專利名稱：雞胚胎素的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胚胎素的制備方法，特別是涉及一種具有較高生物活性的雞胚胎素的制備方法。
二.
背景技術：
雞胚胎素是一組具有高生物活性的生長刺激因子、神經生長因子、活性多糖、活性多肽、多種氨基酸和豐富的其他營養(yǎng)物質的小分子混合物，它們具有促生長和活化生理功能的精華成分，能激活人體組織細胞，活化組織器官功能，調節(jié)人體各種免疫力，提高人體抵抗疾病的能力，并可延緩衰老，其中所含的生長刺激因子可以增加皮膚含水量、促進上皮細胞的新陳代謝，經過一定時間的應用，可延緩真皮層衰老、萎縮，使皮膚真皮層飽滿，并可增加表皮含水量，使表皮光滑滋潤。
雞胚胎素的主要原料是雞胚胎，是用受精雞蛋(即雞受精卵)，通過人工或雞本身的孵化而培育出來的一種動物胚胎。根據《雞胚發(fā)育圖譜》(蔣唏東著、科學出版社1983年出版)中介紹了雞胚胎的發(fā)育過程“一日起了珠，魚眼黃中游；二日‘櫻桃’起，心臟開始動；三日血管成，‘蚊子’在黃中；四日定了位，樣似小蜘蛛，五日長軟骨，眼部顯單珠；六日胎盤動，頭尾成雙珠；七日離了殼，沉入蛋白中；八日邊口硬，胎在蛋中游；九日嘴不分，頭尾來回動；十日顯毛管，血管始加粗；十一腹毛全，尿囊全合攏；十二毛長齊，上下鶚分明；直到二一小雞出”，雞受精卵在短短的21天內即可由一個單細胞發(fā)育成為一個成熟的小雞個體，在此期間雞受精卵發(fā)生了巨大的變化，在此變化過程中伴隨產生大量的生長刺激因子、神經生長因子、活性多糖、活性多肽、多種氨基酸和豐富的其他營養(yǎng)物質，借以支持新生生命個體的生長和發(fā)育。
雞胚胎在血管全部形成后，似肉非肉，似蛋非蛋，是營養(yǎng)最高的活性胚胎，自古以來被稱為“大眾的補養(yǎng)品”，它含有豐富的蛋白質、人體所需的十八種氨基酸、維生素和對人體有益的微量元素。雞胚胎的食療價值雖然很高，但人們的食用方法卻很不科學，雞胚胎的來源往往是從雞蛋孵化過程中被清理下來的死胎蛋、死毛蛋，棄之可惜，廢物利用，比如將死胚胎(即毛蛋)煮著吃，有的還加上中藥煮著吃用于治病、防病，還有人將它加工成罐頭。據測定，死胎蛋和死毛蛋幾乎百分之百可查出大腸桿菌、葡萄球菌等病菌，不宜食用，于是人們便將目光投向了制備雞胚胎素的研究上。中國發(fā)明專利CN 1226401A，申請?zhí)枮?8100528.4，發(fā)明名稱為“‘鳳凰胎’保健食品及其制作方法”中就公開了一種以鮮活的雞胚胎、蛋黃為主要原料的保健食品，它是由活的、胚齡為7～9日的雞胚胎、蛋黃填加一定比例的蒸餾水和適量鹽，攪拌、蒸煮、定量分裝、封蓋、殺菌、包裝而成；中國發(fā)明專利CN 1324625A，申請?zhí)枮?0107555.1，發(fā)明名稱為“雞胚胎精華素的制作方法”中就公開了一種雞胚胎素的制備工藝，它是將活性雞胚胎加中藥轉化成為液體，通過濃縮所得到的精華素系列產品。這兩種專利方法以及現(xiàn)有其他技術制備的胚胎類制劑，多采用常溫分離提取方法，所提取的有效成分只是氨基酸、微量元素等所謂的“營養(yǎng)物質”，由于在室溫的溫度下，甚至酶解、高溫消毒等方法，多肽、蛋白質大多因空間結構破懷、鏈斷裂、酶水解等因素而失去活性，從而成為“死物質”。目前還沒有可以保持較高生物活性的雞胚胎素的有關技術的報道。
三.

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種采用低溫生產過程和現(xiàn)代生物分離技術來保持較高生物活性的雞胚胎素的制備方法。
本發(fā)明的技術方案是一種雞胚胎素的制備方法，包括雞受精卵的精選和孵化，包括下列步驟a.精選雞受精卵，表面常規(guī)去污，依常規(guī)孵化方法孵化10～13天；
b.將孵化好的受精卵表面進行常規(guī)消毒，去除蛋殼取出雞胚胎，在≤4℃的溫度條件下將雞胚胎粉碎；c.將粉碎后的雞胚胎加入3～5倍雞胚胎體積的無菌純水進行打漿；d.將打成漿的雞胚胎在-26～-28℃的溫度條件下進行反復凍融；e.將反復凍融的雞胚胎漿在≤4℃溫度條件下倒入離心機中，在3000～10000轉/分的轉速條件下離心10～30分鐘，獲取上清夜；f.將上清液過截留分子量在800000道爾頓以上的超濾柱，得超濾液；g.將超濾液冷凍干燥后得到類白色疏松團塊狀物質，即為所述的雞胚胎素，或將上述超濾液經超濾濃縮后直接無菌分裝保存，即為雞胚胎素溶液；h.在相對濕度小于30％的環(huán)境中，將所得到的雞胚胎素或雞胚胎素溶液置入密閉容器中進行避光保存，以備用。
所述的精選雞受精卵是選用蛋用型雞雞蛋，產后3～7天以內，蛋重在110～120克，外形規(guī)則、無損傷。
所述的常規(guī)孵化方法是①.孵化溫度第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②.孵化濕度相對濕度為60％左右；③.通風換氣保持孵蛋箱空氣中的氧含量在21％以上；④.翻蛋每1～2小時翻蛋1次；⑤.孵化至11～13天，取出孵化蛋后去除蛋殼取出雞胚胎。
所述粉碎雞胚胎的方法是將新鮮雞胚胎置于低溫冰柜中，在雞胚胎中間放置溫度傳感器探頭，當所有樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍0.5～5小時，然后使用粉碎機械將其粉碎至40～100目。
所述的打漿方法是將粉碎后的雞胚胎在適當?shù)娜萜髦屑尤?～5倍體積預冷至0～4℃的無菌注射用水，在60～80轉/分的攪拌速度下攪拌5～10分鐘。
所述的反復凍融方法是將打漿后的雞胚胎漿置于-30℃的低溫冰柜中，將樣品冷凍至-26～-28℃后，冰凍0.5～5小時，然后置于室溫條件下自然融化至冰水共存時，再置于-30℃低溫冰柜，將樣品冷凍至-26～-28℃，冰凍0.5～5小時，如此反復凍融3～5次。
所述的超濾方法是將離心后的雞胚胎漿上清液過截分子量800000道爾頓以上的中空纖維超濾器，留取分子量大于800000道爾頓部分的成分，獲得分子量小于等于800000道爾頓的超濾液。
所述的超濾液冷凍干燥的方法是將所得到的超濾液置于無菌不銹鋼托盤中，裝料厚度≤1.5厘米，放入預先消毒、預冷后的凍干機凍干艙內，調節(jié)凍干參數(shù)，將上述超濾液均勻冷凍至-40℃以下，然后依次開動凍干機真空系統(tǒng)中的真空泵和羅茨泵，調節(jié)真空度在6.5～13Pa以下，保持2～3小時，然后開動凍干機中的加熱系統(tǒng)，加熱過程中注意并保持真空度在6.5～13Pa以下，加熱時物料最高溫度不得超過35℃，當加熱至物料溫度穩(wěn)定在35℃，真空度穩(wěn)定在8Pa以下時，保持1～3小時，即可關機、出料，所得到的黃白色疏松團塊狀物即為雞胚胎素。
所述的雞胚胎素填加醫(yī)學上的常規(guī)輔料制成片劑，或膠囊，或軟膠囊，或口服液，或美容化妝品，或保健品。
本發(fā)明的積極有益效果是1.本發(fā)明的雞胚胎素的制備方法，保持了雞胚胎中的各種生物活性物質?，F(xiàn)有其他技術制備的胚胎類制劑，多采用常溫分離提取方法，所提取的有效成分只是氨基酸、微量元素等所謂的“營養(yǎng)物質”，由于在室溫的溫度下，甚至酶解、高溫消毒等方法，多肽、蛋白質大多因空間結構破懷、鏈斷裂、酶水解等因素而失去活性，從而成為“死物質”，由于采用了低溫生產過程和現(xiàn)代生物分離技術，不但保留了雞胚胎中的各種營養(yǎng)物質，還保留了雞胚胎中各種生物活性物質，所生產的雞胚胎素是“活物質”，不但營養(yǎng)機體，還能促進機體組織的代謝，對機體的免疫起到調節(jié)作用。
2.本發(fā)明雞胚胎素的制備方法所獲得的雞胚胎素是一組具有高生物活性的生長刺激因子、神經生長因子、活性多糖、活性多肽、多種氨基酸和豐富的其他營養(yǎng)物質的小分子混合物，它們具有促生長和活化生理功能的精華成分，能激活人體組織細胞，活化組織器官功能，調節(jié)人體各種免疫力，提高人體抵抗疾病的能力，并可延緩衰老，其中所含的“尿囊素”和生長刺激因子可以增加皮膚含水量、促進上皮細胞的新陳代謝，經過一定時間的應用，可延緩真皮層衰老、萎縮，使皮膚真皮層飽滿，并可增加表皮含水量，使表皮光滑滋潤。由于采用了低溫生產過程和現(xiàn)代生物分離技術保持了較高生物活性，所獲得的高生物活性雞胚胎素可以被廣泛用于制備高活性生物藥品、功能性食品和化妝品等行業(yè)。
3.本發(fā)明雞胚胎素的制備方法所獲得的雞胚胎素具有較好的抗氧化能力，能顯著地提高D-半乳糖亞急性衰老模型小鼠血液中SOD的活性，降低血清中MDA濃度，抑制肝臟脂褐素的形成。
4.本發(fā)明雞胚胎素的制備方法所獲得的雞胚胎素能顯著改善或調整衰老細胞的新陳代謝，提高細胞的生命力，延緩機體和皮膚衰老的進程。
A.本發(fā)明雞胚胎素的制備方法所獲得的雞胚胎素的理化性質與質量標準1.來源雞胚胎素是從雞受精卵常規(guī)孵化10～13天的雞胚胎中，采用低溫提取、分離方法所得到的分子量小于10×106的蛋白、多肽、氨基酸、調節(jié)機體生長的激素、常量與微量元素等等。
2.性狀2.1.凍干雞胚胎素粉類白色、微黃粉末，有引濕性，有雞胚胎特殊氣味；液體雞胚胎素黃色或微黃色澄明液體，有雞胚胎特殊氣味。
2.2.本品溶于水，不溶于各種有機溶劑。
3.鑒別取凍干雞胚胎素粉約10mg，用50ml蒸餾水溶解，或取雞胚胎素溶液適量，稀釋至0.2mg/ml，此兩種溶液作為待測樣品溶液。
3.1.取待測樣品溶液1ml與pH5.0，0.2mol/L檸檬酸緩沖液充分混合，然后加茚三酮試劑1ml，充分混合，100℃加熱10min，應顯藍紫色。
3.2.取待測樣品溶液適量，用紫外分光光度計進行波長—吸收度掃描，在280nm附近應有最大吸收峰。
4.重金屬含量4.1.重金屬含量(ppm)≤204.2.砷鹽含量(ppm)≤25.干燥失重取凍干雞胚胎素粉0.5g，精密稱定，在P2O5存在下減壓(2.67～5.34Pa)干燥24h后再精密稱定，減失重量不得超過4％。
6.含量測定取凍干雞胚胎素粉或雞胚胎素液體適量，用微量凱氏定氮法測定含氮量，換算為蛋白含量，應大于標示量的90％。
7.微生物檢查7.1.細菌數(shù)每1g凍干雞胚胎素粉內細菌數(shù)＜1000個；每1ml雞胚胎素原液內細菌數(shù)＜100個/ml7.2.酵母菌每1g凍干雞胚胎素粉內霉菌、酵母菌＜100個/g；每1ml雞胚胎素原液內霉菌、酵母菌＜100個/ml7.3.大腸埃希不得檢出/g(固體)，或不得檢出/ml(液體)7.4.大腸菌群＜100個/g(固體)大腸菌群＜10個/ml(液體)8.活性測定8.1.取昆明種小鼠30只，雌雄各半，體重16～18g，隨機分為三組，第一組(雞胚胎素組)小鼠每日以10.0g/kg劑量灌服雞胚胎素，第二組(模型組)和第三組(正常組)小鼠均灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃14天。于給雞胚胎素第10天開始，第一、二組小鼠腹腔注射60mg/kg的環(huán)磷酰胺(Cy)，連續(xù)4天，第三組小鼠同途徑注射等量生理鹽水作為空白對照。于最后一天灌胃和注射Cy2小時后，處死動物，稱體重，迅速剖取胸腺、脾臟組織，用濾紙吸去其表面附著的血液，立即在精密扭力天平上稱其濕重，以每10g體重對胸腺和脾臟的mg數(shù)作為胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，比較雞胚胎素組與模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，雞胚胎素組應比模型組的胸腺指數(shù)高出20％以上，雞胚胎素組應比模型組的脾臟指數(shù)高出30％以上。
8.2.取小鼠30只，雌雄各半，隨機分為雞胚胎素組、模型組和正常組。前兩組動物每日每鼠頸背皮下注射5％D-半乳糖0.5ml，后者同途徑注射等體積生理鹽水，作為空白對照，連續(xù)注射10天。于第11天開始(繼續(xù)注射D-半乳糖)，雞胚胎素組小鼠按體重10g/kg灌服雞胚胎素，模型組和正常組均灌服等體積生理鹽水，再連續(xù)給藥和造模30天。末次灌胃和注射D-半乳糖2小時后，稱體重，眼眶取血，按照SOD、MDA試劑盒操作要求測定血液SOD、MDA。雞胚胎素組小鼠血液SOD平均活性應比模型組高20％以上；雞胚胎素組小鼠血液MDA平均水平應比模型組低30％以上。
B.雞胚胎素美容抗衰老調節(jié)免疫的實驗研究雞胚胎素具有補腎填精、益氣健脾、補血養(yǎng)血、美容養(yǎng)顏、提高處于抑制狀態(tài)的免疫能力等功效。采用人工衰老動物模型，觀察雞胚胎素對某些衰老指標、免疫調節(jié)的影響。
1.實驗材料1.1.藥物與試劑雞胚胎素，符合研究者提出的質量標準；四乙氧基丙烷(TAP)，瑞士FluKa產品；SOD，MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；D-半乳糖(D-gal)及其余試劑均為市售國產生化試劑或分析純化學試劑。
1.2.動物健康昆明種小鼠，體重20±2g，雌雄各半，由河南醫(yī)科大學動物實驗中心提供。
2.方法與結果2.1.D-半乳糖亞急性衰老模型制作法取小鼠30只，雌雄各半，隨機分為雞胚胎素組、模型組和正常組。前兩組動物每日每鼠頸背皮下注射5％D-半乳糖0.5ml，后者同途徑注射等體積生理鹽水，作為空白對照，連續(xù)注射10天。于第11天開始(繼續(xù)注射D-半乳糖)，雞胚胎素組小鼠按體重5g/kg灌服雞胚胎素，模型組和正常組均灌服等體積生理鹽水，再連續(xù)給藥和造模30天。末次灌胃和注射D-半乳糖2小時后，稱體重，眼眶取血，用于生化測定；取肝臟稱重，制作勻漿，備用；剝離皮膚和尾腱，備用。
2.2.血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定SOD測定按照試劑盒說明書操作要求及計算方法進行，詳細結果參見表1表1雞胚胎素對衰老模型小鼠血液中SOD活性的影響(x±s)

與模型組比較**P＜0.01由表1可知，雞胚胎素可明顯升高小鼠血液中SOD的活力，與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)，其上升率達22.75％。
2.3.血清丙二醛(MDA)測定眼眶取血，分離血清，按照試劑盒說明書操作要求及計算方法進行，詳細結果參見表2
表2雞胚胎素對衰老模型小鼠血清中MDA含量的影響(x±s)

與模型組比較**P＜0.01結果顯示，模型組小鼠血清中MDA含量顯著高于正常組水平(P＜0.01)，經口服雞胚胎素40天后，血清中MDA含量明顯下降(P＜0.01)，說明雞胚胎素對MDA的形成有明顯的抑制作用。
2.4.肝臟脂褐素(LF)含量的測定以氯仿—甲醇(2∶1)制備肝勻漿，參照Sohal等人方法用熒光分光光度計在激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長430nm處測其熒光值，以硫酸奎寧作為標準對照，計算其LF的含量，詳細結果參見表3表3雞胚胎素對衰老模型小鼠肝臟LF含量的影響(x±s)

與模型組比較**P＜0.01結果說明，模型組小鼠與正常組比較，其肝臟脂褐素含量顯著上升(P＜0.01)，而經口服雞胚胎素40天后，其脂褐素含量下降明顯(P＜0.01)，可見，雞胚胎素具有抑制脂褐素形成的作用。
2.5.皮膚和尾腱中羥脯氨酸含量的測定取小鼠的皮膚或尾腱，剪碎，混合。精密稱取10mg，以6MHCl溶解制成樣品液，在721分光光度計561nm波長處測錄OD值，羥脯氨酸含量以每百毫克組織所含羥脯氨酸毫克數(shù)表示，詳細結果參見表4
表4雞胚胎素對衰老模型小鼠皮膚和尾腱中羥脯氨酸含量的影響(x±s)

與模型組比較**P＜0.01結果表明，雞胚胎素組與模型組比較，皮膚和尾腱中羥脯氨酸含量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，提示雞胚胎素能顯著增加羥脯氨酸含量和皮膚的彈性。
2.6.對免疫功能低下小鼠免疫器官重量的影響取昆明種小鼠30只，雌雄各半，體重16～18g，隨機分為三組，第一組(雞胚胎素組)小鼠每日以5.0g/kg劑量灌服雞胚胎素，第二組(模型組)和第三組(正常組)小鼠均灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃14天，在給雞胚胎素第10天開始，第一、二組小鼠腹腔注射60mg/kg的環(huán)磷酰胺(Cy)，連續(xù)4天，第三組小鼠同途徑注射等量生理鹽水作為空白對照。于最后一天灌胃和注射Cy2小時后，處死動物，稱體重，迅速剖取胸腺、脾臟組織，用濾紙吸去其表面附著的血液，立即在精密扭力天平上稱其濕重，詳細結果參見表5表5雞胚胎素對免疫功能低下小鼠免疫器官重量的影響(x±s)、(n＝10)

與Cy組比較**P＜0.01從表5可知，雞胚胎素組與Cy組比較，其胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯升高(P＜0.01，P＜0.01)，說明雞胚胎素對于環(huán)磷酰胺造成的免疫器官重量及其免疫功能下降具有明顯的改善作用。
2.7.對血虛模型小鼠紅細胞及血紅蛋白的影響取昆明種小鼠20只，體重18～22g，雌雄各半，隨機分為二組，先測出各鼠給藥前紅細胞(RBC)和血紅蛋白(Hb)值，然后尾部放血法造成失血性血虛模型(RBC、Hb均明顯低于正常值)后，分別每天灌胃雞胚胎素或生理鹽水，連續(xù)給藥14天，末次給雞胚胎素2小時后，尾部采血測RBC和Hb值，詳細結果參見表6表6雞胚胎素對血虛模型小鼠紅細胞和血紅蛋白的影響(x±s)

與生理鹽水比較**P＜0.01由表6可看出，服用雞胚胎素14天后的血虛小鼠RBC和Hb值顯著高于生理鹽水組(P均＜0.01)，說明本品具有較好的補血作用。
3.結論與討論3.1.本實驗證明雞胚胎素具有較好的抗氧化能力，能顯著地提高D-半乳糖亞急性衰老模型小鼠血液中SOD的活性，降低血清中MDA濃度，抑制肝臟脂褐素的形成。結果提示雞胚胎素能顯著改善或調整衰老細胞的新陳代謝，提高細胞的生命力，延緩機體和皮膚衰老的進程。脂褐素(LF)和MDA是體內自由基反應的老化產物，它們隨著年齡的增長而增加，超氧化物歧化酶(SOD)則是機體清除自由基的主要酶類，它隨著年齡增長而活性降低，因此兩者均是人類衰老的重要生化指標之一。此外，自由基還是引起皮膚膠原聚合、降低彈性等衰老的重要原因。
3.2.本實驗結果表明，連續(xù)給小鼠皮下注射大劑量D-半乳糖40天，可使小鼠皮膚和尾腱中的羥脯氨酸顯著低于正常小鼠，經服用雞胚胎素后其羥脯氨酸含量明顯回升，這提示雞胚胎素具有防止皮膚衰老的作用，這可能與提高膠原蛋白含量、增加皮膚彈性的作用有關?，F(xiàn)代研究證實，隨著增齡，機體內膠原蛋白溶解度顯著下降，由于衰老，機體膠原蛋白多肽鏈問的共價交聯(lián)程度增加，使得皮膚變得僵硬少彈性，通透性低，膠原代謝率降低，使膠原組織中的游離肽或結合肽的羥脯氨酸含量降低。
3.3.本實驗觀察到，環(huán)磷酰胺(Cy)可造成小鼠免疫功能低下，并可使免疫器官重量指數(shù)下降。雞胚胎素可以拮抗Cy的免疫抑制作用，保護小鼠胸腺和脾臟免受Cy的損害，說明本品具有增強免疫功能的效應。伴隨著年齡的增長，人類的免疫功能也在逐漸減退。對去胸腺鼠衰老動物模型觀察證明，免疫功能下降是機體衰老的一個重要因素，提高機體免疫力，就使機體免除許多病原體的侵襲，就使機體加強了對突變細胞的監(jiān)控和清除，從而減少了疾病的發(fā)生。其結果為強體和抗衰老。
3.4.本實驗采用鼠尾放血法造成小鼠失血性血虛模型，觀察了雞胚胎素對血虛小鼠紅細胞(RBC)和血紅蛋白(Hb)的影響，結果表明，本品能顯著地改善血虛小鼠的貧血癥狀。提示雞胚胎素具有補益氣血、養(yǎng)顏美膚的作用。中醫(yī)認為，氣血是生命活動的物質基礎。氣血充盛，不但可表現(xiàn)為精神飽滿、容光煥發(fā)、膚色亮麗，而且還能健康長壽，一旦氣血虧損，則必然面色枯槁、皮膚粗糙、皺紋增加、體弱多病。故氣血與壽命、皮膚的關系極為密切。
C.本發(fā)明所制備的雞胚胎素的常規(guī)制劑為1.片劑以雞胚胎素為主料，輔以有關片劑常規(guī)輔料，每片含雞胚胎素0.5g，成人每次1～2片，每天1～2次；2.膠囊以雞胚胎素為主料，輔以有關膠囊劑常規(guī)輔料，每粒膠囊含雞胚胎素0.5g，成人每次1～2粒，每天1～2次；3.軟膠囊以雞胚胎素為主料，輔以不飽和植物油，每粒軟膠囊含雞胚胎素0.5g，成人每次1～2粒，每天1～2次；
4.口服液以雞胚胎素為主料，輔以防腐劑、矯味劑，配制成500mg10ml/瓶濃度口服液，成人每次1～2瓶，每日1～2次。
5.美容化妝品以雞胚胎素為主料，在適當化妝品乳膏基材中乳化，輔以適當防腐劑和香料，即可制作不同香型的乳膏型雞胚胎素美容化妝品；亦可將雞胚胎素溶于適當液體，輔以相關輔料、香料、防腐劑制作出液體劑型美容護膚液。
D.雞胚胎素口服劑量實驗證明本發(fā)明所制備的雞胚胎素無毒性，安全范圍達到食品級，根據動物實驗有效量推算，成人每天0.5g即可產生效果，加大劑量至每天2g，效果將更好；根據成分推理，對雞蛋過敏者，勿用雞胚胎素口服制劑。
四.
具體實施例方式實施例一精選無違規(guī)添加劑的新鮮雞受精卵，置于市售全自動孵蛋機內托盤中，然后調節(jié)各項參數(shù)①孵化溫度第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②孵化濕度相對濕度60％；③通風換氣系數(shù)4～6；④翻蛋每1.5小時翻蛋1次；⑤孵化至14天落盤。取出孵化蛋后迅速去除蛋殼取出雞胚胎，將此新鮮雞胚胎用切碎機切碎至1～3厘米大小碎塊，放入清潔不銹鋼托盤中，置于低溫冰柜，在雞胚中間放置溫度傳感器探頭，當所有樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍1小時，然后使用高效萬能粉碎機粉碎至80目；將粉碎后的雞胚胎在適當?shù)娜萜髦屑尤?倍體積預冷至2℃左右的純水，60轉/分攪拌5分鐘混懸制漿；將此雞胚胎漿置于低溫冰柜，當樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍1小時，然后置室溫條件下自然融化至冰水共存時，再置低溫冰柜，當樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍1小時，如此反復凍融5次；將反復凍融后的雞胚胎漿融化后，置于低溫離心機中，調節(jié)溫度控制使轉子室溫度保持在+4℃，10000轉/分離心10分鐘；將離心后的雞胚胎漿上清液小心吸出，置于無菌不銹鋼容器中，迅速通過截留分子量800,000道爾頓以上的中空纖維超濾器，獲得超濾液；將此超濾液置于無菌不銹鋼托盤中，裝料厚度1.5厘米，放入預先消毒、預冷后的凍干機凍干艙內；調節(jié)凍干參數(shù)、設定凍干曲線；將上述超濾液均勻冷凍至-40℃；然后開動凍干機，真空系統(tǒng)的真空泵、羅茨泵依次打開，調節(jié)真空度在13Pa以下，當真空度保持在13Pa以下恒定1小時后，開動凍干機加熱系統(tǒng)，加熱過程中注意并保持真空度仍在13Pa以下，加熱時物料最高溫度不得超過35℃，當加熱至物料溫度穩(wěn)定在35℃，真空度穩(wěn)定在8Pa以下時，保持2小時，即可關機、出料，所得到的黃白色疏松團塊狀物即為雞胚胎素，將此雞胚胎素立即置入密閉容器中避光冷藏保存，備用。
實施例二精選無違規(guī)添加劑的新鮮雞受精卵，置于市售全自動孵蛋機內托盤中，然后調節(jié)各項參數(shù)①孵化溫度第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②孵化濕度相對濕度60％；③通風換氣系數(shù)4～6；④翻蛋每1小時翻蛋1次；⑤孵化至12天落盤取出；取出孵化蛋后迅速去除蛋殼取出雞胚胎；將此新鮮雞胚胎用切碎機切碎至1～3厘米大小碎塊，放入清潔不銹鋼托盤中，置于低溫冰柜，在雞胚中間放置溫度傳感器探頭，當所有樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍2.5小時，然后使用高效萬能粉碎機粉碎至80目；將粉碎后的雞胚胎在適當?shù)娜萜髦屑尤?倍體積預冷至1℃左右的純水，80轉/分攪拌8分鐘混懸制漿；將此雞胚胎漿置于低溫冰柜，當樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍2.5小時，然后置室溫條件下自然融化至冰水共存時，再置低溫冰柜，當樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍2.5小時，如此反復凍融3次；將反復凍融后的雞胚胎漿融化后，置于低溫離心機中，調節(jié)溫度控制使轉子室溫度保持在+1℃～+4℃，3000轉/分離心30分鐘將離心后的雞胚胎漿上清液小心吸出，置于無菌不銹鋼容器中，迅速通過截留分子量800000道爾頓以上的中空纖維超濾器，獲得超濾液；將此超濾液置于無菌不銹鋼托盤中，裝料厚度小于1.2厘米，放入預先消毒、預冷后的凍干機凍干艙內；調節(jié)凍干參數(shù)將上述超濾液均勻冷凍至-40℃；然后開動凍干機真空系統(tǒng)的真空泵真空度在30Pa以下開動羅茨泵，保持系統(tǒng)真空度5.6Pa～13Pa約1.5小時；然后開動凍干機加熱系統(tǒng)，加熱時物料最高溫度不得超過35℃，并保持真空度在13Pa以下，當加熱至物料溫度穩(wěn)定在35℃，真空度穩(wěn)定在8Pa以下時，保持2.5小時，關機、出料，所得到的黃白色疏松團塊狀物即為雞胚胎素，將此雞胚胎素立即置入密閉容器中避光冷藏保存，備用。
實施例三精選無違規(guī)添加劑飼料喂養(yǎng)的種雞的新鮮受精卵，置于市售全自動孵蛋機內托盤中，然后調節(jié)各項參數(shù)①孵化溫度第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②孵化濕度相對濕度60％；③通風換氣系數(shù)4；④翻蛋每1小時翻蛋1次；⑤孵化至13天落盤取出；取出孵化蛋后迅速去除蛋殼取出雞胚胎；將此新鮮雞胚胎放入冰柜冷凍至-1℃左右，切碎至1～3厘米大小碎塊，放入清潔不銹鋼托盤中，置于低溫冰柜冷凍至-20℃左右，再冰凍3小時，然后使用高效萬能粉碎機粉碎至100目；將粉碎后的雞胚胎在適當?shù)娜萜髦屑尤?倍體積預冷至1℃左右的無菌蒸餾水，70轉/分攪拌10分鐘混懸制漿；將此雞胚胎漿置于低溫冰柜中冷凍至-28℃左右，再冰凍3小時，后置室溫自然融化至冰水共存時，再置低溫冰柜冷凍至-28℃左右，再冰凍3小時，反復凍融4次；將反復凍融后的雞胚胎漿融化后，置于大容量低溫離心機中，調節(jié)轉子室溫度在+4℃，8000轉/分離心20分鐘；將離心后的雞胚胎漿上清液小心吸出，置于無菌不銹鋼容器中，迅速通過截留分子量800000道爾頓以上的中空纖維超濾器，獲得超濾液；將此超濾液再通過結冰法濃縮，濃縮為原體積的1/3量時，置入密閉無菌容器冰凍(-26℃～-40℃)保存，備用。
權利要求
1.一種雞胚胎素的制備方法，包括雞受精卵的精選和孵化，其特征是，包括下列具體步驟a.精選雞受精卵，表面常規(guī)去污，依常規(guī)孵化方法孵化10～13天；b.將孵化好的受精卵表面進行常規(guī)消毒，去除蛋殼取出雞胚胎，在≤4℃的溫度條件下將雞胚胎粉碎；c.將粉碎后的雞胚胎加入3～5倍雞胚胎體積的無菌純水進行打漿；d.將打成漿的雞胚胎在-26～-28℃的溫度條件下進行反復凍融；e.將反復凍融的雞胚胎漿在≤4℃溫度條件下倒入離心機中，在3000～10000轉/分的轉速條件下離心10～30分鐘，獲取上清夜；f.將上清液過截留分子量在800000道爾頓以上的超濾柱，得超濾液；g.將超濾液冷凍干燥后得到類白色疏松團塊狀物質，即為所述的雞胚胎素，或將上述超濾液經超濾濃縮后直接無菌分裝保存，即為雞胚胎素溶液；h.在相對濕度小于30％的環(huán)境中，將所得到的雞胚胎素或雞胚胎素溶液置入密閉容器中進行避光保存，以備用。
2.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的精選雞受精卵是選用蛋用型雞雞蛋，產后3～7天以內，蛋重在110～120克，外形規(guī)則、無損傷。
3.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的常規(guī)孵化方法是①.孵化溫度第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②.孵化濕度相對濕度為60％左右；③.通風換氣保持孵蛋箱空氣中的氧含量在21％以上；④.翻蛋每1～2小時翻蛋1次；⑤.孵化至11～13天，取出孵化蛋后去除蛋殼取出雞胚胎。
4.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述粉碎雞胚胎的方法是將新鮮雞胚胎置于低溫冰柜中，在雞胚胎中間放置溫度傳感器探頭，當所有樣品溫度凍至-26～-28℃后，再冰凍0.5～5小時，然后使用粉碎機械將其粉碎至40～100目。
5.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的打漿方法是將粉碎后的雞胚胎在適當?shù)娜萜髦屑尤?～5倍體積預冷至0～4℃的無菌注射用水，在60～80轉/分的攪拌速度下攪拌5～10分鐘。
6.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的反復凍融方法是將打漿后的雞胚胎漿置于-30℃的低溫冰柜中，將樣品冷凍至-26～-28℃后，冰凍0.5～5小時，然后置于室溫條件下自然融化至冰水共存時，再置于-30℃低溫冰柜，將樣品冷凍至-26～-28℃，冰凍0.5～5小時，如此反復凍融3～5次。
7.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的超濾方法是將離心后的雞胚胎漿上清液過截留分子量800000道爾頓以上的中空纖維超濾器，留取分子量大于800000道爾頓部分的成分，獲得分子量小于等于800000道爾頓的超濾液。
8.根據權利要求1所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的超濾液冷凍干燥的方法是將所得到的超濾液置于無菌不銹鋼托盤中，裝料厚度≤1.5厘米，放入預先消毒、預冷后的凍干機凍干艙內，調節(jié)凍干參數(shù)，將上述超濾液均勻冷凍至-40℃以下，然后依次開動凍干機真空系統(tǒng)中的真空泵和羅茨泵，調節(jié)真空度在6.5～13Pa以下，保持2～3小時，然后開動凍干機中的加熱系統(tǒng)，加熱過程中注意并保持真空度在6.5～13Pa以下，加熱時物料最高溫度不得超過35℃，當加熱至物料溫度穩(wěn)定在35℃，真空度穩(wěn)定在8Pa以下時，保持1～3小時，即可關機、出料，所得到的黃白色疏松團塊狀物即為雞胚胎素。
9.根據權利要求1～8任一權利所述的雞胚胎素的制備方法，其特征是所述的雞胚胎素填加醫(yī)學上的常規(guī)輔料制成片劑，或膠囊，或軟膠囊，或口服液，或美容化妝品，或保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有較高生物活性的雞胚胎素的制備方法。本發(fā)明的高生物活性雞胚胎素的制備方法是將精選雞受精卵常規(guī)孵化10～13天后，將其表面進行消毒，去除蛋殼取出雞胚胎，在低溫下將雞胚胎粉碎，加入無菌純水打漿，4℃條件下離心，獲取上清夜，后將此上清液過截留量為800000道爾頓以上的中空纖維超濾器，得超濾液，將此超濾液冷凍干燥后得到類白色疏松團塊即為雞胚胎素，或將上述超濾液經超濾濃縮至一定濃度后直接無菌分裝保存，即為雞胚胎素溶液。本發(fā)明所制備出來的雞胚胎素含有氨基酸、小分子多肽、生長調節(jié)因子、核酸及核酸衍生物等多種營養(yǎng)成分，由于采用了低溫生產過程和現(xiàn)代生物分離技術，保持了雞胚胎中很多活性物質的較高生物活性。
文檔編號A61P37/00GK1748713SQ20051001799
公開日2006年3月22日 申請日期2005年9月13日 優(yōu)先權日2005年9月13日
發(fā)明者陳正躍, 許建文, 張光軍, 付群 申請人:陳正躍