專利名稱：熒光兩親性聚合物及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光兩親性聚合物及制法和用途。
背景技術(shù)：
熒光技術(shù)對(duì)生物大分子的研究(如蛋白質(zhì)構(gòu)象、DNA的分離及測序等)、對(duì)細(xì)胞的生長、凋亡、變異的原位研究迄今為止還主要集中于在研究體系中引入小分子熒光探針進(jìn)行標(biāo)記，該法雖然簡單、快速、靈敏，但一些小分子熒光探針的非水溶性及可能引起的某些副作用(如誘發(fā)癌變作用)，加之所需添加劑(如表面活性劑)的優(yōu)化困難及重復(fù)性差，使其在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供熒光兩親性聚合物及其制法和用途，這類熒光兩親性聚合物易溶于水，既具有強(qiáng)的熒光響應(yīng)、自組裝行為、靶向載藥能力，又具有對(duì)生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA等非共價(jià)鍵相互作用時(shí)的熒光表達(dá)行為。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是可聚合熒光功能單體，其結(jié)構(gòu)式如下所示 R＝H，X＝NHNH (I)R＝CH3，X＝NHNH(II)R＝H，X＝NHCSNHNH (III)上述可聚合熒光功能單體的合成方法按摩爾比1∶1.2-1.8的比例，將芘丁酰肼與丙烯酰氯在二甲基甲酰胺溶劑中、0±5℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)DMF-EtOH-H2O混合溶劑重結(jié)晶得到功能單體(I)。
按摩爾比1∶1.2-1.8的比例，將芘丁酰肼與甲基丙烯酰氯在甲苯與二甲基甲酰胺混合溶劑中、0±5℃，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)柱色譜分離得到功能單體(II)。
按摩爾比1∶1.2-1.8的比例，將芘丁酰肼與丙烯酸異硫氰酸酯在乙腈溶劑中、室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過濾、洗滌得到功能單體(III)。
熒光兩親性聚合物，其結(jié)構(gòu)式如下
式中X為NHNH或NHCSNHNH；m＝4-12、n＝1-3、z＝40-70。
上述熒光兩親性聚合物的合成方法N-乙烯基吡咯烷酮在二氧六環(huán)溶劑中，以2-巰基乙醇作為鏈轉(zhuǎn)移劑，在65±5℃，偶氮二異丁氰(AIBN)引發(fā)聚合，聚合反應(yīng)4-8h，得到端羥基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物；在二氧六環(huán)溶劑中，室溫下按1∶1.2-1.8摩爾比的比例，端羥基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物與丙烯酰氯，反應(yīng)15-24h，經(jīng)乙醚沉淀，去離子水洗滌，透析，得到端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮預(yù)聚物(PVP-Vinyl)；以二甲基甲酰胺為溶劑，AIBN作引發(fā)劑，上述可聚合的熒光功能單體與端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮預(yù)聚物在65±5℃聚合反應(yīng)15-24h，經(jīng)乙醚沉淀、二氧六環(huán)再溶解、再經(jīng)乙醚沉淀，透析，干燥，得到熒光兩親性聚合物。
通過調(diào)整PVP-Vinyl預(yù)聚物的分子量(調(diào)整鏈轉(zhuǎn)移劑2-巰基乙醇的用量)及其和熒光功能單體、引發(fā)劑AIBN的用量，使聚合物分子量控制在20 000-100 000范圍。
本發(fā)明熒光兩親性聚合物的性能(1)具有良好的水溶性和低的臨界膠束濃度(CMC)，其水溶液可自組裝形成穩(wěn)定的納米膠束，TEM表明膠束的直徑在50-80nm范圍。
(2)具有良好的生物相容性。本發(fā)明熒光兩親性聚合物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)通過使用MDCK細(xì)胞，MTT法檢測。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比(細(xì)胞的存活率定為100％)，其濃度在1×10-10～1×10-1mg/ml范圍，MDCK細(xì)胞的存活率在120-150％之間。表明該熒光兩親性聚合物具有良好的生物相容性，能促進(jìn)細(xì)胞的生長。
(3)具有強(qiáng)的熒光表達(dá)能力。本發(fā)明熒光兩親性聚合物的水溶液具有強(qiáng)的熒光表達(dá)能力，在342nm的激發(fā)波長下，分別于約374、396、475nm出現(xiàn)三個(gè)熒光發(fā)射譜帶。在相同濃度下(w/v)，聚合物的熒光強(qiáng)度隨著聚合物中疏水鏈段含量的增加而增加；同一種聚合物的熒光強(qiáng)度隨著其濃度的增大而增大。
本發(fā)明熒光兩親性聚合物的用途熒光技術(shù)對(duì)生物大分子的研究(如蛋白質(zhì)構(gòu)象、DNA的分離及測序等)、對(duì)細(xì)胞的生長、凋亡、變異的原位研究迄今為止還主要集中于在研究體系中引入小分子熒光探針進(jìn)行標(biāo)記，該法雖然簡單、快速、靈敏，但一些小分子熒光探針的非水溶性及可能引起的某些副作用(如誘發(fā)癌變作用)，加之所需添加劑(如表面活性劑)的優(yōu)化困難及重復(fù)性差，使其在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了限制。
具有熒光響應(yīng)的兩親性聚合物的合成，將是克服這一不足的有效途徑。
PC12細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明具有合適分子量(20000-50000)的熒光兩親性聚合物可以有效的進(jìn)出PC12細(xì)胞并可通過熒光進(jìn)行表達(dá)。
DNA凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明熒光兩親性聚合物可以有效地與DNA結(jié)合，其結(jié)合程度與疏水單體的功能基和聚合物的濃度有關(guān)。
MDCK細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明熒光兩親性聚合物具有良好的生物相容性，能促進(jìn)細(xì)胞的生長。
熒光發(fā)射光譜實(shí)驗(yàn)表明，與DNA、蛋白質(zhì)、碳酸根陰離子相互作用中，本發(fā)明熒光兩親性聚合物的熒光表達(dá)隨識(shí)別對(duì)象濃度的改變而改變，其變化程度與疏水單體的功能基有關(guān)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1功能單體(I)、(II)的合成方法將芘丁酰肼在二甲基甲酰胺(DMF)溶劑中與丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯(摩爾比1∶1.5)0℃反應(yīng)，攪拌過夜，產(chǎn)品經(jīng)DMF-EtOH-H2O混合溶劑重結(jié)晶得到功能單體(I)或(II)。產(chǎn)率分別為58％、62％，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)經(jīng)MS，1H NMR鑒定功能單體(I)FAB-MS m/z(RI)356(38，M+)，271(58，M-CH2CHCONHNH)，215(43，M-CH2CHCONHNHCOCH2CH2)。1H NMR(DMSO-d6，δppm)2.05(t，2H，CH2CH2CO)，2.34(m，2H，CH2CH2CO)，2.91(t，2H，PyCH2)，5.70-6.29(m，3H，CH2＝CH)，7.91-8.42(m，9H，PyH)，9.99，10.12(each s，1H，NHNH)。功能單體(II)FAB-MS m/z(RI)371(48，M+1)，271(63，Py(CH2)3CO+)，215(52，PyCH2+)；1H NMR(CDCl3，δppm)1.89(s，3H，CH3)，2.19(t，2H，CH2CH2CO)，2.34(m，2H，CH2CH2CO)，3.31(t，2H，PyCH2)，5.35，5.76(each d，1H，CH2＝)，7.8-8.2(m，9H，PyH)，8.42，8.51(each b，1H，NHNH)。
實(shí)施例2功能單體(III)的合成方法為將芘丁酰肼在乙腈溶劑中與丙烯酸異硫氰酸酯(摩爾比1∶1.2)室溫反應(yīng)，攪拌過夜，產(chǎn)品經(jīng)過濾，乙腈、H2O、乙腈洗滌得到，產(chǎn)率是67％，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)經(jīng)MS，1H NMR確證FAB-MS m/z(RI)415(30，M+)，344(11，M-CH2CHCONH2)。1HNMR(d6-DMSO，δppm)2.19(t，2H，CH2CH2CO)，2.34(m，2H，CH2CH2CO)，3.31(t，2H，PyCH2)，5.72-6.31(m，3H，CH2＝CH)，7.8-8.2(m，9H，PyH)，10.01，10.14，11.03(each s，1H，CONHNHCS，CONHCS)。
實(shí)施例3端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮預(yù)聚物(PVP-Vinyl)的合成N-乙烯基吡咯烷酮(3.6g)，AIBN(0.014g)，2-巰基乙醇(0.30)在二氧六環(huán)溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在60℃聚合反應(yīng)4h，經(jīng)乙醚沉淀，二氧六環(huán)再溶解、再經(jīng)乙醚沉淀。得到端羥基聚N-乙烯基吡咯烷酮(PVP-OH)。GPC-MALLS分析，其重均分子量為4200Da。隨后在二氧六環(huán)溶劑中，PVP-OH與丙烯酰氯(摩爾比1∶1.2)于室溫下反應(yīng)20h，經(jīng)乙醚沉淀，去離子水洗滌，透析袋(Sigma D-7884)透析72h，得到純化的端乙烯基PVP預(yù)聚物(PVP-Vinyl)。
N-乙烯基吡咯烷酮(3.6g)，AIBN(0.014g)，2-巰基乙醇(0.14g)在二氧六環(huán)溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在70℃聚合反應(yīng)6h，經(jīng)乙醚沉淀，二氧六環(huán)再溶解、再經(jīng)乙醚沉淀。得到端羥基聚N-乙烯基吡咯烷酮(PVP-OH)。GPC-MALLS分析，其重均分子量為7300Da。隨后在二氧六環(huán)溶劑中，PVP-OH與丙烯酰氯(摩爾比1∶1.8)于室溫下反應(yīng)20-24h，經(jīng)乙醚沉淀，去離子水洗滌，透析袋(Sigma D-7884)透析72h，得到純化的端乙烯基PVP預(yù)聚物(PVP-Vinyl)。
上述產(chǎn)品PVP-Vinyl結(jié)構(gòu)經(jīng)IR，1H NMR鑒定。1H NMR(D2O，δppm)5.76(d，Ha，CH2＝)，5.96(d，Hb，CH2＝)，6.23(m，1H，CH＝)，1.4-3.5(PVPH)。IR(KBr pellet，cm-1)2958.9(m)，1723.5(w)，1654.9(s)，1464.8(m)，1423.3(m)，1291.5(s)，849.5(m)cm-1。
實(shí)施例4熒光兩親性聚合物的合成在DMF溶劑中，AIBN作引發(fā)劑，熒光功能單體I-III分別與PVP-Vinyl在65±5℃聚合反應(yīng)20-24h，經(jīng)乙醚沉淀，二氧六環(huán)再溶解、再沉淀，使用去離子水透析72h，得到純化的熒光兩親性聚合物。調(diào)整PVP-Vinyl預(yù)聚物的分子量(通過調(diào)節(jié)2-巰基乙醇的用量來控制Z值在40-70范圍，參見實(shí)施例3)及其和熒光功能單體、引發(fā)劑AIBN(見實(shí)施例5、6、7)的用量(控制m值在4-14范圍，n值在1-3范圍)，使熒光兩親性聚合物的重均分子量控制在20000-100000范圍。
這些熒光兩親性聚合物都具有良好的水溶性。熒光光譜表征聚合物都具有強(qiáng)的熒光發(fā)射，熒光強(qiáng)度隨著聚合物中疏水鏈段(n值)的增加而增加。熒光兩親性聚合物的制備及結(jié)構(gòu)表征見實(shí)施例5-7。
實(shí)施例5熒光兩親性聚合物FAP-I、FAP-II和FAP-III的合成PVP-Vinyl(2.0g，由Mw7300PVP-OH得到的PVP-Vinyl)，熒光功能單體II(分別為0.15、0.09和0.045g)，AIBN(0.008g)，在DMF溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60℃聚合反應(yīng)24h，經(jīng)乙醚沉淀，二氧六環(huán)再溶解、再沉淀，使用去離子水透析袋透析72h，得到FAP-I、FAP-II和FAP-III。經(jīng)GPC-MALLS分析，其重均分子量分別為67500、67200和69900Da。疏水段含量通過UV-vis分析(以芘丁酸/DMF溶液在λmax344nm的紫外吸收作標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光系數(shù)ε＝44680L·mol-1·cm-1計(jì)算)分別為31.4、18.3和8.6μmol/g。1H NMR(CDCl3，δppm)1.18(b，CCH3)，1.61，2.20and 3.18(b，CH2of PVP andPy(CH2)3CO)，1.96 and 3.64(b，CH2and CH of main chain)，7.8-8.4(b，PyH)；IR(KBr pellet，cm-1)3434.1(w)，2958.9(m)，1653.2(s)，1462.8(m)，1423.3(m)，1289.5(s)，843.9(m)cm-1。
實(shí)施例6熒光兩親性聚合物FAP-IV、FAP-V和FAP-VI的合成PVP-Vinyl(2.0g，由Mw 4200PVP-OH得到的PVP-Vinyl)，熒光功能單體I(0.24、0.20和0.14g)，AIBN(0.02g)，在DMF溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，65℃聚合反應(yīng)22h，經(jīng)乙醚沉淀，二氧六環(huán)再溶解、再沉淀，使用去離子水透析袋透析72h，得到FAP-IV、FAP-V和FAP-VI。GPC-MALLS分析，F(xiàn)AP-IV、其重均分子量分別為20030、35280和50050Da。疏水段含量通過UV-vis分析(以芘丁酸/DMF溶液在λmax344nm的紫外吸收作標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光系數(shù)ε＝44680L·mol-1·cm-1計(jì)算)分別為59.4、38.3和18.6μmol/g。1H NMR(CDCl3，δppm)1.61，2.20 and 3.18(b，CH2of PVP andPy(CH2)3CO)，1.96 and 3.64(b，CH2and CH of main chain)，7.8-8.4(b，PyH)；IR(KBr pellet，cm-1)3434.1(w)，2958.9(m)，1653.2(s)，1462.8(m)，1423.3(m)，1289.5(s)，843.9(m)cm-1。
實(shí)施例7熒光兩親性聚合物FAP-VII、FAP-VIII和FAP-IX的合成PVP-Vinyl(2.0g，由Mw7300PVP-OH得到的PVP-Vinyl)，熒光功能單體III(0.18、0.14和0.10g)，AIBN(0.02g)，在DMF溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70℃聚合反應(yīng)20h，經(jīng)乙醚沉淀，二氧六環(huán)再溶解、再沉淀，使用去離子水透析袋透析72h，得到FAP-VII、FAP-VIII和FAP-IX。GPC-MALLS分析，其重均分子量分別為44400、65180和98350Da。疏水段含量通過UV-vis分析(以芘丁酸/DMF溶液在λmax344nm的紫外吸收作標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光系數(shù)ε＝44680L·mol-1·cm-1計(jì)算)分別為30.8、22.3和14.6μmol/g。1H NMR(CDCl3，δppm)1.61，2.20 and 3.18(b，CH2of PVP andPy(CH2)3CO)，1.96 and 3.64(b，CH2and CH of main chain)，7.8-8.2(b，PyH)；IR(KBr pellet，cm-1)3434.1(w)，2958.9(m)，1653.2(s)，1462.8(m)，1423.3(m)，1289.5(s)，843.9(m)cm-1。
權(quán)利要求
1.熒光兩親性聚合物，其結(jié)構(gòu)式為 式中X為NHNH或NHCSNHNH；m＝4-12、n＝1-3、z＝40-70。
2.權(quán)利要求1所述熒光兩親性聚合物的合成方法，其特征在于N-乙烯基吡咯烷酮在二氧六環(huán)溶劑中，以2-巰基乙醇作為鏈轉(zhuǎn)移劑，在65±5℃，偶氮二異丁氰引發(fā)聚合，聚合反應(yīng)4-8h，得到端羥基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物；在二氧六環(huán)溶劑中，室溫下按1∶1.2-1.8摩爾比的比例，端羥基N-乙烯基吡咯烷酮聚合物與丙烯酰氯，反應(yīng)15-24h，經(jīng)乙醚沉淀，去離子水洗滌，透析，得到端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮預(yù)聚物以二甲基甲酰胺為溶劑，偶氮二異丁氰為引發(fā)劑，可聚合的熒光功能單體與端乙烯基N-乙烯基吡咯烷酮預(yù)聚物在65±5℃聚合反應(yīng)15-24h，經(jīng)乙醚沉淀、二氧六環(huán)再溶解、再經(jīng)乙醚沉淀，透析，干燥，得到熒光兩親性聚合物；上述可聚合的熒光功能單體為 R＝H，X＝NHNH(I)R＝CH3，X＝NHNH (II)R＝H，X＝NHCSNHNH(III)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述熒光兩親性聚合物的合成方法，其特征在于按摩爾比1∶1.2-1.8的比例，將芘丁酰肼與丙烯酰氯在二甲基甲酰胺溶劑中、0±5℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)DMF-EtOH-H2O混合溶劑重結(jié)晶得到可聚合的熒光功能單體(I)；或者，按摩爾比1∶1.2-1.8的比例，將芘丁酰肼與甲基丙烯酰氯在甲苯與二甲基甲酰胺混合溶劑中、0±5℃，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)柱色譜分離得到可聚合的熒光功能單體(II)；或者，按摩爾比1∶1.2-1.8的比例，將芘丁酰肼與丙烯酸異硫氰酸酯在乙腈溶劑中、室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過濾、洗滌得到可聚合的熒光功能單體(III)。
4.權(quán)利要求1所述熒光兩親性聚合物作為生物大分子的分離材料、熒光示蹤材料、醫(yī)學(xué)診斷材料、熒光探針材料、載藥緩釋材料或熒光靶材料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光兩親性聚合物，其結(jié)構(gòu)式為(如圖)；它們是由具有與生物大分子如DNA，蛋白質(zhì)相互作用部位和強(qiáng)熒光響應(yīng)的功能單體與N－乙烯基吡咯烷酮預(yù)聚物共聚合的反應(yīng)產(chǎn)物。該聚合物具有優(yōu)良的生物相容性、載藥和靶向給藥能力，并能通過高靈敏的熒光示蹤檢測技術(shù)，在物大分子分離與識(shí)別、生物傳感器、醫(yī)學(xué)診斷、藥物輸送及靶材料等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。其合成路線合理，合成方法簡單，原料易得，具有重要的推廣和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K47/32GK1772782SQ20051001979
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者孟令芝, 武照強(qiáng), 何永炳 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)