以在促紅細(xì)胞生成素部分內(nèi)包含氨基酸修飾，該修飾降低EPO受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或者增加促紅細(xì)胞生成素的生物活性。在多種的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合了免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)、Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分的氨基酸修飾，以及在BHK細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生(例如高水平唾液酸化)所提供的優(yōu)點(diǎn)。組合優(yōu)點(diǎn)具有累加或協(xié)同作用，導(dǎo)致Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有驚奇的延長血清半壽期的增加的體內(nèi)潛能。
因此，本發(fā)明在一個(gè)方面涉及包含編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列的BHK細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的BHK細(xì)胞適于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞適于懸浮生長。在又一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞適于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與生長于其它培養(yǎng)基中的BHK細(xì)胞所產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，生長于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的BHK細(xì)胞所產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出顯著增加的且更加均質(zhì)的唾液酸化作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸穩(wěn)定維持于BHK細(xì)胞中。如文中所使用，“穩(wěn)定維持的核酸”指當(dāng)缺乏維持核酸的選擇壓力，如基于抗生素的篩選時(shí)，其從母細(xì)胞傳遞至子細(xì)胞的損失率低于百分之三的任意核酸。因此，當(dāng)穩(wěn)定維持核酸的細(xì)胞分裂時(shí)，至少97％(并且更加優(yōu)選多于98％、多于99％或者多于99.5％)的所得到細(xì)胞包含核酸。當(dāng)所得到的包含核酸的細(xì)胞分裂時(shí)，在來自該(第二次)分裂的細(xì)胞中至少97％將包含核酸。此外，核酸在每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)基本上不隨重復(fù)的細(xì)胞分裂而減少。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定維持的核酸序列整合入BHK細(xì)胞的染色體。
核酸序列能夠編碼任意多種結(jié)構(gòu)的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其包含F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)N末端的Fc部分和Fc-EPO融合蛋白質(zhì)C末端的促紅細(xì)胞生成素部分。Fc部分通常包含來自免疫球蛋白恒定區(qū)的區(qū)域，包括恒定區(qū)的片段、類似物、變體、突變體或衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分來自人免疫球蛋白重鏈例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它種類。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)不包括免疫球蛋白的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含CH2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含降低對Fc受體的親和力或降低Fc效應(yīng)子功能的突變。例如，F(xiàn)c部分可以包含消除IgG重鏈Fc部分內(nèi)的糖基化位點(diǎn)的突變。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分在對應(yīng)IgG1的Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297或Pro331的氨基酸位置(按照EU命名法對氨基酸編號)處包含突變、缺失或插入。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分在對應(yīng)IgG1的Asn297氨基酸位置處包含突變。在備選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分在對應(yīng)IgG1的Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344或Pro378氨基酸位置處包含突變、缺失或插入。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含來自人IgG2或IgG4重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，CH2結(jié)構(gòu)域包含消除CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)糖基化位點(diǎn)的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變改變了IgG2或IgG4重鏈CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列中的天冬酰胺。優(yōu)選地，突變將天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０?。備選地，突變改變Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列內(nèi)的苯丙氨酸和天冬酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列被替換為Gln-Ala-Gln-Ser氨基酸序列。
Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列內(nèi)的天冬酰胺對應(yīng)IgG1的Asn297。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IgG2或IgG4的Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列內(nèi)的天冬酰胺(即對應(yīng)IgG1的Asn297)突變還令人驚奇地降低Fc-EPO融合蛋白質(zhì)對EPO受體的結(jié)合。不希望被理論所束縛，IgG2或IgG4的Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列內(nèi)的天冬酰胺(即對應(yīng)IgG1的Asn297)突變可以誘導(dǎo)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)內(nèi)全面的構(gòu)象改變，導(dǎo)致顯著改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包括CH2結(jié)構(gòu)域和至少一部分鉸鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)可以來自免疫球蛋白重鏈，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它類型。優(yōu)選地，鉸鏈區(qū)來自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它適宜種類。更加優(yōu)選地，鉸鏈區(qū)來自人IgG1重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG1鉸鏈區(qū)的Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys氨基酸序列內(nèi)的半胱氨酸發(fā)生改變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys氨基酸序列替換為Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包括來自第一種抗體同種型的CH2結(jié)構(gòu)域和來自第二種抗體同種型的鉸鏈區(qū)。在特定實(shí)施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域來自人IgG2或IgG4重鏈，而鉸鏈區(qū)來自改變的人IgG1重鏈。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分來自IgG序列，其中為了消除潛在的連接處T細(xì)胞表位，改變了恒定區(qū)C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser氨基酸序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，Leu-Ser-Leu-Ser氨基酸序列替換為Ala-Thr-Ala-Thr氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分來自IgG序列，其中C末端的賴氨酸殘基被替換了。優(yōu)選地，IgG序列C末端的賴氨酸被替換為非賴氨酸的氨基酸例如丙氨酸，以進(jìn)一步增加Fc融合蛋白質(zhì)的血清半壽期。
根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c部分可以包含一個(gè)或多個(gè)文中所描述的突變。Fc部分內(nèi)突變的組合通常對Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能具有累加或協(xié)同作效應(yīng)。因此，在一個(gè)典型實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含(i)來自IgG序列的區(qū)域，其中Lys-Ser-Lys-Ser氨基酸序列被替換為Ala-Thr-Ala-Thr氨基酸序列；(ii)代替賴氨酸的C末端丙氨酸殘基；(iii)來自不同抗體同種型的CH2結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，例如IgG2CH2結(jié)構(gòu)域和改變的IgG1鉸鏈區(qū)；(iv)消除IgG2衍生CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)糖基化位點(diǎn)的突變，例如IgG2衍生CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)代替Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列的Gln-Ala-Gln-Ser氨基酸序列。
Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素部分可以是全長野生型的或天然產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素、重組促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素樣分子，例如促紅細(xì)胞生成素的生物活性促紅細(xì)胞生成素片段、類似物、變體、突變體或衍生物。優(yōu)選地，促紅細(xì)胞生成素部分來自人促紅細(xì)胞生成素。在一些實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分可包含降低對EPO受體的結(jié)合親和力或增加促紅細(xì)胞生成素生物學(xué)活性的氨基酸修飾。在一些實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分包含至少一個(gè)以下突變Argl31→Glu和Argl39→Glu(氨基酸編號基于成熟人促紅細(xì)胞生成素序列)。在其它實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分包含至少一個(gè)以下突變His32→Gly、Ser34→Arg和Pro90→Ala。在又一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分具有不同于人促紅細(xì)胞生成素的二硫鍵模式。例如，促紅細(xì)胞生成素部分可包含一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸替代位置29替代成非半胱氨酸殘基、位置33替代成非半胱氨酸殘基、位置88替代成半胱氨酸殘基和位置139替代成半胱氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分在位置7、29、88和161處包含半胱氨酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分額外包含一個(gè)或多個(gè)以下替代His32→Gly、Cys33→Pro和Pro90→Ala。根據(jù)本發(fā)明，促紅細(xì)胞生成素部分可包含文中所述突變的任意組合。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)包括Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分之間的接頭。如果包括接頭，則接頭通常包含1至25個(gè)氨基酸，并且優(yōu)選不具有蛋白酶切割位點(diǎn)。接頭可包含N-連接的或O-連接的糖基化位點(diǎn)以阻止蛋白酶解。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包含Asn-Ala-Thr氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的方法。方法包括在適宜所編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下維持包含編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列的BHK細(xì)胞和回收所表達(dá)的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞培養(yǎng)于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中，核酸穩(wěn)定維持于BHK細(xì)胞中。通常，在BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的血清半壽期比在其它細(xì)胞系如NS/0、PerC6或293細(xì)胞產(chǎn)生的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)更長。
本發(fā)明提供包含產(chǎn)生于BHK細(xì)胞的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于藥物組合物的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)尚未進(jìn)行去除唾液酸殘基的處理。藥物組合物還包含可藥用載體。本發(fā)明還提供通過將藥物組合物施用于哺乳動(dòng)物而治療哺乳動(dòng)物的方法。在一些實(shí)施方案中，所治療的哺乳動(dòng)物患有造血障礙或缺陷。由于本發(fā)明的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有增加的體內(nèi)潛能和延長的血清半壽期，所以與包含天然產(chǎn)生或重組促紅細(xì)胞生成素或者產(chǎn)生于其它細(xì)胞的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物組合物相比，包含F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物組合物通常需要較低頻率的施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物施用少于每周三次(例如每周兩次、每周一次或者至多每10天一次，如每兩周一次、每月一次或每兩月一次)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供篩選穩(wěn)定維持編碼融合蛋白質(zhì)的核酸的BHK細(xì)胞的方法，其中融合蛋白質(zhì)包含F(xiàn)c部分和促紅細(xì)胞生成素部分。該方法包括將編碼潮霉素B的核酸序列和編碼融合蛋白質(zhì)的核酸序列導(dǎo)入BHK細(xì)胞；和在潮霉素B存在的條件下培養(yǎng)BHK細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼潮霉素B的核酸序列和編碼融合蛋白質(zhì)的核酸序列存在于一個(gè)核酸中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼潮霉素B的核酸序列和編碼融合蛋白質(zhì)的核酸序列存在于兩個(gè)單獨(dú)的核酸中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一群適宜施用于哺乳動(dòng)物的純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)包括Fc-EPO融合蛋白質(zhì)N末端的Fc部分和Fc-EPO融合蛋白質(zhì)C末端的促紅細(xì)胞生成素部分。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)是高度唾液酸化的，即每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均11-28個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選的高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)群體為每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均13-28、15-28、17-28、19-28或21-28個(gè)唾液酸殘基。例如，優(yōu)選的高度唾液酸化的一群Fc-EPO融合蛋白質(zhì)為每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均20-22個(gè)唾液酸殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)是在BHK細(xì)胞中合成的。在一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞適合懸浮生長。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞適合生長于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞適合于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮生長。與在例如NS/0、PerC6或293細(xì)胞中產(chǎn)生的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明提供的高度唾液酸化的一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有更長的血清半壽期。根據(jù)本發(fā)明，純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分可包含一個(gè)或多個(gè)文中所述的突變或修飾，這些突變或修飾為延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能提供的效應(yīng)與增強(qiáng)的唾液酸化作用所提供的效應(yīng)累加或協(xié)同。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含如文中所描述的高度唾液酸化的一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選的藥物組合物還包含可藥用載體。本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物的方法，包括將包含高度唾液酸化的一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物組合物施用于哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物的施用每周少于三次(例如每周兩次、每周一次或者至多每10天一次，如每兩周一次、每月一次或每兩月一次)。
總而言之，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容●純化的二聚化融合蛋白質(zhì)，基本上由包含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的人IgG分子的二聚化Fc部分和人促紅細(xì)胞生成素(EPO)組成，其中二聚化Fc部分的每條鏈通過其C末端直接與EPO分子的N末端相連或通過接頭肽與EPO分子的N末端相連，所述融合蛋白質(zhì)具有以下特性(i)分子高度唾液酸化，包含15-28個(gè)唾液酸殘基；(ii)CH2結(jié)構(gòu)域來自人IgG2且通過用Ala和Asn代替CH2結(jié)構(gòu)域的Gln-Phe-Asn-Ser序列段內(nèi)的氨基酸殘基Phe和Asn進(jìn)行修飾，因此形成CH2結(jié)構(gòu)域中的Gln-Ala-Gln-Ser序列，和(iii)用Ala-Thr-Ala-Thr代替CH3結(jié)構(gòu)域的C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser氨基酸序列。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中另外地將CH3結(jié)構(gòu)域的C末端Lys殘基用Ala代替。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)來自人IgG1。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中所述IgG1鉸鏈區(qū)通過用Ser殘基代替鉸鏈區(qū)的Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys序列段內(nèi)的氨基酸殘基Cys進(jìn)行修飾，從而形成鉸鏈區(qū)內(nèi)的序列Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中促紅細(xì)胞生成素部分包含至少一個(gè)以下氨基酸替代
(i)EPO分子位置29處替代成非半胱氨酸殘基，(ii)EPO分子位置33處替代成非半胱氨酸殘基，(iii)EPO分子位置88處替代成半胱氨酸殘基，和(iv)EPO分子位置139處替代成半胱氨酸殘基。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中EPO分子位置33處是非半胱氨酸殘基而不是原來的Cys殘基，并且EPO分子位置88處是Cys殘基而不是原來的Trp殘基，從而使融合蛋白質(zhì)內(nèi)的EPO部分能夠形成Cys29-Cys88二硫鍵。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中位置33處的非半胱氨酸殘基是Pro。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中EPO部分包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的突變(i)Arg131→Glu131(ii)Arg139→Glu139(iii)His32→Gly32(iv)Ser34→Arg34(v)Pro90→Ala90●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中接頭肽包含糖基化位點(diǎn)。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中糖基化位點(diǎn)包含Asn-Ala-Thr氨基酸序列。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其額外包含CH1結(jié)構(gòu)域。
●各個(gè)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中包括CH2、CH3且任選包括CH1的完整IgG分子來自IgG2并且鉸鏈區(qū)來自IgG1。
●各個(gè)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中包括CH2、CH3和鉸鏈區(qū)且任選地包括CH1的完整IgG分子來自IgG1。
●各個(gè)二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中融合蛋白質(zhì)具有18-24個(gè)、優(yōu)選20-22個(gè)唾液酸殘基。
●二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其包含序列
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO14).
●二聚化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其包含序列EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO15).
●編碼上面所指定融合蛋白質(zhì)的DNA分子。
●適宜治療哺乳動(dòng)物中造血障礙或缺陷的藥物組合物，其包含有效量的上面指定或權(quán)利要求書中指定的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)和任選的可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
●適宜施用于哺乳動(dòng)物的一群純化的高度唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)包含F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)N末端的Fc部分和Fc-EPO融合蛋白質(zhì)C末端的促紅細(xì)胞生成素部分，所述融合蛋白質(zhì)群體為每一個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均15-28個(gè)唾液酸殘基，并且通過將編碼各個(gè)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的DNA分子導(dǎo)入BHK細(xì)胞并表達(dá)、分離和純化相應(yīng)Fc-EOP融合蛋白質(zhì)群體獲得，其中所述群體與NS/0、PerC6或293細(xì)胞中合成的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)群體相比具有更長的血清半壽期。
●相應(yīng)一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中所述融合蛋白質(zhì)群體為每一個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均20-22個(gè)唾液酸殘基。
●相應(yīng)一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中BHK細(xì)胞適于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長或懸浮生長。
●生產(chǎn)一群高度唾液酸化的純化重組Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的方法，其中重組Fc-EPO融合蛋白質(zhì)包含F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)N末端的Fc部分和Fc-EPO融合蛋白質(zhì)C末端的促紅細(xì)胞生成素部分，所述方法包括以下步驟(i)構(gòu)建編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的DNA分子；(ii)在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中或懸浮培養(yǎng)基中用所述DNA分子轉(zhuǎn)化BHK細(xì)胞；(iii)表達(dá)由所述DNA分子所編碼的一群Fc-融合蛋白質(zhì)；(iv)收獲、分離和純化所述一群Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。
●相應(yīng)方法，其中所述合成的一群融合蛋白質(zhì)為每一個(gè)純化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均15-28個(gè)、優(yōu)選15-25個(gè)、更加優(yōu)選20-22個(gè)唾液酸殘基。
●篩選穩(wěn)定維持核酸序列的BHK細(xì)胞的方法，其中所述核酸編碼包含F(xiàn)c部分和促紅細(xì)胞生成素部分的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，該方法包括以下步驟(a)將編碼潮霉素B的核酸序列和編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列導(dǎo)入BHK細(xì)胞；和(b)在潮霉素B存在情況下培養(yǎng)BHK細(xì)胞。
●相應(yīng)方法，其中編碼潮霉素B的核酸序列和編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列存在于一個(gè)DNA分子內(nèi)。
附圖簡述

圖1A和1B圖示人IgG1、IgG2和IgG4恒定區(qū)氨基酸序列的比對。
圖2圖示小鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，顯示α相期間Fc-EPO劑量和Fc-EPO血清濃度降低量之間的相關(guān)性。在該實(shí)驗(yàn)中使用了在NS/0細(xì)胞中合成的低度唾液酸化Fc-EPO變體。
圖3圖示消除Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的潛在途徑和對可能調(diào)節(jié)這些途徑的融合蛋白質(zhì)的修飾。
圖4圖示在施用Fcg2h(FN＞AQ)-EPO之后小鼠中的典型血細(xì)胞比容反應(yīng)。
圖5圖示在施用BHK細(xì)胞所產(chǎn)生的Fcg2h-EPO、Fcg2h-EPO(NDS)、Fcg4h-EPO和Fcg4h(N＞Q)-EPO蛋白質(zhì)之后大鼠中的典型血細(xì)胞比容反應(yīng)。
圖6圖示在施用BHK細(xì)胞所產(chǎn)生的Fcg2h-EPO(NDS)、NS/0細(xì)胞所產(chǎn)生的Fcg2h-EPO(NDS)和NESP(即Aranesp)之后小鼠中的典型血細(xì)胞比容反應(yīng)。
圖7圖示編碼成熟Fc-EPO蛋白質(zhì)的典型核酸序列。
圖8圖示從BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h(N＞Q)-EPO和從NS/0細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h(N＞Q)-EPO在小鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。
圖9圖示從BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h-EPO(NDS)和從NS/0細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h-EPO(NDS)在小鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。
圖10圖示BHK-21細(xì)胞、PERC6細(xì)胞和293細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。
圖11圖示用BHK細(xì)胞所合成的Fcg2h(FNAQ)-EPO蛋白質(zhì)處理之后比格犬中的血細(xì)胞比容反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供具有改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。具體而言，本發(fā)明提供的Fc-EPO蛋白質(zhì)具有延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供BHK細(xì)胞所合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。已經(jīng)證明，與其它細(xì)胞系如NS/0、PerC6或293細(xì)胞中產(chǎn)生的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，BHK細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有顯著延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一群高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。與具有較低水平唾液酸化的一群相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比，一群高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有更長的血清半壽期。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)可在Fc部分內(nèi)包含延長Fc融合蛋白質(zhì)血清半壽期的氨基酸修飾(例如通過基本上降低或消除Fc受體結(jié)合活性)或者降低補(bǔ)體結(jié)合活性的修飾。此外，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)還可在促紅細(xì)胞生成素部分內(nèi)包含降低EPO受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或增加促紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)活性的氨基酸修飾。
Fc-EPO融合蛋白質(zhì)如文中所使用，“Fc-EPO融合蛋白質(zhì)”指包含至少2個(gè)通常不存在于同一多肽內(nèi)部分(即Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分)的多肽。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分的多肽形成同型二聚體；因此，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)通常是由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起的二聚體，每條多肽鏈包含一個(gè)Fc部分和一個(gè)促紅細(xì)胞生成素部分。然而，本發(fā)明Fc-EPO融合蛋白質(zhì)可具有允許促紅細(xì)胞生成素部分與Fc部分穩(wěn)定結(jié)合并保持促紅細(xì)胞生成素活性的任意構(gòu)型。例如，此類構(gòu)型包括(但不限于)包含2個(gè)Fc部分和2個(gè)促紅細(xì)胞生成素部分的單一多肽、包含2個(gè)Fc部分和1個(gè)促紅細(xì)胞生成素部分的單一多肽、包括一個(gè)包含F(xiàn)c部分和促紅細(xì)胞生成素部分的多肽和包含F(xiàn)c部分的另一個(gè)多肽的異二聚體蛋白質(zhì)，以及其它適當(dāng)構(gòu)型。
促紅細(xì)胞生成素部分可以多種構(gòu)型與Fc部分直接或間接相連。在一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分通過共價(jià)鍵與Fc部分直接連接。例如，促紅細(xì)胞生成素部分可與Fc部分的C末端或其N末端融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分的C末端與促紅細(xì)胞生成素部分的N末端融合，即Nterm-Fc-Cterm-Nterm-EPO-Cterm。在該構(gòu)型中，F(xiàn)c部分位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的N末端且促紅細(xì)胞生成素部分位于C末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素的C末端與Fc部分的N末端融合，即Nterm-EPO-Cterm-Nterm-Fc-Cterm。在該構(gòu)型中，促紅細(xì)胞生成素部分位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的N末端而Fc部分位于C末端。
在其它實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分與Fc部分間接連接。例如Fc-EPO融合蛋白質(zhì)可包括Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分之間的接頭(L)。與直接融合相似，促紅細(xì)胞生成素部分優(yōu)選通過接頭與Fc部分的C末端融合，即Nterm-Fc-Cterm-L-Nterm-EPO-Cterm。因此，F(xiàn)c部分位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的N末端并且通過接頭與位于C末端的促紅細(xì)胞生成素部分分開。備選地，促紅細(xì)胞生成素部分可通過接頭與Fc部分的N末端融合，即Nterm-EPO-Cterm-L-Nterm-Fc-Cterm。
Fc部分如文中所使用，“Fc部分”包括來自免疫球蛋白、優(yōu)選人免疫球蛋白恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，包括恒定區(qū)的片段、類似物、變體、突變體或衍生物。適當(dāng)免疫球蛋白包括IgGI、IgG2、IgG3、IgG4和其它種類。免疫球蛋白的恒定區(qū)定義為天然產(chǎn)生或合成產(chǎn)生的與免疫球蛋白C末端區(qū)域同源的多肽，并且可分別或組合地包括CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域或CH4結(jié)構(gòu)域。人IgG1、IgG2和IgG4恒定區(qū)的序列比對顯示于圖1A和1B。根據(jù)Paul，(1999)Fundamental Immunology第4版，Lippincott-Raven，CH1結(jié)構(gòu)域包括氨基酸118-215；鉸鏈區(qū)包括氨基酸216-230；CH2結(jié)構(gòu)域包括氨基酸231-340；CH3結(jié)構(gòu)域包括氨基酸341-447(氨基酸位置基于IgG1的序列)。鉸鏈區(qū)將CH1結(jié)構(gòu)域與CH2和CH3結(jié)構(gòu)域連接。
在本發(fā)明中，F(xiàn)c部分一般至少包括CH2結(jié)構(gòu)域。例如Fc部分可包括鉸鏈-CH2-CH3。備選地，F(xiàn)c部分可包括鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域的全部或部分。
免疫球蛋白的恒定區(qū)負(fù)責(zé)許多重要的抗體功能，包括Fc受體(FcR)結(jié)合和補(bǔ)體結(jié)合。存在5個(gè)主要類別的重鏈恒定區(qū)，分類為IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每一種類具有由同種型指定的特征性效應(yīng)功能。例如，IgG分為4個(gè)γ亞類γ1、γ2、γ3和γ4，也分別稱為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
IgG分子與多種類型細(xì)胞受體相互作用，包括對IgG類抗體特異的3類Fcγ受體(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII。已經(jīng)報(bào)道，用于將IgG結(jié)合至FcγR受體的重要序列位于CH2和CH3結(jié)構(gòu)域中。抗體的血清半壽期受到抗體與Fc受體(FcR)結(jié)合能力的影響。同樣，免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的血清半壽期也受結(jié)合此類受體能力的影響(Gillies SD等人，(1999)Cancer Res.592159-66)。與IgG1的那些結(jié)構(gòu)域相比，IgG2和IgG4的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域具有生物化學(xué)不可檢測的或降低的Fc受體結(jié)合親和性。已經(jīng)報(bào)道，與包含IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)融合蛋白質(zhì)相比，包含IgG2或IgG4的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有更長的血清半壽期(美國專利號5,541,087；Lo等人，(1998)ProteinEngineering，11495-500)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域來自具有降低的受體結(jié)合親和性和效應(yīng)功能的抗體同種型，例如IgG2或IgG4。更加優(yōu)選的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域來自IgG2。
鉸鏈區(qū)通常位于重鏈恒定區(qū)的C末端至CH1結(jié)構(gòu)域。在IgG同種型中，二硫鍵一般出現(xiàn)于該鉸鏈區(qū)內(nèi)，允許形成最終的四聚體分子。在該區(qū)域中脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸占優(yōu)勢。當(dāng)本發(fā)明中包括鉸鏈區(qū)時(shí)，則鉸鏈區(qū)一般為至少與天然產(chǎn)生免疫球蛋白的區(qū)域同源，該區(qū)域包括形成連接2個(gè)Fc部分的二硫鍵的半胱氨酸殘基。人和小鼠免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的代表性序列可在Borrebaeck，C.A.K.編，(1992)ANTIBODY ENGINEERING，A PRACTICAL GUIDE，W.H.Freeman and Co.中找到。對于本發(fā)明適宜的鉸鏈區(qū)可來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其它免疫球蛋白種類。IgG1鉸鏈區(qū)具有3個(gè)半胱氨酸，其中2個(gè)參與形成免疫球蛋白2條重鏈之間的二硫鍵。這些相同的半胱氨酸允許Fc部分之間形成有效的和穩(wěn)定的二硫鍵。因此，本發(fā)明優(yōu)選的鉸鏈區(qū)來自IgG1，更優(yōu)選來自人IgG1。在一些實(shí)施方案中，人IgG1鉸鏈區(qū)內(nèi)的第一個(gè)半胱氨酸被突變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸，優(yōu)選為絲氨酸。IgG2同種型鉸鏈區(qū)具有4個(gè)二硫鍵，它們在重組系統(tǒng)的分泌過程中傾向于促進(jìn)寡聚化和可能不正確二硫鍵的形成。適宜鉸鏈區(qū)可來自IgG2鉸鏈；最開始2個(gè)半胱氨酸的每一個(gè)優(yōu)選地突變成另一種氨基酸。已知IgG4的鉸鏈區(qū)可效率低地形成鏈間二硫鍵。然而，本發(fā)明適宜的鉸鏈區(qū)可來自IgG4鉸鏈區(qū)，優(yōu)選包含提高重鏈來源部分間二硫鍵正確形成的突變(Angal S等人，(1993)Mol.Immunol.，30105-8)。
根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c部分可包含來自不同抗體同種型的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，即雜合Fc部分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含來自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域和來自IgG1的突變體鉸鏈區(qū)。備選地，來自另一IgG亞類的突變體鉸鏈區(qū)用于雜合Fc部分。例如，可使用允許在2條重鏈之間形成有效二硫鍵的突變體形式的IgG4鉸鏈。突變體鉸鏈也可來自IgG2鉸鏈，其中最開始的2個(gè)半胱氨酸的每一個(gè)被突變成另一種氨基酸。此類雜合Fc部分有助于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)和改善Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的正確組裝。此類雜合Fc部分的組裝已經(jīng)描述于美國專利公布號20030044423(即美國申請?zhí)?0/093,958)，其公開在文中引用作為參考。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含通常延長Fc融合蛋白質(zhì)血清半壽期的氨基酸修飾。此類氨基酸修飾包括基本降低或消除Fc受體結(jié)合活性或補(bǔ)體結(jié)合活性的突變。例如，可以去除免疫球蛋白重鏈的Fc部分內(nèi)的糖基化位點(diǎn)。在IgG1中，糖基化位點(diǎn)是Asn297。在其它免疫球蛋白同種型中，糖基化位點(diǎn)對應(yīng)著IgG1的Asn297。例如，在IgG2和IgG4中，糖基化位點(diǎn)是氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser內(nèi)的天冬酰胺。因此，IgG1的Asn297的突變?nèi)コ藖碜訧gG1的Fc部分內(nèi)的糖基化位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將Asn297替換為Gln。同樣，在IgG2或IgG4中，氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser內(nèi)天冬酰胺的突變?nèi)コ藖碜訧gG2或IgG4重鏈的Fc部分內(nèi)的糖基化位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案，天冬酰胺替換為谷氨酰胺。在其它實(shí)施方案中，進(jìn)一步將氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser內(nèi)的苯丙氨酸進(jìn)行突變以去除由于天冬酰胺突變而產(chǎn)生的潛在的非自身T細(xì)胞表位。例如，IgG2或IgG4重鏈內(nèi)的氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser被替換為Gln-Ala-Gln-Ser氨基酸序列。
還已經(jīng)觀察到，F(xiàn)c部分和非Fc部分的連接附近的氨基酸的改變顯著增加Fc融合蛋白質(zhì)的血清半壽期(PCT公布號WO 01/58957，其公開內(nèi)容在文中引用作為參考)。因此，本發(fā)明Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的連接區(qū)域包含一些改變，相對于免疫球蛋白重鏈和促紅細(xì)胞生成素天然產(chǎn)生序列，這些改變優(yōu)選地位于連接點(diǎn)處的大約10個(gè)氨基酸內(nèi)。這些氨基酸改變可引起疏水性的增加，例如通過將Fc部分的C末端賴氨酸改變成疏水氨基酸，如丙氨酸或亮氨酸。
在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含在免疫球蛋白重鏈Fc部分C末端附近Leu-Ser-Leu-Ser區(qū)段的氨基酸改變。Leu-Ser-Leu-Ser區(qū)段的氨基酸替代消除了潛在的連接處T細(xì)胞表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fc部分C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser氨基酸序列被替換為Ala-Thr-Ala-Thr氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，Leu-Ser-Leu-Ser區(qū)段內(nèi)的氨基酸被替代為其它氨基酸，例如甘氨酸或脯氨酸。產(chǎn)生IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它免疫球蛋白類分子C末端附近Leu-Ser-Leu-Ser區(qū)段的氨基酸替代的詳細(xì)方法已經(jīng)描述于美國專利公布號20030166877(即，美國專利申請?zhí)?0/112,582)，其公開內(nèi)容在文中引用作為參考。
促紅細(xì)胞生成素部分如文中所使用，“促紅細(xì)胞生成素部分”包括來自人和其它物種的野生型或天然產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素、重組促紅細(xì)胞生成素和促紅細(xì)胞生成素樣分子，包括促紅細(xì)胞生成素的生物活性促紅細(xì)胞生成素片段、類似物、變體、突變體或衍生物。
野生型或天然產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素是刺激紅細(xì)胞從促紅細(xì)胞生成素前體細(xì)胞生長和發(fā)育的34KD糖蛋白激素。野生型或天然產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素作為對低氧(例如由于貧血癥形成的紅細(xì)胞損失)的反應(yīng)產(chǎn)生于腎臟并通過與其相關(guān)細(xì)胞受體相互作用而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生長和分化。野生型或天然產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素可從血液(Miyake T.等人，(1977)J.Biol.Chem.，2525558-5564)、血漿(Goldwasser，E.等人，(1971)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，68697-698)或尿液分離并純化。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)可產(chǎn)生重組或化學(xué)合成的促紅細(xì)胞生成素。兩種形式的重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)是商業(yè)可得的Amgen的EPOGEN和Johnson & Johnson的PROSCRIT。
如文中所使用，促紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)活性定義為通過與促紅細(xì)胞生成素受體相互作用而刺激細(xì)胞增殖的能力。促紅細(xì)胞生成素的功能測定可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。例如，促紅細(xì)胞生成素的體外活性可在基于細(xì)胞的測定法中進(jìn)行測試。具體而言，基于TF-1細(xì)胞增殖測定法可確定促紅細(xì)胞生成素活性。TF-1細(xì)胞表達(dá)EPO受體。通過氚化胸腺嘧啶的摻入所確定的TF-1細(xì)胞的增殖是促紅細(xì)胞生成素活性的函數(shù)(Hammerlling等人，(1996)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，141455；Kitamura等人，(1989)J.Cellular Physiol，140323)?；诩?xì)胞的體外測定法詳細(xì)描述于實(shí)施例6。體內(nèi)測定法一般在動(dòng)物模型例如小鼠和大鼠中進(jìn)行。體內(nèi)測定法的實(shí)例包括(但不限于)血細(xì)胞比容(HCT)測定法和網(wǎng)織紅細(xì)胞測定法。HCT測定法測量取自促紅細(xì)胞生成素處理動(dòng)物的血液樣品的紅細(xì)胞的體積，并且通過在毛細(xì)管中離心血液并測量沉淀的紅細(xì)胞所占據(jù)的總體積的分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定。體內(nèi)HCT測定法詳細(xì)描述于實(shí)施例8。網(wǎng)織紅細(xì)胞測定法測量新紅細(xì)胞，其也稱為網(wǎng)織紅細(xì)胞，這些細(xì)胞新近已經(jīng)從前體細(xì)胞分化并仍然具有前體細(xì)胞特征核酸的殘余。通過用核酸染色染料如吖啶橙或噻唑橙染色后在流式細(xì)胞測定儀上分選紅細(xì)胞并計(jì)數(shù)陽性染色網(wǎng)織紅細(xì)胞部分來測量網(wǎng)織紅細(xì)胞。
生物活性或功能活性促紅細(xì)胞生成素樣分子一般與野生型或天然產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素的對應(yīng)序列具有氨基酸序列相似性或同一性(例如至少大約55％、大約65％、大約75％的同一性，一般至少大約80％并且最一般是大約90-95％的同一性)，并且擁有其野生型促紅細(xì)胞生成素的一種或多種功能。
因此，認(rèn)為本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素特異性地包括具有與野生型促紅細(xì)胞生成素的序列類似的氨基酸序列的促紅細(xì)胞生成素多肽。此類蛋白質(zhì)在文中定義為促紅細(xì)胞生成素類似物。文中定義的“類似物”是指與野生型促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列具有足夠相似性并且具有該蛋白質(zhì)生物活性的氨基酸序列。例如，促紅細(xì)胞生成素的類似物可在野生型促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，但仍然擁有例如刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生或成熟的能力。此類氨基酸改變的實(shí)例包括氨基酸殘基的添加、缺失或替代。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素還包括突變體蛋白質(zhì)，其呈現(xiàn)出比野生型促紅細(xì)胞生成素更強(qiáng)或更弱的生物學(xué)活性，例如描述于美國專利號5,614,184。
本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素還包括促紅細(xì)胞生成素的生物活性片段。此類片段可以僅包括促紅細(xì)胞生成素全長氨基酸序列的一部分但仍然具有生物學(xué)活性。如文中所使用，“生物活性片段”意思是指可以產(chǎn)生與全長蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)效應(yīng)的片段。通過氨基和羧基末端缺失以及內(nèi)部缺失可產(chǎn)生此類片段。它們還包括截短和雜合形式的促紅細(xì)胞生成素?！敖囟獭毙问绞歉绦问降拇偌t細(xì)胞生成素，例如氨基末端或羧基末端被去除的促紅細(xì)胞生成素。
促紅細(xì)胞生成素序列內(nèi)的改變氨基酸修飾可引入到本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素部分中以降低對EPO受體的結(jié)合親合性；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、增強(qiáng)正確的活性構(gòu)象的采用；增強(qiáng)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性；增強(qiáng)合成作用；或者提供其它有利特性。例如，通過促紅細(xì)胞生成素和EPO受體之間的結(jié)合親合性確定EPO受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。人促紅細(xì)胞生成素和EPO受體復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)證明，促紅細(xì)胞生成素與其受體的結(jié)合是通過促紅細(xì)胞生成素表面的正電荷和EPO受體上的負(fù)電荷控制的。Syed等人，(1998)Nature，395511。為了降低結(jié)合的結(jié)合率(on-rate)，可導(dǎo)入突變以代替位于促紅細(xì)胞生成素-EPO受體接觸面附近的帶正電荷的氨基酸。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，人促紅細(xì)胞生成素的Arg131和Arg139中一個(gè)或兩個(gè)均可被替換(EPO序列的氨基酸編號基于成熟人EPO)。優(yōu)選地，Arg131和Arg139被替換為谷氨酸、天冬氨酸或其它非正電荷氨基酸。可向其它物種促紅細(xì)胞生成素中引入突變以替換對應(yīng)于人促紅細(xì)胞生成素Arg131和Arg139的氨基酸。然而，為了保留EPO的生物學(xué)活性，當(dāng)在EPO氨基酸序列內(nèi)進(jìn)行改變時(shí)應(yīng)避開EPO-EPO受體相互作用中心的那些殘基。
備選地，通過丙氨酸掃描誘變?nèi)藗兡軌蚋鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)確定將耐受氨基酸替代的那些區(qū)域或位置(Cunningham等人，(1989)Science，244，1081-1085)。在該方法中，將所選擇的氨基酸殘基個(gè)別替換為中性氨基酸(例如丙氨酸)以便確定對生物學(xué)活性的影響。
在一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分包含至少一個(gè)以下突變His32→Gly和/或Ser34→Arg，以及Pro90→Ala。在其它實(shí)施方案中，在促紅細(xì)胞生成素中引入半胱氨酸替代以改變半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵的模式，導(dǎo)致形成新二硫鍵(“NDS突變”)。天然產(chǎn)生的人促紅細(xì)胞生成素(其為哺乳動(dòng)物促紅細(xì)胞生成素中所獨(dú)特的)恰恰在位置7、29、33和161上具有4個(gè)半胱氨酸，它們形成2個(gè)二硫鍵。可改變促紅細(xì)胞生成素部分中半胱氨酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)。為了產(chǎn)生改變的二硫鍵，將一個(gè)半胱氨酸殘基突變成為結(jié)構(gòu)上相容的氨基酸如丙氨酸或絲氨酸，并且在三維結(jié)構(gòu)中接近的第二個(gè)氨基酸被突變成為半胱氨酸。例如，氨基酸Gln86、Pro87、Trp88、Glu89和Leu91之一能夠被Cys替換。如果Trp88被Cys被替換且Cys33被替換成為另一個(gè)氨基酸，則促紅細(xì)胞生成素部分將形成在人EPO中不存在的Cys29-Cys88二硫鍵。該鍵導(dǎo)致產(chǎn)生比具有典型Cys29-Cys33二硫鍵的融合蛋白質(zhì)的活性更高的融合蛋白質(zhì)。此外，當(dāng)在融合蛋白質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素部分內(nèi)存在其它突變時(shí)，與Cys29-Cys33融合蛋白質(zhì)相比，Cys29-Cys88融合蛋白質(zhì)在活性上表現(xiàn)出顯著增加。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分包括至少一個(gè)以下氨基酸替代位置29處替代成非半胱氨酸殘基、位置33處替代成非半胱氨酸殘基、位置88處替代成半胱氨酸殘基和位置139處替代成半胱氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分包含位置7、29、88和161處的半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分還包含一個(gè)或多個(gè)以下替代His32→Gly、Cys33→Pro和Pro90→Ala。在備選的實(shí)施方案中，通過將2個(gè)氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釋⑷碌亩蜴I加入到蛋白質(zhì)中。為了補(bǔ)償Cys突變可能引起的結(jié)構(gòu)變形，在本發(fā)明優(yōu)選的Cys工程化實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素部分還包含被設(shè)計(jì)成減少這些潛能變形的突變。
涉及半胱氨酸替代的其它實(shí)施方案描述于PCT公布號WO 01/36489(即美國申請系列號09/708,506)，其所公開的內(nèi)容在文中引用作為參考。
將突變引入促紅細(xì)胞生成素的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，通過定點(diǎn)誘變技術(shù)可引入突變。重要的是應(yīng)注意到，多種定點(diǎn)誘變技術(shù)是可用的并且能夠用作備選方案以獲得相似結(jié)果。其它技術(shù)包括(但不限于)隨機(jī)或半隨機(jī)突變發(fā)生。
接頭本發(fā)明的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)在Fc部分和促紅細(xì)胞生成素部分之間可包括接頭分子，優(yōu)選肽接頭。具有接頭的融合蛋白質(zhì)可以具有改善的特性，例如增加的生物學(xué)活性。接頭通常包含1至25個(gè)氨基酸(例如5至25個(gè)或者10至20個(gè)氨基酸)?？蓪⒔宇^設(shè)計(jì)成不包括蛋白酶裂解位點(diǎn)。而且，接頭可包含N-連接或O-連接糖基化位點(diǎn)以便在空間上抑制蛋白酶解。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包含Asn-Ala-Thr氨基酸序列。
另外的適宜接頭公開于Robinson等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；95,5929和美國專利申請系列號09/708,506。
糖基化作用表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的天然產(chǎn)生的人促紅細(xì)胞生成素和重組促紅細(xì)胞生成素包含3個(gè)N-連接寡糖鏈和1個(gè)O-連接寡糖鏈。N-連接糖基化發(fā)生于位于位置24、38和83處的天冬酰胺殘基，而O-連接糖基化發(fā)生于位于位置126處的絲氨酸殘基(Lai等人，(1986)J.Biol.Chem.，2613116；Broudy等人，(1988)Arch.Biochem.Biohhys.，265329)。已經(jīng)表明，寡糖鏈已用末端唾液酸殘基進(jìn)行了修飾。N-連接鏈一般每條鏈具有多至4個(gè)唾液酸而O-連接鏈具有多至2個(gè)唾液酸。因此促紅細(xì)胞生成素多肽總共可以包含多達(dá)14個(gè)唾液酸。
唾液酸是N-連接或O-連接寡糖上的末端糖。唾液酸化作用的程度隨每個(gè)位點(diǎn)、每個(gè)蛋白質(zhì)而變化，并且可以依賴于所使用的細(xì)胞培養(yǎng)條件、細(xì)胞類型和特定細(xì)胞克隆而變化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在BHK細(xì)胞中合成的本發(fā)明Fc-EPO融合蛋白質(zhì)是高度唾液酸化的。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整BHK細(xì)胞在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長、懸浮生長或者在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮生長可以進(jìn)一步增強(qiáng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的唾液酸化程度。其它某些通常使用的細(xì)胞系如NS/0、PerC6或293細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。由于唾液酸殘基帶有高度的負(fù)電荷，通過等電聚焦(IEF)凝膠電泳可以確定從不同細(xì)胞系產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)唾液酸化的程度；IEF凝膠電泳的細(xì)節(jié)描述于實(shí)施例5B。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法，通過凝集素-結(jié)合研究還可以定性驗(yàn)證不同細(xì)胞系產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的唾液酸化程度。凝集素-結(jié)合測定法的實(shí)例描述于一般地，本發(fā)明高度唾液酸化的一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)為每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均11-28個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選的一群高度唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)為每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均13-28、15-28、17-28、19-28或21-28個(gè)唾液酸殘基。例如，一個(gè)優(yōu)選高度唾液酸化群的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)為每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均20-22個(gè)唾液酸殘基。另一優(yōu)選群的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)為每個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均23-28個(gè)唾液酸殘基。
唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)確定紅細(xì)胞生成刺激因子的體內(nèi)生物學(xué)活性的最重要因素之一是蛋白質(zhì)的血清濃度保持在紅細(xì)胞生成所必需閾值之上的時(shí)間長度，該閾值是通過紅細(xì)胞生成刺激因子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)確定的。高度唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜不同于天然產(chǎn)生或重組促紅細(xì)胞生成素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。主要的不同在于高度唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有更長的血清半壽期和更慢的清除率，因而導(dǎo)致體內(nèi)生物學(xué)潛能的增加。不希望受到理論的束縛，申請者為唾液酸殘基增加了促紅細(xì)胞生成素分子上的負(fù)電荷，導(dǎo)致降低與帶負(fù)電荷的EPO受體結(jié)合的結(jié)合率和EPO受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，從而延長血清半壽期。而且，唾液酸還阻止促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)被脫唾液酸糖蛋白受體內(nèi)吞，其中脫唾液酸糖蛋白受體可結(jié)合具有暴露的半乳糖殘基的糖蛋白。
一般而言，治療性分子如促紅細(xì)胞生成素的大多數(shù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜顯示，在施用后血清濃度存在初始下降(α相)，接著逐漸降低(β相)。
影響α相的因素根據(jù)小分子藥物代謝動(dòng)力學(xué)理論，α相定義描述分子如何劃分入血液外區(qū)室的分布體積。在α相中觀察到的下降對于不同細(xì)胞系所合成的不同F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)變化很大。在理論上，差異可能是由于分布體積的變化，或者由于區(qū)室內(nèi)運(yùn)輸?shù)淖兓斐傻?。無論如何，已經(jīng)觀察到在小鼠中Fc-EPO蛋白質(zhì)的唾液酸化程度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為之間存在相關(guān)性。例如，BHK細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)是高度唾液酸化的，并且顯示出最好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜，NS/0細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)是稍微有些唾液酸化的并且具有中等的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。293和PerC6細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有很少或者不具有唾液酸并且具有差的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜，其特征為在最開始的30分鐘內(nèi)血清濃度下降大約100倍。因此，影響特定Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的α相的關(guān)鍵因素是糖基化種類的分布和唾液酸化水平。唾液酸化不足的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)迅速消失。
此外，如圖2所示，α相期間Fc-EPO血清濃度下降的程度隨劑量而改變，表明該行為是可飽和的且最有可能是受體介導(dǎo)的。介導(dǎo)α相降低的受體有可能既不是EPO受體也不是Fc受體，而是另一種受體如脫唾液酸糖蛋白受體。由于Aranesp存在額外的N-連接糖基化位點(diǎn)，所以其具有增加的負(fù)電荷，因此與正常人促紅細(xì)胞生成素相比，Aranesp具有降低的EPO受體結(jié)合親和性。無論如何，Aranesp和正常人促紅細(xì)胞生成素的α相期間的下降相似。另外，由于祖紅細(xì)胞細(xì)胞表面的EPO受體數(shù)量通常僅為大約200個(gè)，在比圖2中所用的那些促紅細(xì)胞生成素劑量更低的劑量時(shí)這些受體便完全飽和。Fc受體或許不可能介導(dǎo)α相內(nèi)的急劇降低，因?yàn)榫哂刑腔稽c(diǎn)消除突變(如對應(yīng)IgG1的Asn297的氨基酸突變)的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)仍然顯示在α相內(nèi)急劇降低。此外，盡管不聚集時(shí)的IgG2CH2區(qū)通常不與Fc受體結(jié)合，但包含IgG2CH2區(qū)的Fc-EPO蛋白質(zhì)仍然顯示在α相內(nèi)顯著下降。
不希望受理論的束縛，α相期間Fc-EPO融合蛋白質(zhì)血清濃度的下降可以由脫唾液酸糖蛋白受體經(jīng)過脫唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而介導(dǎo)。唾液酸化不足的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)包含能夠被脫唾液酸糖蛋白受體結(jié)合的暴露半乳糖殘基，從而導(dǎo)致脫唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。結(jié)果，唾液酸化不足的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)可迅速消失。
影響β相的因素β相中Fc-EPO融合蛋白質(zhì)血清濃度的下降與α相中的下降相比較平穩(wěn)。例如，在小鼠中，施用后8至24小時(shí)之間，觀察到Fc-EPO融合蛋白質(zhì)血清濃度下降2至3倍。在不同細(xì)胞系合成的不同F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)之間，β相期間下降的差異也是不太明顯的。然而，與在α相中一樣，唾液酸化程度與β相中藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為相關(guān)。例如，BHK細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)與NS/0細(xì)胞中合成的在其它方面相同的Fc-EPO蛋白質(zhì)相比具有顯著改善的β相。EPO受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用至少部分負(fù)責(zé)β相中Fc-EPO融合蛋白質(zhì)血清濃度的下降。盡管Aranesp(與正常人促紅細(xì)胞生成素相比其具有降低的EPO受體結(jié)合親和性)和正常人促紅細(xì)胞生成素具有相似的α相譜，但是正常人促紅細(xì)胞生成素相比，Aranesp具有顯著改善的β相。
本發(fā)明Fc-EPO融合蛋白質(zhì)與天然產(chǎn)生或重組促紅細(xì)胞生成素相比通常呈現(xiàn)出改善的β相，表明Fc部分的加入顯著減慢β相中血清濃度的下降。還已經(jīng)觀察到，F(xiàn)c部分或促紅細(xì)胞生成素部分內(nèi)的某些氨基酸修飾可顯著改善β相。例如，消除Fc部分內(nèi)糖基化位點(diǎn)的突變改善了Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的β相。增加促紅細(xì)胞生成素部分穩(wěn)定性的突變(例如在促紅細(xì)胞生成素部分內(nèi)的工程改造的二硫鍵突變，如NDS突變)顯著改善Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的β相。一般而言，改善的β相延長Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的終末血清半壽期。
消除Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的途徑從機(jī)體消除促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)分子有幾種可能的途徑。通過腎臟過濾作用和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用能夠從機(jī)體消除野生型或天然產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)分子。內(nèi)吞的促紅細(xì)胞生成素被有效地降解。如圖3所描繪，將Fc部分加入到促紅細(xì)胞生成素部分中預(yù)期可基本削除Fc-EPO融合蛋白質(zhì)通過腎臟的排泄。結(jié)果，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是消除Fc-EPO融合蛋白質(zhì)消除的主要途徑。而且，將Fc部分加入到促紅細(xì)胞生成素部分還預(yù)期可減少內(nèi)化后的降解，因?yàn)镕cRn內(nèi)體受體有望使融合蛋白質(zhì)再循環(huán)返回細(xì)胞外。
原則上，至少3種類型的受體可介導(dǎo)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的清除，即Fc受體、EPO受體和脫唾液酸糖蛋白受體。將Fc部分內(nèi)的IgG1來源的CH2用IgG2來源的CH2結(jié)構(gòu)域代替將顯著降低Fc-EPO融合蛋白質(zhì)通過Fc受體的清除。與IgG1來源的CH2結(jié)構(gòu)域相比，IgG2來源的CH2結(jié)構(gòu)域?qū)cγRI(對IgG具有最高親和力)的親和力低大約100倍。IgG2來源的CH2和FcγRI之間的相互作用在絕大多數(shù)結(jié)合測定中是檢測不到的。然而，IgG2來源的CH2結(jié)構(gòu)域的殘余FcγR結(jié)合活性仍然可以在Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的清除中起作用，因?yàn)橄鼵H2結(jié)構(gòu)域中糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺突變進(jìn)一步降低Fc-受體結(jié)合并改善Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。
NDS突變具有穩(wěn)定促紅細(xì)胞生成素結(jié)構(gòu)的作用，結(jié)果可以預(yù)計(jì)DNS突變可降低內(nèi)化后Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的降解。包含NDS突變的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性和增加的血清半壽期。
唾液酸化作用增加Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的負(fù)電荷，導(dǎo)致降低Fc-EPO融合蛋白質(zhì)對EPO受體的結(jié)合親和性。唾液酸化作用還降低Fc-EPO融合蛋白質(zhì)上暴露的半乳糖殘基的數(shù)量，導(dǎo)致降低Fc-EPO融合蛋白質(zhì)對脫唾液酸糖蛋白受體的親和性。因此，如圖3中所描繪，唾液酸化作用降低EPO受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和脫唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。因此高度唾液酸化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有急劇減慢的清除率，導(dǎo)致血清半壽期顯著增加。
Fc部分的加入、Fc和促紅細(xì)胞生成素部分的改變以及唾液酸化中的每一種均降低Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的清除。對清除和血清半壽期的組合效應(yīng)是可疊加的或倍增的。
Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的體外活性和體內(nèi)潛能在基于細(xì)胞的測定法中可測試Fc-EPO蛋白質(zhì)的體外活性。具體而言，基于TF-1細(xì)胞增殖測定法可確定Fc-EPO和EPO受體之間的相互作用。TF-1細(xì)胞表達(dá)EPO受體，因此，通過氚化胸腺嘧啶摻入所確定的TF-1細(xì)胞的增殖是促紅細(xì)胞生成素活性的函數(shù)(Hammerlling等人，(1996)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，141455；Kitamura等人，(1989)J.Cellular Physio.，140323)。在本發(fā)明中，TF-1細(xì)胞增殖是促紅細(xì)胞生成素部分和EPO受體之間相互作用的函數(shù)。具體而言，如果Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素部分具有降低的EPO受體結(jié)合率，則在基于細(xì)胞的測定法中Fc-EPO蛋白質(zhì)通常具有降低的活性(標(biāo)志為增加的ED50值)。
來自基于細(xì)胞的測定法的數(shù)據(jù)(其相對容易獲得)通常與Fc-EPO蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)潛能相關(guān)。降低的體外活性(表明降低的EPO受體結(jié)合率)通常與改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性和增強(qiáng)的體內(nèi)潛能相關(guān)。相反，增加的體外活性(標(biāo)志為降低的ED50值)表明增強(qiáng)的EPO受體結(jié)合率，通常與較差的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性和降低的體內(nèi)潛能相關(guān)。
通過在動(dòng)物模型如小鼠和大鼠中進(jìn)行的測定法可以測量Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)生物學(xué)活性。體內(nèi)測定法的實(shí)例包括(但不限于)血細(xì)胞比容(HCT)測定法和網(wǎng)織紅細(xì)胞測定法。HCT測定法測量紅細(xì)胞(RBC)所占據(jù)的血液體積，通過在毛細(xì)管中離心血液并測量沉淀的RBC所占總體積的部分簡單地進(jìn)行測定。網(wǎng)織紅細(xì)胞是新的RBC，它們新近從前體細(xì)胞分化形成并且特征為包含來自前體細(xì)胞的剩余核酸。通過核酸染色染料(如吖啶橙或噻唑橙)染色后在流式細(xì)胞儀上分選紅細(xì)胞并對染色部分計(jì)數(shù)來測量網(wǎng)織紅細(xì)胞。一般地，每周測量血細(xì)胞比容和網(wǎng)織紅細(xì)胞兩次。
在某種意義上，網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)據(jù)是血細(xì)胞比容數(shù)據(jù)的一階導(dǎo)數(shù)。網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是紅細(xì)胞生產(chǎn)率的測量，而血細(xì)胞比容測量總紅細(xì)胞。在代表性的實(shí)驗(yàn)中，施用Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的動(dòng)物的血細(xì)胞比容將增加，然后返回到基線。當(dāng)血細(xì)胞比容高且所施用的Fc-EPO蛋白質(zhì)已經(jīng)從動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)消失時(shí)，由于紅細(xì)胞生成受到抑制，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)降低到基線以下。
通常在前體細(xì)胞被定型成為RBC之后4天，在骨髓中出現(xiàn)網(wǎng)織紅細(xì)胞。然而，在高水平促紅細(xì)胞生成素存在情況，網(wǎng)織紅細(xì)胞通常在施用1-3天后離開骨髓。
作為對注射Fc-EPO蛋白質(zhì)的反應(yīng)，動(dòng)物體內(nèi)血細(xì)胞比容增加，保持穩(wěn)定，然后返回到基線。此類血細(xì)胞比容反應(yīng)的例子顯示于圖4-6。在小鼠中降低的最大速率為每周大約7％的血液體積(其對應(yīng)小鼠中大約45天的RBC壽命)，并且在大鼠中降低的最大速率為每周大約5％的血液體積(其對應(yīng)大鼠中大約65天的RBC壽命)。當(dāng)缺乏RBC新合成時(shí)，推測降低的最大速率代表RBC的破壞。如果生物學(xué)活性Fc-EPO蛋白質(zhì)以高于紅細(xì)胞生成閾值的濃度維持于系統(tǒng)中，血細(xì)胞比容水平將保持較高并且不下降，即使生物學(xué)活性Fc-EPO的水平在藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中是不可檢測的。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性與蛋白質(zhì)的體內(nèi)潛能相關(guān)。如上所討論，本發(fā)明增強(qiáng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的全部特性還在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)體內(nèi)潛能。如表1中所顯示，此類特性包括例如Fc部分的加入、Fc部分內(nèi)糖基化位點(diǎn)的消除(例如對應(yīng)IgG1中Asn297位置的N→Q替代)、NDS突變導(dǎo)入促紅細(xì)胞生成素部分和通過在BHK細(xì)胞中進(jìn)行Fc-EPO蛋白質(zhì)合成的高水平唾液酸化。
表1影響Fc-EPO蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)活性的因素
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從BHK細(xì)胞制備的每個(gè)促紅細(xì)胞生成素部分、Fcg2h(FN→AQ)-Epo和Fcg2h-EPO(NDS)都顯示出最佳藥物代謝動(dòng)力學(xué)和最有效的體內(nèi)生物學(xué)活性。Fcg2h(FN→AQ)-Epo和Fcg2h-EPO(NDS)每個(gè)促紅細(xì)胞生成素部分都具有比Aranesp更長的血清半壽期和更有效的體內(nèi)活性。
Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的合成本發(fā)明的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)可在適當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞系，如人或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中產(chǎn)生。適當(dāng)細(xì)胞系包括(但不限于)幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷細(xì)胞)和COS細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用BHK細(xì)胞。
為了在適當(dāng)宿主細(xì)胞(例如BHK細(xì)胞)中表達(dá)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)重組分子技術(shù)首先將編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列導(dǎo)入表達(dá)載體。編碼促紅細(xì)胞生成素部分的序列優(yōu)選進(jìn)行密碼子優(yōu)化以便高水平表達(dá)。密碼優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素描述于PCT公布號WO 01/36489(即美國申請?zhí)?9/708,506)，其公開內(nèi)容在文中引用作為參考。編碼促紅細(xì)胞生成素部分的代表性核酸序列提供于SEQ IDNO1GCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTGCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACCGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAACATCACCGTGCCTGACACCAAAGTGAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTTGGCCAGCAGGCCGTAGAAGTGTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAACTGCATGTGGATAAAGCCGTGAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCCCTCCGCACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCCGGACAGGGGACAGATGA(SEQ ID NO1)編碼優(yōu)選Fc部分(例如包含來自IgG2的CH2結(jié)構(gòu)域和來自IgG1的鉸鏈區(qū)的Fc部分)的代表性核酸序列描述于美國專利公布號20030044423(即美國申請?zhí)?0/093,958)，其公開內(nèi)容在文中引用作為參考。
通常，編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列包括編碼信號肽(前導(dǎo)序列)的核酸序列。前導(dǎo)序列在分泌過程中被切除。編碼不具有前導(dǎo)序列的成熟Fc-EPO蛋白質(zhì)的代表性核酸序列(SEQ ID NO2)顯示于圖7。
適宜載體包括那些適宜在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體。例如，載體可以是質(zhì)?；虿《尽］d體一般將包含以下元件啟動(dòng)子和其它“上游”調(diào)節(jié)元件、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、多聚接頭位點(diǎn)和與在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中使用相容的選則標(biāo)記。載體還可以包含允許在原核宿主細(xì)胞中增殖并維持的元件。用于本發(fā)明的適宜載體包括(但不限于)pdCs-Fc-X及從其衍生的載體和phC10-Fc-X及從其衍生的載體。
通過標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，包括轉(zhuǎn)染和病毒技術(shù)，將編碼Fc-EPO蛋白質(zhì)的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。通過轉(zhuǎn)染意思是利用分離的DNA、RNA或合成的核苷酸多聚體將遺傳信息轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。適宜的轉(zhuǎn)染方法包括(但不限于)磷酸鈣介導(dǎo)的共沉淀(Sambrook等人(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(例如來自Rockville(Maryland)Life Technologies的Lipofectamine Plus)、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)、溶菌酶融合或紅細(xì)胞融合、刮術(shù)(scraping)、直接攝入、等滲或蔗糖休克、直接顯微注射、間接顯微注射例如經(jīng)紅細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)、原生質(zhì)體融合或者通過給宿主細(xì)胞施加電流(例如電穿孔)，僅舉這幾個(gè)為例。不要認(rèn)為上面所列轉(zhuǎn)染方法的是毫無遺漏的，無疑，可開發(fā)用于將遺傳信息導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法。
為了易于篩選包含編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸的宿主細(xì)胞，一般將編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸與選擇標(biāo)記一起導(dǎo)入。選擇標(biāo)記可以由存在于編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的同一載體上的核酸序列編碼。備選地，選擇標(biāo)記可以由存在于不同載體上的核酸序列編碼。在后一情況下，通過共轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)導(dǎo)可將兩種載體共同導(dǎo)入宿主細(xì)胞。適宜的選擇標(biāo)記包括例如潮霉素B(Hyg B)和二氫葉酸還原酶(DHFR)。
瞬時(shí)表達(dá)對于小規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)和Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的快速分析是有用的。將包含編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列的宿主細(xì)胞維持在適宜所編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法、條件和培養(yǎng)可用于維持表達(dá)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對于大規(guī)模生產(chǎn)、高水平表達(dá)和其它目的通常是優(yōu)選的。穩(wěn)定維持的核酸可以任意多種結(jié)構(gòu)存在于宿主細(xì)胞中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定維持的核酸序列被整合入宿主細(xì)胞的染色體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定維持的核酸序列可作為染色體外排列、人工染色體或以另一種適宜結(jié)構(gòu)存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，BHK細(xì)胞用于合成Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞，將編碼融合蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼選擇標(biāo)記的核酸序列導(dǎo)入BHK細(xì)胞，優(yōu)選通過電穿孔、原生質(zhì)體融合或脂質(zhì)體方法進(jìn)行。編碼融合蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼選擇標(biāo)記的核酸序列可存在于同一表達(dá)載體上。備選地，編碼融合蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼選擇標(biāo)記的核酸序列可存在于分開的載體上。對于建立穩(wěn)定的BHK細(xì)胞，優(yōu)選的選擇標(biāo)記是Hyg B。還可使用其它選擇標(biāo)記，例如DHFR。在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基，例如從Life Technologies可獲得的MEM+FBS、DMEM/F-12培養(yǎng)基或VP-SFM以及其他適當(dāng)培養(yǎng)基中，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆在適當(dāng)濃度Hyg B(例如200、250或300μg/ml)存在下生長從而分離和增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)檢測測定法(例如ELISA檢測、Western印跡、斑點(diǎn)印跡)或其它適當(dāng)?shù)臏y定法，可檢測來自上清液和培養(yǎng)基的樣品中的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。篩選高表達(dá)的克隆并進(jìn)行大規(guī)模增殖。
一般地，BHK是貼壁細(xì)胞系，且通常生長于含血清的培養(yǎng)基中，例如MEM+10％的熱滅活肽牛血清(FBS)。然而可將BHK調(diào)整適應(yīng)于懸浮生長和在無血清培養(yǎng)基中生長，例如VP-SFM(Invitrogen Corp.，目錄編號11681-020)或Opti-Pro SFM(Invitrogen Corp.，目錄編號12309)。代表性的適應(yīng)過程描述于實(shí)施例3。適應(yīng)生長于無血清培養(yǎng)基中的BHK細(xì)胞可進(jìn)一步調(diào)整適應(yīng)于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基例如DMEM/F-12(Invitrogen Corp.，目錄編號11039-021)中生長。一個(gè)代表性的調(diào)整適應(yīng)過程描述于實(shí)施例3。優(yōu)選地，向DMEM/F-12中添加適當(dāng)氨基酸和其它成分，例如谷氨酰胺、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物如HyPep 4601(Quest International，目錄編號5Z10419)和HyPep 1510(Quest International，目錄編號5X59053)、乙醇胺(Sigma，目錄編號E0135)和托酚酮(Sigma，目錄編號T7387)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定常規(guī)實(shí)驗(yàn)中每種補(bǔ)充物的適當(dāng)濃度。
在生長于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的BHK細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)在較大程度上被唾液酸化，并且比在含血清培養(yǎng)基(例如MEM+FBS)或者在無血清但有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基(例如VP-SFM)中生長的細(xì)胞所合成的相應(yīng)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出更加均質(zhì)。此外，如此獲得的Fc-EPO蛋白質(zhì)基本上是非聚集的，即大約總產(chǎn)量的98％是非聚集的。在生長于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基的BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)量與在生長于含血清培養(yǎng)基的BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)量相似，即大約10微克/毫升(μg/ml)。因此，懸浮生長和/或在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的生長提供了大量優(yōu)點(diǎn)，包括1)由增加的唾液酸化而產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)；和2)易于下游的純化過程，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可從懸浮生長和在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中進(jìn)行純化。
純化按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)GMP方法進(jìn)行Fc-EPO的純化。蛋白質(zhì)通常純化為均質(zhì)或接近均質(zhì)。通常優(yōu)選層析純化，例如涉及柱層析的那些層析純化。通常，F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)的純化方案可以包括(但不限于)最初的蛋白質(zhì)捕獲步驟；病毒滅活步驟；一種或多種精煉步驟；病毒去除步驟；以及蛋白質(zhì)濃縮和/或配制步驟。例如，與融合蛋白質(zhì)Fc部分的層析樹脂結(jié)合的材料可用于捕獲Fc-EPO蛋白質(zhì)。適宜樹脂材料包括(但不限于)與Protein A的樹脂偶聯(lián)。可包括精煉步驟以去除污染成分。例如可使用羥磷灰石層析、Sepharose Q層析、大小排阻層析或疏水相互作用層析以去除污染物。一種使用基于Protein A柱的層析來結(jié)合Fc部分并純化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的純化方法描述于實(shí)施例12，該方法對于病毒滅活和去除是任選的方法。純化的蛋白質(zhì)通常利用超濾濃縮至預(yù)期濃度；滲濾入適當(dāng)?shù)闹苿┚彌_液；過濾除菌和分裝于小瓶中。
施用藥物組合物和施用途徑本發(fā)明還提供包含按照本發(fā)明產(chǎn)生的Fc-EPO蛋白質(zhì)的藥物組合物。這些藥物組合物可用于刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生并預(yù)防和治療貧血癥。通過本發(fā)明可以治療的疾病包括與腎臟功能減退或損失(慢性腎衰竭)相關(guān)的貧血癥、與骨髓抑制治療如化學(xué)治療藥物或抗病毒藥物(如AZT)相關(guān)的貧血癥、與非骨髓癌進(jìn)程相關(guān)的貧血癥、與病毒感染(例如HIV)相關(guān)的貧血癥和慢性病貧血癥。也可以治療在健康個(gè)體中導(dǎo)致貧血癥的狀況例如外科手術(shù)過程中的預(yù)期失血。通常，使用rHuEpo可治療的任何狀況也使用本發(fā)明Fc-EPO融合蛋白質(zhì)進(jìn)行治療。
包含F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)的制劑通常，制劑包含F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)、緩沖液以及液體或固體形式的表面活性劑。固體制劑包括(但不限于)冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或噴霧干燥制劑。液體制劑優(yōu)選地基于水，但還可包含其它成分，例如乙醇、丙醇、丙二醇或甘油，僅舉這幾個(gè)為例。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)GMP方法將Fc-EPO蛋白質(zhì)配制成水液體。通常，通過將限定體積的包含適當(dāng)濃度的適當(dāng)成分的水溶液混合生產(chǎn)制劑。例如，制劑一般包含0.1-200μg/ml、優(yōu)選0.2-10μg/ml、更加優(yōu)選0.5-6μg/ml濃度的Fc-EPO蛋白質(zhì)。
緩沖液成分包括能夠調(diào)節(jié)pH的任何生理可用物質(zhì)，例如檸檬酸鹽、醋酸鹽、組氨酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽，及其各自的酸或堿或混合物。通常使用的緩沖液成分是檸檬酸鹽和/或其游離酸。制劑一般包含10-100mmol/l、優(yōu)選2-20mmol/l、更加優(yōu)選10mmol/l濃度的緩沖液成分。
用于Fc-EPO制劑的表面活性劑可以是在藥物組合物中用作表面活性劑的任何賦形劑，優(yōu)選聚乙烯山梨聚糖酯類(Tweens)，例如聚氧乙烯(20)-山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)-山梨糖醇酐單棕櫚酸酯和聚氧乙烯(20)-山梨糖醇酐單硬脂酸酯以及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。制劑一般包含0.001-1.0％w/v、優(yōu)選0.005-0.1％w/v、更加優(yōu)選0.01-0.5％w/v濃度的表面活性劑。
制劑還可包含一種或多種氨基酸。適宜氨基酸包括(但不限于)精氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c-EPO制劑包含甘氨酸，優(yōu)選地，氨基酸以鹽(例如鹽酸鹽)的形式使用。可應(yīng)用的氨基酸濃度為2-200mmol/L或者50-150mmol/L。
另外，制劑可包含糖類，例如蔗糖、海藻糖、山梨糖；抗氧化劑，例如抗壞血酸或谷胱甘肽；防腐劑，例如苯酚、間甲酚、羥苯甲酸甲酯或羥苯甲酸丙酯；三氯叔丁醇；硫柳汞；苯扎氯銨；聚乙二醇；環(huán)糊精和其它適宜成分。
等滲的Fc-EPO制劑是所期望的。例如制劑的摩爾滲透壓濃度可以在150-450mOsmol/kg的范圍內(nèi)。藥物制劑在預(yù)期貯存溫度(如2-8℃或者室溫)的預(yù)期貨價(jià)壽命內(nèi)必須是穩(wěn)定的。包含F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)的有用制劑是良好的生理可耐受性的，易于生產(chǎn)的，可以精確給藥的，并且在2℃-8℃或25℃貯存期間、多次凍融循環(huán)過程中和機(jī)械應(yīng)激(stress)以及其它應(yīng)激如在40℃貯存至少3個(gè)月期間是穩(wěn)定的。Fc-EPO制劑的穩(wěn)定性可在應(yīng)激測試(stress test)中檢測。代表性的應(yīng)激測試描述于實(shí)施例13。
施用包含按照本發(fā)明所產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的治療制劑可以通過任意途徑施用于哺乳動(dòng)物宿主。因此，當(dāng)適當(dāng)時(shí)，施用可以是口服或胃腸外給藥(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))，包括靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用途徑。另外，施用可通過大丸劑周期注射進(jìn)行或者可以通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用從體外貯存器(例如靜脈袋)連續(xù)進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑可以是藥物級的。也就是說，某些實(shí)施方案遵守施用于人所必須的純度和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在獸醫(yī)中的應(yīng)用也處于文中所使用的預(yù)定目標(biāo)范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的用于獸醫(yī)用途和人類醫(yī)療用途的治療制劑一般包括與可藥用載體和任選其它成分相關(guān)的此類治療劑。在與制劑其它成分相容的意義上，載體是“可接受的”并且對于其接受者是無害的。在這點(diǎn)上，可藥用載體旨在包括與藥物施用相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。此類介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的用途在本領(lǐng)域中是已知的。但如果任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容則屬例外，可以預(yù)期其在組合物中的用途。補(bǔ)充的活性化合物也可以摻入到組合物中。制劑可以方便地以劑量單位形式存在，并且可以通過藥學(xué)/微生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任意方法進(jìn)行制備。一般而言，一些制劑是通過將治療劑與液體載體或微細(xì)固體載體或兩者結(jié)合制備的，然后如果必要?jiǎng)t將產(chǎn)品制作成預(yù)期制劑。
將本發(fā)明的藥物組合物按配方制成與其預(yù)期施用途徑相容的制劑。施用途徑的實(shí)例包括口服或胃腸外施用，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、吸入(例如霧化后)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、含服和直腸施用。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可包括以下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)整張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。PH可用酸或堿調(diào)整，例如鹽酸或氫氧化鈉。
施用本發(fā)明Fc-EPO蛋白質(zhì)產(chǎn)品的優(yōu)選方法是通過胃腸外(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi))途徑施用并且所施用的組合物通常包括與可接受稀釋劑、載體和/或佐劑相組合的治療有效量的產(chǎn)品。預(yù)計(jì)有效劑量會(huì)取決于所治療的狀況而相當(dāng)大地變化，但是目前治療劑量預(yù)計(jì)在0.2-2μg/kg體重活性物質(zhì)的范圍內(nèi)。預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑如人血清白蛋白可用于本發(fā)明的藥物組合物，同樣也可使用標(biāo)準(zhǔn)載體如鹽水。適宜用于本發(fā)明組合物的佐劑材料包括獨(dú)立具有紅細(xì)胞生成刺激作用的化合物如睪酮、祖細(xì)胞刺激物、胰島素樣生長因子、前列腺素、5-羥色胺、環(huán)AMP、促乳素和三碘甲腺原氨酸，以及通常應(yīng)用于再生障礙性貧血治療的試劑例如美替諾龍、康力龍和諾龍。見例如Resegotti等人(1981)，Panminerva Medics，23，243-248；McGonigle等人，(1984)Kidney Int.，25(2)，437-444；Pavlovic-Kantera等人，(1980)Expt.Hemato.，8(增刊8)，283-291以及Kurtz，(1982)FEBSLetters，14a(1)，105-108。
也可預(yù)期作為佐劑的是報(bào)道具有增強(qiáng)Fc-EPO的作用或與其協(xié)同作用的物質(zhì)(例如腎上腺素激動(dòng)劑、甲狀腺激素、雄激素和BPA)以及指定為“肝臟紅細(xì)胞生成因子”的化合物類(見Naughton等人，(1983)Acta.Haemat.，69，171-179)和如Congote等人(Proceedings 7th InternationalCongress of Endocrinology，Quebec City，Quebec，1984年7月1-7日，摘要364；Congote(1983)，Biochem.Biophys.Res.Comm.，115(2)，447-483和Congote，(1984)，Anal.Biochem.，140，428-433)所描述的“erythrotropins”以及如Rothman，等人，(1982)，J.Surg.Oncol.，20，105-108中所述的“erythrogenins”。
通過在制藥領(lǐng)域中眾所周知的任意方法，例如描述于Remington’sPharmaceutical Sciences，(Gennaro，A.編)，Mack Pub.，1990中的方法，可以制備用于口服或胃腸外施用的有用溶液。用于胃腸外施用的制劑還可包括用于含服的甘油膽酸、用于直腸施用的甲氧基水楊酸酯或者用于陰道施用的檸檬酸。胃腸外制劑可裝于由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或者多重劑量容器。直腸施用的栓劑可通過將藥物與非刺激性賦形劑如可可油、其它甘油酯或者其它在室溫下為固體而在體溫下為液體的組合物相混合而制備。制劑還可包括例如聚二醇如聚乙二醇、植物來源的油類、氫化萘等等。直接施用的制劑可包括甘油或其它高粘度的組合物。用于這些治療劑的其它可能有用的胃腸外載體包括乙烯-醋酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵、植入性輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入施用的制劑可包含賦形劑如乳糖，或者可以是包含諸如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘油膽酸和脫氧膽酸的水溶液，或者以滴鼻劑形式施用的油溶液，或者是鼻內(nèi)應(yīng)用的凝膠。保留灌腸劑也可以用于直腸遞送。
適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(當(dāng)為水溶解性時(shí))或分散劑和用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散劑的的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用，適宜載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物可以是無菌的并且在一定程度上是流動(dòng)以便于注射。組合物在制造和貯存條件下是穩(wěn)定的并且可在抗諸如細(xì)菌和真菌的微生物污染作用下進(jìn)行保存。載體可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)及其適當(dāng)混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，通過施用包衣如卵磷脂、通過維持所需顆粒大小(在分散劑的情況下)和通過使用表面活性劑，可以維持適當(dāng)流動(dòng)性。通過多種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，可以預(yù)防微生物作用。在許多情況下，優(yōu)選的是在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化鈉。通過在組合物中包含延緩吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)可導(dǎo)致注射組合物吸收延長。
通過將在適當(dāng)溶劑中的所需量活性化合物與上面列舉的成分中的一種或組合相混合及隨后(如果需要)過濾除菌，可制備無菌注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入到無菌媒介物可制備分散劑，其中無菌媒介物包含基本分散介質(zhì)和上面列舉的其它所需成分。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生來自先前過濾除菌溶液的活性成分與任何額外的目的成分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用防止從機(jī)體快速排除的載體制備治療劑，例如控制釋放制劑，包括埋植劑和微囊化遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到?、生物適合性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。此類制劑的制備方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。材料還可從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商業(yè)獲得。脂質(zhì)體懸浮液也可用作可藥用載體。它們可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如美國專利號.4,522,811中所描述的方法制備。還可使用微粒體和微顆粒。
口服或胃腸外施用組合物可按配方制成劑量單位形式以易于施用和統(tǒng)一劑量。劑量單位形式是指適合作為用于待治療受試者的單一劑量的物理不連續(xù)單位；每一單位包含預(yù)定數(shù)量活性化合物，經(jīng)計(jì)算與所需藥物載體組合可產(chǎn)生預(yù)期治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格可以指定并且直接依賴于活性化合物的獨(dú)特特征和所要達(dá)到的特定治療效果，以及在此類用于個(gè)體治療的活性化合物的配藥領(lǐng)域內(nèi)固有的局限性。
Fc-EPO的治療有效量和給藥頻率的確定通常，包含按照本發(fā)明所產(chǎn)生Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的治療劑可按配方制成用于以治療有效量向人或其它哺乳動(dòng)物胃腸外或口服施用的制劑，治療有效量即向靶組織提供適當(dāng)濃度藥物達(dá)到足以誘導(dǎo)預(yù)期效果的一段時(shí)間的量。更加具體而言，如文中所使用，術(shù)語“治療有效量”是指使血細(xì)胞比容增加至目標(biāo)血細(xì)胞比容或者目標(biāo)血細(xì)胞比容范圍，以便提供有利于患者或者備選地維持患者在目標(biāo)血細(xì)胞比容或目標(biāo)血細(xì)胞比容范圍內(nèi)的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的量。該量依個(gè)體不同而變化且取決于大量因素，包括患者的總體身體狀況、貧血癥的嚴(yán)重性和根本原因，以及各個(gè)患者的最終目標(biāo)血細(xì)胞比容。目標(biāo)血細(xì)胞比容一般為至少大約30％，或者在30％-38％的范圍內(nèi)，優(yōu)選超過38％并且更優(yōu)選40％-45％。對于rHuEpo的有關(guān)目標(biāo)血細(xì)胞比容范圍的一般指導(dǎo)方針還可見于標(biāo)注日期為12/23/96的EPOGEN包裝說明書內(nèi)，且其為30％-36％，或者備選地為其中所說明的32％-38％。應(yīng)該理解，此類目標(biāo)將依個(gè)體不同而改變，從而使醫(yī)生的判斷可以適于確定任意給定患者的實(shí)際目標(biāo)血細(xì)胞比容。雖然如此，確定目標(biāo)血細(xì)胞比容處于本領(lǐng)域的技術(shù)水平內(nèi)。
本領(lǐng)域的每個(gè)技術(shù)人員可以容易地確定Fc-EPO蛋白質(zhì)的治療有效量。實(shí)施例15提出一種臨床方案，作為該方案的一個(gè)目的，必需確定每周一次、每兩周一次和每月一次給藥的Fc-EPO的治療有效量。例如，每周一次或每兩周一次施用的劑量范圍是從大約0.075至大約4.5μgFc-EPO/kg/劑量。每月一次施用的劑量范圍是0.45-4.5μg Fc-EPO/kg/劑量。
待遞送的治療組合物中的本發(fā)明Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的有效濃度將取決于多種因素而改變，其中因素包括待施用藥物的最終預(yù)期劑量和施用途徑。待施用的優(yōu)選劑量還可能取決于這樣的一些變量，例如待治療疾病或適應(yīng)癥的類型和程度、特定患者的總體健康狀態(tài)、所遞送治療劑的相對生物效能(例如唾液酸化水平)、治療劑的配方、配方中賦形劑的存在和類型，以及施用途徑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑可使用一般劑量單位向個(gè)體提供，該一般劑量單位是從利用非人靈長類和嚙齒類進(jìn)行的哺乳動(dòng)物研究中推導(dǎo)出來的。如上所述，劑量單位是指能夠施用于患者并且可以容易操作和包裝的單一劑量，保留作為包含象這樣的治療劑或與固體或液體藥用稀釋劑或載體相混合的混合物的生理和生物學(xué)穩(wěn)定的單位劑量。
包含F(xiàn)c-EPO融合蛋白質(zhì)的治療劑的給藥頻率將依賴于所治療的狀況和目標(biāo)血細(xì)胞比容而改變，但通常將少于每周三次。給藥頻率可以是大約每周一次或兩次。定量給藥頻率還可以少于大約每周一次，例如大約每兩周一次(大約每14天一次)、每月一次或者每兩月一次。應(yīng)該理解，實(shí)際上使用的給藥頻率可以與文中所公開的頻率稍微有些不同，這是由于不同個(gè)體對促紅細(xì)胞生成素及其類似物的反應(yīng)上的變異；術(shù)語“大約”旨在反映此類改變。
本發(fā)明還提供施用治療有效量的鐵，以便在治療期間維持增加的紅細(xì)胞生成。基于使用rHuEpo進(jìn)行的治療，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定應(yīng)給定的量。另外，本發(fā)明的治療劑可單獨(dú)施用或者與已知對特定疾病或目的適應(yīng)癥具有有益作用的其它分子組合施用。僅作為實(shí)例，有用的輔助因子包括癥狀減輕輔助因子(包括殺菌劑、抗生素、抗病毒試劑和抗真菌劑)以及止痛劑和麻醉劑。
前體藥物本發(fā)明的治療劑還包括“前體藥物”衍生物。術(shù)語前體藥物是指母體分子的藥理學(xué)無活性(或部分無活性)衍生物，其需要在生物體內(nèi)進(jìn)行自發(fā)或酶促生物轉(zhuǎn)化以便釋放或活化活性成分。前體藥物是本發(fā)明治療劑的變體或衍生物，它們具有在代謝條件下可斷裂的基團(tuán)。當(dāng)前體藥物在生理?xiàng)l件下進(jìn)行溶劑分解或者進(jìn)行酶降解時(shí)，它們成為在體內(nèi)具有藥物活性的本發(fā)明治療劑。依賴于在生物體內(nèi)釋放或活化活性藥物成分所需的生物轉(zhuǎn)化步驟數(shù)，本發(fā)明前體藥物可以稱為單前體藥物、雙前體藥物、三前體藥物等等，并且指示前體類型形式中存在的功能性數(shù)目。前體藥物形式通常賦予可溶性、組織相容性或者在哺乳動(dòng)物生物體中緩慢釋放的優(yōu)點(diǎn)(見，Bundgard，(1985)Design of Prudrugs，第7-9、21-24頁，Elsevier，Amsterdam；Silverman，(1992)The Organic Chemistry of Drug Designand Drug Action，第352-401頁，Academic Press，San Diego，Calif.)。而且，本發(fā)明的前體藥物衍生物可與其它特征結(jié)合以增強(qiáng)生物利用度。
體內(nèi)表達(dá)通過體內(nèi)表達(dá)方法可以提供本發(fā)明的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。例如，編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸可以方便地向給患有造血障礙或缺陷的患者直接提供，或者先向離體細(xì)胞提供，隨后將活細(xì)胞施用于患者。本領(lǐng)域已知的體內(nèi)基因治療方法包括提供純化的DNA(例如在質(zhì)粒中)、提供在病毒載體中的DNA或者提供脂質(zhì)體或其它囊泡中的DNA(見例如美國專利號5,827,703(其公開了用于基因治療的脂類載體)和美國專利號6,281,010其提供了用于基因治療的腺病毒載體))。
通過植入已經(jīng)進(jìn)行修飾以表達(dá)重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞來治療疾病的方法也是已知的。見例如美國專利號5,399,346，其公開了將核酸導(dǎo)入用于引入人體的原代人細(xì)胞的方法。
體內(nèi)表達(dá)方法特別用于不進(jìn)行純化而直接遞送蛋白質(zhì)到靶組織或細(xì)胞區(qū)室。在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，使用編碼Fc-EPO的序列的基因治療可用于多種疾病狀態(tài)、障礙和血液學(xué)不正常狀態(tài)，包括貧血癥，特別是對與慢性腎衰竭等等相關(guān)類型的貧血癥的矯正。編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列可以插入到適宜轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒中，并且可以作為裸DNA或者與適宜載體組合被導(dǎo)入宿主哺乳動(dòng)物中。通過核酸雜交、ELISA、western雜交，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它適當(dāng)方法，可實(shí)現(xiàn)對活性Fc-EPO蛋白質(zhì)生產(chǎn)的監(jiān)測。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在全身施用轉(zhuǎn)基因之后多數(shù)組織可發(fā)生轉(zhuǎn)化。將陽離子脂類載體/外源DNA復(fù)合體靜脈注射入哺乳動(dòng)物宿主后，已在多種組織，包括T淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、心臟內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(例如骨髓來源的造血細(xì)胞)中顯示有外源DNA的表達(dá)如美國專利號6,627,615中所描述的體內(nèi)基因治療遞送技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)是無毒的，并且已經(jīng)顯示在單一施用之后轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)至少60天。如通過Southern分析所測定，轉(zhuǎn)基因沒有以體內(nèi)可檢測水平整合入宿主細(xì)胞DNA，這表明用于基因治療的該種技術(shù)將不會(huì)通過改變正常細(xì)胞基因活化的引發(fā)癌癥的癌基因的表達(dá)或者關(guān)閉阻止癌癥的腫瘤抑制基因而在宿主哺乳動(dòng)物引起一些問題。
實(shí)施例實(shí)施例1.編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體編碼包含正常促紅細(xì)胞生成素部分的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒phC10-FcgZh(FN→AQ)-M1-EPO和編碼具有NDS突變的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)構(gòu)建如下。
為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高表達(dá)，對編碼人促紅細(xì)胞生成素的核酸序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。例如，SEQ ID NO3顯示了一個(gè)成熟人促紅細(xì)胞生成素的編碼序列的例子，其具有修飾的密碼子以優(yōu)化翻譯。5’末端的序列也進(jìn)行了修飾以包括易于亞克隆的Sma I位點(diǎn)。
SEQ ID NO3
CCCGGGtGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTgCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACcGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAAcATCACcGTgCCtGACACCAAAGTgAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTtGGcCAGCAGGCCGTAGAAGTgTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAaCTGCATGTGGATAAAGCCGTgAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGgGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCcCTCCGcACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTgcCGGACAGGGGACAGATGActcgag(小寫字母表示與野生型人促紅細(xì)胞生成素編碼序列不同的堿基。這些改變預(yù)期可增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平而不改變所表達(dá)蛋白質(zhì)的序列。)如PCT公布號WO 01/36489中所描述，通過定點(diǎn)誘變可將NDS突變導(dǎo)入促紅細(xì)胞生成素部分，其所公開的內(nèi)容在文中引用作為參考。例如，如WO 01/36489中所公開，使用了包含具突變形式的人促紅細(xì)胞生成素編碼序列的Xma I-Xho I DNA片段，其中突變導(dǎo)致氨基酸替代His32Gly、Cys33Pro、Trp88Cys和Pro90Ala。相應(yīng)蛋白質(zhì)序列顯示于SEQ ID NO4。
APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO4)如美國專利公布號20020147311和例如WO 01/058957中所描述，構(gòu)建了包含IgG2來源的CH2結(jié)構(gòu)域和IgG1來源的鉸鏈區(qū)的雜合Fc部分。
將編碼一種形式的促紅細(xì)胞生成素的Xma I-Xho I DNA片段插入質(zhì)粒載體，例如pdCs-Fc-X，該質(zhì)粒編碼來自IgG1的改變的鉸鏈區(qū)和來自IgG2的CH2和CH3區(qū)，除此之外還具有導(dǎo)致CH3的C末端區(qū)域內(nèi)氨基酸替代的兩套突變(文中稱為M1套突變)，以致于在CH3的C末端和EPO的N末端接點(diǎn)處的序列如下....TQKSATATPGA-APPRLI....(SEQ ID NO5)第一套突變公開于WO 02/079232，其將IgG2 CH3區(qū)域的序列KSLSLSPG(SEQ ID NO6)變成KSATATPG(SEQ ID NO7)。用Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO7的位置3至位置6)替換Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO6的位置3至位置6)的作用是去除潛在的人非自身T細(xì)胞表位，因?yàn)槿薋c和人促紅細(xì)胞生成素之間的接點(diǎn)包含非自身肽序列所以可以產(chǎn)生此非自身T細(xì)胞表位。第二套突變公開于WO 01/58957，其由在CH3區(qū)域C末端氨基酸處的由K至A的單一氨基酸替代組成。
Lo等人，(1998)Protein Engineering 11495描述了用于Fc融合蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)載體pdCs-Fc-X。通過用賦予潮霉素B抗性的基因替換賦予甲氨蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因編碼區(qū)域，從pdCs-Fc-X構(gòu)建質(zhì)粒phC10-Fc-X。使用引物5’-GCTAGCTTGGTGCCCTCATGAAAAAGCCTGAACTC-3’(SEQ ID NO8)和5’-ATGCATTCAGTTAGCCTCCCCCATC-3’(SEQ ID NO9)，通過從模板質(zhì)粒pCEP4(Invitrogen)PCR擴(kuò)增潮霉素B基因獲得了Nhe I/Nsi I潮霉素B DNA片段。將PCR片段克隆入TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen)，并對其序列進(jìn)行驗(yàn)證。
通過來自pdCs-Fcg2h-M1-EPO(NDS)的Nhe I/Afl I和Afl II/Nsi IDNA片段和Nhe I/Nsi I潮霉素B片段三部分連接產(chǎn)生了質(zhì)粒phC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)。
另外，通過PCR突變在IgG2重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Gln-Phe-Asn-Ser氨基酸序列內(nèi)導(dǎo)入了導(dǎo)致雙氨基酸替換“FN＞AQ”的突變，該突變可消除Fc部分內(nèi)潛在T細(xì)胞表位和N-連接糖基化。突變引物5’-AGCAGGCCCAGAGCACGTTCCGTGTGGT-3’(SEQ ED NO10)和5’-GAACGTGCTCTGGGCCTGCTCCTCCCGT-3’(SEQ ID NO11)分別與包含Sac II位點(diǎn)的下游引物5’-CCCCGCGGGTCCCACCTTTGG-3’(SEQID NO12)和包含Pvu II位點(diǎn)的上游引物5’-CCCAGCTGGGTGCTGACACGT-3’(SEQ ID NO13)配對，并且從模板DNA pdC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)擴(kuò)增得到了兩個(gè)重疊的DNA片段。在第二輪擴(kuò)增中，使用上游引物(SEQ ID NO13)和下游引物(SEQ IDNO12)從來自第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增得到包含突變(FN→AQ)的Pvu II/Sac II片段。將Pvu II/Sac II片段克隆入TA載體pCR2.1(Invitrogen)并證實(shí)其序列。將Pvu II/Sac II片段、來自pdC10-Fcg2h-M1-EPO的XhoI/Sac II片段和來自pdC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)的Xho I/Pvu II片段的三部分連接產(chǎn)生了構(gòu)建體pdC10-Fcg2h(FN＞AQ)-M1-EPO(NDS)。
為了將FN＞AQ突變導(dǎo)入質(zhì)粒phC10-Fcg2h-M1-EPO，將來自phC10-Fcg2h-M1-EPO和來自pdC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO的適當(dāng)DNA片段結(jié)合到一起。用Xho I和Xba I消化phC10-Fcg2h-M1-EPO和pdC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO，并將5.7kb的Xho I/Xba IphC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)片段與1.9kb的pdC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO片段相連接，產(chǎn)生phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO。
為了將FN→AQ突變導(dǎo)入質(zhì)粒phC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)，將來自phC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)和來自phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO的兩個(gè)適當(dāng)Xho I/Sma I消化片段連接到一起，產(chǎn)生phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)。
由pdC10-huFcg2h(FN→AQ)-M1-EPO所編碼的Fc-EPO的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO14。
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO14)由pdC10-huFcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)所編碼的Fc-EPO(NDS)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO15。
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO15)加下劃線的序列代表EPO部分，加雙下劃線序列代表IgG1鉸鏈，而無下劃線的序列代表修飾的IgG鏈的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，其中用斜體書寫的序列代表CH3結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例2.Fc-EPO在多種細(xì)胞系中的表達(dá)為了快速分析融合蛋白質(zhì)，通過標(biāo)準(zhǔn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，例如通過磷酸鈣介導(dǎo)的DNA共沉淀方法(Sambrook等人(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)或者通過使用Lipofectamine Plus(Life Technologies)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法并按照制造商的方案將質(zhì)粒phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)或phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO導(dǎo)入適當(dāng)組織培養(yǎng)細(xì)胞中。
為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞，通過電穿孔法將質(zhì)粒phC10-Fcg2h(FN-AQ)-M1-EPO(NDS)或phC10-Fcg2h(FNAQ)-M1-EPO導(dǎo)入BHK-21細(xì)胞。為了高效率電穿孔轉(zhuǎn)染，將生長于MEM培養(yǎng)基(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)所推薦添加了非必需氨基酸和丙酮酸鈉)的BHK-21細(xì)胞用PBS洗滌一次；將大約5×106細(xì)胞重懸于0.5ml PBS并與10μg線性化質(zhì)粒DNA在具有0.4cm電極間隙的Gene PulserTMCuvetter(BioRad，Hercules，CA)內(nèi)冰上孵育10分鐘。使用設(shè)置為0.25V和500μF的Gene PulserTM(BioRad，Hercules，CA)進(jìn)行電穿孔。將細(xì)胞在冰上恢復(fù)10分鐘，重懸于生長培養(yǎng)基中并置于兩塊96孔板上。轉(zhuǎn)染兩天后將潮霉素B(Hyg B)以300μg/ml的濃度加入生長培養(yǎng)基。每3天向細(xì)胞加一次潮霉素B，持續(xù)2-3次以上，并且在2-3周內(nèi)出現(xiàn)Hyg B抗性的穩(wěn)定克隆。
為了鑒定產(chǎn)生高水平Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定克隆，使用抗Fc的抗體通過ELISA測定來自克隆的上清液。分離高產(chǎn)量克隆并在含有300μg/mlHyg B的生長培養(yǎng)基中增殖。為了蛋白質(zhì)生產(chǎn)的目的，BHK-21細(xì)胞常規(guī)生長于經(jīng)補(bǔ)充的DMEM/F-12適宜培養(yǎng)基中或者生長于另一種適宜培養(yǎng)基例如VP-SFM(Life Technologies)中。通過標(biāo)準(zhǔn)正常流動(dòng)過濾法從條件培養(yǎng)基中收獲Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，并將澄清后的物質(zhì)貯存于4℃直到進(jìn)行進(jìn)一步純化。一般地，在轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)模式中，從BHK-21細(xì)胞獲得6-12μg/mlFc-EPO蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
還在NS/0細(xì)胞中表達(dá)并回收Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。通過先前描述于PCT公布號WO 01/36489中的方法，建立穩(wěn)定維持質(zhì)粒pdC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO或pdC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)的NS/0克隆，該公布的全部公開內(nèi)容在文中引用作為參考。一般地，從NS/0細(xì)胞獲得50-100μg/ml的Fc-EPO蛋白質(zhì)生產(chǎn)量。
實(shí)施例3.BHK細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于懸浮生長和/或在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長BHK是貼壁細(xì)胞系，通常生長于含血清的培養(yǎng)基中，例如MEM+10％熱滅活胎牛血清(FBS)。為了維持并擴(kuò)大培養(yǎng)BHK細(xì)胞，周期性(例如間隔4天)地使細(xì)胞脫離其基質(zhì)(一般通過胰酶-EDTA溶液的作用)，將細(xì)胞稀釋于新鮮培養(yǎng)基并重新接種于適當(dāng)容器中。然而，通過以下步驟可以將BHK細(xì)胞調(diào)整適應(yīng)于懸浮生長和在無血清和/或無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長。
在代表性的適應(yīng)過程中，首先將BHK細(xì)胞在MEM+FBS∶靶培養(yǎng)基的75∶25(v/v)混合物上生長直到指數(shù)生長期，隨后以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度在50∶50(v/v)、25∶75(v/v)且最終0∶100(v/v)的原培養(yǎng)基靶培養(yǎng)基中進(jìn)行亞培養(yǎng)。在適應(yīng)過程期間，通過目測檢測BHK細(xì)胞的生長。以下無血清培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性測試293SFM II(Invitrogen Corp.，目錄號11686-929)、CHO-S-SFM II(Invitrogen Corp.，目錄號12052-098)、VP-SFM(Invitrogen Corp.，目錄號11681-020)、Opti-Pro SFM(Invitrogen Corp.，目錄號12309)、CD Hybridoma(Invitrogen Corp.，目錄號11279-023)和H-SFM(Invitrogen Corp.，目錄號12045-076)。
在調(diào)整適應(yīng)過程中，為了將BHK細(xì)胞從貼壁細(xì)胞系轉(zhuǎn)換為懸浮細(xì)胞系，在每次傳代之前靜置培養(yǎng)混合物，并取出頂部25％的細(xì)胞懸液稀釋于新鮮培養(yǎng)基中。因?yàn)榫奂募?xì)胞比單一或雙聯(lián)細(xì)胞更快地沉降至培養(yǎng)容器底部，頂部25％的細(xì)胞懸液通常包含最少量聚集的那些細(xì)胞。因此，每次傳代擴(kuò)大并富集了聚集傾向更差的BHK細(xì)胞，并且通過該方法建立了表達(dá)Fc-EPO蛋白質(zhì)的BHK克隆的懸浮細(xì)胞系。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Fc-EPO蛋白質(zhì)的BHK細(xì)胞可調(diào)整適應(yīng)于在VP-SFM或Opti-PRO SFM無血清培養(yǎng)基中生長，并且獲得了懸浮培養(yǎng)物。表達(dá)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的BHK細(xì)胞不能在以下無血清培養(yǎng)基中生長293SFM II、CHO-S-SFM II、CD Hybridoma和H-SFM。
通過隨后將BHK細(xì)胞以適當(dāng)細(xì)胞密度培養(yǎng)于75∶25(v/v)、50∶50(v/v)、25∶75(v/v)和最終0∶100(v/v)的VP-SFM∶DMEM/F-12混合物中，將調(diào)整適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基(VP-SFM)的BHK細(xì)胞進(jìn)一步調(diào)整適應(yīng)生長于無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基如DMEM/F-12(Invitrogen Corp.，目錄號11039-021)中。無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基DMEM/F-12補(bǔ)充了谷氨酰胺(終濃度6mM)、2g/lHyPep 4601(Quest International，Chicago，IL，目錄號5Z10419)、2g/lHyPep 1510(Quest International，Chicago，IL，目錄號5X59053)、10μl/l(v/v)乙醇胺(Sigma，目錄號E0135)和5μM托酚酮(Sigma，目錄號T7387)。通過該方法獲得了有能力生長于已補(bǔ)充DMEM/F-12的穩(wěn)定表達(dá)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的BHK細(xì)胞系，并維持高的細(xì)胞生存力。
實(shí)施例4.蛋白質(zhì)聚集體狀態(tài)的純化和表征為了分析，通過基于Fc部分對Protein A的親和力的Protein A層析，從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化得到Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。將來自表達(dá)Fc-EPO蛋白質(zhì)的細(xì)胞的條件培養(yǎng)上清液裝載到預(yù)先平衡的Fast-Flow ProteinASepharose柱上。使用磷酸鈉緩沖液(150mM磷酸鈉，100mM NaCl，中性pH)充分洗滌柱子。用低pH(pH 2.5-3)磷酸鈉緩沖液(如上組成)洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)并立即中和洗脫級分。
為了評價(jià)由不同細(xì)胞系所產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)，通過分析型大小排阻層析(SEC)分析Protein A純化的樣品。通過HPLC-SEC(例如Super 3000 SW，TosoHaas，Montgomeryville，PA)以0.35ml/分的流率運(yùn)行15分鐘將樣品分級分離。從BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fc-EPO蛋白質(zhì)的相當(dāng)大部分(例如，多達(dá)總產(chǎn)量的90％至100％)是非聚集的。而且，通過還原SDS-PAGE(預(yù)制NuPAGE 4％-12％凝膠，NuPAGE，Novex)分析的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)樣品基本上顯示為單一條帶，表明產(chǎn)物在標(biāo)準(zhǔn)操作條件下是抗降解的。
通過如上所述的SDS-PAGE和分析型SEC還表征了從懸浮生長、在無血清培養(yǎng)基中生長和/或在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長的BHK細(xì)胞純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。與生長于含血清培養(yǎng)基的BHK細(xì)胞中所合成的蛋白質(zhì)一樣，這些蛋白質(zhì)基本上是不聚集和不降解的。
實(shí)施例5A.糖基化模式的表征人促紅細(xì)胞生成素中的絲氨酸126位于O-糖基化序列中，并且在所有哺乳動(dòng)物促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)中是保守的。然而，絲氨酸126為一個(gè)“松環(huán)”，其沒有靠著蛋白質(zhì)剩余部分緊密包裝。當(dāng)缺乏O-糖基化時(shí)，促紅細(xì)胞生成素的該區(qū)域?qū)Φ鞍酌附馓貏e敏感。
通過反相HPLC檢查了在不同細(xì)胞系中產(chǎn)生的Fc-EPO蛋白質(zhì)中Ser126處的O-糖基化的狀態(tài)。將樣品變性并還原，稀釋于0.1％三氟乙酸(TFA)，并且注射入反相HPLC柱(例如Vydac C4柱，Grace Vydac)。應(yīng)用乙腈中0.085％TFA內(nèi)的梯度并記錄蛋白質(zhì)樣品的保留時(shí)間。發(fā)現(xiàn)BHK-21細(xì)胞中合成的Fc-EPO和Fc-g2h(FN→AQ)-EPO產(chǎn)生兩個(gè)部分重疊的主峰(1號峰和2號峰)。通過肽譜作圖進(jìn)一步分析了峰級分。發(fā)現(xiàn)1號峰對應(yīng)在Ser126糖基化的Fc-EPO形式，如通過標(biāo)志性肽(36號肽)的缺乏所顯示，而2號峰對應(yīng)在Ser126未糖基化的Fc-EPO形式，如通過標(biāo)志性肽(36號肽)的存在所顯示。發(fā)現(xiàn)在BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fc-EPO分子中有大約60％的分子中Ser126是O-糖基化修飾的，這與已經(jīng)報(bào)道的天然存在EPO中的情況一致。而且，BHK細(xì)胞在所補(bǔ)充的無蛋白質(zhì)DMEM/F-12培養(yǎng)基中的生長對O-糖基化的頻率具有正作用。
實(shí)施例5B.唾液酸化模式的表征通過等電聚焦(IEF)凝膠電泳比較了在NS/0、BHK、293和PerC6細(xì)胞中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的唾液酸化程度。簡而言之，將濃縮至2μg/ml并(如果需要)進(jìn)行脫鹽的樣品加入到等體積IEF樣品緩沖液pH 3-7中，并且在垂直預(yù)制Novex pH 3-7 IEF凝膠(Novex，目錄號EC6655B/B2)上運(yùn)行2.5小時(shí)，第一個(gè)小時(shí)為100V，第二個(gè)小時(shí)為200V并在500V持續(xù)30分鐘。然后將凝膠固定、染色和脫色。
在一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)中，比較了以下樣品(樣品來自生長于含血清培養(yǎng)基的細(xì)胞)1.來自NS/0的Fcg2h-EPO(NDS)2.來自BHK-21的Fcg2h-EPO(NDS)3.來自BHK-21的Fcg2h-EPO4.來自BHK-21的Fcg2h(“Δlys”)-EPO5.來自BHK-21的Fcg4h(FN→AQ“ΔLys”)-EPO6.來自BHK-21的Fcg4h(“ΔLys”)-EPO在該組中，“ΔLys”是指Fc結(jié)構(gòu)域C末端的賴氨酸缺失(樣品4-6)。樣品1-3中該C末端賴氨酸突變?yōu)楸彼帷Ｒ虼嗽谌繕悠分腥狈υ揅末端賴氨酸并且在樣品之間沒有電荷差異。全部細(xì)胞作為貼壁細(xì)胞生長于含血清培養(yǎng)基中。
將樣品裝載到pH 3-7IEF凝膠上，并且與在pH 3.5、4.2、4.5、5.2、5.3、6.0和6.9處聚焦的標(biāo)準(zhǔn)(Serva Electrophoresis，德國)相比較。第一個(gè)樣品(來自NS/0的Fcg2h-EPO(NDS))作為等電點(diǎn)在大約pH 5.3和6.5之間的分布條帶遷移；最強(qiáng)的條帶存在于pH 6.0-6.1處。第二個(gè)樣品(來自BHK-21的Fcg2h-EPO(NDS))作為等電點(diǎn)在大約pH 4.6至pH 5.0的強(qiáng)條帶分布運(yùn)行，弱的條帶位于pH 5.0至大約pH 6.0；最強(qiáng)的條帶存在于pH 4.8-4.9處。第三個(gè)和第四個(gè)樣品(分別來自BHK-21的Fcg2h-EPO和來自BHK-21的Fcg2h(“ΔLys”)-EPO)都具有從大約pH 4.7至6.0的條帶分布，最強(qiáng)的條帶集中在大約pH 5.3處。第五個(gè)和第六個(gè)樣品分別來自BHK-21的Fcg4h(FN→AQ“ΔLys”)-EPO和來自BHK-21的Fcg4h(“ΔLys”)-EPO)具有與第二個(gè)樣品相似的聚焦模式，即作為等電點(diǎn)在大約pH 4.6至pH 5.0的強(qiáng)條帶分布運(yùn)行，弱的條帶位于pH 5.0至大約pH6.0。這些結(jié)果表明，BHK細(xì)胞中Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的合成通常產(chǎn)生比在NS/0細(xì)胞中合成的相同或相似產(chǎn)物明顯更加酸性的產(chǎn)物。
在其它實(shí)驗(yàn)中，來自BHK細(xì)胞的Fcg2h-M1-EPO(NDS)樣品用唾液酸苷酶處理，該酶從寡糖去除唾液酸。將所得到的唾液酸苷酶處理樣品在IEF凝膠上運(yùn)行，發(fā)現(xiàn)其聚焦為pH 6.9和更大的少數(shù)幾個(gè)條帶。將來自BHK細(xì)胞的經(jīng)唾液酸苷酶處理或不處理的樣品的條帶模式與來自NS/0細(xì)胞的樣品的條帶模式進(jìn)行比較，鑒定出了大約27種不同的唾液酸化類型。這27種類型與所預(yù)測的28種不同類型很好地對應(yīng)，它們是由于同型二聚體構(gòu)型中Fc-EPO融合蛋白質(zhì)唾液酸化程度的變化產(chǎn)生的。根據(jù)該分析，具有4-5個(gè)唾液酸殘基的Fcg2h-EPO pH 6.9標(biāo)記物一起聚焦，具有11-12個(gè)唾液酸殘基的Fcg2h-EPO同pH 6.0標(biāo)記物一起聚焦。已發(fā)現(xiàn)BHK細(xì)胞中合成的一群Fcg2h-EPO蛋白質(zhì)顯示為每個(gè)蛋白質(zhì)分子具有平均21個(gè)唾液酸殘基。相反，NS/0細(xì)胞中合成的一群Fc(g2h)-EPO蛋白質(zhì)顯示為每個(gè)蛋白質(zhì)分子具有平均大約10個(gè)唾液酸殘基。
在隨后的實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)Fc-EPO蛋白質(zhì)的BHK細(xì)胞被調(diào)整適應(yīng)于無血清生長條件和用于大規(guī)模生產(chǎn)的條件，例如懸浮條件。通過如上所述的IEF凝膠電泳，分析在無血清培養(yǎng)基中生長和懸浮生長的BHK細(xì)胞所產(chǎn)生的Fc-EPO蛋白質(zhì)。這些生長條件改變導(dǎo)致最強(qiáng)條帶的等電點(diǎn)最多僅改變0.1-0.3個(gè)pH單位。
通過IEF凝膠電泳同樣表征了在補(bǔ)充的DMEM/F-12無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)樣品。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的唾液酸化程度更大，并呈現(xiàn)出比從生長于無血清培養(yǎng)基如VP-SFM中的細(xì)胞獲得的相應(yīng)產(chǎn)物更加均質(zhì)的唾液酸化。
通過凝集素結(jié)合研究還定性證實(shí)了不同細(xì)胞系所產(chǎn)生的Fc-EPO蛋白質(zhì)的唾液酸化程度。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)SDS凝膠電泳首先分離Fc-EPO融合蛋白質(zhì)并進(jìn)行印跡，然后用識(shí)別不同糖部分的修飾凝集素(例如從RocheApplied Science，Indianapolis，IN商業(yè)獲得)進(jìn)行探測，然后將所結(jié)合凝集素顯色。適宜凝集素包括(但不限于)西洋接骨木(Sambusus nigra)凝集素(SNA)或朝鮮槐(Maackia amurensis)凝集素(MAA)(它們識(shí)別具有特殊鍵的唾液酸)以及曼陀羅(Datura strarnonium)凝集素(DAA)、花生凝集素(PNA)和榴蓮凝集素(它們識(shí)別糖部分的其它區(qū)域如O-聚糖核心)。基于凝集素結(jié)合測定，可以確定不同細(xì)胞系產(chǎn)生的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的唾液酸化水平。
實(shí)施例6.Fc-EPO變體的體外生物學(xué)活性在基于細(xì)胞的測定法中測試了不同F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)的體外活性。TF-1細(xì)胞系表達(dá)EPO受體，因此在適當(dāng)培養(yǎng)條件下，氚化胸腺嘧啶的摻入是EPO或EPO樣蛋白質(zhì)活性的函數(shù)(Hammerlling等人，(1996)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，141455；Kitamura等人，(1989)J.Cellular Physiol.，140323)。具體而言，將活躍的對數(shù)生長期的TF-1細(xì)胞在不含EPO的培養(yǎng)基中洗滌兩次，并且以大約104細(xì)胞/孔鋪于微孔板。然后將細(xì)胞在具有系列滴定稀釋的Fc-EPO變體的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。在測定細(xì)胞增殖前10小時(shí)，向孔中加入0.3μCi的3H-胸苷。作為對照，TF-1細(xì)胞也在重組人EPO和超糖基化EPO類似物Aranesp存在培養(yǎng)。測量放射性胸苷的摻入作為TCA可沉淀總數(shù)，如表2中所示，F(xiàn)cg2h-M1-EPO分子的活性與重組人EPO的活性是可比的。
從該數(shù)據(jù)可以得出一些一般性結(jié)論。與先前報(bào)道的結(jié)果相一致，CHO細(xì)胞產(chǎn)生的EPO的ED50為大約0.7ng/ml；這包括NIBSC EPO標(biāo)準(zhǔn)、來自R&D Systems的EPO和商品化的Procrit。Aranesp在體外活性顯著較差，經(jīng)推測這反映了由于其負(fù)電荷增加而降低了其結(jié)合率。與此相似，BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fc-EPO比NS/0細(xì)胞產(chǎn)生的Fc-EPO活性較差，這與如下觀察結(jié)果一致，即BHK細(xì)胞產(chǎn)生的Fc-EPO蛋白質(zhì)是高度唾液酸化的，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)上的負(fù)電荷增加。
表2
實(shí)施例7.Fc-EPO變體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析基于以下體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表征了在多種細(xì)胞系中合成的不同F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，如圖8中所示，將大約14μg的NS/0細(xì)胞和BHK細(xì)胞所合成的Fcg2h(N＞Q)-EPO蛋白質(zhì)靜脈內(nèi)施用于Swiss-Webster小鼠。在施用后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(例如T為施用后0、1/2、1、2、4、8和24小時(shí))收集血液樣品并且通過離心制備血清。使用抗Fc抗體通過ELISA確定了Fc-EPO的血清濃度。如圖8中所示，在施用后24小時(shí)，大于起始血清濃度10％的BHK來源Fc-EPO殘存于血清中，而低于起始血清濃度0.1％的NS/0來源Fc-EPO殘存于血清中。
使用NS/0細(xì)胞和BHK細(xì)胞中合成的Fcg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)。將大約14μg的NS/0細(xì)胞和BHK細(xì)胞所合成的Fcg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)靜脈內(nèi)施用于Swiss-Webster小鼠。在施用后0、1/2、1、2、4、8、24和36小時(shí)收集血液樣品，并且通過抗Fc ELISA測量血清中Fcg2h-EPO(NDS)的濃度。如圖9中所示，在施用后24小時(shí)，大于起始血清濃度10％的BHK來源Fcg2h-EPO(NDS)殘存于血清中，而低于起始血清濃度0.1％的NS/0來源Fcg2h-EPO(NDS)殘存于血清中。
還比較了BHK-21細(xì)胞、PERC6細(xì)胞和293細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h-EPO(NDS)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。具體而言，將表達(dá)Fcg2h-Epo(NDS)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入BHK、293和PERC6細(xì)胞。從不同細(xì)胞系純化所表達(dá)的Fcg2h-Epo(NDS)融合蛋白質(zhì)，并且以每只小鼠1.7微克的濃度靜脈內(nèi)注射入Swiss-Webster小鼠。在0、1/2、1、2、4、8、24、48和72小時(shí)取出血液樣品，并且通過抗Fc ELISA測量血清中Fcg2h-Epo(NDS)的濃度。如圖10中所示，在施用后24小時(shí)，大于起始血清濃度10％的BHK來源Fcg2h-EPO(NDS)殘存于血清中，而低于起始血清濃度1％的293細(xì)胞來源Fcg2h-EPO(NDS)殘存于血清中，并且PerC6細(xì)胞來源的Fcg2h-EPO(NDS)在血清中幾乎檢測不到。使用BHK、PerC6和293細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h(N→Q)-EPO蛋白質(zhì)獲得了相似的結(jié)果。
在小鼠中進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)，以便比較Fcg2h(N→Q)-EPO、Fcg2h-EPO(NDS)、Fcg2h-EPO和Aranesp(即NESP)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。此處所使用的Fc-EPO變體是由BHK細(xì)胞合成的。在施用后48小時(shí)，觀察到低于起始血清濃度10％的Aranesp殘存于血清中，而大于起始血清濃度10％的Fcg2h(N→Q)-EPO和Fcg2h-EPO(NDS)殘存于血清中。這些結(jié)果表明，BHK-21細(xì)胞產(chǎn)生的Fcg2h(N→Q)-EPO和Fcg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)具有比Aranesp更長的血清半壽期。
實(shí)施例8.Fc-EPO變體的體內(nèi)潛能在小鼠和大鼠中，通過血細(xì)胞比容(HCT)測定法和網(wǎng)織紅細(xì)胞測定法測量了不同F(xiàn)c-EPO變體的體內(nèi)生物學(xué)活性。
在一個(gè)HCT實(shí)驗(yàn)中，將BHK細(xì)胞合成的Fcg2h(FN→AQ)-EPO蛋白質(zhì)以20μg/kg和10μg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射CD1小鼠。在第4、7、11和14天，從小鼠獲得血液樣品并在毛細(xì)管中離心。沉淀RBC的量測定為占總體積的分?jǐn)?shù)。如圖4所圖解說明，對于Fcg2h(FN＞AQ)-EPO蛋白質(zhì)注射的反應(yīng)，血細(xì)胞比容首先急劇增加，然后穩(wěn)定維持，最后降低。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將BHK細(xì)胞合成的下列蛋白質(zhì)腹膜內(nèi)注射Sprague-Dawley大鼠。所有動(dòng)物以42.5μg/kg的劑量給藥。
1.Fcg2h-EPO2.Fcg2h-EPO(NDS)3.Fcg4h-EPO4.Fcg4h(N＞Q)-EPO如上所述，對從注射鼠獲得的血液樣品進(jìn)行HCT測定。如圖5所示，作為對Fcg2h-EPO(NDS)和Fcg2h-EPO的反應(yīng)，注射大鼠中血細(xì)胞比容的量穩(wěn)定維持延長的一段時(shí)間，這表明Fcg2h-EPO(NDS)和Fcg2h-EPO蛋白質(zhì)具有延長的血清半壽期和潛在的體內(nèi)生物學(xué)活性。還可發(fā)現(xiàn)，如圖5所示，與Fcg2h-EPO(NDS)和Fcg2h-EPO蛋白質(zhì)相比，F(xiàn)cg4h-EPO和Fcg4h(N→Q)-EPO表現(xiàn)出更短的穩(wěn)定階段和血清濃度更快的降低。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將下列樣品腹膜內(nèi)注射人CD1小鼠。
1.劑量為85μg/kg、42.5μg/kg和21.25μg/kg的來自BHK細(xì)胞的Fcg2h-EPO(NDS)2.劑量為85μg/kg、42.5μg/kg和21.25μg/kg的來自NS/0細(xì)胞的Fcg2h-EPO(NDS)3.劑量為50μg/kg、25μg/kg和12.5μg/kg的Aranesp(即NESP)基于無糖的蛋白質(zhì)分子量計(jì)算蛋白質(zhì)的量。在該實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)cg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)的分子量以單體多肽為基礎(chǔ)。因此，F(xiàn)cg2h-EPO(NDS)與NESP的分子量比值為1.71-1。因此，在該實(shí)驗(yàn)中每一蛋白質(zhì)的劑量范圍大約相等。
如圖6所示，BHK細(xì)胞合成的Fcg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)在潛能和作用持續(xù)時(shí)間方面表現(xiàn)出最佳的血細(xì)胞比容，表明與來自NS/0細(xì)胞的Fcg2h-EPO(NDS)和NESP相比，來自BHK細(xì)胞的Fcg2h-EPO(NDS)蛋白質(zhì)具有更長的血清半壽期和更有效的體內(nèi)活性。來自NS/0細(xì)胞的Fcg2h-EPO(NDS)和NESP的血細(xì)胞比容是可比的。
實(shí)施例9.具有來自IgG2的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的Fc-EPO蛋白質(zhì)與具有來自IgG4的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的Fc-EPO蛋白質(zhì)的比較對多種蛋白質(zhì)的基于細(xì)胞的促紅細(xì)胞生成素活性的比較表明，具有來自IgG4的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)通常比具有來自IgG2的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性更差。該結(jié)論對于至少三種類型的Fc-EPO蛋白質(zhì)是正確的，該三種類型蛋白質(zhì)即在促紅細(xì)胞生成素部分具有NDS突變并且在NS/0細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)(表3)、BHK細(xì)胞合成的具有NDS突變的蛋白質(zhì)(表4)和BHK細(xì)胞合成的具有正常促紅細(xì)胞生成素的蛋白質(zhì)(表5)。
在下面表3-5中比較的所有蛋白質(zhì)具有來源于IgG1的修飾的鉸鏈和Fc部分C末端的M1套突變。根據(jù)實(shí)施例6所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過測量由蛋白質(zhì)所刺激的氚化胸苷向TF-1細(xì)胞內(nèi)的摻入來確定蛋白質(zhì)的活性?；钚员硎緸镋D50(ng/ml促紅細(xì)胞生成素部分)表3具有NDS突變且由NS/0細(xì)胞合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的基于細(xì)胞的活性
表4具有NDS突變且由BHK細(xì)胞合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的基于細(xì)胞的活性
表5具有野生型EPO且由BHK細(xì)胞合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的基于細(xì)胞的活性
來自體外的基于細(xì)胞的測定法的活性數(shù)據(jù)通?？梢园凳景偌t細(xì)胞生成素的蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜和體內(nèi)潛能。通常，在體外的基于細(xì)胞的測定法中活性降低象征著對EPO受體結(jié)合率的降低，這于改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性(例如延長的半壽期)和增加的體內(nèi)活性相關(guān)。然而，具有IgG4-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性的降低與改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和增強(qiáng)的體內(nèi)生物學(xué)活性無關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有IgG4-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)與具有IgG2-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜通常無差別。還發(fā)現(xiàn)，與具有IgG2-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)蛋白質(zhì)相比，具有IgG4-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有較差的體內(nèi)活性(見圖5)。
實(shí)施例10.消除Fc部分中糖基化位點(diǎn)的影響開展實(shí)驗(yàn)以測試消除Fc部分中的糖基化位點(diǎn)對體外活性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)潛能的影響。具體而言，測試了包含IgG2-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或IgG4-來源CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)。將IgG2或IgG4中氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser中的天冬酰胺(對應(yīng)IgG1的Asn297)用谷氨酰胺替換。在大部分實(shí)驗(yàn)中，氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser中的苯丙氨酸用丙氨酸替換以消除來自天冬酰胺突變的可能的非自身T-細(xì)胞表位。如表6所示，在基于細(xì)胞的體外測定中，具有FN＞AQ突變(消除Fc部分中的N-連接糖基化位點(diǎn))的Fc-EPO蛋白質(zhì)的ED50值通常比沒有突變的Fc-EPO蛋白質(zhì)的ED50值低大約5倍。表明N-連接糖基化位點(diǎn)的消除導(dǎo)致了基于細(xì)胞測定中體外活性的降低。
還開展實(shí)驗(yàn)測試N-連接糖基化位點(diǎn)的消除對藥物代謝動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)潛能的影響。將BHK細(xì)胞合成的Fcg2h-M1-EPO、Fcg2h-M1-EPO(NDS)和Fcg2h(N＞Q)-M1-EPO蛋白質(zhì)以每種42μg/kg的劑量處理CD1小鼠。觀察到Fcg2h(N→Q)-M1-EPO蛋白質(zhì)表現(xiàn)出比沒有N→Q突變的相應(yīng)蛋白質(zhì)更好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜。因此，消除IgG2-來源Fc部分中N-連接糖基化的N＞Q突變導(dǎo)致產(chǎn)生改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(例如，延長的血清半壽期)。延長的血清半壽期不能用對Fc受體結(jié)合的影響來解釋，因?yàn)橐呀?jīng)檢測不到IgG2-來源的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域?qū)c受體的結(jié)合。
表6Fc部分中糖基化位點(diǎn)的消除降低了Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的體外的基于細(xì)胞的活性
因?yàn)橄齀gG2和IgG4來源Fc部分的N-連接糖基化所造成的影響與降低對促紅細(xì)胞生成素受體的結(jié)合率最一致，所以這些影響沒有預(yù)料到并且是令人驚奇的。不希望受到理論的束縛，對IgG2和IgG4來源Fc部分的N-連接糖基化的消除導(dǎo)致了Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的總體構(gòu)象的改變。
實(shí)施例11.用BHK細(xì)胞合成的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)處理比格犬向比格犬施用Fc-EPO融合蛋白質(zhì)以測試對血細(xì)胞比容、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和其他血液參數(shù)的影響。具體而言，從兩個(gè)獨(dú)立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞系(克隆65和克隆187)純化Fcg2h(FN→AQ)-EPO蛋白質(zhì)，并且靜脈內(nèi)施用于比格犬。用每一制劑按照以下方案注射一只雄性和一只雌性比格犬第0天3μg/kg第16天10μg/kg第23天100μg/kg。
在每次施用后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集大約2ml的血液，并且測定血液參數(shù)，例如血細(xì)胞比、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和其他血液參數(shù)。
處理后的血細(xì)胞比容反應(yīng)示于圖11。在用3μg/kg給藥后，血液參數(shù)沒有升高，處于正常范圍內(nèi)。在用10μg/kg給藥后一周內(nèi)，在4只動(dòng)物中有3只動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增加至超過總血液體積的3％，并且有一只動(dòng)物的血細(xì)胞比容增加至51。其他血液參數(shù)沒有增加，處于正常范圍。在用100μg/kg給藥后，血細(xì)胞比容數(shù)迅速升高，達(dá)到57-62的最高水平，并且維持高于正常范圍達(dá)5-6周。
對于每一只動(dòng)物，每毫升血液的紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白(測定為每分升的克數(shù))與血細(xì)胞比容的量成比例。這些結(jié)果表明，F(xiàn)c-EPO蛋白質(zhì)刺激具有正常血紅蛋白含量的正常大小紅細(xì)胞的產(chǎn)生。
實(shí)施例12.用于臨床用途的Fc-EPO蛋白質(zhì)的純化按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的GMP方法純化Fc-EPO蛋白質(zhì)。在分批培養(yǎng)中將來自儲(chǔ)存庫生產(chǎn)克隆的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于額外補(bǔ)充2.5mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、2g/l的每種HyPep 1501和HyPep 4601(QuestInternational，Chicago，IL)、10μl/l乙醇胺(Sigma)和5μM托酚酮(Sigma)的DMEM/F-12培養(yǎng)基(Invitrogen)中7-10天并且維持高的細(xì)胞生存力(例如，高于80％)。收獲條件培養(yǎng)基并通過正常流動(dòng)過濾使其澄清，將其加載到預(yù)先平衡的Protein A Sepharose Fast-Flow柱(Pharmacia)上，基于Protein A對Fc部分的親和性該柱可捕獲融合蛋白質(zhì)。用15倍體積的磷酸鈉緩沖液(含有150mM磷酸鈉和100mM NaCl，中性pH)將柱充分洗滌。在低pH值下用另外15倍體積的酸性磷酸緩沖液(含有150mM磷酸鈉和100mM NaCl，pH 2.5-3)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。
對于病毒失活，將匯合的峰級分的pH值調(diào)節(jié)至pH 3.8，在室溫下再孵育30分鐘。在30分鐘的孵育之后，將匯合的級分中和并過濾除菌，然后應(yīng)用到Q-Sepharose Fast-Flow陰離子交換柱(Pharmacia)上，其充分利用了Fc-EPO蛋白質(zhì)的酸性pI(由于廣泛唾液酸化)以有效去除了與Fc-EPO蛋白質(zhì)共洗脫的潛在污染物。具體而言，將中和的級分加載到pH5.0的Q-Sepharose Fast-Flow陰離子交換柱(Pharmacia)上，并用NaCl溶液的梯度洗脫。收集Fc-EPO級分并匯合用于隨后分析和進(jìn)一步的純化過程。例如，將來自Q-Sepharose柱的高鹽洗脫物應(yīng)用于方向?qū)游鲋弦匀コ嘤嗟腘aCl。將來自反向柱的稀釋的洗脫液進(jìn)一步應(yīng)用于第二個(gè)Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia，3cm×9cm)柱上。
然后，通過納濾(例如Millipore的Viresolve)去除潛在的病毒顆粒。任選地，可采用進(jìn)一步的純化步驟，例如羥磷灰石柱或者苯基硼酸鹽柱(結(jié)合順式二元醇)。最后，使用超濾將純化蛋白質(zhì)濃縮至預(yù)期濃度，然后滲濾到適宜制劑緩沖液中。最后將材料過濾除菌并以預(yù)定體積分裝到小瓶中。
實(shí)施例13.應(yīng)激測試以確定Fc-EPO蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性包含代表性樣品Fc-EPO制劑或參照Fc-EPO制劑的小瓶儲(chǔ)存于40℃和75％的相對空氣濕度下達(dá)限定的儲(chǔ)存時(shí)間(例如0周、4周、8周等)。在一定的儲(chǔ)存時(shí)間之后，從每一小瓶中取出等分樣品并分析。在用冷光源直接照明下，視覺檢查樣品的渾濁情況。通過測定350nm和550nm下的吸收進(jìn)一步確定渾濁情況。此外，通過分析型大小排阻層析(HPLC-SEC)分析樣品中Fc-EPO蛋白質(zhì)的情況和蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的存在。發(fā)現(xiàn)與參照溶液相比，包含0.5mg/ml Fc-EPO、10mM檸檬酸鹽pH 6.2、100mM甘氨酸、100mM NaCl、0.01％w/v聚山梨醇酯20的制劑具有明顯提高的穩(wěn)定性。
實(shí)施例14.Fcg2h(FN＞AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)在人體中的I期研究如下開展Fcg2h(FN＞AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)在人體中的I期臨床試驗(yàn)。所測定的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本上同在MacDougall等人(1999)J.Am.Soc.Nephrol.102392-2395(其教導(dǎo)在文中整合作為參考)中針對Aranesp所描述的參數(shù)。在人體中靜脈內(nèi)注射的Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)(劑量為1μg/kg)的終末血清半壽期在大約20和30小時(shí)之間。因此，1μg/kg的劑量或者成年貧血癥患者中大約70μg的劑量導(dǎo)致起始血清濃度為大約10ng/ml。由于正常人促紅細(xì)胞生成素濃度為大約0.04至0.25ng/ml(Cazzola等人，(1998)Blood 912139-2145)，所以Fc-EPO蛋白質(zhì)的藥理學(xué)活性水平在患者中保持至少5-10天。
實(shí)施例15.Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)的II期劑量確定和劑量方案研究開展多中心、隨機(jī)、連續(xù)劑量增加研究，以研究將Fcg2h(FN＞AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)經(jīng)皮下或靜脈內(nèi)注射施用于接受透析的患有慢性腎衰竭(CRF)的患者時(shí)的最佳劑量和劑量方案。
在臨床實(shí)踐中，通常方便地依照下列指導(dǎo)方針調(diào)整施用于各個(gè)貧血癥患者的Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)。施用最初劑量，并監(jiān)測血液參數(shù)，例如血細(xì)胞比容、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)。最初劑量一般在大約0.3和3μg/kg之間。適宜的最初劑量為1μg/kg。如果在治療8周后血細(xì)胞比容的增加低于血液體積的5％至6％，則應(yīng)當(dāng)增加劑量。如果在2周時(shí)間內(nèi)血細(xì)胞比容增加大于血液體積的4％或者如果血細(xì)胞比容接近于36％，則應(yīng)當(dāng)降低劑量。
代表性的劑量方案如下每周一次的劑量0.075、0.225、0.45、0.75、1.5和4.5μg/kg/劑量；每兩周一次的劑量0.075、0.225、0.45、0.75、1.5和4.5μg/kg/劑量；每月一次的劑量0.45、0.75、1.5和4.5μg/kg/劑量。
研究分兩部分進(jìn)行。第一個(gè)部分是劑量增加研究，設(shè)計(jì)該研究以估計(jì)每周一次、每兩周一次和每月一次施用Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO融合蛋白質(zhì)使得血紅蛋白以最佳速率增加超過4周(大于和等于1g/dL但小于3g/dL)的劑量。每一研究中的第二部分是確定維持治療目標(biāo)血細(xì)胞比容所需要的劑量(當(dāng)靜脈內(nèi)或者皮下途徑每周一次、每兩周一次或者每月一次施用時(shí))。
權(quán)利要求
1.一種純化的二聚化融合蛋白質(zhì)，其基本上由包含鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的人IgG分子的二聚化Fc部分和人促紅細(xì)胞生成素(EPO)組成，其中二聚化Fc部分中的每一條鏈通過其C末端直接與EPO分子的N末端相連或者通過接頭肽與EPO分子的N末端相連，所述融合蛋白質(zhì)具有以下特性(i)分子被高度唾液酸化，其包含15-28個(gè)唾液酸殘基；(ii)CH2結(jié)構(gòu)域來自人IgG2并且進(jìn)行了修飾，所述修飾為用Ala和Asn替換CH2結(jié)構(gòu)域中Gln-Phe-Asn-Ser序列內(nèi)的氨基酸殘基Phe和Asn，從而形成CH2結(jié)構(gòu)域中的序列Gln-Ala-Gln-Ser；和(iii)用Ala-Thr-Ala-Thr替換接近CH3結(jié)構(gòu)域C末端的Leu-Ser-Leu-Ser氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中另外用Ala替換CH3結(jié)構(gòu)域的C末端Lys殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)來自人IgG1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中所述IgG1鉸鏈區(qū)是被修飾的，所述修飾為用Ser殘基替換鉸鏈區(qū)的Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys序列內(nèi)的氨基酸殘基Cys，從而形成鉸鏈區(qū)內(nèi)的序列Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中促紅細(xì)胞生成素部分包含至少一個(gè)下列氨基酸替代(v)EPO分子位置29處替代成非半胱氨酸殘基，(vi)EPO分子位置33處替代成非半胱氨酸殘基，(vii)EPO分子位置88處替代成半胱氨酸殘基，和(viii)EPO分子位置139處替代成半胱氨酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中EPO分子的位置33處是非半胱氨酸殘基而不是原來的Cys殘基，并且EPO分子的位置88處是Cys殘基而不是原來的Trp殘基，從而使得融合蛋白質(zhì)內(nèi)的EPO部分形成Cys29-Cys88二硫鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中位置33處的非半胱氨酸殘基是Pro。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中EPO部分包含一個(gè)或多個(gè)選自下列的突變(i)Arg131→Glu131(ii)Arg139→Glu139(iii)His32→Gly32(iv)Ser34→Arg34(v)Pro90→Ala90。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中接頭肽包含糖基化位點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中糖基化位點(diǎn)包含Asn-Ala-Thr氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中全部IgG分子來自IgG2并且鉸鏈區(qū)來自IgG1。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其另外包含CH1結(jié)構(gòu)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中融合蛋白質(zhì)具有20-22個(gè)唾液酸殘基。
14.一種二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其包含序列EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SE Q ID NO14)。
15.一種二聚化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其包含序列EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO15)。
16.一種DNA分子，其編碼權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的融合蛋白質(zhì)。
17.一種用于治療哺乳動(dòng)物造血障礙和缺陷的藥物組合物，其包含有效量的按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)說明的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)以及任選的可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
18.一群適于向哺乳動(dòng)物施用的純化的高度唾液酸化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中Fc-EPO融合蛋白質(zhì)包含位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)N末端的Fc部分和位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)C末端的促紅細(xì)胞生成素部分，所述的融合蛋白質(zhì)群體為每一個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均15-28個(gè)唾液酸殘基，并且可以通過將編碼各自的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的DNA分子導(dǎo)入BHK細(xì)胞并表達(dá)、分離和純化該群相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)而得到，其中所述的群體與在NS/0、PerC6或293細(xì)胞中合成的相應(yīng)Fc-EPO融合蛋白質(zhì)相比具有更長的血清半壽期。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中所述的融合蛋白質(zhì)群體為每一個(gè)純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均20-22個(gè)唾液酸殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的一群純化的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)，其中將BHK細(xì)胞適應(yīng)于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長或者懸浮生長。
21.一種生產(chǎn)一群高度唾液酸化的純化重組Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的方法，所述重組Fc-EPO融合蛋白質(zhì)包含位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)N末端的Fc部分和位于Fc-EPO融合蛋白質(zhì)C末端的促紅細(xì)胞生成素部分，所述方法包括步驟(i)構(gòu)建編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的DNA分子；(ii)在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中或懸浮培養(yǎng)基中用所述DNA分子轉(zhuǎn)化BHK細(xì)胞；(iii)表達(dá)一群由所述DNA分子編碼的Fc-融合蛋白質(zhì)；(iv)收獲、分離和純化所述的Fc-EPO融合蛋白質(zhì)群體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述合成的融合蛋白質(zhì)群體為每一個(gè)純化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均15-28個(gè)唾液酸殘基。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述合成的融合蛋白質(zhì)群體為每一個(gè)純化Fc-EPO融合蛋白質(zhì)具有平均20-22個(gè)唾液酸殘基。
24.一種篩選穩(wěn)定維持編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列的BHK細(xì)胞的方法，所述Fc-EPO融合蛋白質(zhì)包含F(xiàn)c部分和促紅細(xì)胞生成素部分，所述方法包括步驟(a)將編碼潮霉素B的核酸序列和編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列導(dǎo)入BHK細(xì)胞；和(b)在潮霉素B存在下培養(yǎng)BHK細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中編碼潮霉素B的核酸序列和編碼Fc-EPO融合蛋白質(zhì)的核酸序列存在于一個(gè)DNA分子上。
全文摘要
本發(fā)明提供新的高度唾液酸化的Fc－EPO融合蛋白質(zhì)，其優(yōu)選地包含在Fc部分以及EPO部分內(nèi)的幾種修飾并且具有改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。具體而言，F(xiàn)c－EPO蛋白質(zhì)具有延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。與其它細(xì)胞系如NS/0細(xì)胞所產(chǎn)生的相應(yīng)Fc－EPO融合蛋白質(zhì)相比，BHK細(xì)胞中合成的Fc－EPO融合蛋白質(zhì)具有顯著延長的血清半壽期和增加的體內(nèi)潛能。
文檔編號A61K38/18GK1902222SQ200480039670
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者S·D·吉利斯, S·勞德, D·克雷斯, H-C·馬勒, R·米勒 申請人:默克專利有限公司