專利名稱：從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的簡化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的簡化方法。更具體地說，本發(fā)明涉及到通過加入鹽從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法。
背景技術(shù)：
脫乙酰殼多糖(聚氨基葡糖)是聚乙酰氨基葡糖(甲殼質(zhì))的脫乙?；问?，它是一種N-乙?；?2-氨基-β-D葡萄糖的線形聚合物，并含有高含量的氨基和羥基官能團(tuán)。在商業(yè)上，該陽離子聚合物通常是從甲殼類動物和昆蟲的外骨骼中天然存在的聚乙酰氨基葡糖進(jìn)行有限定的水解制備的。聚乙酰氨基葡糖是一種N-乙酰基-β-D葡糖胺(2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D吡喃型葡萄糖)單體單元組成的聚合物，而市場上可買到的脫乙酰殼多糖是一種不同分子量的聚乙酰氨基葡糖，脫乙?；讲煌潭冉M成的復(fù)雜混合物。
脫乙酰殼多糖具有種種商業(yè)上和生物醫(yī)學(xué)用途，是與其分子的大小和它的乙?；潭扔嘘P(guān)的。關(guān)于生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，據(jù)報導(dǎo)脫乙酰殼多糖的低亞膽固醇血效率增加與它的分子量大小和乙?；俜?jǐn)?shù)成相反的關(guān)系(LeHoux等人(1993年)脫乙酰殼多糖對老鼠的肝功能的某些影響。內(nèi)分泌學(xué)1321078-1084，Sugano等人(1992年)。聚乙酰氨基葡糖和脫乙酰殼多糖在老的老鼠的脫乙酰殼多糖部分水解的低亞膽固醇血活性，Brine等人，(編者))，Elsevier，Lonton，第472-478頁)。已經(jīng)被報導(dǎo)的其它研究是25-50千道爾頓(千道爾頓簡稱為KDa)脫乙酰殼多糖分子在治療胃潰瘍上是有效率的(Ito等人。(2000年)保健食品，聚乙酰氨基葡糖和脫乙酰殼多糖對老鼠抗?jié)兊男?。日本藥理學(xué)雜志82218-225)同時通過激活腸內(nèi)的免疫功能防止在老鼠典型腫瘤生長(Maeda等人(2004年)各種低分子量的脫乙酰殼多糖的抗癌效率是由于增加了在老鼠的180-方位的肉瘤的腸內(nèi)上皮細(xì)胞淋巴細(xì)胞天然的殺傷細(xì)胞的活性的緣故。營養(yǎng)學(xué)雜志134945-950)。28KDa的脫乙酰殼多糖分子已被用作控制藥品釋放(藥物治療)的毫微顆粒(Chen等人(2003年)在水體系中用于亞油酸改良的脫乙酰殼多糖的自凝聚和毫微顆粒形成的乳化作用。農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志513135-3139)。低分子量的脫乙酰殼多糖(以下簡稱LMWC)(約等于2KDa)已在農(nóng)業(yè)上被用作抗真菌試劑以保存有結(jié)節(jié)的，生菜和煙草種子(Beaulieu等人。(2003年)脫乙酰殼多糖在農(nóng)業(yè)上使用的潛力促進(jìn)植物生長和植物疾病的生物控制。8月27-30日在加拿大，魁北克，蒙特利爾舉行的第9次國際聚乙酰氨基葡糖和脫乙酰殼多糖會議上發(fā)表)。相反，已經(jīng)顯示，400KDa的脫乙酰殼多糖適合于作為一種溶劑，即適用于作為老鼠對花生變態(tài)反應(yīng)素減敏感作用的DNA接種手段時的一種溶劑(Roy等人(用脫乙酰殼多糖-DNA毫微顆粒提供1999個口的基因，使受到花生變態(tài)反應(yīng)的典型老鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)。天然醫(yī)學(xué)雜志5387-391))。這些幾個例子說明了脫乙酰殼多糖值得注意的一系列的應(yīng)用和為了特殊應(yīng)用時脫乙酰殼多糖分子大小的重要性。接著的目標(biāo)應(yīng)用要求有良好特性的產(chǎn)品，該產(chǎn)品必須在嚴(yán)格的可重復(fù)生產(chǎn)的條件下被制備。
市場上可買得到的脫乙酰殼多糖分子大小一般在70KDa-大于1000KDa之間，而脫乙酰作用的百分?jǐn)?shù)通常是約在50-100％的范圍內(nèi)。聚乙酰氨基葡糖的脫乙?；饔煤退慕饩郛a(chǎn)生脫乙酰殼多糖是用堿水進(jìn)行化學(xué)處理的函數(shù)。延長處理導(dǎo)致被稱為多分散特性的脫乙酰殼多糖有更多的碎片分子產(chǎn)生。正如上面所討論的一樣，根據(jù)對它的大小和脫乙?；饔糜嘘P(guān)的性能，多分散特性的脫乙酰殼多糖制劑是比較不合乎需要的。
市場上可買得到的脫乙酰殼多糖聚合物控制酶水解是僅有的可重復(fù)使用的方法，這樣就存在產(chǎn)生一種具有低分散性和確定分子量性能的產(chǎn)物。原材料(脫乙酰殼多糖)的物理特性是重要的(物理特性指大小，乙?；陌俜?jǐn)?shù))，因?yàn)樗鼈儠绊懨赶臈l件。商業(yè)用的脫乙酰殼多糖在大小和性能上的變化會影響在生物醫(yī)學(xué)，農(nóng)業(yè)，化妝品和其它領(lǐng)域所限定的分子量大小的脫乙酰殼多糖解聚生產(chǎn)所需的時間。
用脫乙酰殼多糖酶對脫乙酰殼多糖進(jìn)行酶消化是可能用于再生產(chǎn)產(chǎn)生具有低多分散度的LMWC的。脫乙酰殼多糖酶是一種酶，它具有對于脫乙酰殼多糖的高度專一性(Brzeinski(1996年))在脫乙酰殼多糖水解時使用的酶，摘自US專利號為5,482,843的專利)。使用脫乙酰殼多糖酶對脫乙酰殼多糖進(jìn)行酶消化是在弱酸性溶液中完成的。必須對幾個實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制，這幾個條件如下該酶的消化必須快速停止以防止脫乙酰殼多糖進(jìn)一步的解聚和多分散性產(chǎn)物的產(chǎn)生。
必須利用一種易于使用的工藝來快速分離該消化的產(chǎn)物，并且使其成有利于干燥的固體狀態(tài)，理想的是使其變成一種粉末狀態(tài)。當(dāng)為了商業(yè)上的目的對大量(例如幾百千克)的脫乙酰殼多糖進(jìn)行處理時，這種考慮是相當(dāng)重要的。
該消化產(chǎn)品必須不含酶(脫乙酰殼多糖酶)。
該水解產(chǎn)物必須在以下條件下進(jìn)行分離，使得該產(chǎn)物能適合于人類使用，尤其當(dāng)該水解產(chǎn)物被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時，更加如此。
在脫乙酰殼多糖用作食品添加劑時，該水解產(chǎn)物必須易于溶解在酸性環(huán)境中例如胃的一種酸性環(huán)境中。這個條件限制了許多工藝使得這些工藝不能用于從使用它的酶消化的酸性溶液中或從其它方法中來回收該產(chǎn)物。
許多工藝已經(jīng)被用于從酸性水溶液中分離出脫乙酰殼多糖。最常用的技術(shù)是通過加入一種無機(jī)堿以提高其pH值來降低該脫乙酰殼多糖的溶解度(無機(jī)堿的例子為，氫氧化鈉或氫氧化鉀)。這種程序從這種溶液中沉淀脫乙酰殼多糖是很有效的，但是有以下缺點(diǎn)即得到的混合物的粘度高，使得使用通常的分離技術(shù)難以對沉淀的脫乙酰殼多糖進(jìn)行分離。而且，要求產(chǎn)品必須不含過量的堿。這一點(diǎn)僅能以徹底洗滌為代價才能實(shí)現(xiàn)，洗滌是一種方法或途徑它要消耗時間并使得脫乙酰殼多糖明顯損失(機(jī)械損失或通過溶解損失)。當(dāng)脫乙酰殼多糖用脫乙酰殼多糖酶進(jìn)行水解處理時應(yīng)當(dāng)考慮的另一個方面是溶解度，即在該沉淀中已不含過量的堿后，脫乙酰殼多糖酶被共同地沉淀并且由于它的抗pH處理性能，它可能仍然保留著活性和/或作為一種污染物保留在該處理過的產(chǎn)品中。最重要的另一點(diǎn)是該最終產(chǎn)物必須不含污染的堿，尤其是，如果它被用于生物醫(yī)學(xué)目的更應(yīng)當(dāng)如此。
通常從水溶液中沉淀脫乙酰殼多糖的一種有效的方法是在水溶液中加入多磷酸(Shu等人(2002年)。多價磷酸鹽的結(jié)構(gòu)對用于控制藥釋放的離子交聯(lián)的脫乙酰殼多糖的膜性能的影響。歐洲藥物學(xué)和生物藥物學(xué)雜志54235-243)或多磷酸鹽(Chiou等人(2003年))通過化學(xué)交聯(lián)脫乙酰殼多糖顆粒來吸附水溶液中的染料的方法。美國專利申請公開號為20030101521。該脫乙酰殼多糖的磷酸鹽是不溶解于水溶劑中的。然而，這種方法的主要缺點(diǎn)是該脫乙酰殼多糖的磷酸鹽是很少溶解于生理學(xué)的酸性環(huán)境中，例如胃的酸性環(huán)境中。
感興趣要進(jìn)一步指出的是，當(dāng)使用一種脫乙酰殼多糖酶處理制備脫乙酰殼多糖時，可使用加熱來停止脫乙酰殼多糖酶的反應(yīng)。在此情況下，由于脫乙酰殼多糖酶對熱變性所固有的穩(wěn)定性，需要將反應(yīng)溫度升高到60℃或60℃以上。這個溫度證實(shí)了已被較好的敘述的和已知的美拉德反應(yīng)。(O’Brien等人(編者)(1998年))。在食品和醫(yī)學(xué)方面的美拉德反應(yīng)。英國，劍橋，劍橋化學(xué)協(xié)會；Ikan.(編者)(1996年)。美拉德反應(yīng)。美國，紐約，紐約John Wiley & Sons)，它引起脫乙酰殼多糖的部分分解和有色產(chǎn)物的產(chǎn)生，而后者是由于脫乙酰殼多糖分子的伯胺反應(yīng)引起的。這種情況是非常不希望產(chǎn)生的，因?yàn)檫@些相同的氨基基團(tuán)對于脫乙酰殼多糖的生物學(xué)性能是很重要的。還有2點(diǎn)是更感興趣的。第1，熱變性的脫乙酰殼多糖酶可能沉淀，并且在隨后的分離脫乙酰殼多糖的步驟中被轉(zhuǎn)移。(例如通過沉淀被轉(zhuǎn)移)。第2，脫乙酰殼多糖酶對熱變性的部分抵抗性，可能使得它再生和恢復(fù)了其部分活性。
因此，總的說來，已有技術(shù)公開的從化學(xué)或酶水解來沉淀和分離脫乙酰殼多糖的方法是不能令人滿意的。最感興趣的是易于使用的工藝，因?yàn)樵摴に囂峁┝烁弋a(chǎn)率的脫乙酰殼多糖的、適合于商業(yè)上使用的，尤其適合于生物醫(yī)學(xué)使用的易于使用的工藝。當(dāng)前的從酸性水溶液中分離脫乙酰殼多糖的工藝即通過加入堿來提高其pH值或生成不可溶解的脫乙酰殼多糖鹽的工藝沒有達(dá)到這些要求。
因此，還需要一種簡單的，可靠的，可重復(fù)的方法，該方法可通過化學(xué)或酶水解回收高產(chǎn)率的脫乙酰殼多糖并可適合于商業(yè)上使用，并且尤其可應(yīng)用于食品和生物醫(yī)學(xué)工業(yè)上。
還需要一種從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法，該方法提供了一種無污染物的產(chǎn)品(例如不含脫乙酰殼多糖酶，也不含其它不想要的鹽的產(chǎn)品)，并且該無污染物的產(chǎn)品易于溶解在適合于人類使用的酸性環(huán)境中。
本發(fā)明尋找令人滿意的這些需求和其它需求。本說明書涉及到許多文件，這些文件的內(nèi)容在此全部被參考應(yīng)用了。
發(fā)明的摘要因此，廣義地說，本發(fā)明涉及到一種脫乙酰殼多糖制劑和該制劑的制造方法。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到通過加入鹽析鹽從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法(以上所述的鹽析鹽是指例如各種Kosmotropic鹽，其混合物，離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物，等)，例如適合于食用的和適合于生物醫(yī)學(xué)的無機(jī)鹽或有機(jī)鹽。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到通過加入例如無機(jī)酸鹽這樣的鹽析劑的方法從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到通過加入適合于人類食用的有機(jī)酸鹽的方法從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法。加入一種鹽析鹽(和它們的結(jié)合)，或各種Kosmotropic鹽，(和它們的結(jié)合)，或離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物，產(chǎn)生了一種鹽析效率，該鹽析效率是由于加入了引起溶解的脫乙酰殼多糖分子脫水和使它們從溶液中沉淀的鹽，產(chǎn)生了使水分子重排的鹽析效率。
在一個實(shí)施例中，該鹽析反應(yīng)是在不變性的條件下完成的。根據(jù)本發(fā)明可能采用的非限定的pH值例子是pH值約在3-7之間(例如pH值為3，3.5，4，4.5，6，6.5和7)。當(dāng)本發(fā)明的方法可能被實(shí)現(xiàn)時，非限定的溫度的例子包括溫度約在4℃-55℃之間(例如4，6，8，10，12，14，16，18，20，25，28，30，32，35，38，40，42，45，48，50，52，55℃)。根據(jù)本發(fā)明，也可能使用較高的溫度(例如60，65，68℃等)或較低的溫度(例如3或2℃)。為簡化起見，各單位(例如pH值為3.2，3.4，5.7，6.8等和溫度為5，7，9，21，22℃等)沒有特別被敘述，但仍然被認(rèn)為在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還涉及到一種用于從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法，該方法回收的脫乙酰殼多糖仍然保留著天然的脫乙酰殼多糖的物理性能，例如其離子電荷和分子大小的物理性能。采用本發(fā)明的方法可以沉淀出其分子量約為7-幾百KDa和更高的分子量(例如300厘泊)的脫乙酰殼多糖聚合物。本發(fā)明所述的方法還可應(yīng)用到其乙?；潭燃s為0％到至少50％的脫乙酰殼多糖聚合物。
另外，本發(fā)明還涉及到從酸性溶液中鹽析脫乙酰殼多糖的方法，使得能生產(chǎn)一種有粘性的、像纖維的外部特征的沉淀的脫乙酰殼多糖制劑。因此，這樣的一種脫乙酰殼多糖制劑能使用普通的簡單的技術(shù)，容易地從酸性溶液中被回收，上述普通的簡單的技術(shù)是指從液相中回收固相的例如超濾，離心，或其它已知的和常用的方法。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到一種能通過脫乙酰殼多糖酶選擇性地鹽析脫乙酰殼多糖的適合于用酶水解產(chǎn)物純化的從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法。這種選擇性鹽析防止了脫乙酰殼多糖的進(jìn)一步水解，于是減少了脫乙酰殼多糖制劑的聚合度和產(chǎn)率，該制劑基本上不含脫乙酰殼多糖酶。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到一種含少量脫乙酰殼多糖酶的脫乙酰殼多糖制劑。本發(fā)明提供了一種從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法；如此回收的脫乙酰殼多糖制劑能容易地將鹽析鹽以及其它可溶性物質(zhì)除去(以上所述的鹽析鹽是指例如Kosmotropic鹽，其混合物和離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的脫乙酰殼多糖制劑的回收率至少達(dá)到90％(例如90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100％)。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明的脫乙酰殼多糖制劑的回收率至少達(dá)到95％(例如95，96，97，98，99，100％)。在再一個實(shí)施例中，本發(fā)明的脫乙酰殼多糖制劑的回收率至少達(dá)到98％。
另外，本發(fā)明涉及到用于從酸性水溶液中純化脫乙酰殼多糖的方法和由該方法所獲得的脫乙酰殼多糖制劑。如此純化的脫乙酰殼多糖制劑適用于人類或動物的消費(fèi)，因此令人滿意地符合在生物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用或作為一種食品添加劑的要求。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到用于純化各種不同分子大小的脫乙酰殼多糖的方法。本發(fā)明的方法獲得的脫乙酰殼多糖能容易地被干燥，并接著的該粉末也容易溶解在稀的有機(jī)酸中以及更好是容易溶解在無機(jī)酸中，例如容易溶解在類似于胃的酸含量的鹽酸溶液中。在該脫乙酰殼多糖制劑作為一種食品添加劑的情況下，它具有高的可溶解性能。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明也涉及到一種選定分子大小或各種分子大小的脫乙酰殼多糖制劑，該制劑容易溶解在稀鹽酸溶液中。在一個實(shí)施例中，該稀鹽酸溶液模擬胃的酸含量。
在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及到一種脫乙酰殼多糖制劑，該制劑基本上或全部不含脫乙酰殼多糖酶，適合于人類消費(fèi)，可溶解在例如胃酸這樣的酸性環(huán)境中，并且基本上不含沉淀的鹽(例如鹽析鹽)。
通過閱讀以下僅作為例子的說明書實(shí)施例的非限定性說明，本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)會變得更清楚明了。
除非另有說明，此處所用的科技術(shù)語和專門用語的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常了解的含義相同。
定義在權(quán)利要求書和/或說明書中當(dāng)將字“a”或“an”與術(shù)語“comprising”連起來使用時，可能表示“1個”，但也符合“1個或多個”，“至少1個”，和“1個或超過1個”的意思。
在整個申請中，術(shù)語“about”被用來表示一個值，該值包括用來測定該值的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通常，術(shù)語“about”指的是一個可能一直變化到10％的意思。因此，一個數(shù)值1，2，3，4，5，6，7，8，9和10％的變化被包括在術(shù)語about之內(nèi)。
當(dāng)在說明書和權(quán)利要求書中被使用時，字“comprising”(和comprising的任何形式，例如“comprise”和“comprises”)，“having”(和having的任何形式，例如“have”和“has”)，“including”(和including的任何形式，例如“includes”和“include”)或“containing”(和containing的任何形式，例如“contains”和“contain”都包括或可擴(kuò)充的和不排除另外的未被敘述的另部件或方法步驟在其中。
當(dāng)在此處被使用時，術(shù)語“purified”涉及到從原來就存在于該組合物的組分中已經(jīng)被分離出來的一個(克)分子(例如脫乙酰殼多糖)。因此，說明該脫乙酰殼多糖已經(jīng)被純化到在自然界中尚未被發(fā)現(xiàn)的程度(或濃度)。一種基本上純的分子是一種分子，該分子是缺少大多數(shù)其它成分的分子(例如不含30，40，50，60，70，75，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100％的各種雜質(zhì))。相反的，術(shù)語“crude”表示其中的各分子沒有從原來就存在于該原始組合物中的各成分中被分離出來(例如一種包含脫乙酰殼多糖酶的酸溶液)。因此，術(shù)語“separating”或“purifying”涉及到方法，用此方法該樣品中的一個或一個以上的成分可從該樣品的一種或一種以上的其它成分中被分離出來。樣品的各成分包括從昆蟲或動物的外骨骼中提取的提取物以及市場上能買得到的脫乙酰殼多糖制劑。該提取物可能包括在天然原料中發(fā)現(xiàn)的原來的各成分的全部成分或部分成分。因此，除了包括脫乙酰殼多糖以外，該提取物可能還包括其它成分，例如蛋白質(zhì)(例如脫乙酰殼多糖酶)，碳水化合物，類脂(化合)物或核酸。在另一個實(shí)施例中，分離或純化步驟可除去存在于所需要的樣品中的至少約50％的其它成分(例如除去50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99，100％)，并且，在另一個實(shí)施例中，分離或純化步驟可除去存在于所需要的樣品中的至少約95％的其它成分(例如除去95，96，97，98，99，100％)。為了簡便起見，該單位(例如66，67，...81，82，...91，92％...)沒有系統(tǒng)地被敘述，但是已被考慮了，仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
“酸性環(huán)境”，“酸性條件”，或“酸性pH范圍被確定為覆蓋了pH約小于7的所有pH值的范圍”。然而，對于本發(fā)明的目的，當(dāng)涉及到用于從酸性環(huán)境中鹽析出脫乙酰殼多糖的酸性溶液時，pH值約在2-6的范圍內(nèi)被認(rèn)為是較好的pH值范圍。根據(jù)本發(fā)明可能被使用的弱有機(jī)酸的非限定例子包括蘋果酸和乳酸?？赡鼙皇褂玫乃岬钠渌影ㄒ宜岷望}酸(HCL)。在使用乙酸，乳酸和蘋果酸的情況下，以體積計，其較好的濃度約為5-10％。在使用鹽酸的情況下，其較好的濃度約為0.2N。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明也可能使用其他濃度的酸。
當(dāng)其中化合物相互反應(yīng)時或當(dāng)工藝條件被改變時(例如加入鹽，改變溫度，大氣壓或溶液的pH值)在溶液中產(chǎn)生沉淀，形成了一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物不溶于溶液中并像雨或雪一樣地從溶液中降落。沉淀物是由于化學(xué)反應(yīng)或工藝條件改變后(例如鹽析反應(yīng))從溶液中分離出的一種固體物質(zhì)。沉淀物可以包括或多或小的細(xì)顆粒并可能通過給予該混合物渾濁的，乳狀的，膠狀的或粒狀的外形被鑒定。該固體可能均勻地沉淀到該容器的底部。
廣義地說，該術(shù)語溶解度被定義為一種物質(zhì)溶解到另一種物質(zhì)中的能力或趨勢。化合物的溶解度可能是全部的或部分的并且溶解度隨著混合它的溶劑的物理一化學(xué)特性的變化而變化(例如溫度，壓力，pH值等)。摩爾溶解度被定義為在每升溶液中溶解的溶質(zhì)的最大摩爾數(shù)。某種物質(zhì)的溶解度也可能用特定條件下在被確定的溶劑體積中該物質(zhì)被溶解的最大量(用克或用摩爾表示)來表示。
(混)濁點(diǎn)對于本發(fā)明的目的，該(混)濁點(diǎn)表示在特定的條件下(pH值，溫度，脫乙酰殼多糖的分子量，脫乙?；潭?，環(huán)境壓力和用于鹽析的特定的鹽)，脫乙酰殼多糖開始沉淀時該鹽析鹽的濃度(以上所述的鹽析鹽是指例如各種Kosmotropic鹽，它們的混合物，離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物，一種有機(jī)酸或無機(jī)酸的鹽等)。該(混)濁點(diǎn)可能用簡單的目檢方法被確定(當(dāng)該溶液已不再均勻，即當(dāng)它變成渾濁的或不透明時)。該(混)濁點(diǎn)也可能用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知技術(shù)，即較精確的分析方法來進(jìn)行測定，該方法是在給定的條件下(例如給定分子量的脫乙酰殼多糖和在給定溫度和pH值時的脫乙?；潭?，給定的鹽濃度的條件下，通過測定被沉淀的脫乙酰殼多糖的量進(jìn)行測定。根據(jù)本發(fā)明可能使用的分析方法包括比色測定法，例如由Muzzarelli在1998年提出的使用Cibracon亮紅3B-A染料來進(jìn)行比色的方法(脫乙酰殼多糖的比色測定法，生物化學(xué)分析雜志260255-257)，由Neugebauer等人公開的苦味酸方法(1989年)(甲殼質(zhì)-脫乙酰殼多糖與苦味酸的N-乙酰化度的測定。碳水化合物研究189，363-369)，不太可靠的(Hugerth等人(1997年)電荷密度和組成(構(gòu)造，結(jié)構(gòu))對角叉菜聚糖和脫乙酰殼多糖之間的聚合電解質(zhì)絡(luò)合物形成的影響。碳水化合物的聚合物34149-156)由Curotto和Aros敘述的(水合)三酮法(1993年)(脫乙酰殼多糖和自由氨基基團(tuán)的百分?jǐn)?shù)的定量測定。分析生物化學(xué)211240-241)或由該方法衍生的方法。根據(jù)本發(fā)明也可使用例如基于特別用于脫乙酰殼多的糖的抗體使用的其他已知方法(例如抗-脫乙酰殼多糖的抗體的制備和開發(fā)。生物醫(yī)學(xué)材料研究期刊67A766-774)。
術(shù)語“離液序列高的”表示渾沌，不規(guī)則的組成，是生物化學(xué)的術(shù)語，通常涉及到一種化合物的破壞水中氫鍵結(jié)構(gòu)的能力。這個氫鍵深深的影響著生物聚合物的二級結(jié)構(gòu)以及它們在水介質(zhì)中的溶解度，上述生物聚合物是例如DNA，RNA，蛋白質(zhì)和多糖(例如脫乙酰殼多糖)。離液序列高的鹽由于氫鍵破壞和疏水作用其結(jié)構(gòu)減少(增加了渾沌，不規(guī)則的組成)。離液序列高的(不穩(wěn)定劑)鹽的非限定性例子包括NaCLO4，NaSCN，NaNO3和NaBr.相反，Kosmotropic(穩(wěn)定劑)鹽顯示出與水分子的強(qiáng)相互作用。因此，水分子變的有序地繞著該Kosmotropic鹽離子周圍到如此的程度，以使得繞著該溶質(zhì)的它的正常編排方式被減少，并且，該溶質(zhì)可能在固相中結(jié)合(例如沉淀)。Kosmotropic(穩(wěn)定劑)鹽的非限定性例子包括Na2SO4，檸檬酸鈉，酒石酸鈉和NaH2PO4。
鹽析。鹽析效率通過增加在代替溶質(zhì)的該離子周圍的水分子編排方式(organization)減少了該溶質(zhì)的溶解度。基本上是在該被加入的鹽離子和其它被溶解的溶質(zhì)之間爭奪溶劑分子的結(jié)果。在高鹽濃度的情況下，許多被加入的離子被溶劑化，使得可利用的大量溶劑變成溶解其它溶質(zhì)(例如脫乙酰殼多糖)。因此，溶質(zhì)-溶質(zhì)的相互作用比溶質(zhì)-溶劑的相互作用更強(qiáng)。該鹽析效率導(dǎo)致該溶質(zhì)脫水并從溶液中沉淀出來(Collins和Washabaugh(1985年))。Hofmeister效率和水在界面的行為。生物物理季刊18323-422；Cacace等人，(1997年。)Hofmeister系列鹽和溶劑對界面現(xiàn)象的影響。生物物理季刊30241-277；Kunz等人(2004年)‘Zur Lehre von der Wirkung des Salze’(關(guān)于鹽影響的科學(xué))Franz Hofmeister’s歷史論文。當(dāng)前關(guān)于膠體和界面科學(xué)的見解919-37)。因此，如果中性鹽的濃度在較高的范圍內(nèi)(例如＞0.1M)，在許多情況下，蛋白質(zhì)沉淀。溶劑的減少和排斥力的抵消，使得該蛋白質(zhì)聚集和沉淀。鹽析鹽。本發(fā)明的鹽析鹽特征在于通過增加代替脫乙酰殼多糖的，在它們周圍的水分子的結(jié)構(gòu)減少了脫乙酰殼多糖的溶解度(鹽析效率)。因此，如此處使用的一樣，術(shù)語鹽析鹽表示包括任何鹽，該鹽使脫乙酰殼多糖從水溶液中脫水和沉淀(例如各種Kosmotropic鹽，它們的混合物，有機(jī)酸或無機(jī)酸的鹽，離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物等)。
當(dāng)在此處使用時，術(shù)語鹽是無機(jī)的和/或有機(jī)的酸與堿形成的酸性和/或堿性鹽。兩性(陰陽)離子(內(nèi)部或內(nèi)側(cè)鹽)包括在此處使用的術(shù)語鹽的范圍內(nèi)，季胺鹽例如烷基銨鹽便是此類鹽。無毒的，藥物驗(yàn)收合格的鹽是較好的，雖然如分離或純化步驟的例子所說的一樣，其它的鹽也可能被利用。
加酸的鹽的例子包括以下的鹽，但不是限定以下的鹽乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊丙酸鹽，digluconate，十二烷基硫酸鹽，乙基磺酸鹽，反丁烯二酸鹽，葡糖庚酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫化溴化物，碘化氫，2-羥基乙基磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，果膠酸鹽，過(二)硫酸鹽，3-丙酸苯酯，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫代氰酸鹽，甲苯磺酸鹽，和十一酸酯。
當(dāng)在此處使用時，術(shù)語“鹵素”或“鹵”表示氯，溴，氟和碘。
本發(fā)明將通過下面的特定的例子作進(jìn)一步說明。這些例子僅用于對本發(fā)明進(jìn)行說明，不是用來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍的。
附圖的簡單說明下面，將參考附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明

圖1是表示從酶水解的240KDa的脫乙酰殼多糖(VansonHaloSource)中，用低角度的光散射裝置裝備的三聯(lián)探測器陣列裝置(Viscotek Corporation)來測定檸檬酸三鈉鹽析(即沉淀)92％脫乙?；母鞣N不同分子量大小的脫乙酰殼多糖的效率.試驗(yàn)是在4℃下進(jìn)行的。
圖2是表示從酶水解的240KDa的脫乙酰殼多糖(VansonHaloSource)中，用低角度的光散射裝置裝備的三聯(lián)探測器陣列裝置(Viscotek Corporation，Houston，Texas，USA)來測定檸檬酸三鈉鹽析(即沉淀)92％脫乙?；母鞣N不同分子量大小的脫乙酰殼多糖的效率，試驗(yàn)是在室溫下進(jìn)行的。
圖3是表示從酶水解的240KDa的脫乙酰殼多糖(VansonHaloSource)中，用低角度的光散射裝置裝備的三聯(lián)探測器陣列裝置(Viscotek Corporation)來測定硫酸銨鹽析(即沉淀)92％脫乙?；母鞣N不同分子量大小的脫乙酰殼多糖的效率，試驗(yàn)是在4℃下進(jìn)行的。
圖4是表示從酶水解的240KDa的脫乙酰殼多糖(VansonHaloSource)中，用低角度的光散射裝置裝備的三聯(lián)探測器陣列裝置(Viscotek Corporation)來測定硫酸銨鹽析(即沉淀)92％脫乙酰化的各種不同分子量大小的脫乙酰殼多糖的效率，試驗(yàn)是在室溫下進(jìn)行的。
圖5a，5b和5c分別表示用硫酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(5a)，室溫(5b)和50℃(5c)的條件下進(jìn)行的。
圖6a，6b和6c分別表示用檸檬酸三鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(6a)，室溫(6b)和50℃(6c)的條件下進(jìn)行的。
圖7a，7b和7c分別表示用硫酸銨來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(7a)，室溫(7b)和50℃(7c)的條件下進(jìn)行的。
圖8a，8b和8c分別表示用酒石酸二鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(8a)，室溫(8b)和50℃(8c)的條件下進(jìn)行的。
圖9a，9b和9c分別表示用一堿價的磷酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙酰化)的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(9a)，室溫(9b)和50℃(9c)的條件下進(jìn)行的。
圖10a，10b和10c分別表示用蘋果酸二鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(10a)，室溫(10b)和50℃(10c)的條件下進(jìn)行的。
圖11a，11b和11c分別表示用硝酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(11a)，室溫(11b)和50℃(11c)的條件下進(jìn)行的。
圖12a，12b和12c分別表示用二堿價的磷酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙酰化)的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(12a)，室溫(12b)和50℃(12c)的條件下進(jìn)行的。
圖13a，13b和13c分別表示用琥珀酸二鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(13a)，室溫(13b)和50℃(13c)的條件下進(jìn)行的。
圖14a，14b和14c分別表示用乙酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(14a)，室溫(14b)和50℃(14c)的條件下進(jìn)行的。
圖15a和15b分別表示用丙二酸二鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(15a)和室溫(15b)的條件下進(jìn)行的。
圖16a，16b和16c分別表示用乳酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙酰化)的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(16a)，室溫(16b)和50℃(16c)的條件下進(jìn)行的。
圖17a和17b分別表示用丙酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(17a)和室溫(17b)的條件下進(jìn)行的。
圖18a和18b分別表示用無機(jī)鹽和有機(jī)鹽對溶解脫乙酰殼多糖的比例按1∶1(18a)和4∶1(18b)以鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(用酶水解制備的30KDa，92％脫乙?；?的對比效率，試驗(yàn)是分別在4℃，室溫和50℃的條件下進(jìn)行的。
圖19a和19b分別表示用硫酸銨來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的240KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(19a)和室溫(19b)的條件下進(jìn)行的。
圖20a和20b分別表示用硫酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的240KDa，92％脫乙酰化)的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(20a)和室溫(20b)的條件下進(jìn)行的。
圖21a和21b分別表示用檸檬酸三鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的240KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(21a)和室溫(21b)的條件下進(jìn)行的。
圖22a和22b分別表示用一堿價的磷酸鈉來鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的240KDa，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(22a)和室溫(22b)的條件下進(jìn)行的。
圖23a和23b分別表示用無機(jī)鹽和有機(jī)鹽對溶解脫乙酰殼多糖的比例按1∶1(23a)和4∶1(23b)的比例來溶解脫乙酰殼多糖，以鹽析(即沉淀)脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的240KDa，92％脫乙?；?的對比效率，試驗(yàn)是分別在4℃和室溫的條件下進(jìn)行的。
圖24a和24b分別表示用硫酸銨來鹽析(即沉淀)高分子量(HMW)的脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的300cps，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(24a)和室溫(24b)的條件下進(jìn)行的。
圖25a和25b分別表示用硫酸鈉來鹽析(即沉淀)高分子量(HMW)的脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的300cps，92％脫乙?；?的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(25a)和室溫(25b)的條件下進(jìn)行的。
圖26a和26b分別表示用一堿價磷酸鈉來鹽析(即沉淀)高分子量(HMW)的脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的300cps，92％脫乙酰化)的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(26a)和室溫(26b)的條件下進(jìn)行的。
圖27a和27b分別表示用檸檬酸三鈉來鹽析(即沉淀)高分子量(HMW)的脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的300cps，92％脫乙酰化)的效率，試驗(yàn)是分別在4℃(27a)和室溫(27b)的條件下進(jìn)行的。
圖28a和28b分別表示用無機(jī)鹽和有機(jī)鹽對溶解脫乙酰殼多糖的比例按1∶1(28a)和4∶1(28b)的比例來溶解脫乙酰殼多糖，以鹽析(即沉淀)高分子量(HMW)的脫乙酰殼多糖(來自Vanson Halosource的300cps，92％脫乙酰化)的對比效率，試驗(yàn)是分別在4℃和室溫的條件下進(jìn)行的。
實(shí)施例的描述此處敘述的一種易用的和可再生產(chǎn)的協(xié)議，提供了溶解在酸性水溶液中的脫乙酰殼多糖的高回收率和快速回收的方法。該協(xié)議是基于加入鹽析鹽使脫乙酰殼多糖聚合物的水化層重排的原理提出的(以上所述的鹽析鹽是指例如各種Kosmotropic鹽，它們的混合物，離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物等)。鹽析鹽的非限定性例子包括以下各種酸的鈉鹽或鉀鹽，這些酸是指檸檬酸，蘋果酸，酒石酸，丙二酸，乙酸，乳酸，琥珀酸，丙酸或磷酸。根據(jù)本發(fā)明，硫酸的鉀鹽或鈉鹽和硝酸的鈉鹽或鉀鹽也能有效地被使用。
該協(xié)議與以前使用的從酸性溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法是不同的，因?yàn)橐郧笆褂酶遬H值或絮凝方法。本發(fā)明的方法具有許多優(yōu)點(diǎn)例如a)由于使用非腐蝕性試劑，因此操作安全；b)脫乙酰殼多糖的回收率高；c)脫乙酰殼多糖的聚合物的物理性能沒有改變，例如剩余離子電荷和分子大小沒有改變。該協(xié)議可在很大的脫乙酰殼多糖分子量范圍內(nèi)使用。另外，在一個實(shí)施例中，鑒于脫乙酰殼多糖制劑中基本上不含脫乙酰殼多糖酶這一事實(shí)，因此，本發(fā)明的脫乙酰殼多糖制劑具有其穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。
脫乙酰殼多糖是一種聚陽離子聚合物，在商業(yè)上它通常是用天然存在的甲殼質(zhì)(即聚乙酰氨基葡糖)經(jīng)過限定的堿性水解制備的，上述甲殼質(zhì)是指例如甲殼類動物和昆蟲的外骨骼。甲殼質(zhì)是一種聚合物，該聚合物是由N-乙?；?β-D-葡糖胺(2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃型葡萄糖)單體單元組成的聚合物，而市場上能買得到的脫乙酰殼多糖通常是由甲殼質(zhì)脫乙酰化到各種不同程度的分子大小的復(fù)雜混合物組成的。甲殼質(zhì)(chitin)和脫乙酰殼多糖(chitosan)的示意骨架(或主要構(gòu)架)結(jié)構(gòu)如下所示。
因此，本發(fā)明概括地提供了一種克服了已有技術(shù)的該制劑和制備方法的缺點(diǎn)的脫乙酰殼多糖制劑和該制劑的制備方法。
在一個實(shí)施例中，該發(fā)明涉及到一種從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法。更具體地說，本發(fā)明的目的是提供一種通過加入鹽從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖的方法(以上所述的鹽是鹽析鹽，例如各種Kosmotropic鹽，它們的混合物，離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物等)。在一個特別實(shí)施例中，適合于食用的無機(jī)鹽或有機(jī)鹽被用于從酸性水溶液中沉淀脫乙酰殼多糖。
脫乙酰殼多糖具有聚電解質(zhì)的性能。它在水中的溶解度的規(guī)則與蛋白質(zhì)在水中的溶解度的實(shí)驗(yàn)規(guī)則相同。這些因素包括溶解介質(zhì)的pH值，溫度和離子強(qiáng)度。此處敘述的創(chuàng)新協(xié)議基于脫乙酰殼多糖對于鹽析效率的靈敏度，該鹽析效率是由于選擇性地加入感膠離子序的電解質(zhì)引起的(感膠離子(1888年)，Zur Lehre von des Wirkung desSalze.ll.Naunyn-Schmiedebergs Archiv fur Experimentelle Pathologie undPharmakologie(Leipzig)24247-260；Kunz等人。(2004年)Zur Lehre vondes Wirkung des Salze.ll.(關(guān)于鹽效率的科學(xué))Franz感膠離子的歷史論文，當(dāng)前在膠體和界面科學(xué)方面的見解919-37；Collins和Washabaugh(1985年)感膠離子效率和在界面處水的行為。生物物理季刊18323-422；Cacace等人，(1997年)感膠離子序鹽和溶劑對界面現(xiàn)象的影響。生物物理季刊30241-277)，或適合于食用的有機(jī)鹽。該鹽析效率通過增加繞著代替溶質(zhì)的離子的水分子有序排列(結(jié)構(gòu))，減少了該溶質(zhì)的溶解度。鹽析效率導(dǎo)致溶質(zhì)脫水并使它從溶液中沉淀出來。(Collins和Washabaugh(1985年)，感膠離子效率和在界面處水的行為。生物物理季刊18323-422)。
鹽析效率增加的情況如下陰離子citrate3-＞SO42-＞PO43-＞acetate-＞CL-＞Br-＞CLO4-＞I-＞SCN-陽離子NH4+＞Rb+＞K+＞Na+＞Cs+＞Li+＞Mg2+＞Ca2+＞Ba2+以上是陰離子和陽離子感膠離子序的一些例子本發(fā)明的方法包括將感膠離子序的鹽析鹽(以上所述的鹽析鹽是指例如各種Kosmotropic鹽，它們的混合物，離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物等)加入到脫乙酰殼多糖的酸性溶液中。在另一個特別的實(shí)施例中，一種適合于食用的鹽或一種適合于食用的電解質(zhì)被加入到脫乙酰殼多糖的酸性溶液中是為了將它沉淀。根據(jù)本發(fā)明可能使用的鹽析鹽的非限定性例子包括硫酸銨或硫酸鈉；磷酸鈉或磷酸鉀；檸檬酸鈉或檸檬酸鉀；酒石酸鈉；蘋果酸鈉；硝酸鈉；乳酸鈉；丙二酸鈉；琥珀酸鈉；乙酸鈉；丙酸鈉。
脫乙酰殼多糖可溶解于其中的，鹽析鹽可以加入到其中的非限定性稀酸溶液的例子包括乙酸，乳酸，蘋果酸或鹽酸。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明也可使用其它稀酸溶液。使脫乙酰殼多糖沉淀所要求的鹽析鹽或有機(jī)鹽的有效量與許多因素有關(guān)，這些因素包括溫度，酸性溶液中脫乙酰殼多糖的濃度，所使用的特定的鹽，環(huán)境壓力，特定分子量的脫乙酰殼多糖，和該聚合物的脫乙?；饔贸潭取１景l(fā)明不限定僅加入一種類型的鹽(例如適合于食用的有機(jī)鹽或無機(jī)鹽)。根據(jù)本發(fā)明也可使用2種或2種以上的鹽析鹽的組合物(例如3，4，5，6等)。另外，不同鹽的組合物也不被限定在僅采用Kosmotropic鹽的組合物。根據(jù)本發(fā)明也可使用離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物，只要最終的效率從酸性溶液中鹽析出脫乙酰殼多糖。
該鹽析的脫乙酰殼多糖中不含沉淀的鹽析鹽，因?yàn)椋诠I(yè)上，沉淀的鹽析鹽可通過測定該洗滌液的電導(dǎo)率很容易被控制。使用已有技術(shù)中的任何方法可容易地從酸性水溶液中回收脫乙酰殼多糖，上述已有技術(shù)的方法包括過濾，離心，蒸發(fā)，噴霧干燥或這些方法的結(jié)合。
在一個實(shí)施例中，在特定溫度下，當(dāng)脫乙酰殼多糖聚合物被攪拌或被攪動很長時間(例如一周)，如果該特定的脫乙酰殼多糖不溶解成透明均勻的溶液，可以認(rèn)為該特定的酸性溶液中鹽析出了特定的脫乙酰殼多糖聚合物。
從上可知，在特定的酸性鹽溶液中，特定脫乙酰殼多糖聚合物的溶解度可能與溫度有關(guān)，使得該脫乙酰殼多糖在較低溫度下在水溶液中被鹽析出來，但在較高溫度下，該脫乙酰殼多糖是可溶解的，或者反過來也一樣。這里敘述的幾個例子說明了溫度對用一系列鹽或有機(jī)鹽和無機(jī)鹽來鹽析脫乙酰殼多糖的影響。因此，人們可利用這個特性從特定的酸性鹽溶液中回收脫乙酰殼多糖。
為了鑒定一種或多種有效的鹽析鹽和它們的組合物(例如適合于人類消費(fèi)的有機(jī)鹽)所使用的常規(guī)實(shí)驗(yàn)可能使用多種方法來完成，上述鹽會沉淀特定濃度的特定脫乙酰殼多糖聚合物。在一個實(shí)施例中，根據(jù)Muzzarelli方法，所要求的有效濃度的鑒定是通過測定加入多磷酸到溶液后沉淀的脫乙酰殼多糖來完成的，或通過比色測定來完成的(Muzzarelli(1998年)分析生物化學(xué)260255-257)。在另一個實(shí)施例中，通過測量濁點(diǎn)來確定用于沉淀特定脫乙酰殼多糖時所用的鹽析鹽或有機(jī)鹽的有效量。也可以用簡單的目測方法來鑒定，在一定溫度下，特定脫乙酰殼多糖的溶解度性能可能與每一種鹽的類型和濃度有關(guān)。
如果全部的脫乙酰殼多糖或僅有一部分的脫乙酰殼多糖被沉淀，可以認(rèn)為脫乙酰殼多糖被沉淀了。在一個實(shí)施例中，如果至少90％(90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100％)的脫乙酰殼多糖被沉淀了，可以認(rèn)為脫乙酰殼多糖被沉淀了。在另一個實(shí)施例中，如果至少95％(95，96，97，98，99，100％)的脫乙酰殼多糖被沉淀了，可以認(rèn)為上述脫乙酰殼多糖被沉淀了。在另一個實(shí)施例中，如果至少98％(98，99，100％)的脫乙酰殼多糖被沉淀了，可以認(rèn)為上述脫乙酰殼多糖被沉淀了。
本發(fā)明所使用的鹽可能是任何的無機(jī)鹽析鹽或有機(jī)鹽析鹽。非限定的例子包括硫酸鹽，磷酸鹽，檸檬酸鹽，硝酸鹽，蘋果酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，丙酸鹽，乳酸鹽和磷酸氫鹽。帶相反電荷的離子有小的效果，并可能是銨或任何堿或堿土金屬例如鈉，鎂，鈣，鉀，鋰等。根據(jù)本發(fā)明也可能使用無機(jī)鹽或有機(jī)鹽的混合物，以及離液序列高的鹽和Kosmotropic鹽的混合物，只要最終的效率從酸性水溶液中鹽析出(即沉淀)脫乙酰殼多糖。
使用鹽析鹽鹽析脫乙酰殼多糖的一般步驟在一個實(shí)施例中，從水溶液中回收脫乙酰殼多糖的一般步驟包括以下步驟。一種含約1-10重量％脫乙酰殼多糖的溶液，尤其是含約5重量％脫乙酰殼多糖的溶液是通過在稀酸溶液溶解上述脫乙酰殼多糖制備的(上述稀酸溶液是指例如鹽酸(約0.2N)，乙酸，乳酸，蘋果酸(約5-10％))。該沉淀鹽，以固態(tài)或較好以濃溶液狀態(tài)，較好在混合的條件下分批被加入其中。沉淀鹽的比例可根據(jù)下面給出的各種樣品的重量來調(diào)節(jié)，并且用圖來說明沉淀鹽和溶解的脫乙酰殼多糖的量之間的比例關(guān)系。而且，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會了解該事實(shí)，即回收脫乙酰殼多糖的步驟可通過在本發(fā)明的實(shí)施例范圍內(nèi)已知樣品(但不限定于這些樣品)所說明的不同溫度下完成的。該鹽析的脫乙酰殼多糖所得到的懸浮液被攪拌30分，或根據(jù)要被回收的脫乙酰殼多糖的重量延長時間周期(例如1小時，1.5小時，2小時，3小時，4小時，5小時，6小時，8小時，10小時，12小時，16小時，24小時，36小時，48小時等)。該沉淀被回收，洗滌和干燥。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會從以上所述的方法中選出任一種方法作為回收脫乙酰殼多糖量的最合適的方法。
實(shí)例1選用硫酸鈉鹽析(70kDa，84％脫乙?；?脫乙酰殼多糖將20克從Fluka(Sigma-Aldrich，St Louis，Missouri，USA)獲得的70kDa的脫乙酰殼多糖溶解于(500ml)5％含水乙酸中。在攪拌下分批加入75克Na2SO4(使最終濃度達(dá)到0.47M)。該鹽析的脫乙酰殼多糖在4℃下保持約30分，然后在(8000×g)的條件下離心分離約20分。上層清液不含大量的脫乙酰殼多糖，當(dāng)通過加入多磷酸進(jìn)行定量測定時，像前面的公知技術(shù)的樣品一樣形成不溶于水介質(zhì)的脫乙酰殼多糖鹽(Roberts(1992))甲殼質(zhì)化學(xué)，MacMillan Press Ltd，Houdmills，Hampshire，UK.第281頁)。另一方面，保留在溶液中的上述脫乙酰殼多糖的量用Muzzarelli敘述的比色測定方法定量地被確定(Muzzarelli 1998年，上文)。據(jù)報道，該測定方法定量測定溶解在水介質(zhì)中的脫乙酰殼多糖比其它公開的技術(shù)測定時具有更高的靈敏度和可重復(fù)性，(Muzzarelli 1998年，上文)。該鹽析脫乙酰殼多糖用水洗3-5次并通過離心分離來收集。
實(shí)例2選用檸檬酸三鈉鹽析(70kDa，84％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖將20克從Fluka(Sigma-Aldrich)獲得的70kDa的脫乙酰殼多糖溶解于(500ml)5％含水乙酸中。在攪拌下分批加入80克檸檬酸三鈉(使最終濃度達(dá)到0.34M)。該鹽析的脫乙酰殼多糖在4℃下保持30分，然后在(8000×g)的條件下離心分離20分。當(dāng)通過加入多磷酸(Roberts 1992年；上文)進(jìn)行測定或根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定時，發(fā)現(xiàn)上層清液不含任何有價值量的脫乙酰殼多糖。該鹽析脫乙酰殼多糖用水洗3-5次并通過離心分離來收集。
實(shí)例3選用硫酸銨鹽析(30kDa，92％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖將1份92％脫乙?；?，分子量為30kDa的脫乙酰殼多糖，溶解于5％含水乙酸中，該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard Biotech Ltee，Rivere-au-Renard，Gaspesie，Quebec，Canada)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置(由Viscotec Corporation提供，Houston，Texas，USA)測定的。接著，分批加入4份硫酸銨濃縮的水溶液。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在4℃下攪拌30-60分。當(dāng)通過加入多磷酸(Roberts 1992年；上文)進(jìn)行測定或根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定時，發(fā)現(xiàn)上層清液不含任何有價值量的脫乙酰殼多糖。該鹽析的脫乙酰殼多糖用水洗3-5次，并使用本發(fā)明實(shí)施例所述的合適方法來收集。
實(shí)施例4選用一堿價的磷酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖將1份92％脫乙?；?，分子量為30kDa的脫乙酰殼多糖，溶解于5％含水乙酸中，該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard Biotech Ltee)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置(由Viscotec Corporation提供)測定的。接著，分批加入4份一堿價的磷酸鈉濃縮的水溶液。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在室溫下攪拌30-60分。當(dāng)通過加入多磷酸(Roberts 1992年；上文)進(jìn)行測定或根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定時，發(fā)現(xiàn)上層清液不含任何有價值量的脫乙酰殼多糖。該鹽析的脫乙酰殼多糖用水洗，并使用本發(fā)明實(shí)施例所述的合適方法來收集。
實(shí)施例5選用硫酸鈉鹽析(240kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖將1份92％脫乙?；?，分子量為240kDa的脫乙酰殼多糖溶解于10％乙酸中，該脫乙酰殼多糖來自Vanson HaloSource(Redmond，Washington，USA)。接著，分批加入4份濃縮的硫酸鈉水溶液。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在室溫下攪拌30-60分。當(dāng)通過加入多磷酸(Roberts 1992年；上文)進(jìn)行測定或根據(jù)由Muzzarelli公開的方法(Muzzarelli 1998年，上文)用比色測定時，發(fā)現(xiàn)上層清液不含任何有價值量的脫乙酰殼多糖。該鹽析的脫乙酰殼多糖用水洗，并使用本明實(shí)施例所述的合適方法來收集。
實(shí)施例6選用硫酸銨鹽析(300cps，92％脫乙酰基)高分子量脫乙酰殼多糖將1份92％脫乙?；?，高分子量的脫乙酰殼多糖(分子量為300cps)溶解于10％乙酸中，該脫乙酰殼多糖來自Vanson HaloSource(Redmond，Washington，USA)。接著，分批加入4份濃縮的硫酸銨水溶液。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在室溫下攪拌30-60分。當(dāng)通過加入多磷酸(Roberts 1992年；上文)進(jìn)行測定或根據(jù)由Muzzarelli公開的方法(Muzzarelli 1998年，上文)用比色測定時，發(fā)現(xiàn)上層清液不含任何有價值量的脫乙酰殼多糖。該鹽析的脫乙酰殼多糖用水洗，并使用本明實(shí)施例所述的合適方法來收集。
實(shí)施例7在4℃時，檸檬酸三鈉鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率圖1說明檸檬酸三鈉鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率，該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解的分子量為240kDa的脫乙酰殼多糖(Vanson HaloSource)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置(由Viscotec Corporation提供)測定的。將溶解于5％含水乙酸中的上述水解的脫乙酰殼多糖樣品冷卻到4℃。接著，在4℃的條件下，加入4份檸檬酸三鈉的水溶液，根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在4℃的條件下攪拌30-60分。將脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中保留的脫乙酰殼多糖的量。圖1還說明檸檬酸三鈉鹽析分子量為240kDa和高分子量(HMW)的未水解的脫乙酰殼多糖的效率。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員注意到，重要的是脫乙酰殼多糖酶的活性還保留在該水解的可溶相中。
實(shí)施例8在室溫時，檸檬酸三鈉鹽析不同分子量大小的(92％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖的效率圖2說明檸檬酸三鈉鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率，該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解的分子量為240kDa的脫乙酰殼多糖(Vanson HaloSource)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置(由Viscotec Corporation提供)測定的。將溶解于5％含水乙酸中的上述脫乙酰殼多糖樣品放置在室溫下。接著，在室溫的條件下，加入4份檸檬酸三鈉的水溶液，根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該溶液在室溫的條件下攪拌30-60分。將脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中保留的脫乙酰殼多糖的量。圖2還說明檸檬酸三鈉鹽析分子量為240kDa和高分子量(HMW)的未水解的脫乙酰殼多糖的效率。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員注意到，重要的是脫乙酰殼多糖酶的活性還保留在該可溶相中。
實(shí)施例9在4℃時，硫酸銨鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率圖3說明硫酸銨鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率，該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解的分子量為240kDa的脫乙酰殼多糖(Vanson HaloSource)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置(由Viscotec Corporation提供)測定的。將溶解于5％含水乙酸中的上述水解的脫乙酰殼多糖樣品冷卻到4℃。接著，分批加入4份冷卻到4℃的硫酸銨的水溶液，根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在4℃的條件下攪拌30-60分。將脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中保留的脫乙酰殼多糖的量。圖3還說明硫酸銨鹽析分子量為240kDa和高分子量(HMW)的未水解的脫乙酰殼多糖的效率。
實(shí)施例10在室溫時，硫酸銨鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率圖4說明硫酸銨鹽析不同分子量大小的(92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率，該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解的分子量為240kDa的脫乙酰殼多糖(Vanson HaloSource)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置(由Viscotec Corporation提供)測定的。將溶解于5％含水乙酸中的上述脫乙酰殼多糖樣品放置在室溫下。接著，在室溫的條件下，加入4份硫酸銨的水溶液，根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在室溫的條件下攪拌30-60分。將脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中保留的脫乙酰殼多糖的量。圖4還說明硫酸銨鹽析分子量為240kDa和高分子量(HMW)的未水解的脫乙酰殼多糖的效率。
實(shí)施例11在4℃，室溫和50℃時，硫酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體硫酸鈉的重量，或較好的是將一種硫酸鈉的濃溶液分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵校?該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard BiotechLtee)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供))，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖5所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中保留的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例12在4℃，室溫和50℃時，檸檬酸三鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體檸檬酸三鈉的重量，或較好的是將一種檸檬酸三鈉的濃溶液分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(MarinardBiotech Ltee)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供))，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖6所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例13在4℃，室溫和50℃時，硫酸銨鹽析(30kDa，92％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖的效率增加固體硫酸銨的重量，或較好的是將一種的硫酸銨濃溶液分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard BiotechLtee)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供))，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖7所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例14在4℃，室溫和50℃時，酒石酸二鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體酒石酸二鈉的重量，或較好的是將一種酒石酸二鈉的濃溶液分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵校?該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(MarinardBiotech Ltee)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供))，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖8所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例15在4℃，室溫和50℃時，一堿價的磷酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體一堿價的磷酸鈉的重量，或較好的是將一種一堿價的磷酸鈉的濃溶液分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard Biotech Ltee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖9所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例16在4℃，室溫和50℃時，蘋果酸二鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體蘋果酸二鈉的重量，或較好的，一種蘋果酸二鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(MarinardBiotech Ltee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖10所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例17
在4℃，室溫和50℃時，硝酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體硝酸鈉的重量，或較好的，一種硝酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard BiotechLtee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖11所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例18在4℃，室溫和50℃時，二堿價的磷酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體二堿價的磷酸鈉的重量，或較好的，一種二堿價的磷酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard Biotech Ltee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖12所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例19在4℃，室溫和50℃時，琥珀酸二鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體琥珀酸二鈉的重量，或較好的，一種琥珀酸二鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(MarinardBiotech Ltee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖13所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例20在4℃，室溫和50℃時，乙酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體乙酸鈉的重量，或較好的，一種乙酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard BiotechLtee)獲得的，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖14所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例21在4℃，室溫時，丙二酸二鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體丙二酸二鈉的重量，或較好的，一種丙二酸二鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(MarinardBiotech Ltee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖15所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例22在4℃，室溫和50℃時，乳酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體乳酸鈉的重量，或較好的，一種乳酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard BiotechLtee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖16所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中所含的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例23在4℃，室溫時，丙酸鈉鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體丙酸鈉的重量，或較好的，一種丙酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard BiotechLtee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖17所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例24在4℃，室溫和50℃時，將有機(jī)鹽和無機(jī)鹽分別相對于被溶解的脫乙酰殼多糖的比例為1∶1和4∶1來鹽析(30kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖時，比較其鹽析效率無機(jī)的鹽析鹽或有機(jī)的鹽析鹽相對于上述脫乙酰殼多糖的質(zhì)量比為1∶1和4∶1分別加入到一份分子量為30kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中，(該脫乙酰殼多糖是通過用酶水解市場上買的脫乙酰殼多糖(Marinard Biotech Ltee)獲得的)，上述數(shù)據(jù)是采用低角度的光散射裝置裝備的3個探測器陣列裝置測定的(由Viscotec Corporation提供)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖18所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例25在4℃，室溫時，硫酸銨鹽析(240kDa，92％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖的效率增加固體硫酸銨的重量，或較好的，一種硫酸銨的濃溶液被分批地加入到一份分子量為240kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?，(VansonHaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖19所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例26在4℃，室溫時，硫酸鈉鹽析(240kDa，92％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖的效率增加固體硫酸鈉的重量，或較好的，一種硫酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為240kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中，(VansonHaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖20所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例27在4℃，室溫時，檸檬酸三鈉鹽析(240kDa，92％脫乙酰基)脫乙酰殼多糖的效率增加固體檸檬酸三鈉的重量，或較好的，一種檸檬酸三鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為240kDa，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中，(Vanson HaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖21所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例28在4℃，室溫時，一堿價磷酸鈉鹽析(240kDa，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖的效率增加固體一堿價磷酸鈉的重量，或較好的，一種一堿價磷酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份分子量為240kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?Vanson HaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖22所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例29在4℃和室溫時，將無機(jī)鹽和有機(jī)鹽分別相對于溶解的脫乙酰殼多糖(240kDa，92％脫乙?；?以1∶1和4∶1的比例，以鹽析脫乙酰殼多糖時，比較其鹽析效率無機(jī)的鹽析鹽或有機(jī)的鹽析鹽相對于上述溶解的脫乙酰殼多糖的質(zhì)量比分別為1∶1和4∶1加入到一份分子量為240kDa，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?來自Vanson HaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖23所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例30在4℃和室溫時，硫酸銨鹽析(300cps，92％脫乙酰基)高分子量(HMW)脫乙酰殼多糖的效率增加固體硫酸銨的重量，或較好的，一種硫酸銨的濃溶液被分批地加入到一份高分子量，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?VansonHaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖24所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例31在4℃和室溫時，硫酸鈉鹽析(300cps，92％脫乙酰基)高分子量(HMW)脫乙酰殼多糖的效率增加固體硫酸鈉的重量，或較好的，一種硫酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份高分子量，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中(VansonHaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖25所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例32在4℃和室溫時，一堿價磷酸鈉鹽析(300cps，92％脫乙?；?高分子量(HMW)脫乙酰殼多糖的效率增加固體一堿價磷酸鈉的重量，或較好的，一種一堿價磷酸鈉的濃溶液被分批地加入到一份高分子量，92％脫乙酰基的脫乙酰殼多糖中(Vanson HaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖26所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例33在4℃和室溫時，檸檬酸三鈉鹽析(300cps，92％脫乙?；?高分子量(HMW)脫乙酰殼多糖的效率增加固體檸檬酸三鈉的重量，或較好的，一種檸檬酸三鈉的濃溶液被分批地加入到一份高分子量，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?VansonHaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖27所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例34在4℃和室溫時，將無機(jī)鹽和有機(jī)鹽相對于溶解的(300cps，92％脫乙?；?脫乙酰殼多糖分別以1∶1和4∶1的比例，來鹽析脫乙酰殼多糖時，比較其鹽析效率無機(jī)的鹽析鹽或有機(jī)的鹽析鹽相對于上述脫乙酰殼多糖的質(zhì)量比為分別1∶1和4∶1加入到一份高分子量的，92％脫乙?；拿撘阴ざ嗵侵?Vanson HaloSource)，將上述脫乙酰殼多糖樣品溶解于5％含水乙酸中。根據(jù)要被處理的脫乙酰殼多糖的量，該懸浮液在圖28所述的溫度的條件下攪拌30-60分。將懸浮的脫乙酰殼多糖從可溶相分離出來，并根據(jù)由Muzzarelli(Muzzarelli 1998年，上文)公開的方法用比色測定來測定在可溶相中的脫乙酰殼多糖的量。
實(shí)施例35使用有機(jī)鹽析鹽或無機(jī)鹽析鹽，通過鹽析效應(yīng)，從水溶液中被回收的脫乙酰殼多糖溶解度。該溶解度是在含水的稀鹽酸或稀乙酸中被定性地測定的。
表1是說明用本發(fā)明的實(shí)施例范圍內(nèi)所敘述的一系列鹽析鹽來鹽析(即沉淀)各種不同的分子量的脫乙酰殼多糖的溶解度例子。定性地分析了樣品的溶解度，定性分析時使用與在胃中的胃酸濃度(0.2N)相同的5％含水稀鹽酸或5％含水稀乙酸。
表1 脫乙酰殼多糖的沉淀在稀鹽酸或稀乙酸中的溶解度

對上表中符號作如下說明++++，片劑易于溶解；+++，片劑在1分鐘之內(nèi)溶解；++，片劑在1-5分鐘之內(nèi)溶解；+，片劑在5-10分鐘之內(nèi)溶解；ns，片劑在15分鐘后還不溶解；nd，未進(jìn)行測量。
也可以通過加入鹽析鹽的組合物(例如各種Kosmotropic鹽，其混合物，Kosmotropic鹽和離液序列高的鹽的混合物等)從稀含水的乙酸溶液中回收脫乙酰殼多糖，上述鹽析鹽的組合物是指例如實(shí)例中給出的檸檬酸三鈉和硫酸銨或硫酸鈉或一堿價磷酸鈉。
總之，根據(jù)此處所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過加入鹽析鹽從含水的酸性溶液中純化脫乙酰殼多糖(上述鹽析鹽是指例如各種Kosmotropic鹽，其混合物，Kosmotropic鹽和離液序列高的鹽的混合物等)。使用本發(fā)明的方法純化的脫乙酰殼多糖至少可防止脫乙酰殼多糖聚合物的某些物理性能的變化，上述物理性能是指剩余離子電荷和分子量大小(即本發(fā)明的脫乙酰殼多糖保留著天然的脫乙酰殼多糖的物理性能)。本發(fā)明所述的方法是一種簡單，成本低，易于使用和能快速達(dá)到目的的方法。在保留該產(chǎn)品的完整的性能的同時，該方法可利用最少量的易于實(shí)現(xiàn)的操作，快速的，有效的從含水的酸性溶液中定量回收脫乙酰殼多糖。本發(fā)明所述的方法在用于工業(yè)生產(chǎn)制造時，不受被溶解的脫乙酰殼多糖量的限制，即既可以小規(guī)模生產(chǎn)，也可大規(guī)模生產(chǎn)或超大規(guī)模生產(chǎn)。而且，當(dāng)適合于食用的鹽析鹽被用于從溶液中鹽析脫乙酰殼多糖量時，用本發(fā)明的方法純化的脫乙酰殼多糖制劑適合于人類或動物消費(fèi)。另外，本發(fā)明也不限于僅加入一種鹽或僅使用一種類型的鹽(例如各種Kosmotropic鹽)。也可以使用鹽的混合物(例如Kosmotropic鹽和離液序列高的鹽的混合物)，只要最終的效果能從含水的酸性溶液中鹽析脫乙酰殼多糖。在涉及到脫乙酰殼多糖用于人類和動物的情況下，例如涉及到用于生物醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)的情況下，以上這一點(diǎn)是相當(dāng)重要的。
當(dāng)參考某些具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行敘述時，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會體會到，雖然可以作各種變化，改變，省略和替代，但是也沒有脫離本發(fā)明的精神和實(shí)況，即各種變化，改變，省略和替代仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。例如，為了鹽析特定的脫乙酰殼多糖要求的鹽析鹽的有效量與以下多個因素有關(guān)，這些因素包括含水的酸性溶液中脫乙酰殼多糖的濃度，溫度，所用的無機(jī)鹽或有機(jī)鹽，特定的脫乙酰殼多糖的分子量，在低于1％到高于70％之間可以變化的乙?；饔贸潭?，該溶液的pH值和環(huán)境壓力。因此，不用說，本發(fā)明不被限定于所給出的特定實(shí)施例，但試圖覆蓋在所附的權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化。
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權(quán)利要求
1.一種用于沉淀脫乙酰殼多糖的方法，該方法包括以下步驟將含一種脫乙酰殼多糖聚合物和至少一種無機(jī)鹽或有機(jī)鹽按照任何順序混合于酸性水溶液中，其中所述的無機(jī)鹽或有機(jī)鹽的量要使得其能有效地鹽析上述脫乙酰殼多糖聚合物以形成一種含水的組合物，該組合物至少包括上述鹽析出的脫乙酰殼多糖聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述無機(jī)鹽或有機(jī)鹽是適合于食用的或適合于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的無機(jī)鹽或有機(jī)鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述酸性水溶液的pH值約在2-6之間。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中沉淀是在約4-55℃之間的溫度下實(shí)現(xiàn)的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述無機(jī)鹽或有機(jī)鹽選自包括硫酸銨或硫酸鈉，磷酸鈉或磷酸鉀，檸檬酸鈉或檸檬酸鉀，酒石酸鈉，蘋果酸鈉，硝酸鈉，乳酸鈉，丙二酸鈉，琥珀酸鈉，乙酸鈉和丙酸鈉類的無機(jī)鹽或有機(jī)鹽。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述酸性水溶液選自包括乙酸，乳酸，蘋果酸和鹽酸類的酸性水溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用了至少2種無機(jī)鹽或至少2種有機(jī)鹽組成的組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中上述鹽的組合物是kosmotropic鹽和離液序列高的鹽的組合物。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中沉淀的脫乙酰殼多糖的量至少是溶液中脫乙酰殼多糖的量的90％。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述的脫乙酰殼多糖聚合物的分子量約在7KDa到幾百KDa之間。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述的脫乙酰殼多糖聚合物的乙?；饔贸潭燃s在0％-50％之間。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中上述鹽析的脫乙酰殼多糖，用水洗滌，然后通過離心分離從上述酸性水溶液中分離出來。
13.一種使用權(quán)利要求1所述的方法獲得的脫乙酰殼多糖制劑。
14.如權(quán)利要求13所述的脫乙酰殼多糖制劑，其中上述制劑適合于人類消費(fèi)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求13所述的脫乙酰殼多糖制劑，其中上述制劑基本上不含脫乙酰殼多糖酶。
16.如權(quán)利要求13所述的脫乙酰殼多糖制劑，其中上述制劑基本上不含鹽。
17.如權(quán)利要求13所述的脫乙酰殼多糖制劑，其中上述脫乙酰殼多糖，在沉淀后保留其原來的物理化學(xué)性能。
18.如權(quán)利要求13所述的脫乙酰殼多糖制劑，其中上述制劑可溶解在胃的酸性環(huán)境中。
19.一種脫乙酰殼多糖制劑，該制劑有以下特征1)基本上不含脫乙酰殼多糖酶；2)適合于人類消費(fèi)；3)可溶解于例如胃的含水的酸性環(huán)境中；以及4)基本上不含沉淀的各種鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用含某些鹽析鹽的混合物來鹽析脫乙酰殼多糖聚合物的成分以及制造和使用該脫乙酰殼多糖聚合物的方法。用此方法生產(chǎn)的脫乙酰殼多糖聚合物制劑基本上不含脫乙酰殼多糖酶，不含不想要的鹽和過量的酸，并保留了脫乙酰殼多糖聚合物的物理性能，生物性能和物理化學(xué)性能。本發(fā)明的脫乙酰殼多糖聚合物制劑用于配制具有生物活性的脫乙酰殼多糖藥物或作為食品添加劑時是有價值的。這些制劑大多數(shù)都易于溶解于含水的酸性環(huán)境例如胃的酸性環(huán)境中。
文檔編號A61K47/36GK1938335SQ200480039999
公開日2007年3月28日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月6日
發(fā)明者讓－居伊·勒吾, 德碧·日依勒 申請人:西爾布魯克大學(xué)