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胸腺素α原基因的新用途的制作方法

文檔序號(hào):1094389閱讀:317來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):胸腺素α原基因的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及胸腺素α原基因的新用途,特別是涉及胸腺素α原基因在作為DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
胸腺素α原(Prothymosin α,ProTα)是由109~113個(gè)氨基酸殘基組成的小分子蛋白。ProTα分子氨基酸殘基總數(shù)的約50%為酸性氨基酸殘基,且成簇分布于ProTα分子的中部,使分子具有很強(qiáng)的親水性。ProTα分子中不含有分泌信號(hào),而含有由兩部分組成的核定位信號(hào),主要分布在核內(nèi),與細(xì)胞增殖功能有關(guān),血清中僅含有少量ProTα(約占全血ProTα的10%)。大鼠ProTα由111個(gè)氨基酸殘基組成,人ProTα由110個(gè)氨基酸殘基組成。人淋巴母細(xì)胞(PHA激活的淋巴細(xì)胞)膜表面存在著兩類(lèi)ProTα受體,說(shuō)明ProTα具有免疫調(diào)節(jié)作用。
1985年,Haritos等發(fā)現(xiàn)大鼠ProTα能增強(qiáng)小鼠抗白色念珠菌(Candidaalbicans)感染的能力,后來(lái)又發(fā)現(xiàn)ProTα能刺激轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)的釋放。1987年,Salvin等發(fā)現(xiàn)腹腔注射ProTα能增強(qiáng)RF/J小鼠產(chǎn)生抗體的能力,鋅能加強(qiáng)這種作用,能使青年大鼠和老年大鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫都增強(qiáng)。ProTα能延長(zhǎng)白血病模型DBA/2小鼠的存活期,當(dāng)腹腔注射ProTα?xí)r,能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、NC細(xì)胞、LAK細(xì)胞的活性,并誘導(dǎo)IL-2和TNFα的產(chǎn)生,從而產(chǎn)生非特異性腫瘤殺傷作用,同時(shí),誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+)和輔助性T細(xì)胞(CD4+)的特異性抗腫瘤作用。另外,ProTα還具有誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IL-2R(IL-2受體)的能力,增強(qiáng)人和小鼠淋巴細(xì)胞的MHC II類(lèi)抗原和mRNA的表達(dá)。
DNA疫苗是指攜帶有抗原蛋白基因及表達(dá)必要的調(diào)控元件的質(zhì)粒DNA的表達(dá)載體。將其導(dǎo)入到宿主的有機(jī)體中,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,達(dá)到免疫的目地。這種方法與傳統(tǒng)的活病毒疫苗或亞單位疫苗相比,有如下優(yōu)點(diǎn)易于構(gòu)建;規(guī)模化生產(chǎn)成本低廉;以天然抗原形式被免疫系統(tǒng)識(shí)別,可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫;可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期持久的免疫力;制劑穩(wěn)定;可組建多價(jià)復(fù)合疫苗聯(lián)合免疫。但是,有些抗原基因的免疫原性比較弱,單獨(dú)注射這些疫苗不能誘發(fā)足夠的保護(hù)性免疫。因此,尋找合適的DNA疫苗佐劑,提高免疫反應(yīng)及其免疫效果,意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供胸腺素α原基因在作為DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)證實(shí),ProTα能夠顯著改善動(dòng)物對(duì)DNA疫苗的反應(yīng)性,可以用作DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑。
在實(shí)際應(yīng)用中,胸腺素α原基因的來(lái)源是廣泛的,可以是人源的,也可以是鼠源的,還可以是其它動(dòng)物來(lái)源的。胸腺素α原基因與DNA疫苗的基因可以存在于不同的重組質(zhì)粒中,使用時(shí)聯(lián)合注射,也可以使胸腺素α原基因與DNA疫苗的基因融合,形成一個(gè)重組質(zhì)粒,使用起來(lái)會(huì)更方便。當(dāng)然,在制備該佐劑時(shí),也不排除添加其它藥學(xué)上可接受的輔料及載體。
胸腺素α原基因可以使各種DNA疫苗免疫原性得到增強(qiáng),具有廣譜性,是一種不可多得的DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑,在DNA疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用中意義重大。


圖1為質(zhì)粒pThα和TLH的酶切鑒定圖譜。
圖2為質(zhì)粒pS2S的酶切鑒定圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1質(zhì)粒的制備1、含有胸腺素α原基因的重組質(zhì)粒pThα的構(gòu)建使用上游引物5’cgcggatccatgtctgatgcagctgtagatacc-3’(BamHI),下游引物5’ccggaattcgtc atcctcgtcggtcttctg-3’(EcoRI),以人胎肝cDNA文庫(kù)為模板,擴(kuò)增胸腺素α原基因(1)95℃,5分鐘;(2)95℃,30秒,55℃,20秒,72℃,30秒,25個(gè)循環(huán);(3)72℃,5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收,再用KpnI和EcoRI酶切得到的基因片段,將其克隆入同樣酶切的質(zhì)粒載體pcDNA3(Invitrogen,USA)上,得到重組質(zhì)粒pThα。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,挑選陽(yáng)性克隆,經(jīng)DNA序列分析正確(序列1),其編碼的氨基酸序列為序列表中的序列2。該質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜如圖2所示,圖中1為pTha,約330bp;2和4分別為Marker DL-2000和DL-15000。
2、含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒pS2S的構(gòu)建使用上游引物B2 5’GGAAGATCTCAGGCCATG CAGTGGA ATT-3’(BglII);和下游引物S3 5’AGGGGGCCCAGCCCATGAAGTTTAGGGAA-3’(ApaI),從HBV2質(zhì)粒(張彤等;中華微生物和免疫學(xué)雜志。1997,16(6)421-424)擴(kuò)增出乙肝表面抗原中蛋白(preS2.S)基因片段,PCR程序如下(1)95℃,5分鐘;(2)95℃,30秒,58℃,30秒,72℃,50秒,25個(gè)循環(huán);(3)72℃,5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收,然后用BamHI和ApaI酶切該基因片段,克隆入pcDNA3(Invitrogen公司)載體的多克隆位點(diǎn)BamHI和ApaI之間,得到重組質(zhì)粒pS2S。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選正確克隆,經(jīng)DNA序列分析正確后用于后述研究,其酶切鑒定圖譜如圖1所示,圖中1為pS2S,約841bp;2為Marker DL-2000.
3、含有胸腺素α原和乙肝表面抗原融合基因的重組質(zhì)粒TLH的構(gòu)建用于構(gòu)建融合基因的pS2S引物上游引物S1 5’CCCaagcttCA GG C CA TG CAGTGGAATT-3’(HindIII),下游引物S25’TTTTCCTTTTgcggccgc AGCCCAT GAA GTTTAGG GA-3’(NotI),以HBV2質(zhì)粒為模板,其PCR程序如下(1)95℃,5分鐘;(2)95℃,30秒,55℃,30秒,72℃,55秒,25個(gè)循環(huán);(3)72℃,5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收,然后使用HindIII和NotI雙酶切該基因片段,與Linker(其核苷酸及編碼蛋白的序列分別為序列表中的序列3和序列4)一起在T4連接酶的作用下,克隆入胸腺素α原基因下游,形成pTha-Linker--pS2S重組質(zhì)粒,命名為T(mén)LH。Linker上游引物5’gaattcttcggtggcggctccggtgggggca-3’(EcoRI)。下游引物5’gaggccaccgccgaggccacccccgttcgaa-3’(HindIII)。Linker的兩條引物為互補(bǔ)序列,只須經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性過(guò)程,即可形成帶酶切位點(diǎn)雙鏈片段。其PCR程序如下95℃,5分鐘;50℃,50分鐘即可。該質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜如圖2所示,圖中3為T(mén)LH切出pTha和pS2S兩個(gè)片段;2和4分別為Marker DL-2000和DL-15000。
4、含有瘧疾多表位抗原基因的重組質(zhì)粒AWTE的構(gòu)建使用上游引物5’cgcggatccatgaacgctaaccctgg tgat-3’(BamHI),下游引物5’agggggcccttacgatggtaccacaacgtt-3’(ApaI)。從CTB-AWTE重組質(zhì)粒上擴(kuò)增AWTE片段(鐘輝等??茖W(xué)通報(bào).43(13)1417-1422.)。其PCR程序如下(1)95℃,5分鐘;(2)95℃,30秒,45℃,20秒,72℃,30秒,5個(gè)循環(huán);(3)95℃,30秒,55℃,20秒,72℃,30秒,25個(gè)循環(huán),(4)72℃,5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收,然后使用(BamHI)和ApaI雙酶切該基因片段,將其克隆入同樣酶切的質(zhì)粒載體pcDNA3(Invitrogen,USA)上,得到重組質(zhì)粒AWTE。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,挑選陽(yáng)性克隆,經(jīng)DNA序列分析正確。
5、含有胸腺素α原與瘧疾多表位抗原融合基因的重組質(zhì)粒pTha-ATWE的構(gòu)建使用瘧疾多表位抗原基因(AWTE)的上游引物5’ccggaattcatgaacgctaaccctggtgat-3’(EcoRI),下游引物5’agggggcccttac gatggtaccacaacgtt-3’(ApaI),從pCMV-AWTE重組質(zhì)粒(鐘輝等??茖W(xué)通報(bào).43(13)1417-1422.)上擴(kuò)增AWTE片段。其PCR程序如下(1)95℃,5分鐘;(2)95℃,30秒,45℃,20秒,72℃,30秒,5個(gè)循環(huán);(3)95℃,30秒,55℃,20秒,72℃,30秒,25個(gè)循環(huán),(4)72℃,5分鐘,PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收,然后使用(EcoRI)和ApaI雙酶切該基因片段,將其克隆入pTha基因下游,構(gòu)成融合基因重組質(zhì)粒pTha-ATWE。
實(shí)施例2胸腺素α原基因?qū)σ腋尾《颈砻婵乖璂NA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用小鼠C57BL/6,雌性,4-6周齡(19-21g)。
分組(1)空載體組(pcDNA3),6只;(2)乙肝蛋白疫苗組(rHBsAg),6只;(3)pS2S組,30只;(4)pS2S+pThα佐劑組,10只;(5)TLH(乙肝表面抗原基因與胸腺素α原基因融合)質(zhì)粒組,6只。
免疫方案(1)空載體組pcDNA3200ug/只/次;(2)乙肝蛋白疫苗組(rHBsAg)400ng/只/次;(3)pS2S組100ug pS2S+100ug pcDNA3/只/次;(4)pS2S+pThα佐劑組100ug pS2S+100ug pThα。(5)TLH質(zhì)粒組100ug TLH。
在小鼠麻醉狀態(tài)下(75mg/kg sodium pentobarbital IP),在小鼠的兩后肢的股四頭肌肉各注射50ul樣品,然后用活體基因?qū)雰x(浙江新芝公司生產(chǎn)),在注射部位進(jìn)行電擊,電壓為120V/cm,時(shí)長(zhǎng)2ms,2次。
免疫次數(shù)共兩次,初次免疫后,在第14天加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后,每隔2周,取血檢測(cè)抗HBsAg抗體產(chǎn)生的滴度。ELISPOT檢測(cè)IFN-γ產(chǎn)生情況。
結(jié)果表明,含有胸腺素α原質(zhì)粒佐劑的第4組初次免疫后2周的HBsAb陽(yáng)性率為50%,加強(qiáng)免疫后2周,HBsAb陽(yáng)性率為80%;第5組初次免疫后2周的HBsAb陽(yáng)性率為30%,加強(qiáng)免疫后2周,HBsAb陽(yáng)性率為60%;而未加佐劑的第3組初次免疫后2周的HBsAb陽(yáng)性率為10%,加強(qiáng)免疫后2周,HBsAb陽(yáng)性率為27%。14周后,第4、5組的HBsAb陽(yáng)性率均為100%,而未加佐劑的第3組的HBsAb陽(yáng)性率僅為50%。ELISPOT檢測(cè)結(jié)果第4組產(chǎn)生的IFN-γ是第3組的2-3倍。因此,可以明顯看出,胸腺素α原無(wú)論是以融合基因的形式還是以單獨(dú)質(zhì)粒的形式,均顯著增強(qiáng)乙肝表面抗原質(zhì)粒在小鼠激發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例3、胸腺素α原基因?qū)Ο懠捕啾砦豢乖璂NA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用小鼠Balb/c,雌性,4-6周齡(19-21g)。
分組(1)空載體組(pcDNA3),6只;(2)AWTE質(zhì)粒組,6只;(3)AWTE質(zhì)粒+胸腺素α原(pThα)質(zhì)粒佐劑組,6只;(4)pTha-ATWE(瘧疾多表位抗原基因與胸腺素α原基因融合)質(zhì)粒組,6只。
免疫方案(1)空載體組pcDNA3 200ug/只/次;(2)AWTE質(zhì)粒組100ug AWTE+100ug pcDNA3/只/次;(3)AWTE質(zhì)粒+胸腺素α原質(zhì)粒佐劑組100ug AWTE+100ugpThα。(4)pTha-ATWE質(zhì)粒組100ug pTha-ATWE。
在小鼠麻醉狀態(tài)下(75mg/kg sodium pentobarbital IP),在小鼠的兩后肢的股四頭肌肉各注射50ul樣品,然后用活體基因?qū)雰x(浙江新芝公司生產(chǎn)),在注射部位進(jìn)行電擊,電壓為120V/cm,時(shí)長(zhǎng)2ms,2次。免疫次數(shù)共兩次,初次免疫后,在第14天加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后,每隔2周,取血檢測(cè)抗AWTE抗體產(chǎn)生的滴度。末次免疫3周后,取脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行CTL細(xì)胞活性檢測(cè)。
結(jié)果表明,含有胸腺素α原質(zhì)粒佐劑的第3組初次免疫后2周的AWTE滴度為1∶200,加強(qiáng)免疫后2周,AWTE陽(yáng)性率為1∶5000;第2組初次免疫后2周的AWTE滴度檢測(cè)不到,加強(qiáng)免疫后2周,AWTE陽(yáng)性率為1∶100;第4組初次免疫后2周的AWTE滴度為1∶100,加強(qiáng)免疫后2周,AWTE陽(yáng)性率為1∶2000。CTL活性檢測(cè)在效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞為100∶1時(shí),第3組為67%,第2組為20%,第4組為52%。可以明顯看出,胸腺素α原不論是單獨(dú)使用,還是以融合基因的形式,均可以顯著增強(qiáng)瘧疾多表位抗原免疫原性,誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫。
序列表<160>4<210>1<211>333<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1atgtctgatg cagctgtaga taccagctcc gaaatcacca ccaaggactt aaaggagaag 60aaggaagttg tggaagaggc agaaaatgga agagacgccc ctgctaacgg gaatgctaat120gaggaaaatg gggagcagga ggctgacaat gaggtagacg aagaagagga agaaggtggg180gaggaagagg aggaggaaga agaaggtgat ggtgaggaag aggatggaga tgaagatgag240gaagctgagt cagctacggg caagcgggca gctgaagatg atgaggatga cgatgtcgat300accaataagc agaagaccga cgaggatgac taa 333<210>2<211>110<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp1 5 10 15Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp20 25 30Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala35 40 45Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu65 70 75 80Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp85 90 95Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp100 105 110<210>3
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ttcggtggcg gctccggtgg gggc 24<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly。
權(quán)利要求
1.胸腺素α原基因作為DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于所述胸腺素α原基因?yàn)槿诵叵偎卅猎颉?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用,其特征在于所述胸腺素α原基因與DNA疫苗的基因存在于不同的重組質(zhì)粒中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于所述DNA疫苗為乙肝病毒表面抗原DNA疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于所述DNA疫苗為瘧疾多表位抗原DNA疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用,其特征在于所述胸腺素α原基因與DNA疫苗的基因是融合基因,存在于同一重組質(zhì)粒中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于所述DNA疫苗為乙肝病毒表面抗原DNA疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于所述DNA疫苗為瘧疾多表位抗原DNA疫苗。
9.胸腺素α原基因在制備DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了胸腺素α原基因的新用途。本發(fā)明發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)證實(shí),ProTα能夠顯著改善動(dòng)物對(duì)DNA疫苗的反應(yīng)性,可以用作DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑。胸腺素α原基因可以使乙肝病毒表面抗原DNA疫苗、瘧疾多表位抗原DNA疫苗等各種DNA疫苗免疫原性均得到增強(qiáng),具有廣譜性,是一種不可多得的DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑,在DNA疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用中意義重大。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1806848SQ200510002000
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月17日
發(fā)明者馬清鈞, 靳彥文, 曹誠(chéng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
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