專利名稱：治療乙型肝炎的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種治療乙型肝炎的藥物組合物及其在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物和在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人們通常所說的肝炎，就是病毒性肝炎。目前已發(fā)現(xiàn)由7種肝炎病毒引起的肝炎分別為甲型肝炎，乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎和TTV。這7種病毒性肝炎中，甲型、戊型肝炎是通過胃腸道傳播，屬自限性疾病，不會(huì)發(fā)展為慢性肝炎。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，只有依附于乙型肝炎病毒才能復(fù)制；庚型肝炎不引起大范圍傳播。乙型和丙型肝炎是嚴(yán)重危害人體健康的病毒性傳染病。乙肝病毒屬DNA嗜肝病毒科，丙肝病毒屬RNA黃病毒科，其傳播途徑是通過血液、母嬰和性接觸等3種途徑傳染，并且易轉(zhuǎn)成慢性肝炎，是肝硬化、肝癌的主要病因。乙型肝炎病毒的復(fù)制過程涉及5步結(jié)合、侵入，轉(zhuǎn)錄，翻譯，基因復(fù)制和包裝。首先顆粒通過受體附著于肝細(xì)胞，侵入胞漿后脫去外膜，形成核心顆粒。核心顆粒移至肝細(xì)胞核，HBV DNA右核心顆粒脫殼而出，在細(xì)胞核內(nèi)形成cccDNA.cccDNA是乙型肝炎病毒復(fù)制的膜板，是感染長(zhǎng)期持續(xù)的關(guān)鍵物質(zhì)。cccDNA有2種功能，其一是合成病毒顆粒的各種構(gòu)件，如HBsAg(面抗原，構(gòu)成外膜)，HBcAg(核心抗原，構(gòu)成內(nèi)膜)，HBeAg(e抗原，分泌到血液中)；其二是合成下一代HBV DNA.大部分新合成的HBVDNA用于新病毒顆粒的包裝，部分則重新進(jìn)入肝細(xì)胞核，成為cccDNA的另一個(gè)來源。部分新合成的HBVDNA首先與HBcAg組裝成核心顆粒，進(jìn)而與HBsAg組裝成完整的HBV顆粒，向細(xì)胞外釋放。HBsAg有時(shí)過剩而獨(dú)自釋放入血，形成小球型顆?；蚬苄皖w粒。
目前對(duì)乙型和丙型病毒性肝炎的治療尚缺乏專屬性較強(qiáng)的治療藥物。國(guó)外對(duì)治療病毒性肝炎新藥的研制側(cè)重于開發(fā)抗肝炎病毒藥，在抗肝炎病毒化療藥物的研究中取得一些進(jìn)展。80年代曾進(jìn)行試驗(yàn)的阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韋、齊多夫定因療效不佳，毒性反應(yīng)大，在國(guó)外已不再用于治療乙肝。近幾年開發(fā)了多種核苷類藥物，對(duì)HBV有明顯的抑制作用。拉米夫定(lamivudine)，泛昔洛韋(famciclovir)，洛布卡韋(lobucavir)，阿地福韋(adefovir dipivoxiil)，F(xiàn)TC(二脫氧氟硫代胞嘧啶)，F(xiàn)MAU(氟甲阿糖尿嘧啶)，F(xiàn)DDC(氟二脫氧胞嘧啶)，BMS 200475(環(huán)氧羥碳脫氧鳥苷)這些藥物具有下列共同點(diǎn)均為核苷類的衍生物，分別為胞嘧啶，尿嘧啶，鳥嘧啶或嘌呤化合物。在體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HIV、HBV或HCV等病毒有抑制作用。其作用機(jī)制為進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)成為三磷酸化合物，通過底物的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)病毒的聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶抑制，最終抑制病毒DNA的合成、病毒的增殖。經(jīng)過長(zhǎng)期的治療后，病毒可能出現(xiàn)變異和耐受性。需長(zhǎng)期用藥，因短期應(yīng)用僅有暫時(shí)效果。如與其他不同作用靶點(diǎn)的藥物聯(lián)合應(yīng)用，可提高療效，降低耐藥性發(fā)生。其他治療方法如利巴韋林和基因重組干擾α-2b(intron A)合用、干擾素復(fù)合物、干擾素復(fù)合物(pegasys、2001年)治療慢性丙型肝炎。另外為控制乙型肝炎的蔓延，醫(yī)學(xué)界還研究出有效的乙型肝炎疫苗，對(duì)公眾進(jìn)行免疫注射。如治療慢性乙型肝炎采用的藥物是α一干擾素(IFN)，其作用主要是免疫調(diào)節(jié)。但干擾素治療慢性乙型肝炎有其制約因素其一，它從未獲得真正成功，除非病人在治療前已出現(xiàn)對(duì)HBV的實(shí)質(zhì)性免疫反應(yīng)。其二，在干擾素誘導(dǎo)的HBeAg血清轉(zhuǎn)換之前，肝炎活動(dòng)的突然、一過性加重(表現(xiàn)為ALT升高)可導(dǎo)致肝硬化病人發(fā)生肝功能衰竭、偶爾出現(xiàn)死亡。研發(fā)出抗肝炎、抗肝硬化的新一代藥物在市場(chǎng)上會(huì)有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。抗肝炎藥物在國(guó)內(nèi)外有非常大的市場(chǎng)，但現(xiàn)在的抗肝炎藥物普遍存在耐藥性的問題。成功地開發(fā)出能解決抗肝炎藥物的耐藥性，臨床有效率高，且毒副作用較低的藥物，應(yīng)有非常好的市場(chǎng)前景。
迄今，現(xiàn)有技術(shù)中沒有含有式(I)化合物澤瀉醇A(Alisol A)作為有效成分在治療艾滋病方面的報(bào)道，也沒有該化合物在制備乙型肝炎藥物和乙型肝炎抑制劑藥物中的應(yīng)用報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于治療乙型肝炎藥物組合物，其中含有治療乙型肝炎有效量的式(I)化合物澤瀉醇A(Alisol A)及藥用載體和/或賦形劑，提供該藥物組合物在制備抗乙型肝炎藥物中和抗乙型肝炎抑制劑藥物中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案治療乙型肝炎的藥物組合物，其中含有式(I)化合物澤瀉醇A(Alisol A)作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。
本發(fā)明同時(shí)提供了上述藥物組合物在制備抗乙型肝炎藥物中和抗乙型肝炎抑制劑藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有0.1-99％，優(yōu)選為0.5-90％的本發(fā)明化合物澤瀉醇A(AlisolA)，其余為藥物學(xué)上可接受的，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體。
所述的藥用載體是一種或多種選固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1澤瀉醇A的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定澤瀉醇A(Alisol A)的提取分離采集澤瀉塊根，其學(xué)名經(jīng)鑒定為Alisma orientalis(Sam.)Juzep.，.室溫陰干，粉碎。取20千克干粉，用90％乙醇回流提取3次，每次3小時(shí)，合并醇提液，減壓回收得乙醇得浸膏。該浸膏懸浮于水中，用氯仿、正丁醇分別萃取，回收溶劑得氯仿部分(450克)和正丁醇部分(130克)。氯仿部分用甲醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干，研粉，經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(100∶0-90∶10)梯度洗脫，TLC F254硅膠薄板指導(dǎo)分離并檢測(cè)各流份，相同流份合并，第14-18流份合并，甲醇重結(jié)晶2次，得白色小針晶化合物澤瀉醇A(Alisol A)23克(得率0.115％)。經(jīng)TLC硅膠F254薄板檢測(cè)與對(duì)照品澤瀉醇A(Alisol A)，Rf值相同。
澤瀉醇A(Alisol A)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)熔點(diǎn)用四川大學(xué)科儀廠的顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀XRC-1型測(cè)定；紅外光譜(IR)用Bio-Rad FTS-135型分光光度計(jì)測(cè)定，KBr壓片。質(zhì)譜(MS)用Auto SPEC3000型質(zhì)譜儀測(cè)定，采用EI-MS技術(shù)。核磁共振譜(1H NMR和13C NMR)用BrukerWH-400超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定，TMS作內(nèi)標(biāo)，CDCl3作溶劑。青海洋化工廠出品的200-300目硅膠作為柱層析材料；薄層層析用青?；S出品的硅膠板指導(dǎo)分離。展開劑A氯仿-甲醇(95∶5，/v)B石油醚-乙酸乙酯-(7∶3)C，甲醇-水(8∶2)。顯色劑A、5％ H2SO4-EtOH。
結(jié)構(gòu)如化學(xué)式 所示分子式C30H50O5分子量490性狀無(wú)色柱狀晶體(甲醇[α]D25+99°(c 0.586，吡啶)。
IR vmaxKBr cm-13391(OH)，1733，1717，1652，1608，1575，1506，1500，1361，1248，1183。
EI-MS m/z472[M]+。
1H NMR(C5D5N)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ1.02(3H，d，J＝6.9Hz，H-21)，0.99，1.05，1.05，1.07，1.12，1.24，1.30(each 3H，s)，1.76(1H，d，J＝10.8Hz，H-9)，2.79(1H，m，H1-12)，3.00(1H，br.s，H-24)，3.78(1H，dd，J＝9.4，2.4Hz，H-23)，3.88(1H，ddd，J＝10.7，10.7，6.0Hz，H-11)。
13C NMR(CDCl3)δ30.9(C-1)，33.6(C-2)，221.0(C-3)，46.9(C-4)，48.4(C-5)，20.1(C-6)，34.2(C-7)，40.3(C-8)，49.4(C-9)，36.8(C-10)，69.6(C-11)，34.2(C-12)，137.6(C-13)，56.9(C-14)，30.4(C-15)，29.0(C-16)，135.2(C-17)，22.9(C-18)，25.5(C-19)，28.1(C-20)，20.1(C-21)，40.0(C-22)，69.4(C-23)，77.7(C-24)，74.1(C-25)，27.2(C-26)，26.2(C-27)，29.5(C-28)，19.9(C-29)，24.0(C-30).
實(shí)施例2澤瀉醇A(Alisol A)對(duì)2.2.15細(xì)胞的毒性和對(duì)分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用試驗(yàn)。
1材料和方法1.1藥物澤瀉醇A(Alisol A)為來自中藥澤瀉(Alisma plantago-aquqticavar.orienta)中的為單體化合物。
1.2 2.2.15細(xì)胞引自北京302醫(yī)院；用DMEM液培養(yǎng)，培養(yǎng)液添加10％胎牛血清，0.03％L-谷氨酰胺，100mg/LG418，105IU/L青酶素，100mg/L鏈霉素，5％NaCO3調(diào)PH至6.8。
1.3儀器酶標(biāo)儀ELX800(德國(guó))1.4藥物應(yīng)用用胰蛋白酶將2.2.15細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，每孔按3×104·0.1ml-1分種于96孔板，24h后換用含藥培養(yǎng)液，每種藥物設(shè)八個(gè)藥物濃度，每個(gè)濃度設(shè)兩孔，并設(shè)不加藥物的對(duì)照；11d后收集上清，備作HBsAg和HBeAg測(cè)定。同時(shí)測(cè)定藥物細(xì)胞毒性。
1.5細(xì)胞毒性檢測(cè)根據(jù)Mosmann建立的MTT法檢測(cè)藥物細(xì)胞毒性[1]。具體方法是向吸去上清的細(xì)胞孔中加入0.4g/L MTT的無(wú)血清培養(yǎng)液0.1ml/孔，37℃培養(yǎng)4h，去上清，用二甲基亞砜溶解，測(cè)490nm波長(zhǎng)下的吸光下的吸光度A值。破壞百分率ηdistroy＝(A細(xì)胞組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A細(xì)胞組-A空白組)×100，50％毒性濃度(CC50)為實(shí)驗(yàn)孔存活細(xì)胞為對(duì)照孔50％時(shí)的藥物濃度。
1.6 HBsAg、HBeAg的檢測(cè)采用華美生物工程公司生產(chǎn)的酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。藥物對(duì)抗原的抑制百分率ηinhibitory＝(A細(xì)胞組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A細(xì)胞組-A空白組)×100，50％抑制濃度(IC50)為HBsAg或HBeAg以抑制率為50％時(shí)的藥物濃度。選擇指數(shù)(SI)為評(píng)價(jià)藥物臨床應(yīng)用前景的參數(shù)，TI＝CC50/IC50。
2.結(jié)果藥物對(duì)HBsAg、HBeAg分泌及細(xì)胞存活的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇HBsAg、HBeAg作為澤瀉醇A(Alisol A)效果的研究指標(biāo)，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性(表1)，并相應(yīng)計(jì)算出治療指數(shù)來評(píng)價(jià)藥物臨床應(yīng)用前景，其中SI＞2為有效低毒，1＜SI＜2為低效有毒，TI＜1為毒性作用。表1、表2和表3給出了具體結(jié)果。
表1 澤瀉醇A(Alisol A)對(duì)2.2.15細(xì)胞的毒性作用

表2.澤瀉醇A(Alisol A)對(duì)2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用

表3.澤瀉醇A(alimasol A對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制效果

結(jié)果表明澤瀉醇A(Alisol A)對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg具有抑制作用。
3.結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示澤瀉醇A(Alisol A)在對(duì)2.2.15細(xì)胞的半數(shù)毒性作用下，在體外對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。
實(shí)施例3澤瀉醇A(Alisol A)對(duì)鴨乙肝病毒(DHBV)感染的抑制作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯繚蔀a醇A對(duì)鴨乙肝病毒(DHBV)感染的抑制作用。
實(shí)驗(yàn)材料一、藥物1.澤瀉醇A(Alisol A)為來自中藥澤瀉(Alisma plantago-aquqtica var.orienta)中的為單體化合物。在植物中的含量為0.1％。
2.阿昔洛韋(ACV)由麗珠集團(tuán)湖北科益藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0112005。
二、動(dòng)物雄性一日齡龍巖麻鴨，購(gòu)自石井潮陽(yáng)村孵化場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)體重約120克/只，常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境本校動(dòng)物飼養(yǎng)室，溫度24℃～26℃，相對(duì)濕度60～80％，定時(shí)通風(fēng)換氣，每日約12小時(shí)光照。飼料寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業(yè)有限公司飼料廠生產(chǎn)，本產(chǎn)品符合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。40kg/包。
三、主要試劑及儀器1.NC膜購(gòu)自Amersham公司。
2.DHBV質(zhì)粒由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所病毒室技術(shù)人員提取。
3.缺口翻譯藥盒購(gòu)自promega公司。α-32p-dCTP，購(gòu)自北京亞輝公司。
4.Sephadex G-50購(gòu)自Pharmacia公司。
5.96孔雜交點(diǎn)樣器美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。
6.蓋革氏計(jì)數(shù)器美國(guó)S.E.International公司產(chǎn)品。
四、陽(yáng)性藥選擇選擇對(duì)DHBV抑制作用較強(qiáng)的阿昔洛韋(ACV)作為陽(yáng)性對(duì)照藥。
五、藥物劑量配制澤瀉醇A(Alisol A)高劑量取120mg+0.4ml DMSO+3.8ml水(30mg/ml)；澤瀉醇A(Alisol A)低劑量；取80mg+0.5ml DMSO+8.2水(9.2mg/ml)，每天現(xiàn)配；阿昔洛韋(ACV)200mg/kg。
六、結(jié)果處理用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
七、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果(一)、抗鴨乙肝病毒作用在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一日齡龍巖麻鴨購(gòu)回后，于第6天經(jīng)脛靜脈取血，分離血清后，用斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)DHBV，選出先天感染的鴨子實(shí)驗(yàn)。澤瀉醇A(alimasol A)大劑量組和小劑量組給藥劑量均為1ml/只/天；另設(shè)病毒對(duì)照(DHBV)，以水代替藥物；陽(yáng)性藥用阿昔洛韋(ACV)200mg/kg/天。以上藥物均口服給藥，10天一療程。在第17天即用藥前(T0)、用藥第5天(T5)、第10天(T10)及停藥后第3天(P3)，自鴨脛靜脈取血，分離血清，-70℃凍存待檢。
(二)、DHBV-DNA檢測(cè)方法取上述鴨血清，每批同時(shí)點(diǎn)膜，測(cè)定鴨血清中DHBV-DNA水平的變化，按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32p標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點(diǎn)雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)，在酶標(biāo)檢測(cè)儀上測(cè)定OD值(濾光片波長(zhǎng)為490nm)，計(jì)算血清DHBV-DNA密度。
(三)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4 澤瀉醇A(Alisol A)在鴨體內(nèi)對(duì)DHBV-DNA的抑制作用(x±s)

注澤瀉醇A(Alisol A)組給藥不同時(shí)間與給藥前(T0)比較*P＜0.05澤瀉醇A(Alisol A)組與對(duì)照組相同時(shí)間比較△△P＜0.01△P＜0.05(四)、結(jié)論實(shí)驗(yàn)表明，澤瀉醇A(Alisol A)二個(gè)劑量組10天療程，在高劑量(300mg/kg/天)組對(duì)鴨乙型肝炎病毒有明顯的抑制作用。
實(shí)施例4按實(shí)施例1的方法先制得澤瀉醇A(Alisol A)，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
實(shí)施例5按實(shí)施例1的方法先制得澤瀉醇A(Alisol A)，將其溶于無(wú)菌注射用水中，攪拌使溶，用無(wú)菌抽濾漏斗過濾，再無(wú)菌精濾，分裝于2安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封得粉針劑。
實(shí)施例6將所分離得到的澤瀉醇A(Alisol A)與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成粉劑。
實(shí)施例7按實(shí)施例1的方法先制得澤瀉醇A(Alisol A)，按其與賦形劑重量比為5∶1的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實(shí)施例8按實(shí)施例1的方法先制得澤瀉醇A(Alisol A)，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
實(shí)施例9按實(shí)施例1的方法先制得澤瀉醇A(Alisol A)，按其與賦形劑重量比為5∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實(shí)施例10按實(shí)施例1的方法先制得澤瀉醇A(Alisol A)，按其與賦形劑重量比為3∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
權(quán)利要求
1.治療乙型肝炎的藥物組合物，其中含有式(I)化合物澤瀉醇A(Alisol A)作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。
2.權(quán)利要求1所述藥物化合物澤瀉醇A(Alisol A)在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述藥物化合物澤瀉醇A(Alisol A)在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
治療乙型肝炎的藥物組合物，其中含有式(I)化合物澤瀉醇A(Alisol A)作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。上述藥物化合物澤瀉醇A(Alisol A)在制備抗乙型肝炎藥物和抗乙型肝炎抑制劑藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1775217SQ20051001082
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者陳紀(jì)軍, 江志勇, 張奉學(xué), 劉妮, 趙舫, 張雪梅, 周俊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所