專利名稱：兔創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓形成動(dòng)物模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療模型技術(shù)領(lǐng)域，是建立具有骨科臨床特點(diǎn)創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓動(dòng)物模型的方法，可為研究創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓、肺血栓栓塞癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸，探索更有效的預(yù)防、診療方法提供一動(dòng)物模型平臺(tái)。
背景技術(shù)：
血栓病是一類嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病，見于多個(gè)臨床科室患者，其發(fā)病率、致殘率和死亡率都很高，危害性極大。在西方國(guó)家，靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)的發(fā)病率高達(dá)0.1％，其中半數(shù)為深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)。美國(guó)每年因DVT及肺血栓栓塞癥(pulmonarythromboembolism，PTE)住院人數(shù)約650000例，死亡人數(shù)約50000～200000例，死亡率占第3位，僅次于腫瘤和心肌梗死。歐洲大宗尸檢資料證實(shí)，DVT的發(fā)生率比動(dòng)脈血栓高4倍，40％～60％的尸體標(biāo)本中可發(fā)現(xiàn)DVT，其中僅11％～15％的病例在生前確診。臺(tái)灣地區(qū)的DVT發(fā)生率和PTE的死亡率約為歐美的2/3，我國(guó)大陸尚無對(duì)DVT和PTE發(fā)病情況的統(tǒng)計(jì)，推測(cè)應(yīng)與臺(tái)灣地區(qū)發(fā)病情況相似。
隨著人口老齡化，工業(yè)、交通的發(fā)展，高能量創(chuàng)傷患者增多，骨科創(chuàng)傷病人數(shù)呈上升趨勢(shì)。近年來，DVT已成為骨科常見并發(fā)癥，發(fā)病例數(shù)明顯增加。DVT往往又是PTE的源頭，其誘發(fā)PTE的危險(xiǎn)度為50％，常引起致命性臨床事件發(fā)生。Lowxy等研究表明，在股骨骨折、全膝置換和髖關(guān)節(jié)手術(shù)后DVT的發(fā)生率分別為50％、76.5％和37％～74％。國(guó)外大宗尸檢發(fā)現(xiàn)脛骨骨折45％～60％，骨盆骨折50％～70％，脊柱脊髓損傷50％～100％的病人發(fā)生DVT；創(chuàng)傷病人15％、骨盆骨折25％、脊柱骨折14％病人并發(fā)PTE。引起PTE的栓子主要源于下肢DVT，故DVT與PTE密切相關(guān)。
動(dòng)物模型的建立是探索疾病原因、病理生理變化、開展新療法、預(yù)測(cè)臨床轉(zhuǎn)歸不可缺少的方法之一。在醫(yī)學(xué)研究中，理想的動(dòng)物模型應(yīng)具備以下特點(diǎn)(1)、應(yīng)再現(xiàn)所要研究的人類疾病，應(yīng)該與人類疾病相類似；(3)、動(dòng)物背景資料完整，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格，生命周期要滿足實(shí)驗(yàn)需要；(4)、動(dòng)物廉價(jià)，來源充足，便于運(yùn)送。
目前在靜脈血栓動(dòng)物模型建立方面國(guó)內(nèi)外有如下方法(1)機(jī)械損傷法；(2)結(jié)扎法；(3)銅針通電靜脈血栓形成法；(4)激光照射法；(5)家兔耳緣靜脈血栓法；(6)氣球?qū)Ч芷髯枞o脈法；(7)電解質(zhì)損傷血管內(nèi)皮法；(8)血管內(nèi)放置異物法；(9)其他靜脈血栓形成的方法。
以上造模方法雖各有特點(diǎn)，但更主要是用于研究凝血、纖溶系統(tǒng)的變化及相關(guān)藥物篩選和療效評(píng)價(jià)，與骨科臨床DVT自然病程實(shí)際不盡相符(1)、骨科臨床DVT絕大部分為亞急性或慢性，上述方法所形成的血栓均為急性；(2)、骨科臨床DVT幾乎都未直接損傷深靜脈，上述方法均直接損傷血管。(3)、骨科臨床DVT大多發(fā)生于創(chuàng)傷或手術(shù)后肢體制動(dòng)、長(zhǎng)期臥床者，上述方法并不符合此條件；(4)、骨科臨床DVT患者多無使用促凝血藥史，部分患者在使用抗凝血藥時(shí)仍發(fā)生DVT。
為深入研究具有骨科特點(diǎn)深靜脈血栓及由此并發(fā)的肺血栓栓塞癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸，探索更有效的預(yù)防、診斷、治療方法，就有必要建立新的、更適應(yīng)其特點(diǎn)的動(dòng)物模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出的兔創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓制作方法，是通過應(yīng)用自制可定量擊打裝置，模擬與骨科臨床相似的創(chuàng)傷過程，造成兔左后肢近端不同程度損傷，導(dǎo)致肢體深靜脈血栓形成及肺血栓栓塞癥發(fā)生，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。
本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)(1)、制作過程簡(jiǎn)單易行，動(dòng)物死亡率低。
(2)、肢體深靜脈血栓、肺血栓栓塞癥發(fā)生率高。
(3)、能較好模擬臨床骨科創(chuàng)傷后，深靜脈血栓發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸等臨床及病理過程，可為研究深靜脈血栓、肺血栓栓塞癥提供一動(dòng)物模型，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。
具體步驟1、動(dòng)物與分組健康成年新西蘭大白兔，體重3.0±0.2kg，雌雄不限。按創(chuàng)傷程度不同及有無石膏固定分為左后肢骨折固定組，左后肢創(chuàng)傷無骨折固定組，左后肢無創(chuàng)傷固定組，無創(chuàng)傷無固定的空白對(duì)照組等四組。在造模后第5、7、9天觀察血栓形成情況。
2、自制擊打裝置以骨科髓內(nèi)釘打撥器為基礎(chǔ)，標(biāo)上刻度，可運(yùn)用不同質(zhì)量的重錘擊打。創(chuàng)傷能量按Ep＝mgh計(jì)算。擊打接觸圓面直徑為1cm。
3、造模方法兔耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg麻醉，右側(cè)俯臥位，左大腿根部置打擊平臺(tái)上，觸清兔左股骨大轉(zhuǎn)子，將擊打頭平面緊貼股骨大轉(zhuǎn)子至大轉(zhuǎn)子下1.5cm范圍內(nèi)，使用上述擊打裝置，以不同質(zhì)量重錘擊打大腿近端外側(cè)。石膏外固定方法以寬10cm的無水石膏繃帶卷，浸入自來水中至氣泡消失后，固定兔左后肢于屈髖屈膝位，石膏繃帶層數(shù)為7層，石膏位于兔軀體后1/2～1/3，上石膏繃帶時(shí)檢查右髖活動(dòng)自如后(以防右后肢活動(dòng)受限，造成進(jìn)食困難)，俯臥位待石膏定型。
造模后四組動(dòng)物自由飲水，顆粒飼料飼養(yǎng)，不用抗凝劑及抗生素。
A組擊打瞬間能量為12焦耳(Ep＝4kg×10×0.3m)，擊打一次，經(jīng)攝片證實(shí)股骨骨折后，石膏固定。
B組擊打瞬間能量為7.5焦耳(Ep＝2.5kg×10×0.3m)，擊打一次，不造成骨折，石膏固定。
C組未行擊打，僅行石膏固定。
D組雙后肢無創(chuàng)傷不固定。
4、觀察指標(biāo)于造模后5、7、9d，每時(shí)相點(diǎn)用10只兔，作如下檢測(cè)(1)血細(xì)胞分析(2)D-二聚體(D-Dimer，DD)及凝血指標(biāo)檢測(cè)(PT-SEC、PT-INF、Fib、TT、APTT)檢測(cè)
(3)影像學(xué)檢測(cè)1)磁共振血栓直接成像(MRDTI)和磁共振血管成像(MRA)。
2)數(shù)字減影血管造影(DSA)檢測(cè)。
完成上述檢查后在麻醉下解剖兔，作大體觀察并取股動(dòng)、靜脈及全肺標(biāo)本后，處死兔。
(4)肉眼觀察暴露左側(cè)股動(dòng)靜脈，觀察有無血栓。
完整暴露全肺，觀察肺葉情況，有無肺出血、肺水腫等。
(5)光鏡觀察切取后的股動(dòng)、靜脈，標(biāo)記近遠(yuǎn)端，用10％中性甲醛溶液固定，于血栓發(fā)生明顯處取材行石蠟切片包埋，HE染色；血栓發(fā)生不確定時(shí)，取近端、中間及遠(yuǎn)端共三點(diǎn)作切片，以其中一點(diǎn)納入統(tǒng)計(jì)。
取出的全肺，用10％中性甲醛液固定，石蠟切片包埋，HE染色，光鏡觀察是否有肺動(dòng)脈栓塞。
(6)透射電鏡觀察(7)免疫組織化學(xué)檢測(cè)(8)血液流動(dòng)狀態(tài)觀測(cè)5、數(shù)據(jù)處理使用SPSS10.0版統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
具體實(shí)施例方式
一、造模過程及觀察指標(biāo)1、動(dòng)物與分組健康成年新西蘭大白兔，體重3.0±0.2kg，雌雄不限。單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周，飼養(yǎng)期間給兔顆粒飼料，自由飲水，兔舍室溫20℃，相對(duì)濕度60％RH，通風(fēng)良好。120只新西蘭大白兔，隨機(jī)分為A、B、C、D四大組A組為左后肢骨折固定組，B組為左后肢創(chuàng)傷無骨折固定組，C組為左后肢無創(chuàng)傷固定組，D組為無創(chuàng)傷無固定的空白對(duì)照組。每大組30只，按造模后觀察時(shí)間位點(diǎn)不同再隨機(jī)分為3小組，每組10只，第1小組為造模后5天觀察組，第2小組為造模后7天觀察組，第3小組為造模后9天觀察組。
2、自制擊打裝置以骨科髓內(nèi)釘打撥器為基礎(chǔ)，標(biāo)上刻度，可運(yùn)用不同質(zhì)量的重錘擊打。創(chuàng)傷能量按Ep＝mgh計(jì)算。擊打接觸圓面直徑為1cm。
3、指標(biāo)檢測(cè)所用實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑(1)全自動(dòng)血凝儀法國(guó)STAGO公司的STA-R型。按其操作規(guī)程進(jìn)行操作。試劑由廣州倍肯公司提供。
(2)大型雙C形臂X光數(shù)字減影機(jī)德國(guó)SIEMENS公司的BICORPLUS/TOP型，按其操作規(guī)程進(jìn)行操作。
(3)核磁共振設(shè)備美國(guó)GE公司的1.5T磁共振設(shè)備，2003年SiguaImfinity Excite II MR/I V.11.0版軟件。
(4)全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀，型號(hào)BECKMAN COULTER。
(5)透射電子顯微鏡，型號(hào)JEM-100CX。
(6)免疫組織化學(xué)檢測(cè)設(shè)備和試劑。
設(shè)備1)CM2000C型北航醫(yī)學(xué)病理圖像分析儀；2)市售紅雙喜18cm壓力鍋；3)塑料切片架；4)家庭用National微波爐(23L、900W)；5)PHS-25數(shù)字酸度計(jì)；6)經(jīng)多聚賴氨酸液浸泡處理后的載玻片；7)PAP Pen免疫組化劃圈筆；8)免疫組化染色孵育盒；9)便攜式電子定時(shí)器；10)恒溫箱100L、冰箱(-18C～4℃)。
試劑1)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、CD34和FVIII-RAg抗體，S-P即用型試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；2)抗原修復(fù)緩沖液∶檸檬酸鹽緩沖液(0.01mmol，pH＝6.0)、EDTA緩沖液(1mmol，pH＝8.0)按1∶50的比例稀釋；3)二甲苯、10％福爾馬林液、3％雙氧水甲醇液、PBS液(pH＝7.2～7.4)、DAB顯色液等。
(7)顯影劑MRA用磁顯葡胺注射液。DSA用37.1％的Injection Dimeglumine Gadopentetate(釓噴酸葡胺注射液Gd-DTPA，先靈藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
(8)無水石膏繃帶。
(9)彩色超聲檢查設(shè)備Logic 9型高頻彩色超聲機(jī)。
4、造模方法兔耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg麻醉，右側(cè)俯臥位，左大腿根部置打擊平臺(tái)上，觸清兔左股骨大轉(zhuǎn)子，將擊打頭平面緊貼股骨大轉(zhuǎn)子至大轉(zhuǎn)子下1.5cm范圍內(nèi)，使用上述擊打裝置，以不同質(zhì)量重錘擊打大腿近端外側(cè)。石膏外固定方法以寬10cm的無水石膏繃帶卷，浸入自來水中至氣泡消失后，固定兔左后肢于屈髖屈膝位，石膏繃帶層數(shù)為7層，石膏位于兔軀體后1/2～1/3，上石膏繃帶時(shí)檢查右髖活動(dòng)自如后(以防右后肢活動(dòng)受限，造成進(jìn)食困難)，俯臥位待石膏定型。
造模后四組動(dòng)物自由飲水，顆粒飼料飼養(yǎng)，不用抗凝劑及抗生素。
A組擊打瞬間能量為12焦耳(Ep＝4kg×10×0.3m)，擊打一次，經(jīng)攝片證實(shí)股骨骨折后，石膏固定。
B組擊打瞬間能量為7.5焦耳(Ep＝2.5kg×10×0.3m)，擊打一次，不造成骨折，石膏固定。
C組未行擊打，僅行石膏固定。
D組雙后肢無創(chuàng)傷不固定。
5、觀察指標(biāo)于造模后5、7、9d，每時(shí)相點(diǎn)用10只兔，作如下檢測(cè)(1)血細(xì)胞分析從兔耳緣靜脈抽血0.5ml，注入含0.1ml抗凝劑的全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀專用試管內(nèi)，立即充分搖勻，1h內(nèi)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀作紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)，血紅蛋白定量檢測(cè)，白細(xì)胞分類。由同一專業(yè)人員按規(guī)程操作。
(2)D-二聚體(D-Dimer，DD)及凝血指標(biāo)檢測(cè)(PT-SEC、PT-INF、Fib、TT、APTT)檢測(cè)從兔耳緣靜脈抽血2ml，注入全自動(dòng)血凝儀專用試管內(nèi)，立即充分搖勻，1h內(nèi)用STA-R型全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)。由同一專業(yè)人員按規(guī)程操作。
(3)影像學(xué)檢測(cè)造模后從A2、B2、C2組中以簡(jiǎn)單隨機(jī)方法各抽取2只兔，按上述方法麻醉后，用電動(dòng)石膏鋸拆除固定石膏。按下述順序進(jìn)行檢查。
1)磁共振血栓直接成像(MRDTI)和磁共振血管成像(MRA)MRDTI按文獻(xiàn)報(bào)告的方法，由專業(yè)人員按核磁共振設(shè)備操作規(guī)程進(jìn)行。完成MRDTI檢測(cè)后，從兔耳緣靜脈注入造影劑磁顯葡胺10ml作MRA檢查，速率0.3ml/s，掃描延遲時(shí)間50～60s，F(xiàn)SPGR(快速梯度回波)序列，冠狀位無間隔掃描，TR10.2ms，TE1.9ms，連續(xù)3～4回合，經(jīng)工作站對(duì)原始圖像進(jìn)行重建。
2)數(shù)字減影血管造影(DSA)檢測(cè)從兔的下腔靜脈注入37.1％的Gd-DTPA，在大型雙C臂X光數(shù)字減影機(jī)上檢測(cè)，由專業(yè)人員按規(guī)程操作。
完成上述檢查后在麻醉下解剖兔，作大體觀察并取股動(dòng)、靜脈及全肺標(biāo)本后，處死兔。
(4)肉眼觀察暴露左側(cè)股動(dòng)靜脈，觀察有無血栓。血栓的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)為無血栓；1級(jí)為血管外觀顏色變暗，靜脈近端通血試驗(yàn)通血減慢，可疑血栓；2級(jí)為血管外觀增粗，顏色變深，靜脈近端通血試驗(yàn)通血減慢，有血栓；3級(jí)為血管外觀明顯增粗，屬支也增粗顏色變深，靜脈近端通血試驗(yàn)通血極慢或無通血，有明顯的血栓。由兩位不詳本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的專業(yè)人員分別評(píng)定并記錄血栓發(fā)生情況。
完整暴露全肺，觀察肺葉情況。觀察有無肺出血、肺水腫。分級(jí)0級(jí)雙肺無肺出血、肺水腫；1級(jí)雙肺有少許散在出血點(diǎn)；2級(jí)雙肺下極點(diǎn)片狀出血或雙肺點(diǎn)狀出血；3級(jí)雙肺大片狀出血、水腫，大于兩葉者。
(5)光鏡觀察切取后的股動(dòng)、靜脈，標(biāo)記近遠(yuǎn)端，用10％中性甲醛溶液固定，于血栓發(fā)生明顯處取材行石蠟切片包埋，HF染色；血栓發(fā)生不確定時(shí)，取近端、中間及遠(yuǎn)端共三點(diǎn)作切片，以其中一點(diǎn)納入統(tǒng)計(jì)。光鏡鏡檢觀察靜脈和動(dòng)脈是否有血栓及血管壁的變化。根據(jù)血栓對(duì)血管的阻塞程度分為4個(gè)等級(jí)0級(jí) 無血栓；1級(jí) 血管阻塞＜50％；2級(jí) 血管阻塞＞50％，但未完全阻塞；3級(jí) 血管完全阻塞。
取出的全肺，用10％中性甲醛液固定，石蠟切片包埋，HE染色，光鏡觀察是否有肺動(dòng)脈栓塞。
(6)透射電鏡觀察造模后第7天從A2、B2組各隨機(jī)抽取肉眼觀察發(fā)生血栓的2只兔，從C2組隨機(jī)抽取肉眼觀察無血栓發(fā)生的2只兔，在擊打平面取左股動(dòng)靜脈，長(zhǎng)度2cm，戊二醛前固定，鋨酸后固定，常規(guī)包埋，制成超薄切片，醋酸鈉和檸檬酸鋁雙染色，透射電子顯微鏡觀察。
(7)免疫組織化學(xué)檢測(cè)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、CD34、FVIII-PAg。將10％中性甲醛溶液固定完全的靜脈組織標(biāo)本制成常規(guī)石蠟切片(厚4～5μm)。1)行常規(guī)脫蠟水洗后，用3％雙氧水甲醇液處理10分鐘，2)用蒸餾水沖洗切片3次，3)切片置于裝有已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液(0.01mmol，pH＝6.0)和EDTA緩沖液(1mmol，Ph＝8.0)的高壓鍋中，加熱至噴汽，開始計(jì)時(shí)，1-2分鐘后，離開熱源，自然冷卻至室溫，4)蒸餾水沖洗2次，PBS液沖洗2次，每次約3分鐘。檢測(cè)均采用免疫組織化學(xué)SP法。用多克隆抗體及SP試劑盒(購自福州邁新公司)對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)后，按S-P試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。
在顯微鏡下觀察，免疫組化陽性染色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，有陽性結(jié)果后再用CM2000C型北航醫(yī)學(xué)病理圖像分析儀進(jìn)行定量檢測(cè)。
(8)血液流動(dòng)狀態(tài)觀測(cè)造模前從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中隨機(jī)抽取12只兔，麻醉后用高頻彩色多普勒血流顯像觀測(cè)兔仰臥、左后肢伸直位和屈髖(120°)屈膝位(110°)時(shí)，腹股溝部股靜脈血流速度(V)、血管內(nèi)徑(D)的變化并計(jì)算血流量，血流量cm3/s＝π×(D/2)2×V。
6、數(shù)據(jù)處理使用SPSS10.0版統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，多組數(shù)據(jù)間比較、組間兩兩比較用隨機(jī)區(qū)組(無重復(fù)數(shù))設(shè)計(jì)的雙因素方差分析或R×C表卡方檢驗(yàn)或四格表資料的Fisher確切概率法，對(duì)資料相關(guān)性的分析用Superman法，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
二、結(jié)果1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況A組30只兔中死亡5只，其中，第5天觀察組1d、5d各死亡一只，第7天觀察組1d、5d各死亡一只，第9天觀察組6d死亡一只。經(jīng)解剖2只死于失血性休克，2只死于肺血栓栓塞癥，1只原因不明。B、C、D組兔無死亡。
2、血細(xì)胞分析(1)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)各組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C、D組比較，C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)RBC計(jì)數(shù)(X±S)(單位×1012/L)

(2)白細(xì)胞計(jì)數(shù)各組白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C、D組比較，C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)WBC計(jì)數(shù)(X±S)(單位×109/L)

(3)血小板計(jì)數(shù)各組血小板計(jì)數(shù)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C、D組比較，C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)PLT計(jì)數(shù)(X±S)(單位×109/L)

(4)血紅蛋白測(cè)定各組血紅蛋白檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C、D組比較，C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)HGB計(jì)量(X±S)(單位g/L)

(5)MID檢測(cè)各組MID結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)MID比例(X±S)(單位×100％)

3、D-二聚體(D-Dimer，DD)檢測(cè)D-二聚體檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)DD計(jì)量(X±S)(單位μg/ml)

4、凝血指標(biāo)檢測(cè)(1)PT-SEC檢測(cè)PT-SEC檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)PT-SEC比較(X±S)(單位s)

(2)INR檢測(cè)INR檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)INR比較(X±S)

(3)Fib檢測(cè)Fib檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)Fib比較(X±S)(單位g/L)

(4)TT檢測(cè)TT檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)TT比較(X±S)(單位s)

(5)APTT檢測(cè)APTT檢測(cè)結(jié)果見下表。經(jīng)雙因素方差分析，A、B、C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；進(jìn)一步作q檢驗(yàn)A組與B、C、D組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與C、D組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)APTT比較(X±S)(單位s)

5、磁共振血栓直接成像(MRDTI)、磁共振血管成像(MRA)與數(shù)字減影血管造影(DSA)檢查股靜脈血栓MRDTI、MRA與DSA檢測(cè)結(jié)果見下表。
造模第7天MRDTI、MRA、DSA血栓檢測(cè)結(jié)果

6、肉眼觀察(1)、肉眼觀察左股靜脈血栓發(fā)生A組不同時(shí)相點(diǎn)均見兔腹股溝區(qū)有不同程度的出血及血腫，血腫較大且彌散，可見部分股靜脈血栓，以2、3級(jí)為多，股動(dòng)脈搏動(dòng)可見，大部分股靜脈、股動(dòng)脈受損較重。
B組第5天見部分兔腹股溝區(qū)血腫較小且彌散，大部分兔腹股溝區(qū)無血腫，部分股靜脈可見血栓；第7天見大部分股靜脈可見血栓，以2、3級(jí)為多，1級(jí)較少；第9天部分股靜脈仍可見靜脈血栓存在，以1級(jí)和2級(jí)為主，3級(jí)少。從第5天到第9天均可見股動(dòng)脈搏動(dòng)。
C組均未見腹股溝區(qū)血腫，少見靜脈血栓，為1、2級(jí)，未見3級(jí)，股動(dòng)脈搏動(dòng)正常。
肉眼觀察各組左股靜脈血栓發(fā)生見下表。經(jīng)x2檢驗(yàn)，A、B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；進(jìn)一步作x2分割，A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。C組與D組經(jīng)Fisher確切概率法比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
肉眼觀察各組左股靜脈血栓發(fā)生結(jié)果

(2)肉眼觀察肺血栓栓塞癥發(fā)生A、B組部分出現(xiàn)肺充血、肺水腫，表面有點(diǎn)片狀出血灶，病變呈雙側(cè)性分布，主要為1級(jí)和2級(jí)，少數(shù)為3級(jí)。C組少見肺出血、肺水腫，主要為1級(jí)。D組肺表面光滑均一，呈淡粉紅色，未見充血、水腫、壞死及出血等情況。A、B、C各組以(1級(jí)+2級(jí)+3級(jí))/n×100％計(jì)算發(fā)生率，顯示A、B組肉眼觀察肺出血、肺水腫發(fā)生率較C組高。
肉眼觀察各組肺血栓栓塞癥發(fā)生結(jié)果見下表。經(jīng)四格表x2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法比較A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；A組與D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組與D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組與D組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
肉眼觀察各組肺血栓栓塞癥發(fā)生結(jié)果

7、光鏡觀察
(1)光鏡觀察左股動(dòng)靜脈血栓發(fā)生A組左股靜脈第5天少見股靜脈內(nèi)血栓，多為不完全血栓，可見靜脈內(nèi)膜損傷嚴(yán)重，血管內(nèi)皮細(xì)胞剝脫，內(nèi)皮下層裸露，少數(shù)有動(dòng)脈內(nèi)膜損傷和不全血栓；第7天可見大部分股靜脈發(fā)生血栓，以2、3級(jí)為主，靜脈內(nèi)膜損傷嚴(yán)重，血栓與血管壁粘連，血管壁及組織間隙炎性浸潤(rùn)明顯，少數(shù)有動(dòng)脈內(nèi)膜損傷和不全血栓；第9天可見大部分股靜脈有血栓，多為不完全血栓；部分血栓纖維化，可見部分新生內(nèi)皮細(xì)胞形成迷路狀相互溝通的管道，血管部分再通，動(dòng)脈內(nèi)仍可見不全血栓。各組以(1級(jí)+2級(jí)+3級(jí))/n×100％計(jì)算血栓發(fā)生率。
B組第5天部分股靜脈內(nèi)血栓發(fā)生，多為不完全血栓，僅見1例完全性血栓，靜脈內(nèi)膜損傷，內(nèi)皮細(xì)胞剝脫，內(nèi)皮下層裸露，部分內(nèi)皮細(xì)胞變性，細(xì)胞漿內(nèi)大量空泡形成，細(xì)胞水腫呈球形，細(xì)胞間隙增大，偶見動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，部分動(dòng)脈內(nèi)有血栓栓塞但程度輕，均為1級(jí)；第7天大部分股靜脈發(fā)生血栓，多為2、3級(jí)，靜脈內(nèi)膜損傷，部分內(nèi)皮細(xì)胞變性，細(xì)胞漿內(nèi)大量空泡形成，細(xì)胞水腫呈球形，細(xì)胞間隙增大，血管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，少部分動(dòng)脈內(nèi)有程度較輕的不完全性血栓；第9天可見部分股靜脈血栓發(fā)生，多為不完全血栓；靜脈內(nèi)膜損傷，有靜脈內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋至血栓周邊表面，血管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)仍存在，部分血栓纖維化，可見部分新生內(nèi)皮細(xì)胞形成迷路狀可相互溝通的管道，血管部分再通。
C組第5天可見少部分股靜脈1級(jí)血栓，動(dòng)脈內(nèi)未見血栓，未見動(dòng)、靜脈內(nèi)膜損傷；第7天可見部分股靜脈1、2級(jí)血栓，少見靜脈內(nèi)膜損傷；第9天可見少部分股靜脈1、2級(jí)血栓，少見靜脈內(nèi)膜損傷，動(dòng)脈內(nèi)未見血栓。
光鏡觀察各組左股靜脈血栓發(fā)生結(jié)果見下表。經(jīng)x2檢驗(yàn)，A、B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；進(jìn)一步作x2分割，A組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；A組與D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。C組與D組經(jīng)Fisher確切概率法比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
光鏡觀察各組左股靜脈血栓發(fā)生結(jié)果

(2)光鏡觀察肺血栓栓塞癥發(fā)生D組肺組織病理切片在光鏡下可見肺泡壁完整、肺泡膨脹良好、肺泡和間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血，肺血管結(jié)構(gòu)完整未見異常變化；有栓塞的肺組織鏡下可見肺泡周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡和間質(zhì)內(nèi)有局灶出血、肺動(dòng)脈血管內(nèi)可見血栓存在；A、B組大部分血栓堵塞于肺小動(dòng)脈遠(yuǎn)端，呈散在分布，未波及大血管(圖31、32)；C組少見肺動(dòng)脈血栓；D組未見肺動(dòng)脈血栓存在。
光鏡觀察各組肺血栓栓塞癥發(fā)生結(jié)果見下表。經(jīng)x2檢驗(yàn)，A、B、C、D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；進(jìn)一步作x2分割A(yù)組與B組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A組與C組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；A組與D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與C組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；B組與D組比較，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。C組與D組經(jīng)Fisher確切概率法比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
光鏡觀察各組肺血栓栓塞癥發(fā)生結(jié)果

8、光鏡觀察股靜脈血栓發(fā)生率與肺血栓栓塞癥發(fā)生率的相關(guān)性分析各組光鏡觀察股靜脈血栓發(fā)生率與肺血栓栓塞癥發(fā)生率結(jié)果見下兩表。Superman相關(guān)系數(shù)為0.901，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)股靜脈血栓發(fā)生率(％)

A、B、C、D四組各時(shí)相點(diǎn)肺血栓栓塞癥發(fā)生率(％)

9、透射電鏡觀察左股動(dòng)靜脈內(nèi)膜和內(nèi)皮細(xì)胞A組第7天動(dòng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均有損傷，以靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯?？梢婌o脈內(nèi)皮下基底膜裸露，內(nèi)皮下基質(zhì)大片暴露，附壁血栓發(fā)生，血栓與靜脈內(nèi)膜接觸部位的內(nèi)皮細(xì)胞幾乎完全脫落，內(nèi)皮細(xì)胞核溶解，細(xì)胞膜破裂，有多核粒細(xì)胞粘附。動(dòng)脈內(nèi)膜脫落，彈力層斷裂，單核粒細(xì)胞侵入中膜。血栓邊緣有殘存內(nèi)皮細(xì)胞，大小不一。
B組第7天；可見靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯，而動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷不明顯?？梢娧ㄅc靜脈內(nèi)膜接觸部位的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，裸露出中膜平滑肌，靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體腫脹，嵴溶解，鄰近部位內(nèi)皮細(xì)胞增生，靜脈內(nèi)膜面單核粒細(xì)胞粘附。靜脈內(nèi)膜有增生的內(nèi)皮細(xì)胞存在。動(dòng)脈彈力層和中膜結(jié)構(gòu)仍保持完整，未見中性粒細(xì)胞侵入中膜，內(nèi)皮細(xì)胞基本完整，細(xì)胞間存在明顯間隙。
C組第7天靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞均無損傷。部分靜脈內(nèi)皮細(xì)胞水腫失去正常形態(tài)，但無明顯內(nèi)皮下基質(zhì)暴露，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞均正常。
10、免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMP-2、CD34、FVIII-RAg檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
11、血液流動(dòng)狀態(tài)觀測(cè)造模前從120只兔中隨機(jī)抽取12只，用高頻彩色多普勒血流顯像儀觀測(cè)左后肢伸直位和屈髖屈膝位時(shí)股靜脈的血流速度和血管內(nèi)徑，結(jié)果顯示屈髖屈膝位較伸直位時(shí)血流速度減慢，血管內(nèi)徑變小，兩樣本配對(duì)t檢驗(yàn)t＝8.106p＜0.01，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見下表。
兩種體位股靜脈血流量結(jié)果(n＝12)

權(quán)利要求
1.一種建立兔創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓動(dòng)物模型的方法。其特征在于應(yīng)用骨科髓內(nèi)釘打撥器改裝自制的可定量擊打裝置，模擬與骨科臨床相似的創(chuàng)傷過程，造成兔單側(cè)下肢近端不同程度的損傷，創(chuàng)建一種具有骨科臨床特點(diǎn)的肢體深靜脈血栓動(dòng)物模型制作方法，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)，觀察深靜脈血栓、肺血栓栓塞癥發(fā)生情況，局部及全身相應(yīng)變化，具體步驟如下(1)、自制擊打裝置以骨科髓內(nèi)釘打撥器為基礎(chǔ)，標(biāo)上刻度，可測(cè)出不同質(zhì)量擊打錘自30cm高度自由落下的不同擊打能量。擊打頭平面直徑為1cm，瞬間打擊能量按Ep＝mgh計(jì)算。(2)、造模方法健康成年新西蘭大白兔，體重3.0±0.2kg，雌雄不限。適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周，耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg麻醉，右側(cè)俯臥位，左大腿根部置打擊平臺(tái)上，觸清兔左股骨大轉(zhuǎn)子，將擊打頭平面緊貼股骨大轉(zhuǎn)子至大轉(zhuǎn)子下1.5cm范圍內(nèi)，使用上述擊打裝置，以不同質(zhì)量重錘擊打大腿近端外側(cè)后，7層石膏繃帶屈髖屈膝位固定，瞬間打擊能量按Ep＝mgh計(jì)算，并據(jù)創(chuàng)傷能量不同及有無石膏固定分為左后肢骨折固定組(12焦耳)，左后肢創(chuàng)傷無骨折固定組(7.5焦耳)，左后肢無創(chuàng)傷固定組，無創(chuàng)傷無固定的空白對(duì)照組等四組。(3)、觀察指標(biāo)于造模后5、7、9d，每時(shí)相點(diǎn)用10只兔，作如下檢測(cè)1)、血細(xì)胞分析2)、D-二聚體(D-Dimer，DD)及凝血指標(biāo)檢測(cè)(PT-SEC、PT-INF、Fib、TT、APTT)檢測(cè)3)、影像學(xué)檢測(cè)①、磁共振血栓直接成像(MRDTI)和磁共振血管成像(MRA)。②、數(shù)字減影血管造影(DSA)檢測(cè)。完成上述檢查后在麻醉下解剖兔，作大體觀察并取股動(dòng)、靜脈及全肺標(biāo)本后，處死兔。4)、肉眼觀察暴露左側(cè)股動(dòng)靜脈，觀察有無血栓。完整暴露全肺，觀察肺葉情況。觀察有無肺出血、肺水腫。5)、光鏡觀察切取后的股動(dòng)、靜脈，標(biāo)記近遠(yuǎn)端，用10％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色，觀察血栓發(fā)生情況。取出的全肺，用10％中性甲醛液固定，石蠟切片包埋，HE染色，光鏡觀察是否有肺動(dòng)脈栓塞。6)、透射電鏡觀察7)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)8)、血液流動(dòng)狀態(tài)觀測(cè)(4)、數(shù)據(jù)處理使用SPSS10.0版統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
全文摘要
本發(fā)明是一種兔創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓模型的建立方法。其特征在于應(yīng)用骨科髓內(nèi)釘打撥器改裝自制的可定量擊打裝置，模擬與骨科臨床相似的創(chuàng)傷過程，造成兔單側(cè)下肢近端不同程度的損傷，創(chuàng)建出一種具有骨科臨床特點(diǎn)的肢體深靜脈血栓動(dòng)物模型，深靜脈血栓、肺血栓栓塞癥發(fā)生率高，并可進(jìn)行不同指標(biāo)的檢測(cè)。該發(fā)明制作過程簡(jiǎn)單易行，動(dòng)物死亡率低；能較好模擬臨床骨科創(chuàng)傷后，深靜脈血栓發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1751742SQ20051001079
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2005年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月10日
發(fā)明者趙學(xué)凌, 李文, 黃河, 王兵, 趙宏斌, 何飛, 王建偉, 吳雪梅, 張春強(qiáng), 賈代良, 趙 智, 唐錫章, 周兆文, 李世和 申請(qǐng)人:昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院