專利名稱：核因子－κB p65亞基拮抗肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一組治療用核因子-κB(NF-κB)p65亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一組能夠與核因子-κB p65亞基特異結(jié)合并抑制其活性的小分子肽。本發(fā)明還涉及這些核因子-κB p65亞基拮抗肽的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NF-κB是普遍存在于幾乎所有細(xì)胞胞漿中的一種轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，具有調(diào)控多種參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖以及生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的功能。NF-κB系由兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和合成方式等方面的差異，可將Rel蛋白家族分成兩類一類是前體蛋白p105和p100，其C末端含錨蛋白重復(fù)序列(ankin repeat motif)，可通過ATP依賴的蛋白水解過程裂解，變?yōu)槌墒斓膒50和p52。該類蛋白缺乏反式激活結(jié)構(gòu)域，無獨立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能；另一類是RelA(p65)、Rel(c-Rel)、v-Rel和RelB，其C末端含有1個或多個反式激活域(transactivationdomain)，具有獨立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能[1]。
當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB主要與κB抑制蛋白(IκBs)結(jié)合形成三聚體，以無活性方式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到前炎癥細(xì)胞因子、病毒、內(nèi)毒素、紫外線、氧化劑和放射線等多種外界信號刺激而啟動細(xì)胞第二信使系統(tǒng)時，IκBs在IκB激酶(IKK)的作用下發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB失去IκBs的嚴(yán)格控制而被激活，并移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)與靶基因啟動子內(nèi)的特定部位結(jié)合，高效誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(如TNF、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-11、IL-17等)、趨化因子(如IL-8、RANTES、MIP-1α、MCP-2等)、粘附分子(如ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等)、免疫受體(如IL-2R)以及參與炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大的多種酶(如NO合成酶、環(huán)氧化酶等)的表達(dá)[2]。NF-κB所誘導(dǎo)的一些蛋白可進(jìn)一步反轉(zhuǎn)活化NF-κB，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大和延續(xù)。基于上述認(rèn)識，許多學(xué)者認(rèn)為抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性將為炎性相關(guān)疾病的治療開辟新的途徑。另外，NF-κB在細(xì)胞凋亡和增殖中也發(fā)揮重要作用，其可通過直接上調(diào)凋亡抑制因子(c-IAP1、c-IAP2、和IXAP)、TNF受體相關(guān)因子(TRAF1和TRAF2)、鋅指蛋白A20、超氧化錳歧化酶、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等抗凋亡基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡[3]。在腫瘤治療中，化療和放療可使NF-B活化，致使腫瘤細(xì)胞對化療耐藥和對放射線不敏感。因此，抑制NF-B的轉(zhuǎn)錄活性，降低腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力不失為提高抗癌藥物治療功效的良策[4]。
由于NF-κB強大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，NF-κB的過渡活化在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的作用如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、慢性腎小球性腎炎、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、炎癥性腸道疾病等慢性炎性疾病[5，6，7，8]，膿毒癥、膿毒性休克、急性腎小球性腎炎等急性炎性疾病[9]，Alzheimer′s病[10]，動脈粥樣硬化[11]，系統(tǒng)性紅斑自狼瘡等身免疫性疾病[12]和癌癥的發(fā)生和發(fā)展均于NF-κB過度或持續(xù)活化密切相關(guān)。另外，NF-κB也參與了鼻病毒、流感病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、HTL病毒和HIV病毒等在感染細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，在這些病毒的感染和致病過程中起著重要的作用[13]。
鑒于NF-κB在上述疾病的發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，以NF-κB及其信號傳導(dǎo)通路中的相關(guān)蛋白為靶點，研發(fā)NF-κB相關(guān)疾病的治療藥物已成為本領(lǐng)域中的研究熱點。目前國外有關(guān)以NF-κB為靶點的拮抗治療策略主要包括以下幾個方面[14，15，16，17(1)應(yīng)用傳統(tǒng)抗炎藥物——糖皮質(zhì)激素等激素藥物直接地或間接地部分拮抗NF-κB的活性；(2)抗氧化治療如抗氧化劑——乙酰半胱氨酸、阿司匹林水楊酸鈉和吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)等作為NF-κB的抑制劑，其中PDTC作為NF-κB的抑制劑已受到眾多研究者的青睞；(3)抑制IκK的形成及活性如靶向IκKα的反義核酸，可阻止IκKα的形成，從而緩解或減輕IκB的磷酸化及降解過程，最終達(dá)到抑制NF-κB活性的目的；NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB essential modifier，NEMO)是IκK蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)蛋白，對維持IκK的功能有重要作用。May等設(shè)計了針對NEMO的抗炎多肽，該多肽包含NEMO結(jié)合域(NEMO binding domain，NBD)，它可以與NEMO結(jié)合，阻止NEMO與IκKβ的連接，從而抑制IκK的活性及其后續(xù)效應(yīng)；(4)減少IκB的降解某些蛋白酶小體抑制劑如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近來發(fā)現(xiàn)的epoxomicin均可通過抑制IκB的降解從而拮抗NF-κB的活性，某些絲氨酸蛋白酶抑制劑如TLCK(N alpha-p-tosyll-L-lysinechloromethyl ketone)、TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)以及分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑也具有類似的功能；(5)促進(jìn)IκB的生成應(yīng)用IκBα的腺病毒表達(dá)載體，使IκBα顯型失活突變體過量表達(dá)，可明顯抑制NF-κB的核移位及其后續(xù)效應(yīng)。(6)抑制NF-κB的合成如針對p50和p65的反義寡脫氧核苷酸可與編碼NF-κB的基因及mRNA結(jié)合，進(jìn)而阻斷基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，最終抑制NF-κB的形成。設(shè)計針對NF-κB家族高保守區(qū)的核酶，可對編碼NF-κB的mRNA進(jìn)行切割破壞，在mRNA水平阻斷NF-κB的形成。
上述以NF-κB為靶點的治療策略在動物實驗及體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中已表現(xiàn)出不同程度的療效。但上述措施均存在特異性欠佳的問題。事實上，要獲得最佳的治療效果并盡可能地減少系統(tǒng)毒性，則應(yīng)注意NF-κB靶性治療的特異性。如糖皮質(zhì)激素是NF-κB的強效抑制劑，但全身應(yīng)用時具有擾亂內(nèi)分泌和物質(zhì)代謝的副作用[18]。而抗氧化劑對NF-κB活性的抑制效應(yīng)更無特異性可言[19]，動物實驗表明，PDTC具有很強的毒副作用。蛋白酶小體，它除了可降解IκB外，還具有其他許多重要的功能，因此抑制蛋白酶小體活性將導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重副作用[5]。盡管有學(xué)者認(rèn)為IκK、IκB對NF-κB的調(diào)節(jié)是特異性的，但迄今的研究尚無足夠的證據(jù)表明IκK、IκB對其他的蛋白分子不具備調(diào)節(jié)作用，因此就不能確切的肯定靶向IκK、IκB的措施對NF-κB活性的干預(yù)就是特異性的。抑制NF-κB的合成策略對于NF-κB是特異性的，但在一些急性炎癥反應(yīng)性疾病中，NF-κB的活化(而不是合成)過程(細(xì)胞質(zhì)中無活性的NF-κB→活化入核→與DNA結(jié)合→啟動基因表達(dá))更為重要，因此抑制NF-κB的合成策略并非最優(yōu)選擇。從NF-κB的整個活化途徑不難看出，NF-κB與DNA順式元件的結(jié)合是特異性的，也是NF-κB啟動靶基因轉(zhuǎn)錄的必經(jīng)之路。只有對NF-κB與DNA順式元件的結(jié)合實施直接的干預(yù)措施，才能達(dá)到真正意義上的特異性。而對NF-κB活化的上游途徑進(jìn)行干預(yù)則難以達(dá)到這一目的。
由p50和p65兩亞基形成的異二聚體是NF-κB的典型代表，是NF-κB所有形式中最重要的一種，幾乎存在于體內(nèi)所有細(xì)胞，其含量遠(yuǎn)高于其它二聚體。此異二聚體的氨基末端可構(gòu)成1個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，由其介導(dǎo)與DNA堿基特異性結(jié)合。晶體衍射分析顯示，p50/p65異源二聚體與免疫球蛋白κ鏈基因增強子κB序列特異性結(jié)合的方式為p50亞單位的Arg-54、Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸殘基與κB序列5′端的5′-G-5G-4G-3A-2C-1-3′堿基系列特異結(jié)合；p65亞單位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、和Arg-187，與κB序列3′端的5′-T+1T+2C+3C+4-3′4個堿基對特異結(jié)合。另外，由NF-kB P 50/p65異源二聚體的氨基端和二聚化結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，還可非特異地識別DNA核糖磷酸骨架[20]。即由p50和p65 N末端共同構(gòu)成的這一環(huán)狀結(jié)構(gòu)域形成了NF-κB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)其與順式作用元件的結(jié)合，值得注意的是，這鐘結(jié)合為特異性結(jié)合。NF-κB激活靶基因首先需要DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別靶基因啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件，并與之結(jié)合，后在p65反式激活域的輔助下，激活靶基因的表達(dá)。如果我們能夠阻斷NF-κB p65亞基與其順式作用元件的結(jié)合，則可阻斷含p65亞基的NF-κB異二聚體與其順式作用元件的結(jié)合，最終達(dá)到抑制NF-κB調(diào)控靶基因表達(dá)的目的。
隨著20世紀(jì)80年代后期崛起的一種研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具——酵母雙雜交技術(shù)的建立、成熟和發(fā)展，對NF-κB拮抗多肽的篩選工作最終成為可能。酵母雙雜交系統(tǒng)具有很高的靈敏度，能檢測微弱而短暫的蛋白質(zhì)間相互作用，且該系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)生于酵母細(xì)胞胞內(nèi)和/或核內(nèi)。與原核細(xì)胞相比，真核酵母細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯和加工更加接近哺乳細(xì)胞，以其為工程菌研究蛋白質(zhì)的相互作用將更佳接近哺乳細(xì)胞的生理狀態(tài)，即保持蛋白質(zhì)天然的折疊狀態(tài)，使蛋白質(zhì)間相互作用更接近哺乳細(xì)胞內(nèi)的真實水平。因此，應(yīng)用該系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)間的相互作用已得到愈來愈廣泛的應(yīng)用，特別對胞內(nèi)靶蛋白相互作用蛋白或多肽的篩選，此系統(tǒng)更為首選[21]。NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，存在于細(xì)胞漿中，但于細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。因此，我們選用酵母雙雜交系統(tǒng)，以NF-κB p65 DNA結(jié)合域為誘餌蛋白，從一個16肽的隨機(jī)肽庫中篩選NF-κB相互作用多肽，并鑒定這些多肽的功能。目前我們已篩選獲得兩組具有一致序列的NF-κB p65亞基拮抗肽，這里所列的是其中一組具有一致序列的NF-κB拮抗肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠與核因子-κB p65亞基專一結(jié)合，并能夠抑制核因子-κB活性及其所調(diào)控基因表達(dá)的核因子-κB拮抗肽。
本發(fā)明的另一目的是提供這些核因子-κB拮抗肽的用途。
本發(fā)明的核因子-κB p65亞基拮抗肽具有以下通式結(jié)構(gòu)X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16式中，X1代表任何氨基酸殘基；X2代表任何氨基酸殘基；X4代表任何氨基酸殘基或缺失；X7代表任何氨基酸殘基或缺失；X8代表任何氨基酸殘基或缺失；X9代表任何氨基酸殘基或缺失；X11代表任何氨基酸殘基或缺失；X12代表任何氨基酸殘基或缺失；X13代表任何氨基酸殘基或缺失；X14代表任何氨基酸殘基或缺失；X16代表任何氨基酸殘基；優(yōu)選的是
X2代表非極性氨基酸；X4代表非極性氨基酸；X7代表蘇氨酸；X8代表非極性氨基酸；X16代表亮氨酸或蘇氨酸；其他與上相同。
更優(yōu)選的是X2代表纈氨酸或丙氨酸；X4代表纈氨酸或異亮氨酸；X8代表纈氨酸或色氨酸；其他與上相同。
特別優(yōu)選的是X1代表Val；X2代表Val；X4代表Ile；X7缺失；X8缺失；X9缺失；X11缺失；X12缺失；X13缺失；X14缺失；X16代表Leu；其氨基酸序列為Val Val Met Ile Glu Val Val Phe Leu。
或X1代表Leu；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；
X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe Thr。
或X1代表Pro；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe Thr。
或X1代表Thr；X2代表Gln；X4缺失；X7代表Thr；X8代表Trp；X9代表Arg；X11代表Glu；X12代表Cys；X13代表Cys；
X14代表Leu；X16代表Leu；其氨基酸序列為Thr Gln Met-Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys Leu Phe Leu。
其中“-”代表氨基酸缺失。
以上特別優(yōu)選的4個多肽結(jié)構(gòu)如下PT1Val Val Met Ile Glu Val---Val----Phe LeuPT2Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe ThrPT3Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe ThrPT4Thr Gln Met-Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys Leu Phe Leu本發(fā)明還包括，本發(fā)明的核因子-κB p65亞基拮抗肽在制備抗核因子-κB的藥物中的應(yīng)用。所述抗核因子-κB的藥物是治療免疫相關(guān)疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。
本發(fā)明還包括，含有本發(fā)明的核因子-κB p65亞基拮抗肽的藥物組合物。
具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽可與核因子-κB p65亞基專一結(jié)合，并阻斷核因子-κB與其順式作用元件的結(jié)合，從而抑制核因子-κB的生物學(xué)活性，即核因子-κB調(diào)控各種靶基因表達(dá)的活性。此類結(jié)構(gòu)模式既可以多肽形式單獨存在，也可與其它蛋白和多肽融和，或插入蛋白質(zhì)表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存在，含此結(jié)構(gòu)模式的物質(zhì)可能表現(xiàn)出與核因子-κB p65亞基結(jié)合，并抑制核因子-κB活性的作用。
本發(fā)明通過對一組與核因子-κB p65亞基結(jié)合多肽的結(jié)構(gòu)分析，確定了與核因子-κB p65亞基結(jié)合的氨基酸序列模式或稱結(jié)構(gòu)模式，這對于設(shè)計和研制新型抗核因子-κB的藥物具有重要意義。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明篩選到的多肽不僅能夠競爭性阻斷核因子-κB與其順式作用元件的結(jié)合，也能夠抑制核因子-κB所調(diào)控的靶基因的表達(dá)，因而可以成為新的抗核因子-κB藥物或藥物前體，本發(fā)明的多肽可以用于治療各種炎癥或免疫性相關(guān)疾病和腫瘤?？梢詫⑵渥鳛樗幬锘钚猿煞种苽涑伤幬锝M合物，該組合物根據(jù)需要可以加入一些藥物可接受的載體，可以采用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備該組合物，本發(fā)明的組合物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優(yōu)選的組合物是單位劑量的注射劑形式如凍干粉針劑。本發(fā)明的核因子-κB拮抗肽在制造抗核因子-κB的藥物中具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景。
另外，本發(fā)明的核因子-κB p65亞基結(jié)合肽作為生物制劑也有著潛在的應(yīng)用價值，如作為配體用于核因子-κB的親和純化、作為探針用于核因子-κB的檢測等等。
根據(jù)核因子-κB p65亞基結(jié)合肽序列模式的多種存在形式，可以有多種獲取含此序列模式物質(zhì)的方法，如固相合成方法，溶液中合成方法，基因重組方法，以及其它化學(xué)方法合成。以上制備方法可以采用多肽合成和制備的常規(guī)方法，如教科書中的方法，優(yōu)選的制備方法列在本發(fā)明的具體實施例中。
含此序列模式的物質(zhì)可有各種應(yīng)用方式，主要包括在體外和體內(nèi)抑制核因子-κB的活性，以各種給藥方式實現(xiàn)以抑制核因子-κB活性為目的的疾病治療，以及核因子-κB的檢測或純化等。
含本發(fā)明序模式列的物質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用還包括1、通過合成或基因重組的方式，將含此序列模式的肽段與其它蛋白或肽融合，用于以抑制核因子-κB活性為目的的各種炎性相關(guān)疾病、自身免疫疾病、腫瘤以及其它相關(guān)疾病的治療。
2、 將其與瓊脂糖偶聯(lián)后，用于核因子-κB的親和分離。
3、將其與指示標(biāo)簽偶聯(lián)后，用于核因子-κB的鑒定。


圖1A為GST融合肽大腸桿菌表達(dá)結(jié)果。M為蛋白Marker；GST為pET-42a(+)空載體表達(dá)產(chǎn)物；1～4號分別與PT1～PT4 GST融合肽對應(yīng)。
圖1B為GST融合肽GST親和層析純化的結(jié)果。M為蛋白Marker；GST為pET-42a(+)空載體表達(dá)產(chǎn)物；1～4PT1～PT4 GST融合肽。
圖2A為PT1/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結(jié)合的生物傳感器的檢測結(jié)果圖2B為PT2/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結(jié)合的生物傳感器的檢測結(jié)果圖2C為PT3/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結(jié)合的生物傳感器的檢測結(jié)果圖2D為PT4/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結(jié)合的生物傳感器的檢測結(jié)果圖3為ELISA檢測GST融合肽與核因子-κBp65亞基的特異性結(jié)合的結(jié)果。GST為pET-42a(+)空載體表達(dá)產(chǎn)物；1～4號分別與PT1～PT4 GST融合肽對應(yīng)。
圖4為ELISA方法檢測GST融合肽對核因子-κBp65亞基與核因子-κB順式作用元件結(jié)合的競爭抑制實驗的結(jié)果曲線圖5A為熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PT1穿膜肽對核因子-κB反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
圖5B為熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PT2穿膜肽對核因子-κB反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
圖5C為熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PT3穿膜肽對核因子-κB反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
圖5D為熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PT4穿膜肽對核因子-κB反應(yīng)性熒素酶報告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
具體實施例方式
實施例1、核因子-κB p65亞基拮抗肽的GST融合表達(dá)和純化根據(jù)PT1、PT2、PT3、PT4多肽的基因序列，在保持多肽蛋白編碼序列不變的情況下，按照大腸桿菌偏愛密碼子，分別設(shè)計并合成上游序列含BamHI，下游序列含SalI粘性末端的互補DNA片段，DNA序列如下PT1-FP5’-GATCGTTGTAATGATCGAAGTAGTTTTCCTGTAG-3’，PT1-RP5’-TCGACTACAGGAAAACTACTTCGATCATTACAAC-3’PT2-FP5’-GATCCTGGCGATGGTTGAAGTAACTGTTGTTCTGTCTTGGGGTTTCACTTAG-3’PT2-RP5’-TCGACTAAGTGAAACCCCAAGACAGAACAACAGTTACTTCAACCATCGCCAG-3’PT3-FP5′-GATCCCGGCGATGGTTGAAGTAACTGTTGTTCTGTCTTGGGGTTTCACTTAG-3′PT3-RP5′-TCGACTAAGTGAAACCCCAAGACAGAACAACAGTTACTTCAACCATCGCCGG-3′
PT4-FP5′-GATCCAGACTCAGATGGAAGTTACTTGGCGTGTTGAATGTTGCCTGTTCCTGTAG-3′PT4-RP5′-TCGACTACAGGAACAGGCAACATTCAACACGCCAAGTAACTTCCATCTGAGTCTG-3′用無菌雙蒸水將上述DNA序列溶解，終濃度為20μM，后取4個0.5ml EP管并標(biāo)記為PT1、PT2、PT3和PT4，分別于PT1 EP中加入20μl PT1-FP和20μl PT1-RP，于PT2 EP中加入20μl PT2-FP和20μl PT2-RP，于PT3 EP中加入20μl PT3-FP和20μl PT3-RP，于PT4 EP中加入20μl PT4-FP和20μl PT4-RP，充分混合，后將混合物放入94℃水浴變性，室溫放置讓水浴自然冷卻，使多肽基因序列能夠緩慢退火形成雙鏈。后分別用T4連接酶將4條多肽基因序列插入經(jīng)BamHI/SalI雙酶切的pET 42a載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的E.coliDH-5α感受態(tài)細(xì)胞。各挑取數(shù)個單菌落進(jìn)行酶切鑒定，并測序。分別將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET42a/PT1、pET42a/PT2、pET42a/PT3、pET42a/PT4轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的E.coli.BL-21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100比例將過夜菌菌液轉(zhuǎn)接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.5～0.6，加IPTG至終濃度為0.1-0.5mmol/L，移至30℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集菌體，菌體可進(jìn)行純化或凍存于-70℃。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體按原菌液1/10的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF15μl后超聲破碎細(xì)胞(6×10sec×40hz)，后加入終濃度為1％的Triton X-100，輕輕振蕩20min，于4℃，12000r/m離心15min取上清，加DTT至終濃度為1mmol/L。同時用10倍柱體積的PBS液平衡Glutathione Sepharose4B親和樹脂，后取適量的上述上清液上柱，使GST融合肽蛋白與樹脂結(jié)合，再用10倍柱體積的PBS液洗去非特異結(jié)合的雜蛋白。最后用10mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白，并通SDS-PAGE鑒定其純度，純化蛋白經(jīng)蒸餾水充分透析去除還原型谷胱甘肽后凍干于-20℃保存。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，4條GST融和多肽為可溶性表達(dá)，表達(dá)量約為總蛋白量的20％(圖1A)。經(jīng)GST親和純化后融和蛋白純度達(dá)到85％以上(圖1B)實施例2、生物傳感器(Biosensor)檢測GST融合肽與核因子-κB p65亞基的結(jié)合將羧甲基葡聚糖生物傳感片裝入Iasys Plus系統(tǒng)微射流卡盤，用60μl PBS/T(pH 7.4PBS，0.05％吐溫20)沖洗3次，平衡10min，待基線走平后采集基線數(shù)據(jù)5min；將EDC和NHS按1∶1比例混合，取40μl混合液沖洗樣品池2次，后再在樣品池中加入40μl混合液，保留7min以激活傳感片表面；用50μl PBS/T沖洗樣品池3次采集基線值1min；用40μl 10mM pH5.5的乙酸緩沖液沖洗樣品池3次，后再加入40μl乙酸緩沖液，采集基線值1min；然后在樣品池中加入40μl用乙酸緩沖液稀釋的總量約為0.5μg的p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白；反應(yīng)20min后用PBS/T沖洗3次，并采集基線值1min；用40μl 1M pH 8.0的Tris-Hcl緩沖液沖洗樣品池3次，并保留3min以封閉未反應(yīng)的NHS；用40μl 10mM HCl沖洗3次，除去傳感片上殘留的沒用發(fā)生共價結(jié)合的p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白；用50μl PBS/T沖洗3次，采集基線值1min，4℃放置待后進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。
用蛋白結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl，10mM MgCl2，10uM ZncL2，1mM DTT，0.1％(v/v)NP40)將GST-結(jié)合肽融合蛋白稀釋成10μg/L，取50μl融合蛋白稀釋液加入樣品池，溫度25℃，結(jié)合反應(yīng)5～10min；待反應(yīng)完全，用50μl蛋白結(jié)合緩沖液沖洗樣品池3次，以洗脫非特異性結(jié)合，待反應(yīng)曲線走平后采集反應(yīng)曲線值1min；用40μL10mM HCl沖洗樣品池3次，再生傳感片；再用50μl蛋白結(jié)合緩沖液沖洗樣品池3次，采集基線數(shù)據(jù)1min，開始新一輪的結(jié)合反應(yīng)。
Biosensor結(jié)果表明，本發(fā)明的4條p65拮抗多肽均能高親和與p65結(jié)合，其中PT3多肽與p65結(jié)合的親和力最強，見圖2A～2D。
實施例3、ELISA方法檢測GST融合肽與核因子-κB p65亞基的特異性結(jié)合用去離子水洗ELISA平板包被孔數(shù)次，倒置平版，并在一清潔濾紙上拍打平板，去除剩余的水份；用PBS緩沖液稀釋p65蛋白，濃度為10μg/ml；加100μl稀釋的p65蛋白至96孔酶聯(lián)板的包被孔中，室溫孵育3～4h或4℃過夜孵育，注意水份蒸發(fā)；用300μl PBS洗孔3次，去除未結(jié)合的p65蛋白；制備5％的脫脂奶粉水溶液，每孔加入200μl，室溫孵育1h或4℃過夜孵育封閉包被孔；用蛋白結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl，10mM MgCl2，10uM ZncL2，1mM DTT，0.1％(v/v)NP40)洗板5次；加入0.5μmol/L的GST融合肽(蛋白結(jié)合緩沖液稀釋)100μl/孔(除未包被的對照孔外，設(shè)置加GST融合肽同時加入系列濃度的p65蛋白作為對照，以檢測GST融合肽與p65蛋白的特異性結(jié)合。)，室溫結(jié)合1h；PBST(PBS+0.1％TWEEN-20)洗板3次后加入抗GST的單克隆抗體(1∶1000稀釋于PBS中)100μl/孔，室溫孵育1h；PBST洗板3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(按產(chǎn)品說明要求稀釋于PBS中)100μl/孔，室溫孵育1h；PBST洗板3次后加入顯色液100μl/孔避光保存顯色5～10min，加入1mol/L H2SO450μl/孔終止反應(yīng)，立即測定OD450。
結(jié)果表明，本發(fā)明的短肽PT1、PT2、PT3和PT4均可特異性地與P65結(jié)合，隨著p65加入量的增加，多肽與包被蛋白的結(jié)合減少，見圖3。
實施例4、ELISA方法檢測GST融合肽對核因子-κB p65亞基與核因子-κB順式作用元件結(jié)合的競爭抑制實驗于包被了核因子-κB順式作用元件的96孔酶聯(lián)板(購自美國Clontech公司的MercuryTMTransfactor p65 kits)中加入150μl/孔轉(zhuǎn)錄因子封閉液，室溫孵育15min；棄轉(zhuǎn)錄因子封閉液后加入50μl/孔用轉(zhuǎn)錄因子封閉液稀釋的檢測樣品，樣品分別為含10ng/μl的p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為陽性對照、含10ng/μl的p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時加入系列濃度GST融合肽以及含10ng/μl的p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時加入相同系列濃度GST純化蛋白的樣品，室溫孵育1h，空白對照為加入50μl轉(zhuǎn)錄因子封閉液；加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液150μl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉(zhuǎn)錄因子封閉液以1∶500稀釋的p65抗體100μl/孔，室溫孵育1h；加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液150μl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉(zhuǎn)錄因子封閉液以1∶1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗100μl/孔，室溫孵育30min；加入轉(zhuǎn)錄因子緩沖液250μl/孔洗滌4次，每次4min，去除洗滌液；加入TMB底物，室溫孵育10min，待液體變藍(lán)后，用100μl/孔的終止液終止反應(yīng)；于450nm和630nm雙波長檢測OD值。P65結(jié)合肽對p65與其順式作用元件結(jié)合的抑制百分?jǐn)?shù)計算公式為(同一濃度GST純化蛋白OD-同一濃度GST融合肽OD)/p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白陽性對照OD。
結(jié)果表明，本發(fā)明的短肽PT1、PT2、PT3和PT4均可特異性抑制P65與其順式作用元件的結(jié)合，而這種抑制效應(yīng)具有量效關(guān)系，既抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，而GST則不影響P65與其順式作用元件的結(jié)合。在4條多肽中PT3的抑制效應(yīng)優(yōu)于其它3條，如圖4所示。
實施例5、多肽的有機(jī)合成因為核因子-κB拮抗肽只有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能有效抑制核因子-κB的轉(zhuǎn)錄活性及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，為此我們分別將穿膜肽(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)與PT1、PT2、PT3和PT4融合，并采用有機(jī)合成的方法合成這4條融合多肽(由深圳翰宇生物工程有限公司合成)，工藝流程如下1)稱1g(0.01mmol)Rink樹脂置于反應(yīng)器中，用DMF溶脹30min，濾去DMF；2)向樹脂中加入5mL 20％哌啶-DMF溶液，反應(yīng)10min，脫除Fmoc保護(hù)基，然后濾去脫保護(hù)試劑；3)用DMF和甲醇交替洗滌樹脂3次(5mL×3，1min)，再用DMF洗滌1次；4)將Fmoc-AA-OH(0.4mmol)，HBTU(0.4mmol)，HOBT(0.4mmol)和N-甲基嗎啉(0.6mmol)溶于適量DMF，加入樹脂中，于35～40℃恒溫?fù)u床中振搖反應(yīng)1h；5)濾除反應(yīng)液，洗滌同3)，再用乙醚(5mL×2，1min)洗滌，抽干；取2～3粒樹脂，用茚三酮法檢測是否有自由氨基；如果結(jié)果為陰性；進(jìn)入下一循環(huán)；否則重復(fù)4)～6)；7)循環(huán)操作2)～6)，依次分別按穿膜肽與PT1、PT2、PT3和PT4的融合多肽的氨基酸序列自C-端至N-端序列加入Fmoc-AA-OH和縮合試劑，直到肽鏈組裝完畢；8)最后脫除Fmoc，操作同2)；9)用DMF、甲醇、冰乙酸、DMF和無水乙醚充分洗滌樹脂，干燥保存；10)將合成好的多肽經(jīng)過G10柱脫鹽和HPLC純化，冷凍干燥保存。其純度分別為82.3％、79.6％、85.3％、88.8％，將其溶解于DMSO中，濃度為20mmol/L。
實施例6、核因子-κB p65亞基拮抗肽對核因子-κB反應(yīng)性報告基因表達(dá)的抑制實驗。
1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞密度調(diào)整為0.5～2.5×105個/mL，過夜培養(yǎng)；取3mL過夜培養(yǎng)細(xì)胞或以1-2×105個細(xì)胞/孔細(xì)胞量加入6孔培養(yǎng)板；取3μL GeneJuice轉(zhuǎn)染試劑加入100μL無血清1640培養(yǎng)基中，旋渦混勻，室溫放置5min；取1μg p4-kB-Luc質(zhì)粒加入GeneJuice/1640培養(yǎng)基混合物中，輕輕吹打混勻，室溫放置5-15min；將上述混合物逐滴加入完全培養(yǎng)基中，輕輕震蕩，使混合物和細(xì)胞充分混勻；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染5h后，加入終濃度為1μg/mL的LPS進(jìn)行刺激，同時加入系列濃度(0、1、5、10、20、40、80、160μg/mL)的穿膜拮抗肽，2h后吸取細(xì)胞500g離心5min，PBS洗滌細(xì)胞一次，除盡PBS上清；以100μl/孔加入1×CCLR細(xì)胞裂解緩沖液；渦旋EP管10-15s，4℃，12000rpm離心2min，取上清，-70℃保存或直接檢測熒光素酶的活性；于96孔檢測板中加入100μL/孔熒光素酶檢測試劑后，再加入100μL/孔細(xì)胞裂解液后立刻讀數(shù)，并打印或記錄數(shù)據(jù)。
結(jié)果表明，本發(fā)明的短肽穿膜肽Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys與PT1、PT2、PT3和PT4的融合多肽均具有抑制核因子-κB反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達(dá)的效應(yīng)，且這種抑制效應(yīng)具有量效關(guān)系，既抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，且這種穿膜PT3拮抗肽的抑制效應(yīng)最強，如圖5A-D所示。由此說明，我們篩選獲得的p65拮抗肽具有抑制核因子-κB轉(zhuǎn)錄活性的功能，既也具有抗炎功能。
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序列表<110>徐祥 梁華平<120>核因子-κB p65亞基拮抗肽及其應(yīng)用<160>8<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>1Val Val Met Ile Glu Val Val Phe Leu1 59<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>2Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val Val Leu Ser TRP Gly Phe Thr1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>3Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val Val Leu Ser TrP Gly Phe Thr1 5 10 15
<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>4Thr Gln Met Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys Leu Phe Leu15 10 15<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>5gttgtaatga tcgaagtagt tttcctgtag 30<210>6<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>6ctggcgatgg ttgaagtaac tgttgttctg tcttggggtt tcacttag 48<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>7ccggcgatgg ttgaagtaac tgttgttctg tcttggggtt tcacttag 48
<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>8cagactcaga tggaagttac ttggcgtgtt gaatgttgcc tgttcctgta g 5權(quán)利要求
1.具有以下通式結(jié)構(gòu)的核因子-κB p65亞基拮抗肽X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16式中，X1代表任何氨基酸殘基；X2代表任何氨基酸殘基；X4代表任何氨基酸殘基或缺失；X7代表任何氨基酸殘基或缺失；X8代表任何氨基酸殘基或缺失；X9代表任何氨基酸殘基或缺失；X11代表任何氨基酸殘基或缺失；X12代表任何氨基酸殘基或缺失；X13代表任何氨基酸殘基或缺失；X14代表任何氨基酸殘基或缺失；X16代表任何氨基酸殘基；
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核因子-κB p65亞基拮抗肽，具有以下結(jié)構(gòu)，X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16其特征在于，式中X2代表非極性氨基酸；X4代表非極性氨基酸；X7代表蘇氨酸；X8代表非極性氨基酸；X16代表亮氨酸或蘇氨酸；其他與權(quán)利要求1相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的核因子-κB p65亞基拮抗肽，具有以下結(jié)構(gòu)，X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16其特征在于，式中X2代表纈氨酸或丙氨酸；X4代表纈氨酸或異亮氨酸；X8代表纈氨酸或色氨酸；其他與權(quán)利要求2相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Val；X2代表Val；X4代表Ile；X7缺失；X8缺失；X9缺失；X11缺失；X12缺失；X13缺失；X14缺失；X16代表Leu；其氨基酸序列為Val Val Met Ile Glu Val Val Phe Leu。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Leu；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp GlyPhe Thr。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Pro；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp GlyPhe Thr。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Thr；X2代表Gln；X4缺失；X7代表Thr；X8代表Trp；X9代表Arg；X11代表Glu；X12代表Cys；X13代表Cys；X14代表Leu；X16代表Leu；其氨基酸序列為Thr Gln Met-Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys LeuPhe Leu。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項的核因子-κB p65亞基拮抗肽在制備抗核因子-κB的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，所述抗核因子-κB的藥物是治療免疫相關(guān)疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。
10.含有權(quán)利要求1-7中任意一項的核因子-κB p65亞基拮抗肽的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及核因子－κB p65亞基拮抗肽及其應(yīng)用，特別是涉及一組治療用核因子－κB(NF－κB)p65亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一組能夠與核因子－κB p65亞基特異結(jié)合并抑制其活性的小分子肽。本發(fā)明還涉及這些核因子－κB p65亞基拮抗肽的制備和應(yīng)用。
文檔編號A61P29/00GK1683395SQ200510007479
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月22日
發(fā)明者徐祥, 梁華平, 王正國 申請人:徐祥, 梁華平