專利名稱：一種組織工程骨軟骨復合物制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組織工程復合物的制備方法及其應用，尤其是一種組織工程骨軟骨復合物的制備方法及其應用。
背景技術：
關節(jié)軟骨的損傷和缺損是臨床骨科的常見疾病，連接替代和骨軟骨缺損重建對于恢復骨和軟骨功能是非常重要的，目前臨床上通常采用非生物替代物，異種和同種異體的骨軟骨移植物來治療軟骨缺損。但是，非生物替代物的連接替代的效果不能持久，經(jīng)常磨損和松脫；自體供者組織的可用性和供體的損傷限制了自體移植的應用，異體移植又存在免疫排斥和病毒感染等危險性，都無法達到令人滿意的效果。組織工程學是近年來發(fā)展起來的一種結(jié)合了細胞生物學、工程學和材料科學和外科領域的發(fā)展的、提供了一種新的用活細胞、生物材料和信號分子來構建功能性的組織的新的學科。目前應用組織工程的手段修復關節(jié)軟骨缺損的研究中存在三個難點，一是種子細胞的選擇，種子細胞必須滿足一定的數(shù)量，并且能夠維持良好的生物學特性；二是支架材料的選擇，支架材料必須具備優(yōu)良的生物相容性，生物可降解性和可塑性；三是組織工程組織的固定方法，組織工程復合物必須穩(wěn)固地固定于缺損局部，才能達到良好的修復效果。
由于構建骨軟骨組織工程復合物需要不同組織來源的細胞，應用新鮮的骨和軟骨細胞的兩個不利因素是不能得到足夠數(shù)量的細胞和取材的局限性，一些研究指出，軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)中的去分化也影響其接種到支架上以后軟骨細胞功能的發(fā)揮。研究證實累及軟骨下骨的缺損，其周圍的軟骨細胞不參與細胞再生，修復組織主要起源于髓腔內(nèi)的基質(zhì)細胞(MSCs)。骨髓MSCs是一簇具有向多系轉(zhuǎn)化潛能的間質(zhì)干細胞。它在一定的環(huán)境及刺激因子的作用下，可以轉(zhuǎn)化為成骨細胞、軟骨細胞、骨髓間質(zhì)細胞、脂肪細胞甚至肌細胞等。它是骨及軟骨組織損傷中的主要修復細胞，因而應用組織工程的方法將MSC帶到局部損傷部位可以作為一種非常有潛力的治療方法。用該種組織工程軟骨移植物修復關節(jié)軟骨缺損具有如下優(yōu)點(1)細胞來源方便，誘導前的MSCs為干細胞表現(xiàn)型，經(jīng)體外長期傳代增殖后，不丟失表現(xiàn)型及多潛能轉(zhuǎn)化活性。(2)屬于自體移植，沒有免疫原性。(3)誘導后的細胞除部分骨和軟骨細胞外，還含有較多的定向性骨和軟骨起源細胞，它具有在體內(nèi)發(fā)育成骨和軟骨的能力。(4)其軟骨形成過程是一個類似于胚胎的軟骨發(fā)育過程，有可能使軟骨缺損得到根本修復。因此應用MSC的在不同的培養(yǎng)條件下可分化為軟骨和骨組織的潛能，可以分別構建骨和軟骨組織，同時從臨床應用的角度來看，骨髓的采集相對簡單，損傷小的，費用低，具有很好的實用性。
支架材料的選擇也是影響組織工程組織構建效果的一個重要因素，支架材料分為天然的生物材料和合成材料，天然生物材料具有良好的生物相容性，但機械性能稍差。合成材料雖然具有良好的空隙率和可塑性功能，但生物相容性較差，細胞黏附性不好。一般認為良好的支架材料應該具有良好的生物相容性、可塑性及可降解性。I型膠原是天然的骨軟骨基質(zhì)成分，已在許多研究中被用于MSC的載體構建軟骨或修復關節(jié)軟骨缺損，結(jié)果顯示其可以給細胞提供黏附、分化、細胞外基質(zhì)分泌和軟骨組織形成的環(huán)境。脫鈣骨基質(zhì)是天然骨質(zhì)脫鈣后的成分，具有很好的支持成骨細胞生長和分泌骨基質(zhì)的能力，也顯示出支持MSC成骨的能力，具有良好的成軟骨效果。
目前已有很多研究者嘗試應用MSCs與各種支架材料復合在體內(nèi)外構建組織工程軟骨，取得了不同程度的修復效果。如王萬明，胡蘊玉.骨髓基質(zhì)細胞源性軟骨細胞修復兔全層關節(jié)軟骨缺損。中國修復重建外科雜志，2004，1858-62。但是應用組織工程軟骨復合物在軟骨損傷的修復還存在一個不容忽視的問題，那就是用于修復的組織工程軟骨復合物不易固定，很容易脫落，造成修復的不良，由于軟骨細胞的自身修復能力非常有限，因此限于軟骨層面的損傷基本不能修復。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種應用多潛能干細胞構建優(yōu)良的組織工程骨軟骨的方法，同時解決組織工程修復關節(jié)軟骨缺損方法中組織工程復合物容易脫落的難題。
由于深達軟骨下骨的損傷可以依靠骨髓中的間質(zhì)干細胞得到不同程度的修復。所以，我們設想用組織工程的方法分別構建骨和軟骨復合物，然后用一種黏性產(chǎn)物將這兩部分粘接起來，將成骨的部分做成一個楔子，插入損傷部位深處，使其可以牢固的固定在損傷局部，同時進行骨和軟骨的修復。I型膠原已在許多研究中被用于MSCs的載體去形成軟骨或修復關節(jié)軟骨缺損，結(jié)果顯示其可以給細胞提供黏附、分化、細胞外基質(zhì)分泌和軟骨組織形成的環(huán)境。脫鈣骨基質(zhì)也顯示出支持MSCs成骨的能力。
這種組織工程組織復合物構建的一個關鍵是如何在體內(nèi)移植和組織處理過程中連接不同的材料和維持完整的結(jié)構。用于這個目的的材料應該是可再吸收性的和生物相容性的，在最近的研究中，纖維蛋白原(FS)由于其生物來源和廣泛的臨床用途受到很多關注，F(xiàn)S的是模仿機體凝血機制的最后階段，液相的纖維蛋白原與凝血酶接觸后，在XIII因子的作用下，最終聚合成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構的纖維蛋白。由于其具有在一定條件下在液態(tài)和固態(tài)之間轉(zhuǎn)化的特點，具有良好的融合性以及在接種后6周可再吸收的特點，提示這種封閉劑作為兩種不同的生物材料的一種連接載體是適宜和有效的。
因此，我們將這兩種材料的優(yōu)勢結(jié)合起來構建骨和軟骨的復合物，來修復兔骨軟骨損傷。數(shù)據(jù)提示用MSC和支持軟骨和骨分化的不同的生物材料和生物反應因子來進行組織工程骨和軟骨復合物的構建是可行的。
應用淋巴細胞分離液密度梯度離心的方法體外分離和擴增骨髓多潛能干細胞(BMSCs)，當BMSCs第2-3代達到匯合后，消化，計數(shù)，按照3×107-6×107/100mm2的密度接種，分別用不同的軟骨和骨的誘導體系來進行初步的軟骨和骨起源的誘導。
取新西蘭兔髂骨、膝關節(jié)，進行一系列的脫鈣處理，制備脫鈣骨基質(zhì)；然后分別將脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿切成3×3×3mm-4×4×4mm大小，預先包被人纖維連接蛋白并干燥過夜。培養(yǎng)在不同誘導體系中的BMSCs分別接種到脫鈣骨基質(zhì)立方體和I型膠原中，接種了細胞的材料在構建復合物前置于培養(yǎng)箱中孵育1-2h。然后接種了細胞的支架表面直接用無菌醫(yī)用紗布擦干，按照修復的結(jié)構將兩種支架放于一個合適大小的模子中，中間留有縫隙，分別滴加5-10μl纖維蛋白溶液形成一個薄膜，然后再滴加等體積的凝血酶溶液中，讓這兩個成分之間發(fā)生反應在5-10秒中之內(nèi)形成凝膠。再將兩種支架細胞復合物輕輕的擠壓，促進這兩種材料緊密的接觸。這種復合移植物放于37℃，30min后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。制備兔關節(jié)軟骨缺損的模型，用構建的組織工程骨軟骨復合物進行修復治療。
本發(fā)明的有益效果是在膠原中形成了軟骨組織而在脫鈣骨基質(zhì)中形成了骨組織，在這兩種材料之間有膠原分泌來進行結(jié)構連接。實驗證明它在體內(nèi)關節(jié)滑液及力學環(huán)境的作用下，可迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓墓呛蛙浌羌毎⒎置诨|(zhì)，形成了與周圍關節(jié)軟骨無明顯差異的透明軟骨，促進了軟骨下骨板的早期形成，阻止或延緩了透明軟骨組織的退化。同時組織工程復合物在本實驗的12周觀察期內(nèi)，所形成的軟骨基本穩(wěn)定。


圖1.本發(fā)明的骨軟骨組織構建流程2.分離培養(yǎng)的BMSC圖3.軟骨誘導7天II型膠原染色圖4.軟骨誘導7天甲苯胺蘭染色圖5.成骨誘導7天堿性磷酸酶染色圖6.成骨誘導7天I型膠原免疫組化染色圖7.I型膠原支架圖8.脫鈣骨基質(zhì)支架圖9.實施例1支架對照組修復軟骨效果10.實施例1實驗組修復軟骨效果11.實施例1支架對照組修復軟骨甲苯胺蘭染色圖12.實施例1實驗組修復軟骨甲苯胺蘭染色圖13.實施例2支架對照組修復軟骨效果14.實施例2實驗組修復軟骨效果15.實施例2支架對照組修復軟骨甲苯胺蘭染色圖16.實施例2實驗組修復軟骨甲苯胺蘭染色圖17.實施例3支架對照組修復軟骨效果18.實施例3實驗組修復軟骨效果19.實施例3支架對照組修復軟骨甲苯胺蘭染色圖20.實施例3實驗組修復軟骨甲苯胺蘭染色圖21.實施例4支架對照組修復軟骨效果22.實施例4實驗組修復軟骨效果23.實施例4支架對照組修復軟骨HE染色圖24.實施例4實驗組修復軟骨HE染色具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明如圖1所示，本發(fā)明的組織工程骨軟骨復合物制備方法，包括以下步驟1)應用淋巴細胞分離液密度梯度離心的方法體外分離和擴增骨髓多潛能干細胞BMSCs，當BMSCs第2-3代達到匯合后，消化，計數(shù)，按照3×107-6×107/100mm2的密度接種，分別用不同的軟骨和成骨的誘導體系來進行初步的軟骨和骨起源的誘導；2)取新西蘭兔新鮮的髂骨、膝關節(jié)，進行脫鈣處理，制備脫鈣骨基質(zhì)；3)然后分別將脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿切成所需大小的立方體支架，預先包被人纖維連接蛋白并干燥過夜；4)將步驟1中培養(yǎng)在不同誘導體系中的BMSCs分別接種到步驟3中制備的脫鈣骨基質(zhì)支架和I型膠原支架中，接種了細胞的材料置于培養(yǎng)箱中孵育1-2h；5)將接種了細胞的支架表面直接用無菌醫(yī)用紗布擦干，按照修復的結(jié)構將兩種支架放于一個合適大小的模子中，中間留有縫隙，分別滴加5-10μl纖維蛋白溶液形成一個薄膜，然后再滴加等體積的凝血酶溶液中，讓這兩個成分之間發(fā)生反應，在5-10秒中之內(nèi)形成凝膠；6)將兩種支架細胞復合物輕輕的擠壓，促進這兩種材料緊密的接觸；這種復合移植物放于37℃，30min后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
下面對具體的實施例進行更詳細的說明實施例1應用間充質(zhì)干細胞制備組織工程軟骨修復關節(jié)軟骨缺損1)骨髓多潛能干細胞的體外分離和擴增經(jīng)骨髓穿刺抽取兔骨髓，應用密度梯度離心的方法用淋巴細胞分離液(比重1.077)分離單個核細胞，按照4×107/100mm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含60％的DMEM-LG/F/12，40％MCDB-201(Gibco)，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb(Peprotech)成分。置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～72小時后，棄除懸浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換液一次，至細胞長至80％匯合后，以含0.25％胰酶-0.1％EDTA 37℃消化細胞，計數(shù)，以3×104-5×104/cm2的密度接種細胞，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)及傳代。
2)軟骨起源細胞的誘導當MSC第一代達到匯合，消化，計數(shù)，按照5×103/mm2的密度培養(yǎng)于含10％胎牛血清，TGF-β1 10ng/ml，地塞米松100nmol/L，維生素C50μg/ml，胰島素10U/ml，牛血清白蛋白1.25mg/ml，脯氨酸40μg/ml，丙酮酸鹽100μg/ml的DMEM-LG培養(yǎng)體系中，每3天換液1次，14d后收集細胞接種到I型膠原海綿材料上用于軟骨組織的構建。
3)I型膠原海綿的準備清華大學材料系制備。75％乙醇消毒備用，使用前以無菌生理鹽水清洗3次，每次10min，風干后應用。
4)體外軟骨復合移植物的構建I型膠原海綿切成3×3×3mm大小，MSC用滴加的方法分別接種到I型膠原中，這種接種了細胞的材料在構建復合物前置于培養(yǎng)箱中37℃，2小時后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
5)動物模型的制備5個月齡的日本大耳白兔36只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg，平均分為2組，每組18只。于股骨髁部滑車槽內(nèi)鉆孔，直徑3mm，深6mm，深達軟骨下骨。用無菌PBS液沖洗缺損部位，將培養(yǎng)的軟骨細胞復合物來填充，用纖維蛋白封閉劑封閉創(chuàng)面四周，A組為移植上述制備的組織工程軟骨移植物組，B組為移植無細胞的單純載體對照組。修復12周后的大體和甲苯胺蘭染色圖片見圖9-12，可見對照組缺損沒有修復，顯示明顯的圓形缺損外觀，骨質(zhì)裸露或以少量纖維組織覆蓋缺損。實驗組沒有見到明顯的軟骨修復，缺損邊緣清晰可見，表層為纖維組織而且向宿主兩端延伸，缺損出底端有海綿狀骨生成。兩組修復效果沒有明顯差別。
實施例2應用骨髓間充質(zhì)干細胞制備組織工程骨軟骨復合物修復關節(jié)軟骨缺損1)骨髓多潛能干細胞的體外分離和擴增經(jīng)骨髓穿刺抽取兔骨髓，淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，按照5×107/100mm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含60％的DMEM-LG/F/12，40％MCDB-201(Gibco)，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb(Peprotech)成分。置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天后，棄除懸浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換液一次，至細胞長至80％匯合后，以含0.25％胰酶-0.1％EDTA 37℃消化細胞，計數(shù)，以3×104-5×104/cm2的密度接種細胞，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)及傳代。
2)軟骨起源細胞的誘導當MSC第一代達到匯合，消化，計數(shù)，按照5×103/mm2的密度培養(yǎng)于含10％胎牛血清，TGF-β1 10ng/ml，地塞米松100nmol/L，維生素C50μg/ml，胰島素10U/ml，牛血清白蛋白1.25mg/ml，脯氨酸40μg/ml，丙酮酸鹽100μg/ml的DMEM-LG培養(yǎng)體系中，每3天換液1次，14d后收集細胞接種到I型膠原海綿材料上用于軟骨組織的構建。
3)骨起源細胞的誘導當BMSC第2-3代達到匯合后，消化，計數(shù)，按照5×103/mm2的密度培養(yǎng)在含有100nm地塞米松，10nmβ-磷酸甘油，和0.05mM的V-C，10％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)體系中，每周換液2次。7d后收集細胞接種于脫鈣骨基質(zhì)中用于構建組織工程骨。
4)脫鈣骨基質(zhì)的制備新西蘭兔髂骨、膝關節(jié)取材，去凈周圍軟組織、骨膜及表面軟骨，預冷生理鹽水沖洗骨髓腔，徹底去除殘存骨髓和血塊。然后進行如下處理①25℃，1∶1氯仿2甲醇1h；②4℃，0.6mmol/L鹽酸72h；③4℃，2mmol/L氯化鈣1h；④4℃，0.5mmol/L EDTA 1h；⑤4℃，8mmol/L氯化鋰1h；⑥55℃，水浴4h。每步完成后，均以預冷蒸餾水漂洗3次，每次10min。標本凍干，75％乙醇消毒備用。使用前以無菌生理鹽水清洗3次，每次10min，風干后應用。
5)I型膠原海綿的準備清華大學材料系制備。75％乙醇消毒備用，使用前以無菌生理鹽水清洗3次，每次10min，風干后應用。
6)體外骨和軟骨復合移植物的構建脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿被切成合適大小。培養(yǎng)在不同誘導體系中的BMSC用滴加的方法分別接種到脫鈣骨基質(zhì)立方體和I型膠原中，接種了細胞的材料在構建復合物前置于培養(yǎng)箱中37℃，2h。接種了細胞的支架表面直接用無菌醫(yī)用紗布擦干，少量的纖維蛋白溶液覆蓋于支架表面，形成一個薄膜，等體積的凝血酶溶液繼而滴加于纖維蛋白層上，這兩個成分之間發(fā)生反應在幾秒中之內(nèi)形成凝膠。I型膠原海綿繼而放于這個凝膠中，輕輕的擠壓促進這兩種材料緊密的接觸。這種復合移植物放于37℃，30min后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
7)動物模型的制備5個月齡的日本大耳白兔36只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg，平均分為3組，每組12只。于股骨髁部滑車槽內(nèi)鉆孔構建關節(jié)軟骨缺損模型，用無菌PBS液沖洗缺損部位，將培養(yǎng)的骨軟骨細胞復合物來填充，成骨端插入骨軟骨損傷的深部，成軟骨端在外部，與正常關節(jié)組織結(jié)構相吻合。A組為移植上述制備的組織工程軟骨移植物組，B組為移植無細胞的單純載體對照組。修復12周后的大體及組織學染色圖片見圖13-16，可見對照組缺損沒有修復，顯示明顯的圓形缺損外觀，缺損表面不規(guī)則，填充處主要為纖維組織填充。實驗組可見缺損有部分修復，但仍可見明顯缺損，表層外周有少量軟骨形成，但軟骨細胞排列不規(guī)則，中間以纖維組織覆蓋。
實施例3應用骨髓間充質(zhì)干細胞制備組織工程骨軟骨復合物修復關節(jié)軟骨缺損1)采用實施例2制備的軟骨和骨起源細胞。
2)采用實施例2制備的軟骨和骨支架材料。
3)體外骨和軟骨復合移植物的構建脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿被切成合適大小。培養(yǎng)在不同誘導體系中的BMSC用滴加的方法分別接種到脫鈣骨基質(zhì)立方體和I型膠原中，接種了細胞的材料在構建復合物前置于培養(yǎng)箱中37℃，2h。接種了細胞的支架表面直接用無菌醫(yī)用紗布擦干，按照修復的結(jié)構將兩種支架放于一個合適大小的模子中，中間留有2-4mm的縫隙，分別滴加7μl纖維蛋白溶液，使其形成一個薄膜，然后再滴加等體積的凝血酶溶液中，讓這兩個成分之間發(fā)生反應在5-10秒中之內(nèi)形成凝膠。然后將兩種支架細胞復合物輕輕的擠壓，促進這兩種材料的接觸。將這種復合移植物放于37℃，30min后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
4)采用實施例2制備的動物模型。修復12周后的大體及組織學圖片見圖17-20，可見對照組缺損沒有修復，顯示明顯的圓形缺損外觀，底部被纖維組織填充，實驗組可見缺損有大部分修復，但仍可見較為明顯缺損，缺損表層有薄層軟骨形成，未形成軟骨下骨板，底部有少量海綿狀骨生成。說明實驗組達到部分修復效果。
實施例4應用骨髓間充質(zhì)干細胞制備組織工程骨軟骨復合物修復關節(jié)軟骨缺損1)骨髓多潛能干細胞的體外分離和擴增經(jīng)骨髓穿刺抽取兔骨髓，淋巴細胞分離液(比重1.077)分離單個核細胞，按照5×107/100mm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含60％的DMEM-LG/F/12，40％MCDB-201，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb等成分。置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～72小時后，棄除懸浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換液一次，至細胞長至80％匯合后，以含0.25％胰酶-0.1％EDTA37℃消化細胞，計數(shù)，以3×104-5×104/cm2的密度接種細胞，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)及傳代。體外培養(yǎng)的BMSC見圖2，可見細胞呈梭形，呈渦旋樣生長。
2)軟骨起源細胞的誘導當BMSCs第一代達到匯合，消化，計數(shù)，按照5×103/mm2的密度培養(yǎng)于含有TGF-β1 10ng/ml，地塞米松100nmol/L，維生素C50μg/ml，胰島素10U/ml，牛血清白蛋白1.25mg/ml，脯氨酸40μg/ml，丙酮酸鹽100μg/ml的含10％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)體系中，每3天換液1次，7d后收集細胞接種到I型膠原海綿材料上用于軟骨組織的構建。誘導7天的BMSC見圖3，圖4，可見誘導后細胞免疫組化染色顯示II型膠原分泌陽性，并分泌軟骨細胞特異性的甲苯胺蘭異染性的糖胺多糖。
3)骨起源細胞的誘導消化第1代BMSCs細胞，培養(yǎng)在含有100nmol/L地塞米松，10nmol/L β-磷酸甘油，和0.05mol/L的V-C，含10％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)體系中，每周換液2次。7d后收集細胞接種于脫鈣骨基質(zhì)中用于構建組織工程骨。誘導7天的BMSC見圖5，圖6，可見誘導后的細胞堿性磷酸酶染色陽性，并表達成骨細胞特異性的I型膠原。
4)脫鈣骨基質(zhì)的制備新西蘭兔髂骨、膝關節(jié)取材，去凈周圍軟組織、骨膜及表面軟骨，預冷生理鹽水沖洗骨髓腔，徹底去除殘存骨髓和血塊。然后進行如下處理①25℃，1∶1氯仿2甲醇1h；②4℃，0.6mmol/L鹽酸72h；③4℃，2mmol/L氯化鈣1h；④4℃，0.5mmol/L EDTA 1h；⑤4℃，8mmol/L氯化鋰1h；⑥55℃，水浴4h。每步完成后，均以預冷蒸餾水漂洗3次，每次10min。標本凍干，75％乙醇消毒備用。使用前以無菌生理鹽水清洗3次，每次10min，風干后應用。制備的脫鈣骨基質(zhì)材料見圖7。
5)I型膠原海綿的準備清華大學材料系制備。75％乙醇消毒備用，使用前以無菌生理鹽水清洗3次，每次10min，風干后應用。制備的I型膠原海綿見圖8。
6)體外骨和軟骨復合移植物的構建脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿被切成3×3×3mm大小，預先包被人纖維連接蛋白(100μl/ml)并干燥過夜。培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基中的MSC用抽真空的方法分別接種到脫鈣骨基質(zhì)立方體和I型膠原中，每毫克脫鈣骨基質(zhì)黏附接近2500個細胞，而每毫克I型膠原海綿黏附3600-4500個細胞，這種接種了細胞的材料在構建復合物前置于培養(yǎng)箱中37℃，2h。纖維蛋白封閉劑是一種商業(yè)產(chǎn)品，由兩種組分構成，纖維蛋白溶液(75-115mg/ml纖維蛋白原和3000U/mL纖維蛋白融解抑制劑)和凝血酶溶液(500U凝血酶和40μmol/L)的氯化鈣)。接種了細胞的支架表面直接用無菌醫(yī)用紗布擦干，按照修復的結(jié)構將兩種支架放于一個合適大小的模子中，中間留有2-4mm的縫隙，分別滴加7μl纖維蛋白溶液形成一個薄膜，然后再滴加等體積的凝血酶溶液中，讓這兩個成分之間發(fā)生反應在幾秒中之內(nèi)形成凝膠。然后將兩種支架細胞復合物輕輕的擠壓，促進這兩種材料緊密的接觸。這種復合移植物放于37℃，30min后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
7)動物模型的制備5個月齡的日本大耳白兔36只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg，平均分為2組，每組18只。于股骨髁部滑車槽內(nèi)鉆孔，直徑3mm，深6mm，深達軟骨下骨。用無菌PBS液沖洗缺損部位，將培養(yǎng)的骨軟骨細胞復合物來填充，成骨端插入骨軟骨損傷的深部，成軟骨端在外部，與正常關節(jié)組織結(jié)構相吻合。A組為移植上述制備的組織工程軟骨移植物組，B組為移植無細胞的單純載體對照組。修復12周后的大體圖片見圖21-22，可見對照組缺損沒有修復，顯示明顯的圓形缺損外觀。實驗組缺損表面已被一層薄薄的軟骨膜修復，修復組織與正常組織連接，沒有炎性組織增生，厚度稍薄于正常軟骨。修復后組織切片HE染色見圖23-24，對照組仍有很大缺損沒有修復，缺損內(nèi)充滿了纖維組織，以纖維組織修復為主。實驗組可見典型的透明軟骨，軟骨下骨厚度接近正常，新生軟骨與正常軟骨結(jié)合密切，軟骨細胞呈串狀排列，可見軟骨陷窩。但顯微鏡下仍可見修復的關節(jié)軟骨表面有微小凹陷。
當然，通過上面的動物實驗證明在膠原中形成了軟骨組織而在脫鈣骨基質(zhì)中形成了骨組織，在這兩種材料之間有膠原分泌來進行結(jié)構連接。本結(jié)果也可用于人的組織工程骨軟骨復合物制備。
權利要求
1.一種組織工程骨軟骨復合物制備方法，包括以下步驟1)應用淋巴細胞分離液密度梯度離心的方法體外分離和擴增骨髓多潛能干細胞BMSCs，當BMSCs第2-3代達到匯合后，消化，計數(shù)，按照3×107-6×107/100mm2的密度接種，分別用不同的軟骨和成骨的誘導體系來進行初步的軟骨和骨起源的誘導；2)取新西蘭兔新鮮的髂骨、膝關節(jié)，進行脫鈣處理，制備脫鈣骨基質(zhì)；3)然后分別將脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿切成所需大小的立方體支架，預先包被人纖維連接蛋白并干燥過夜；4)將步驟1中培養(yǎng)在不同誘導體系中的BMSCs分別接種到步驟3中制備的脫鈣骨基質(zhì)支架和I型膠原支架中，接種了細胞的材料置于培養(yǎng)箱中孵育1-2h；5)將接種了細胞的支架表面直接用無菌醫(yī)用紗布擦干，按照修復的結(jié)構將兩種支架放于一個合適大小的模子中，中間留有縫隙，分別滴加5-10μl纖維蛋白溶液形成一個薄膜，然后再滴加等體積的凝血酶溶液中，讓這兩個成分之間發(fā)生反應，在5-10秒中之內(nèi)形成凝膠；6)將兩種支架細胞復合物輕輕的擠壓，促進這兩種材料緊密的接觸；這種復合移植物放于37℃，30min后用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
2.根據(jù)權利要求1所述的組織工程骨軟骨復合物制備方法，其特征在于步驟1中所述的軟骨的誘導體系是DMEM-LG培養(yǎng)液，其中含10％胎牛血清，TGF-β1 10ng/ml、地塞米松100nmol/L、維生素C 50μg/ml、胰島素10U/ml、牛血清白蛋白1.25mg/ml、脯氨酸40μg/ml、丙酮酸鹽100μg/ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的組織工程骨軟骨復合物制備方法，其特征在于步驟1中所述的成骨的誘導體系是100nmol/L的地塞米松，10nmol/L β-磷酸甘油，0.05mol/L維生素C和10％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權利要求1所述的組織工程骨軟骨復合物制備方法，其特征在于所述的脫鈣骨基質(zhì)和I型膠原海綿的支架立方體為3×3×3mm-4×4×4mm。
5.根據(jù)權利要求1所述的組織工程骨軟骨復合物制備方法，其特征在于所述的留有縫隙為2-4mm。
6.權利要求1所制備的骨軟骨復合物，用于關節(jié)軟骨缺損的修復。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織工程骨軟骨復合物制備方法及其應用，用組織工程的方法分別構建骨和軟骨復合物，然后用一種黏性產(chǎn)物將這兩部分粘接起來，將成骨的部分做成一個楔子，插入損傷部位深處，使其可以牢固的固定在損傷局部，同時進行骨和軟骨的修復。本發(fā)明是一種應用多潛能干細胞構建優(yōu)良的組織工程骨軟骨的方法，同時可以解決組織工程修復關節(jié)軟骨缺損方法中組織工程復合物容易脫落的難題。
文檔編號A61B17/56GK1954890SQ20051001557
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權日2005年10月24日
發(fā)明者葛薇, 李長虹 申請人:中國醫(yī)學科學院血液學研究所