專利名稱：重組人生肝素的制備方法及其在制備抗肝損傷藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明為一種重組人生肝素的制備方法及其在制備抗肝損傷藥物中的用途。
背景技術(shù)：
我國(guó)是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，全國(guó)每年發(fā)生急性病毒性肝炎約120萬(wàn)例，每年死于肝病者約30萬(wàn)人。根據(jù)現(xiàn)有調(diào)查推算，我國(guó)有1.2億人攜帶乙肝病毒，3800萬(wàn)人攜帶丙肝病毒。所以，肝病的預(yù)防和治療對(duì)提高我國(guó)國(guó)民的身體素質(zhì)有重要意義。
當(dāng)肝臟被部分切除或肝細(xì)胞受到破壞(如中毒、缺血、缺氧、病毒性肝炎)時(shí)，剩余的肝細(xì)胞迅速進(jìn)入分裂周期，表現(xiàn)出很強(qiáng)的再生能力。肝細(xì)胞的分裂繁殖受到嚴(yán)格調(diào)控，并受到很多因素的影響。能夠促進(jìn)肝細(xì)胞分裂的物質(zhì)很多，包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocytegrowth factor，HGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰高血糖素、胰島素、類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、IGF-II)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)、纖粘素(Fn)、雌激素、腎上腺素、前列腺素(PGE)以及多聚胺類(PA)等等。但上述各類生長(zhǎng)因子對(duì)肝細(xì)胞的刺激作用都是非特異性的。以HGF為例，HGF除了對(duì)肝細(xì)胞具有刺激作用外還對(duì)腎小管上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等有刺激增殖作用。尋找肝臟特異性的刺激因子對(duì)于深入認(rèn)識(shí)肝再生的分子機(jī)制有重要意義。
早在二十世紀(jì)八十年代末，本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了人胎肝中促肝細(xì)胞增殖活性物質(zhì)的研究，并最終獲得了具有抗肝損傷作用的人肝細(xì)胞生成素(hepatopoietin，HPO)。2002年我們又從胎肝cDNA文庫(kù)中找到了一種肝臟特異性表達(dá)的基因，命名為生肝素，其cDNA全長(zhǎng)936bp，編碼312個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。經(jīng)檢索，生肝素與Yamamoto等報(bào)道的HFREP1高度同源，與Hara等報(bào)道的hepassocin為同一蛋白。HFREP1是FGL1基因表達(dá)產(chǎn)物，而FGL1(Fibrinogen-like 1)是Yamamoto等于1993年通過(guò)差減雜交方法篩選到的在肝細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)的一種基因，其表達(dá)產(chǎn)物HFREP1(Hepatocyte-Derived Fibrinogen-Related Protein 1)屬于纖維蛋白原家族。纖維蛋白原和纖維蛋白原相關(guān)蛋白C端具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，HFREP1同纖維蛋白原β、γ的C末端同源——包含4個(gè)半胱氨酸，但缺少纖維蛋白凝血形成所必需的血小板結(jié)合位點(diǎn)、交聯(lián)區(qū)和凝血酶敏感位點(diǎn)，故Yamamoto推測(cè)該蛋白是一種與血液凝固不相關(guān)的分泌蛋白。Hepassocin是Hara等在2001年利用大鼠的FGL1 cDNA作為探針，在人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆到一種與HFREP1高度同源的基因。Hepassocin與HFREP1只有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)的不同，即Asn69，Ile72，Leu105，而HFREP1則分別為Asp69，Val72，Pro105。Hara等在CHO真核細(xì)胞表達(dá)了hepassocin，并通過(guò)[3H]TdR摻入法證明真核細(xì)胞表達(dá)的hepassocin能刺激兔、狗等的原代肝細(xì)胞的增殖，說(shuō)明Hepassocin具有促有絲分裂活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用原核細(xì)胞，通過(guò)基因工程技術(shù)、體外復(fù)性技術(shù)和層析技術(shù)建立一種可以工業(yè)化生產(chǎn)的生肝素的制備方法，并提供了一種生肝素在制備抗肝損傷藥物中的用途。
本發(fā)明首次利用原核細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了HPS的高效表達(dá)，并首次利用體外復(fù)性技術(shù)實(shí)現(xiàn)了HPS的成功復(fù)性。本發(fā)明的主要內(nèi)容是在獲得人生肝素cDNA的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了HPS的原核表達(dá)載體，此表達(dá)載體為溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體。將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得了表達(dá)HPS的基因工程菌。利用此基因工程菌建立了一套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)體外復(fù)性和純化工藝，利用此工藝可以生產(chǎn)大量的有活性的HPS。在獲得大量的有活性的HPS之后，對(duì)HPS的生物學(xué)性能進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明公開(kāi)了一種HPS在制備抗肝損傷藥物中的用途。
本發(fā)明以從胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增到的HPS全長(zhǎng)cDNA為模板，利用PCR引物擴(kuò)增HPS基因中不包括信號(hào)肽的cDNA序列，經(jīng)測(cè)序，其擴(kuò)增的序列如圖1。通過(guò)雙限制性酶切后將此cDNA連接到用同樣雙酶切的pBV220溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體中，構(gòu)建pBV-HPS重組載體(圖2)，用此載體通過(guò)CaCl2沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21、JM109、DH5α或MM294等(優(yōu)選BL21)，然后，在氨芐抗性的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。取陽(yáng)性克隆在30℃條件下培養(yǎng)至菌體密度OD600為0.3～0.8時(shí)(優(yōu)選0.5)，升高溫度到42℃誘導(dǎo)HPS基因表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為3～6小時(shí)，優(yōu)選5小時(shí)。在優(yōu)選表達(dá)條件下，表達(dá)的HPS占菌體總蛋白的比例大于50％，實(shí)現(xiàn)了HPS的高效表達(dá)。
表達(dá)的HPS以無(wú)活性的包涵體形式存在，需要經(jīng)過(guò)體外復(fù)性工藝才能獲得有活性的HPS。通過(guò)離心方法收集誘導(dǎo)表達(dá)后的HPS工程菌，并通過(guò)超聲破碎方法將菌體破碎，再通過(guò)3000r/min離心10min將破碎后的菌體分為上清和沉淀部分。棄掉上清部分，保留沉淀部分，沉淀部分即為粗制包涵體。用各種不同的緩沖液充分洗滌粗制包涵體，然后，再通過(guò)離心方法回收沉淀，即包涵體。將包涵體用含有0.1％巰基乙醇和8mol/L尿素的20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)在室溫條件下裂解過(guò)夜，然后，離心，回收離心上清，上清中主要為處于變性狀態(tài)的HPS。包涵體也可以用含有0.1％巰基乙醇的6-7mol/L的鹽酸胍裂解。
在4℃條件下，用含8mol/L尿素的20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)的緩沖液調(diào)整離心上清中的蛋白濃度至200～600μg/ml，然后用pH8.0的20mmol/L Tris-HCl緩沖液作4倍稀釋，使最終稀釋液中的尿素濃度為2mol/L，稀釋液中的蛋白濃度維持在50～150μg/ml。將此蛋白溶液在4℃條件下復(fù)性6～12小時(shí)。復(fù)性后的HPS經(jīng)過(guò)pH8.0的20mmol/L Tris-HCl緩沖液充分透析后，上樣于用pH8.0的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡后的Q Sepharose Fast Flow離子交換柱，上樣完畢，再用同樣的緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，然后，用溶解于pH8.0的20mmol/LTris-HCl緩沖液中的NaCl洗脫結(jié)合到Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱上的蛋白質(zhì)，HPS在NaCl濃度為0.3-0.5mol/L范圍內(nèi)被洗脫，蛋白質(zhì)純度達(dá)到95％(圖3)。通過(guò)此方法制備的HPS具有圖4所示的氨基酸序列，能夠刺激L02細(xì)胞增殖(圖5)，但不能HepG2、7721等肝癌細(xì)胞的增殖。
利用上述制備方法制備了大量有活性的HPS之后，對(duì)HPS的在制藥方面的應(yīng)用進(jìn)行了研究。本發(fā)明公開(kāi)了HPS在制備抗肝損傷藥物中的用途。
四氯化碳造成的急性肝損傷模型是目前公認(rèn)的驗(yàn)證、檢測(cè)抗急性肝損傷類藥物的動(dòng)物模型。在四氯化碳造成的大鼠急性肝損傷模型后4小時(shí)，給予大鼠腹腔注射HPS，能明顯降低肝損傷大鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平(圖6)，并且能明顯降低急性肝損傷大鼠的死亡率(圖7)。這說(shuō)明HPS具有抗肝損傷作用。
為了更好地發(fā)揮HPS的療效，將重組的HPS制成藥學(xué)上合理的藥物制劑，優(yōu)選的制劑為凍干劑。該制劑除包含緩沖液外，還可加入保護(hù)劑，如甘露糖、海藻糖和白蛋白等，優(yōu)選海藻糖。制備好的該制劑經(jīng)過(guò)濾除菌后分裝、凍干。
為了更有效地治療肝損傷類疾病，HPS和以下的抗肝損傷類細(xì)胞因子組成藥物組合物肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，肝細(xì)胞生成素(HPO)，γ-干擾素(IFN-γ)和α-干擾素。
為了更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)肝損傷疾病的治療，HPS可以被制成基因治療劑，該類治療劑包含HPS基因，該類治療劑包括含有HPS基因的重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或裸DNA載體。這些基因治療劑可通過(guò)靜脈給藥，也可以利用電脈沖方法通過(guò)肌肉給藥。
為了更有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)肝損傷疾病的治療，HPS的基因治療劑除包含HPS基因外，還包含選自如下的抗肝損傷類細(xì)胞因子或RNA的基因肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因，肝細(xì)胞生成素(HPO)基因，γ-干擾素(IFN-γ)基因和α-干擾素(IFN-α)基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的反義RNA基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的干涉RNA基因。這些基因治療劑可通過(guò)靜脈給藥，也可以利用電脈沖的方法通過(guò)肌肉給藥。
含有HPS的藥物制劑或藥物組合物用于治療由化學(xué)物質(zhì)或病毒造成的急性或慢性肝損傷，臨床上的病癥為急性肝壞死、亞急性肝壞死、慢性重癥肝炎、慢性肝炎。
對(duì)于重癥肝炎，臨床上的HPS的用量在30-90μg/kg/day，靜脈或肌肉注射，一個(gè)療程為30天?？筛鶕?jù)病人的不同情況，用藥劑量可適當(dāng)超出此范圍，也可以適當(dāng)延長(zhǎng)治療時(shí)間。對(duì)于慢性肝炎，臨床上的HPS的用量在30-90μg/kg/day，靜脈或肌肉注射，一個(gè)療程為90天?？筛鶕?jù)病人的不同情況，用藥劑量可適當(dāng)超出此范圍，也可以適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短治療時(shí)間。


圖1生肝素的cDNA序列；圖2生肝素原核表達(dá)載體構(gòu)建圖；圖3純化后的生肝素(MMarker；1，2，3Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化的HPS的還原性電泳結(jié)果，示HPS單體；4Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化的HPS的非還原性電泳結(jié)果，示HPS雙體)圖4生肝素的氨基酸序列；圖5生肝素刺激L02細(xì)胞的增殖(陰性對(duì)照組未加HPS組；陽(yáng)性對(duì)照組加20ng/mlHGF組)；圖6生肝素抗肝損傷作用(對(duì)照組注射生理鹽水組；實(shí)驗(yàn)組注射500μg/kg HPS組)；圖7生肝素降低由CCl4引起的大鼠的死亡率(對(duì)照組注射生理鹽水組；實(shí)驗(yàn)組注射500μg/kg HPS組)。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1人生肝素cDNA的獲得設(shè)計(jì)兩條生肝素引物，分別為引物15’CGGAATTCATGCATCGAGGACTGTGCCCAGGAG3’引物25’CGGGATCCTTAAATTACATTTGGAATAAA3’
利用人HPS的全長(zhǎng)cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增人生肝素不包括信號(hào)肽序列的cDNA。
PCR參數(shù)為94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min。共進(jìn)行30循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)延伸7分鐘。
實(shí)施例2人生肝素原核表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1中的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體中，測(cè)序，挑取序列正確的克隆。擴(kuò)增所得的人生肝素cDNA序列如圖1所示。人生肝素cDNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如圖4。
取序列正確的克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒與pBV220載體同時(shí)用EcoR I，BamHI雙酶切，回收相應(yīng)片段后用T4 DNA連接酶中在16℃條件下連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中，在氨芐抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，鑒定，并培養(yǎng)。
實(shí)施例3人生肝素的誘導(dǎo)表達(dá)、復(fù)性和純化將含人生肝素表達(dá)質(zhì)粒的BL21工程菌在30℃下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日以2％接種于SOB培養(yǎng)基中，在30℃下震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5，將溫度迅速提高到42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)，離心收集菌體，用還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，表明有目的蛋白表達(dá)帶出現(xiàn)，分子量約為34kDa。
將細(xì)菌超聲破碎后，3000r/min離心，將離心沉淀和上清分別進(jìn)行還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果表明表達(dá)的人生肝素全部在沉淀中，說(shuō)明表達(dá)的人生肝素是以無(wú)活性的包涵體的形式存在的。
將離心沉淀即粗制包涵體分別以20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)、含0.1％TritonX-100的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)、含1mol/L NaCl的20m mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)、含1mol/L尿素的20mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌，然后用含8mol/L尿素、0.1％巰基乙醇的20m mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)裂解包涵體，室溫裂解過(guò)夜。
在4℃條件下，用含8mol/L尿素的20mol/L Tris-HCl(pH8.0)的緩沖液調(diào)整上清中的蛋白濃度至400μg/ml，然后用pH8.0的20mol/L Tris-HCl緩沖液作4倍稀釋，使最終稀釋液中的尿素濃度為2mol/L，蛋白濃度為100μg/ml。將此蛋白溶液在4℃條件下復(fù)性12小時(shí)。復(fù)性后的HPS經(jīng)過(guò)pH8.0的20mol/L Tris-HCl緩沖液充分透析后，上樣于用pH8.0的20mol/LTris-HCl緩沖液平衡后的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，上樣完畢，再用同樣的pH8.0的緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，然后，用溶解于pH8.0的20mol/L Tris-HCl緩沖液的NaCl洗脫結(jié)合到Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱上的蛋白質(zhì)，HPS在NaCl濃度為0.3-0.5mol/L范圍內(nèi)被洗脫，蛋白質(zhì)純度達(dá)到95％(圖3)。純化后的HPS在還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)為分子量為34kD的條帶(單體形式)，而在非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)為分子量為66kD的條帶(雙體形式)(圖3)，說(shuō)明體外復(fù)性的HPS是以雙體形式存在的。
實(shí)施例4.重組人生肝素的活性測(cè)定方法以正常人肝細(xì)胞系L02為測(cè)試細(xì)胞，采用[3H]TdR摻入方法進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的L02細(xì)胞，用胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5萬(wàn)/ml，取100μl接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，然后，更換培養(yǎng)液，將血清濃度降低至0.5％。在此條件下，向培養(yǎng)體系中加入不同濃度純化的生肝素，陽(yáng)性對(duì)照孔加入20ng/ml HGF。加藥后置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后每孔加入1.8×104Bq3H-TdR，3h后胰酶消化，收集細(xì)胞并進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，生肝素在體外能促進(jìn)L02細(xì)胞增殖，其刺激指數(shù)達(dá)到3以上，結(jié)果如表1，圖5；同時(shí)生肝素對(duì)L02細(xì)胞的刺激增殖作用具有劑量關(guān)系(表1)。生肝素對(duì)HepG2、7721等肝癌細(xì)胞無(wú)刺激活性(表2、3)。
表1生肝素對(duì)L02細(xì)胞的刺激作用

表2生肝素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞無(wú)刺激作用

表3生肝素對(duì)7721肝癌細(xì)胞無(wú)刺激作用

實(shí)施例5.生肝素的抗肝損傷實(shí)驗(yàn)取雄性Wister大鼠，體重140±20g，按照體重均衡原則隨機(jī)分組，分為人生肝素治療組和生理鹽水作對(duì)照組。每只按4ml/kg一次性腹腔注射50％的四氯化碳溶液(四氯化碳∶豆油＝1∶1)造成大鼠急性肝損傷。
4h后生肝素治療組每只大鼠腹腔一次性注射生肝素500μg/kg，生理鹽水對(duì)照組每只大鼠腹腔同樣體積的生理鹽水作對(duì)照。注射生肝素24h，48h后測(cè)定各大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST水平。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生肝素能明顯降低四氯化碳致肝損傷大鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST水平，24h、48h時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清的ALT水平分別為對(duì)照組的54％和57％，AST水平分別為對(duì)照組的37％、35％(圖6)。此外，重組生肝素還能提高因四氯化碳致急性肝損傷大鼠的存活率(圖7)。
實(shí)施例6.重組人生肝素凍干劑配方及制備方法重組人生肝素 5mg
海藻糖10mg磷酸鹽緩沖液 加至1ml充分溶解后，無(wú)菌過(guò)濾，分裝，并冷凍干燥，制成凍干劑。
實(shí)施例7.重組人生肝素與肝細(xì)胞生成素組成的藥物組合物配方及制備方法重組人生肝素5mg重組人肝細(xì)胞生成素 2mg海藻糖 10mg磷酸鹽緩沖液加至1ml充分溶解后，無(wú)菌過(guò)濾，分裝，并冷凍干燥，制成凍干劑。
實(shí)施例8重組人生肝素基因治療劑配方人生肝素真核表達(dá)質(zhì)粒 50μgDNA酶抑制劑ATA100μg加150mmol/L磷酸鹽緩沖液至 50μl實(shí)施例9含有人生肝素基因的藥物組合物配方人生肝素真核表達(dá)質(zhì)粒 50μg人γ-干擾素真核表達(dá)質(zhì)粒 50μgDNA酶抑制劑ATA100μg加150mmol/L磷酸鹽緩沖液至 50μl參考文獻(xiàn)1Yamamoto T，Gotoh M，Sasaki H，Terada M，Kitajima M，Hirohashi S.Molecularcloning and initial characterization of a novel fibrinogen-related gene，HFREP-1.BiochemBiophys Res Commun.1993 Jun 15；193(2)681-7.
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序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所<120>重組人生肝素的制備方法及其在制備抗肝損傷藥物中的用途<160>1<210>1<211>291<212>PRT<213>人<400>1MLEDCAQEQM RLRAQVRLLE TRVKQQQVKI KQLLQENEVQ FLDKGDENTV 50IDLGSKRQYA DCSEIFNDGY KLSGFYKIKP LQSLAEFSVY CDMSDGGGWT 100VIQRRSDGSE NFNRGWKDYE NGFGNFVQKH GEYWLGNKNL HFLTTQEDYT 150LKIDLADFEK NSRYAQYKNF KVGDEKNFYE LNIGEYSGTA GDSLAGNFHP 200EVQWWASHQR MKFSTWDRDH DNYEGNCAEE DQSGWWFNRC HSANLNGVYY 250SGPYTAKTDN GIVWYTWHGW WYSLKSVVMK IRPNDFIPNV I 29權(quán)利要求
1.一種制備人生肝素(human hepassocin，HPS)的方法，其特征為利用溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體在原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)HPS的高效表達(dá)，采用稀釋方法在變性劑介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)HPS的體外復(fù)性，該方法包括(1)將HPS的cDNA克隆到溫度誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體中，構(gòu)建HPS表達(dá)載體；(2)用HPS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，構(gòu)建HPS基因表達(dá)工程菌；(3)30℃條件下培養(yǎng)HPS基因表達(dá)工程菌，42℃條件下誘導(dǎo)HPS表達(dá)；(4)分離HPS包涵體，用變性劑裂解HPS包涵體；(5)用稀釋方法在變性劑介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)HPS的體外復(fù)性；(6)用Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析實(shí)現(xiàn)對(duì)HPS的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件為菌體密度OD600＝0.3～0.8時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為HPS的復(fù)性體系的蛋白濃度維持在50～150μg/ml，復(fù)性時(shí)間為6～12小時(shí)，復(fù)性溫度為4℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其制備的HPS具有以下特征具有附圖4所示的氨基酸序列，分子量約為34,000道爾頓；在體外能刺激人L02細(xì)胞的增殖，但不能刺激肝癌細(xì)胞的增殖。
5.人生肝素的用途，其特征在于，用于制備抗肝損傷藥物制劑或藥物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物制劑用于治療急性或慢性肝損傷。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物制劑含有人生肝素。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物含有人生肝素和選自如下的抗肝損傷類細(xì)胞因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，肝細(xì)胞生成素(HPO)，γ-干擾素(IFN-γ)和α-干擾素(IFN-α)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物制劑含有人生肝素基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物制劑含有人生肝素基因和選自如下的抗肝損傷類細(xì)胞因子或RNA的基因肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因，肝細(xì)胞生成素(HPO)基因，γ-干擾素(IFN-γ)基因和α-干擾素(IFN-α)基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的反義RNA基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的干涉RNA基因。
全文摘要
本發(fā)明為重組人生肝素(hepassocin，HPS)的制備方法及其在制備抗肝損傷藥物中的應(yīng)用，屬生物產(chǎn)品的生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域。在獲得人HPS cDNA之后，將此cDNA插入原核表達(dá)載體，構(gòu)建原核高效表達(dá)工程菌，在此基礎(chǔ)上建立了一套工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離與裂解、HPS的體外復(fù)性和分離純化工藝。利用此工藝能最終得到具有生物學(xué)活性的HPS純品，實(shí)現(xiàn)HPS的工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明還提供了HPS在制備抗肝損傷藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1800382SQ20051000025
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月7日
發(fā)明者楊曉明, 曹傳增, 王清明, 李圍, 李永輝, 詹軼群, 許望翔, 陳吉中 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所, 廣州貝科能生物科技開(kāi)發(fā)有限公司