專利名稱：一種益氣健脾的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種益氣健脾的藥物組合物，具體地，是以中藥材為原料提取制備的有效部位為原料制備而成的藥物組合物，屬藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤對人類身心健康的嚴(yán)重威脅眾所周知。全世界每年死于惡性腫瘤的患者，35％為消化系統(tǒng)的腫瘤，其中，胃癌的死亡率具首位。我國1997年癌情公布，癌癥的病死率已由70年代的11.7％上升到90年代的18.14％，而胃癌居10種惡性腫瘤之首。近年來研究表明，胃癌由正常組織發(fā)展到惡性腫瘤之前，要經(jīng)過一個相當(dāng)長的演變階段，即胃癌癌前病變(Precancerous Lesions of gastric cancer)。由于胃癌的病因尚不完全清楚，實施針對病因的一級預(yù)防比較困難，因此，國內(nèi)外學(xué)者把胃癌癌前病變作為開展胃癌二級預(yù)防的重要內(nèi)容。世界衛(wèi)生組織于1978年已經(jīng)統(tǒng)一了癌前疾病(或狀態(tài))和癌前病變(或病損)的認(rèn)識。癌前疾病是指與胃癌的發(fā)生有密切關(guān)系的胃良性疾病，包括萎縮性胃炎、殘胃、胃息肉、惡性貧血及胃潰瘍等。而胃癌癌前病變是指胃粘膜出現(xiàn)中、重度不典型增生或/和不完全性結(jié)腸型腸化生。國內(nèi)外學(xué)者對胃癌癌前病變進行了廣泛地研究。如Levin B.等發(fā)現(xiàn)，鈣、硒、葉酸等適合于胃癌癌前病的化學(xué)預(yù)防，化學(xué)預(yù)防的機制可能包括矯正致癌物的活性和細胞攝入，抑制異常信號的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細胞調(diào)亡和抑制致癌作用；國外學(xué)者Fang JY.NenseyYM.國內(nèi)學(xué)者楊佳琦、房靜遠、李春啟等研究結(jié)果表明，葉酸、維甲酸對胃癌癌前疾病和胃癌癌前病變有一定的藥效作用，其機理可能一誘導(dǎo)癌細胞凋亡有關(guān)。但以上的研究成果，還有許多問題有待解決，諸如藥物的效價比不高，抑制癌前病變的遠期療效不肯定，藥物的劑量與逆轉(zhuǎn)的效果關(guān)系不清楚，抑制癌前病變的機理不確切。總之，到目前為止，尚缺乏療效肯定的化學(xué)治療藥品。
近年來，我國學(xué)者在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，對胃癌癌前病變進行了一些研究。如董建華教授認(rèn)為，胃癌癌前病變屬中醫(yī)“虛痞”的范疇，分為氣陰兩虛、虛火灼胃、脾胃虛陰弱三型。張鏡人教授認(rèn)為，萎縮性胃炎合并不完全性結(jié)腸型腸上皮化生或中、重度不典型增生，就是胃癌癌前病變，發(fā)病與脾胃虛弱、正氣不足有關(guān)。目前一般認(rèn)為胃癌癌前病變屬中醫(yī)痞滿、胃脘痛的范疇，以虛證多見，脾虛是胃癌癌前病變的基本病機，脾虛癥狀的輕重與胃癌癌前病變及胃癌發(fā)生發(fā)展各階段病變之間呈等級正相關(guān)。
由人參、白術(shù)為原料制備的藥物制劑始載于明《證治準(zhǔn)繩》，由人參、白術(shù)組成，是治療脾氣虛證的基本代表方劑。它淵源于漢代張仲景《傷寒論》理中湯、唐代王燾《外臺秘要》人參飲、宋代《和劑局方》，成方于明代《證治準(zhǔn)繩》。明代王肯堂《證治準(zhǔn)繩.類方》卷一載“本發(fā)明藥物膏……人參、白術(shù)各等分，水煎稠湯化服之”。由于工藝簡單，其中的揮發(fā)油易揮發(fā)，且有效成分易損失，藥效不明確。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種益氣健脾的藥物組合物，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了該藥物組合物的制備方法和用途。
本發(fā)明提供了一種益氣健脾的藥物組合物，它是含有由下述重量配比的原料制備而成的藥劑人參總皂苷5-50份、白術(shù)油1-10份、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5-50份。
進一步地，它是由下述重量配比的原料制備而成的藥劑人參總皂苷5-50份、白術(shù)油1-10份、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5-50份。
其中，所述的人參總皂苷中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總重量百分含量占0.5-5％，所述白術(shù)油中揮發(fā)油的重量百分比≥60％，每毫升白術(shù)油中含亞油酸≥30mg。
所述的藥劑是丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑、口服液、注射劑。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、取紅參藥材，加50％～80％乙醇浸泡，回流提取，濾過，合并濾液，濾液通過大孔吸附樹脂，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮，得人參總皂苷；c、取白術(shù)，食用植物油為溶劑，提取，濾過，濾液回收溶劑植物油，所得產(chǎn)物為白術(shù)油；d、取白術(shù)藥渣，加乙醇提取濾過，藥渣再與紅參藥渣混合，加水煎煮，濾過，精制，備用，得紅參和白術(shù)復(fù)合多糖；e、將b、c、d制備的人參總皂苷、白術(shù)油、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖按如下重量配比，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
人參總皂苷5-50份、白術(shù)油1-10份、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5-50份。
其中，步驟c所述的白術(shù)油可加入到β-環(huán)糊精水溶液中，超聲包合，冷藏，離心，沉淀即得經(jīng)包合后得白術(shù)油。
其中，所述的紅參干浸膏中人參總皂苷的重量百分含量≥60％，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總重量百分含量≥6％，白術(shù)油中揮發(fā)油的重量百分含量≥60％；d步驟紅參和白術(shù)干浸膏中的復(fù)合多糖的重量百分含量以葡萄糖計≥60％。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備益氣健脾的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備治療胃癌的藥物中的用途。進一步地，所述的藥物是抑制胃癌癌前病變的藥物。
祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃癌癌前病變屬“痞滿”、“胃脘痛”等范疇，脾氣虛是其基本病機，臨床主要以食欲減退，食后飽脹或上腹部鈍痛，以及大便溏薄，神疲體倦等脾虛氣弱癥狀表現(xiàn)為特征。故本方針對上述脾虛癥狀和病機，采取“虛者補之”、“損者益之”的治療原則，重用紅參為君，甘溫入脾，“調(diào)中益氣”(《湯液本草》)，“和中健脾”(《本草匯言》)，“消食開胃”(《日華子本草》)，“通血脈，破堅積”(《名醫(yī)別錄》)，凡脾氣虛衰，而見食少、腹脹、便溏、體倦懶言等癥，用之皆有確實療效。臣以白術(shù)，苦溫燥濕健脾，“除心下急滿” (《名醫(yī)別錄》)。兩藥合用，共奏補氣與健脾之功。使脾氣之虛得補而濕不滯，運化之健得復(fù)而積滯消。故能對脾虛型胃癌癌前病變及一般脾胃氣虛而運化機能衰減者，切中病情，療效顯著。經(jīng)藥理實驗證明，由本發(fā)明藥物有效部位紅參皂苷、白術(shù)油、紅參復(fù)合多糖、白術(shù)復(fù)合多糖組成的藥物組合物具有明顯改善食醋脾虛大鼠的脾虛癥狀，增加尿液D-木糖的含量，升高胸腺小體的數(shù)量，擴大脾臟T、B細胞區(qū)，提高T-淋巴細胞轉(zhuǎn)換率，糾正胃腸組織病損，提高脾虛小鼠胃腸運動的能力；延長脾虛小鼠的游泳時間，增加耐缺氧、耐寒、耐高溫的能力；糾正胃癌癌前病變大鼠、小鼠的脾虛癥狀，改善胃粘膜萎縮、充血水腫，胃腺體囊性擴張、異型增生、腸腺化生的病理變化，糾正腸組織的病理損害，糾正胃癌轉(zhuǎn)移鼠的脾虛癥狀，抑制胃癌病變，調(diào)控胃癌基因。
本發(fā)明藥物具有治療脾虛胃癌癌前病變的作用，且四個有效部位組合，藥效明確，發(fā)揮了協(xié)同增效的作用，可控性強，質(zhì)量穩(wěn)定，為臨床提供了一種新的選擇。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明原料的提取工藝取紅參藥材，加50％乙醇浸泡，回流提取，濾過，合并濾液；藥液回收乙醇，濃縮，上大孔吸附樹脂，先用及20％乙醇洗脫除雜，繼用的70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，備用。白術(shù)用溶劑油(或植物油)浸泡，回流提取，濾過，濾液回收溶劑，加入到β-環(huán)糊精水溶液中，超聲包合，冷藏，離心，沉淀備用；取白術(shù)藥渣，加乙醇提取濾過，藥渣再與紅參藥渣混合，加水煎煮，濾過，濾液濃縮，離心，上清液醇沉，離心，沉淀備用。紅參皂苷濃縮液加入白術(shù)油β-環(huán)糊精包合物及復(fù)合多糖沉淀，混合均勻，以淀粉為母核，制粒，整粒，裝入膠囊，即得。
實施例2本發(fā)明原料的提取工藝取紅參藥材，加80％乙醇浸泡，回流提取，濾過，合并濾液；藥液回收乙醇，濃縮，上大孔吸附樹脂，先用及20％乙醇洗脫除雜，繼用的70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，備用。白術(shù)溶劑油(或植物油)浸泡，回流提取，濾過，濾液回收溶劑，濃縮，備用；取白術(shù)藥渣，加乙醇提取濾過，藥渣再與紅參藥渣混合，加水煎煮，濾過，濾液濃縮，離心，上清液醇沉，離心，沉淀備用。紅參皂苷濃縮液加入白術(shù)油及復(fù)合多糖沉淀，混合均勻，以淀粉為母核，制粒，整粒，裝入膠囊，即得。
實施例3本發(fā)明藥物的制備按實施例1的方法制備得人參總皂苷50g、白術(shù)揮發(fā)油10g、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖50g，加入淀粉制粒、整粒，加硬脂酸鎂，壓片，得片劑。
實施例4本發(fā)明藥物的制備按實施例1的方法制備得人參總皂苷5g、白術(shù)揮發(fā)油1g、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5g，加入淀粉制粒、整粒，加硬脂酸鎂，壓片，得片劑。
實施例5本發(fā)明藥物的制備按實施例1的方法制備得人參總皂苷25g、白術(shù)揮發(fā)油10g、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖25g，加入淀粉制粒、整粒裝膠囊，得膠囊劑。
實施例6本發(fā)明藥物的制備按實施例1的方法制備得人參總皂苷40g、白術(shù)揮發(fā)油10g、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖50g加入淀粉制粒、整粒裝膠囊，得膠囊劑。
實施例7本發(fā)明藥物的制備按實施例1的方法制備得人參總皂苷10g、白術(shù)揮發(fā)油10g、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖10g，將白術(shù)油乳化、加入人參總皂苷、復(fù)合多糖，加入注射用附加劑，調(diào)pH值及滲透壓，制備成注射劑。
實施例8本發(fā)明藥物的制備按實施例1的方法制備得人參總皂苷50g、白術(shù)揮發(fā)油1g、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5g，加入淀粉制粒、整粒裝膠囊，得膠囊劑。
實施例9本發(fā)明藥物質(zhì)量控制方法(1)紅外光譜鑒別取本發(fā)明藥物膠囊內(nèi)容物適量，加水溶解多糖，濾過，濾液加95％乙醇至含醇量達到約80％后，靜置12小時，離心，收集沉淀，真空干燥，得復(fù)合多糖。兩批復(fù)合多糖的IR圖譜一致。并對同一批樣品中分得的復(fù)合多糖比較除蛋白前后的IR圖譜，結(jié)果，兩張圖譜非常相似。又將與復(fù)合多糖相同制法制得的紅參多糖與白術(shù)多糖在未除蛋白的情況下，作IR圖譜比較，紅參多糖與白術(shù)多糖的IR圖譜，從吸收峰的位置來看很相近，但峰的大小有一些區(qū)別。在1740.5cm-1處，紅參多糖與復(fù)合多糖有一小峰而白術(shù)多糖沒有。
(2)高效毛細管電泳法①儀器BeckmanHPCE毛細管電泳儀；二極管陣列檢測器；毛細管柱(56cm×75μm)。
色譜條件的考察對影響分離和檢測的條件如柱溫、流動相、檢測波長進行了考察。最終確定色譜條件為 L硼酸-硼酸鈉；柱溫30℃；電壓15KV。
②樣品溶液制備方法的考察對影響樣品水解的各因素如水解時間、水解方式、H2SO4加入量、中和試劑的選擇等進行了考察。最終確定水解條件為稱取30mg多糖，加入H2SO45ml，100℃水解，用Ba(OH)2先中和一部分，臨近終點時，再用BaCO3中和至中性。分別以12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，上清液用0.45μm濾膜濾過，即得。
白術(shù)多糖樣品的制備精密稱取白術(shù)多糖約30mg，按上述方法制備，即得。
紅參多糖樣品的制備精密稱取紅參多糖約30mg，按上述方法制備，即得。
紅參、白術(shù)復(fù)合多糖樣品的制備精密稱取紅參、白術(shù)復(fù)合多糖約30mg，按上述方法制備，即得。
β-環(huán)糊精樣品的制備精密稱取β-環(huán)糊精約30mg，按上述方法制備，即得。
③淀粉的制備精密稱取淀粉約30mg，按上述方法制備，即得。
④測定方法分別吸取上述樣品溶液各1μl，注入高效毛細管電泳儀進行測定，結(jié)果如下在固定波長204和214nm測定下，白術(shù)多糖和紅參多糖的出峰時間基本一致，譜圖基本一致。但在全波長掃描下，得到三維譜圖，發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖在284nm處有一峰，紅參多糖無此峰；而紅參多糖在190nm處有一吸收峰，白術(shù)多糖無此峰；復(fù)合多糖在284nm和190nm處都有吸收峰。
另外，將β-環(huán)糊精和淀粉進行了測定，發(fā)現(xiàn)它們的譜圖在284nm和190nm處無吸收。說明它們不影響多糖的毛細管電泳分析。
結(jié)論采用高效毛細管電泳法可區(qū)分人參多糖和白術(shù)多糖，并且方中β-環(huán)糊精和淀粉無干擾。
實施例10本發(fā)明藥物原料白術(shù)油的質(zhì)量控制(1)總揮發(fā)油的測定精密量取白術(shù)油1ml，按《中國藥典》2000年版藥典附錄XD揮發(fā)油測定法中甲法操作，測定揮發(fā)油含量。
本品含揮發(fā)油量不得少于60％。
(2)白術(shù)油中亞油酸含量的測定照氣相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VIE)測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗10％DEGS為擔(dān)體，Chromsorb w Aw-DMCS為固定相(60～80目，2.1m×3mm)玻璃柱。柱溫165℃。進樣口溫度220℃。檢測器FID，230℃。H230ml/分鐘。Air100ml/分鐘。N260ml/分鐘。理論塔板數(shù)(N)以亞油酸甲酯計不低于1000。
對照品溶液的制備取亞油酸甲酯對照品約1g，精密稱定，置50ml量瓶中，加正已烷溶解并定容至刻度。精密量取3.0ml置10ml量瓶，加正已烷至刻度，即得。
供試品溶液的制備與測定量取本品約0.25ml，精密稱定取，置具塞刻度試管中，加入0.5mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液2.0ml，搖勻，置70℃水浴中皂化15分鐘，取出，冷至室溫，再加入12.5％的三氟化硼-甲醇溶液2ml，置70℃水浴中甲酯化5分鐘，取出，冷至室溫，精密加入正已烷2.0ml，搖勻，再加入飽和氯化鈉溶液2.0ml，搖勻，靜置，搖勻，靜置，記下上清液的總體積，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入氣相色譜儀，測量亞油酸甲酯峰面積，用外標(biāo)法計算含量，即得。
本品每ml含亞油酸(C18H32O2)不得少于30.0mg。
(3)穩(wěn)定性按《中國藥典》2000年版及“藥品注冊管理辦法”中有關(guān)穩(wěn)定性技術(shù)要求，試驗按照“本發(fā)明藥物膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案”的方法，對白術(shù)油包合物及成品經(jīng)常溫6個月穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明本品基本穩(wěn)定。
以下通過具體的藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明的有益效果。證明本發(fā)明藥物具有抑制胃癌癌前病變。
試驗例1本發(fā)明藥物對脾虛胃癌癌前病變大鼠的治療作用一、實驗材料1、藥物①受試藥物本發(fā)明藥物膠囊劑，實施例1的方法制備，每g干浸膏含原生藥10g。用蒸餾水配制成1％、2％、4％的藥液(即每ml含原生藥0.1g、0.2g、0.4g)備用。
②陽性藥物正大養(yǎng)胃沖劑，由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號浙衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)0376-1號。麗珠得樂顆粒，由麗珠制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(90)衛(wèi)藥準(zhǔn)字X-91-3號。
2、動物SD大鼠，雌雄均有，體重180～220g， 由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，合格證號川實動管質(zhì)(97)第8號。檢疫后備用。
二、實驗方法取SD大鼠70只，隨機分為空白對照組(N＝10)、脾虛胃癌癌前病變模型組(N＝10)、正大養(yǎng)胃沖劑組(N＝10)、麗珠得樂組(N＝10)、本發(fā)明藥物膠囊高劑量組(N＝10)、本發(fā)明藥物膠囊中劑量組(N＝10)、本發(fā)明藥物膠囊低劑量組(N＝10)。除空白對照組外，主動免疫、饑飽不均加飲用氨水法復(fù)制脾虛胃癌癌前病變動物模型90d。第91d，按組分別灌胃等容積蒸餾水、養(yǎng)胃沖劑藥液15g/kg、麗珠得樂藥液1.00g/kg、4％、2％、1％本發(fā)明藥物膠囊藥液10ml/kg，連續(xù)給藥30d。實驗前、造模后測定動物體重、體溫、攝食量和自發(fā)活動，以后每10d測體重1次，以便調(diào)整給藥容積；治療后同法測定動物體重、體溫、攝食量和自發(fā)活動。第121d，股靜脈取血，分離血清，按胃泌素放射免疫分析測定試劑盒的要求，F(xiàn)J-2003r計數(shù)器測定血清胃泌素含量；處死動物，剖檢后取胃、空腸組織各一塊，立即投入10％甲醛液內(nèi)固定，石臘包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。
三、實驗結(jié)果1.對脾虛胃癌癌前病變大鼠脾虛癥狀的影響脾虛胃癌癌前病變模型組大鼠攝食量明顯降低，自發(fā)活動減少，豎毛，腹脹，大便異常，部分動物肛周污移，與空白對照組比較，差異明顯。經(jīng)本發(fā)明藥物治療后，攝食量、自發(fā)活動均明顯升高，高劑量組動物體重明顯增加，與脾虛胃癌癌前病變模型組比較，有明顯差異，與正大養(yǎng)胃沖劑組比較，無明顯差異，但明顯優(yōu)于麗珠得樂組。結(jié)果詳見表1。
表1對脾虛大鼠脾虛癥狀的影響(X±SD)

注與空白對照組比較**P＜0.01；與模型組比較ΔΔP＜0.01；2、對脾虛胃癌癌前病變大鼠胃腸病理形態(tài)學(xué)的影響①剖檢觀察脾虛胃癌癌前病變模型組動物胃腸脹氣，胃粘膜變薄，空腸充血水腫。經(jīng)藥物治療后，本發(fā)明藥物高中低劑量組、麗珠得樂組、正大養(yǎng)胃沖劑組基本恢復(fù)正常。
②組織病理學(xué)觀察脾虛胃癌癌前病變模型組動物胃上皮細胞壞死萎縮，胃腺體囊性擴張、異型增生、腸腺化生，胃粘膜下充血水腫；空腸充血水腫、上皮細胞壞死脫落。本發(fā)明藥物高中低劑量組、麗珠得樂組大鼠胃腸病損基本恢復(fù)正常，與空白對照組無顯著性差異。結(jié)果詳見表2。
表2本發(fā)明藥物膠囊對脾虛胃癌癌前病變大鼠胃、空腸組織形態(tài)的影響(X±SD)

注與空白對照組比較*P＜0.05；與脾虛模型組比較ΔP＜0.05；四、結(jié)論本發(fā)明藥物能夠改善脾虛萎縮性大鼠的癥狀，升高血清胃泌素的含量，糾正胃粘膜壞死萎縮、胃腺體囊性擴張、異型增生、腸腺化生、胃粘膜下充血水腫及空腸充血水腫、上皮細胞壞死脫落的病理變化，其作用優(yōu)于麗珠得樂和正大養(yǎng)胃沖劑。
試驗例2本發(fā)明藥物對脾虛胃癌癌前病變小鼠的治療作用一、實驗材料1、藥物①受試藥物本發(fā)明藥物膠囊，由實施例2方法制備，每g干浸膏含原生藥10g。用蒸餾水配制成1％、2％、4％的藥液(即每ml含原生藥0.1g、0.2g、0.4g)備用。
②陽性藥物胃復(fù)春片，規(guī)格0.37g/片，由杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號000102，配制29片(10.73g)碾為細末加無菌水溶解為72.5ml。
③2-乙基亞硝胺，華西醫(yī)大腫瘤研究所提供；山西白醋由山西省美和居老陳醋有限公司生產(chǎn)，酸度3.5g/100ml，批號200012。
2、動物NIH小鼠，雌雄均有，體重18～22g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，合格證號川實動管質(zhì)(99)第6號。檢疫后備用。
二、實驗方法取NIH小鼠60只，隨機分為空白對照組(N＝10)、脾虛胃癌癌前病變模型組(N＝10)、胃復(fù)春組(N＝10)、本發(fā)明藥物膠囊高劑量組(N＝10)、本發(fā)明藥物膠囊中劑量組(N＝10)、本發(fā)明藥物膠囊低劑量組(N＝10)。除空白對照組外，其余各組按文獻{11.12.}禁食后灌胃山西白醋15ml/kg，第2-10日灌胃山西白醋10ml/kg，第11-130日灌胃2-乙基亞硝胺2.8mg/kg，復(fù)制脾虛胃癌癌前病變動物模型。第131-160日，按組分別灌胃等容積蒸餾水、胃復(fù)春藥液1.48g/kg、本發(fā)明藥物膠囊藥液0.4g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg，連續(xù)給藥30d。實驗前、造模后測定動物體重、體溫、攝食量和自發(fā)活動，以后每10d測體重1次，以便調(diào)整給藥容積；治療后同法測定動物體重、體溫、攝食量和自發(fā)活動。第161d，處死動物，剖檢后取胃組織一塊，立即投入10％甲醛液內(nèi)固定，石臘包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。
三、實驗結(jié)果1.對脾虛胃癌癌前病變小鼠脾虛癥狀的影響脾虛胃癌癌前病變模型組小鼠豎毛、拱背、自發(fā)活動減少、攝食明顯降低、體重減輕、腹脹、大便異常、部分動物肛周污移、消瘦、被毛蓬松失澤。經(jīng)本發(fā)明藥物膠囊治療后，攝食量、自發(fā)活動、體重、腹形、被毛等脾虛癥狀消失。
2、對脾虛胃癌癌前病變小鼠胃腸病理形態(tài)學(xué)的影響①剖檢觀察脾虛胃癌癌前病變模型組動物胃腸脹氣，胃粘膜變薄，空腸充血水腫。經(jīng)藥物治療后，本發(fā)明藥物膠囊高中低劑量組、胃復(fù)春組基本恢復(fù)正常。
②組織病理學(xué)觀察脾虛胃癌癌前病變模型組動物胃中重度異型增生明顯，與空白對照組比較有顯著性差異。本發(fā)明藥物膠囊高中低劑量組、胃復(fù)春組小鼠胃組織基本恢復(fù)正常，與模型對照組比較有顯著性差異。結(jié)果詳見表3。
表3本發(fā)明藥物膠囊對脾虛胃癌癌前病變小鼠胃組織形態(tài)的影響(X±SD)

注與空白對照組比較*P＜0.05；與脾虛模型組比較ΔP＜0.05；
四、結(jié)論本發(fā)明藥物能夠改善脾虛小鼠的癥狀，改善胃組織的胃癌癌前病變，能逆轉(zhuǎn)異型增生。
試驗例3本發(fā)明藥物對脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠的治療作用一、實驗材料1、藥物①受試藥物本發(fā)明藥物膠囊，由實施例1制備，每g干浸膏含原生藥10g。用蒸餾水配制成1％、2％、4％的藥液(即每ml含原生藥0.1g、0.2g、0.4g)備用。
②陽性藥物胃復(fù)春片，規(guī)格0.37g/片，由杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號020717，配制29片(10.73g)碾為細末加無菌水溶解為72.5ml。5-氟尿嘧啶，規(guī)格0.25g/10ml，由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，批號0207012，配制12ml5-Fu加無菌水至100ml(100ml∶300mg)。
2、動物BALB/c-nu/nu裸鼠108只，SPF動物，雌雄均有，8周齡。由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供。動物合格證99-6，檢疫后備用。
3、瘤源人胃癌細胞株SGC-7901懸液(3×106)由華西腫瘤研究所提供。
4、試劑TIMP1(H-150)，rabbit polyclonal IgG，購自Santa Cruz公司。
TIMP2(H-140)，rabbit polyclonal IgG，購自Santa Cruz公司。
MMP2(C-19)，goat polyclonal IgG，購自Santa Cruz公司。
uPA(M-20)，goat polyclonal IgG，購自Santa Cruz公司。
PAI-1(H-135)，rabbit polyclonal IgG，購自Santa Cruz公司。
MMP9，rabbit anti MMP-9(Ab1)，BA0573，購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。
相應(yīng)二抗及試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。
5、設(shè)備CB3201數(shù)字描記式小動物活動觀測儀 中國川北電子工業(yè)公司電子天平PA2003 上海天平儀器廠Olympus BX50光學(xué)顯微鏡 日本MIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)四川大學(xué)圖像圖形研究所
6、設(shè)施SPF(specific pathogen free condition)實驗動物屏障系統(tǒng)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，實驗動物設(shè)施環(huán)境符合SPF級標(biāo)準(zhǔn)，動物實驗合格證號99-5。
二、實驗方法1、脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠動物模型的建立及分組處理取BALB/c-nu/nu裸鼠108只。實驗第1 d將SGC-7901懸液接種于2只裸鼠腋下(0.2ml/只)，培育胃癌組織塊，待胃癌組織塊長成1cm×1cm大后將此胃癌組織塊傳代培育至實體瘤，本次實驗傳至第四代時待其長成1cmm×1cm大備用(8周)。其余自由攝食無菌全價顆粒飼料，第9周開始將其余100只裸鼠造脾虛證動物模型，實驗前禁食36h后，首次灌胃以山西白醋按15ml/kg/d，以后按10ml/kg/d灌胃6 d；第10周時，在嚴(yán)格無菌操作條件下進行手術(shù)造胃癌轉(zhuǎn)移動物模型，即在手術(shù)第1天用戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉下，手術(shù)視野皮膚消毒，并在裸鼠劍突下開-0.7cm-1cm長縱向切口，找到胃，在腺胃處切開漿膜并用荷包縫合法縫入前述傳至第四代的胃癌組織塊0.1×0.1cm后，關(guān)閉腹腔。實驗過程在SPF動物實驗室內(nèi)進行，術(shù)后將此100只裸鼠隨機分為6組，即脾虛胃癌模型組20只，西藥對照組20只，中藥對照組15只，本發(fā)明藥物膠囊低劑量組15只，本發(fā)明藥物膠囊中劑量組15只，本發(fā)明藥物膠囊高劑量組15只，手術(shù)第2天開始除脾虛胃癌模型組自由飲用無菌水外，西藥組灌胃給予5-氟尿嘧啶30mg/kg/d，中藥對照組灌胃給予胃復(fù)春1.48g/kg/d，本發(fā)明藥物膠囊低劑量組灌胃給予本發(fā)明藥物膠囊藥液100mg/kg/d，本發(fā)明藥物膠囊中劑量組灌胃給予本發(fā)明藥物膠囊藥液200mg/kg/d，本發(fā)明藥物膠囊高劑量組灌胃給予本發(fā)明藥物膠囊藥液400mg/kg/d，除模型組外均按此法治療21天(3周)，禁食24小時，脫頸椎處死，取出胃，沿胃大彎側(cè)縱向剖開，用生理鹽水洗凈食物殘渣后，將胃組織用10％的中性福爾馬林液固定待測。
實驗中每周電子天平稱一次體重、小動物活動觀測儀測定10分鐘內(nèi)的自發(fā)活動、電子天平稱24h動物的攝食量，觀察大便性狀、腹形及體表的其他表現(xiàn)。
2、病理組織學(xué)染色步驟及胃癌細胞的形態(tài)觀察將前述胃組織10％中性福爾馬林液固定48小時，逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸臘，石蠟包埋，常規(guī)切片4um，HE染色.每個標(biāo)本在10×40高倍鏡下，隨機觀察20個癌細胞核形態(tài)，并在MIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)下測量細胞核及相應(yīng)核仁的面積(截面的面積等于落在截面內(nèi)的像素點計數(shù)乘以每個測試像素點所代表的測試面積(a＝d2k2Pc))、周長(指圍繞被測試物體周邊的長度)、最大直徑、最小直徑(平面圖形的卡規(guī)直徑是指正切該圖形的兩條平行線之間的距離，它可用最大直徑、最小直徑和平均卡規(guī)直徑來描述)及形狀因子(一般指二維形狀因子，綜合反映二維形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，無量綱參數(shù)(即無單位)，當(dāng)被測物體為園時，形狀因子等于1，當(dāng)物體不規(guī)則或呈橢圓時，形狀因子小于1，反映被測物體截面的不規(guī)則程度)5種形態(tài)參數(shù)。
3、胃癌侵潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的檢測免疫組織化學(xué)染色步驟(SP法)采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的待測抗原。染色的主要過程如下1.石蠟切片脫蠟至水，用PBS液(0.01mol/L PH7.4)沖洗3次×5min.
2.3％H2O2室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10min.
3.蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。
4.10％的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加1∶100比例稀釋的一抗，37℃孵育1小時。
5.PBS沖洗，5分鐘×3次。
6.滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育30分鐘。
7.PBS沖洗，5分鐘×3次。
8.滴加第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30分鐘。
9.PBS沖洗，5分鐘×3次。
10.DAB顯色。
11.自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片。
陽性結(jié)果判定MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、uPA及PAI-1陽性物質(zhì)棕褐色至淡黃色，呈細絲狀或者細顆粒狀，MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2主要表達部位在腫瘤細胞胞漿，部分表達在腫瘤間質(zhì)細胞(包括血管內(nèi)皮細胞)胞漿及基質(zhì)；uPA及PAI-1表達部位主要在血管內(nèi)皮細胞胞漿，部分在腫瘤細胞胞漿及基質(zhì)。
MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、uPA及PAI-1基因表達的檢測首先將SP法染色切片在10×10低倍視野下進行全面觀察，尋找腫瘤內(nèi)MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、uPA及PAI-1陽性物質(zhì)最豐富區(qū)域(即“熱點”區(qū)，染色顏色最深伴/或者染色面積最多)，然后在10×20中倍視野下選擇20個熱點區(qū)，采用MIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)測量各個指標(biāo)陽性物質(zhì)的面積、平均光密度、積分光密度、平均黑度，表示它們的含量。
統(tǒng)計學(xué)處理所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±SD)，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包處理，組間比較用LSD(方差齊)和S-N-K或Tamhane(方差不齊)。
三、實驗結(jié)果1、脾虛表現(xiàn)用山西白醋灌胃6d后，實驗裸鼠的一般情況都發(fā)生了變化，攝食量、自發(fā)活動、體重下降，腹部脹大，大便變溏或呈小干顆粒狀，與造脾虛模型前有極顯著差異。實驗過程中共死亡60只動物，其中在食醋灌胃及手術(shù)雙重打擊下有47只動物死亡，后在灌胃治療中又死亡13只，特別是西藥組由于5-fu的副作用大，動物消瘦死亡多達7只，尸檢無特殊。實驗結(jié)束時，動物分別為脾虛胃癌模型組10只，西藥對照組6只，中藥對照組6只，本發(fā)明藥物膠囊低劑量組6只，本發(fā)明藥物膠囊中劑量組6只，本發(fā)明藥物膠囊高劑量組6只。
2、病理組織學(xué)觀察HE染色切片下觀察脾虛胃癌模型組癌組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈浸潤性生長，與周圍組織分界不清，癌細胞中等偏大，呈圓形、橢圓形、多邊形及不規(guī)則形，胞漿較少，核染色較深，呈橢圓形、三角形及不規(guī)則形，多數(shù)呈空泡狀，核分裂像較多，核仁粗大，位于核中央或偏位，多數(shù)具有一個核仁，少數(shù)有兩個或者以上，染色深。5個治療組癌細胞大小與模型組相似，但形狀以圓形、橢圓形居多，多邊形及不規(guī)則形減少，尤其是核的面積減小、形狀明顯變得規(guī)則、核仁數(shù)目和面積均較模型組減少。在核面積上，西藥組有顯著性差異，其余4個組差異無顯著性；核周長和核最大直徑較模型組減小，西藥組和本發(fā)明藥物高劑量組有顯著性差異，其余3組差異無顯著性；核最小直徑較模型組減小，但均無顯著性差異；代表核形狀的核形狀因子較模型組增大，其中西藥組和中藥對照組有顯著性差異，本發(fā)明藥物低、中、高劑量組有極顯著性差異；核仁面積、核仁與核面積之比較模型組減小，且5個治療組均有極顯著性差異；核仁形狀因子較模型組增大，除本發(fā)明藥物高劑量組有顯著性差異外，其余各組均差異無顯著性。結(jié)果詳見表4、表5。
表4 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織內(nèi)癌細胞核仁形態(tài)變化(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
表5 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織內(nèi)癌細胞核形態(tài)變化(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
3、胃癌侵潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達3.1 TIMP1基因的表達TIMP1基因在本發(fā)明藥物膠囊低中高三劑量組的表達較脾虛胃癌模型組、西藥對照組及中藥對照組有所增強，但差異無顯著性。結(jié)果詳見表6。
表6 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織細胞內(nèi)TIMP1含量變化(x±SD)

3.2.TIMP2基因的表達TIMP2基因在五個治療組的表達均較脾虛胃癌模型組增強，其中胃復(fù)春組、本發(fā)明藥物膠囊高、中、低劑量組與脾虛胃癌組比較有顯著性(p＜0.05)或極顯著性差異(p＜0.01)。結(jié)果詳見表7。
表7 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織細胞內(nèi)TIMP2含量的比較(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
3.3 MMP2基因的表達MMP2基因在五個治療組中的表達均較脾虛胃癌模型組減弱，其中中藥對照組、本發(fā)明藥物膠囊中劑量組與高劑量組較脾虛胃癌模型組有極顯著性差異(p＜0.01)，本發(fā)明藥物膠囊低劑量組較脾虛胃癌模型組有顯著性差異(p＜0.05)，而西藥組較脾虛胃癌模型組差異無顯著性。結(jié)果詳見表8。
表8 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織細胞內(nèi)MMP2含量的比較(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
3.4 MMP9基因的表達MMP9基因在西藥對照組中的表達較脾虛胃癌模型組有一定增強，但差異無顯著性；在中藥對照組、本發(fā)明藥物膠囊低中高三劑量組的表達較脾虛胃癌模型組減弱，且本發(fā)明藥物膠囊高劑量組較脾虛胃癌模型組有顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)果詳見表9。
表9 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織細胞內(nèi)MMP9含量的比較(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
3.5 uPA基因的表達uPA基因在五個治療組的表達均較脾虛胃癌模型組減弱，且本發(fā)明藥物中劑量組較脾虛胃癌模型組有顯著性差異(p＜0.05)，本發(fā)明藥物高劑量組較脾虛胃癌模型組有極顯著性差異(p＜0.01)。結(jié)果詳見表10。
表10 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織細胞內(nèi)uPA含量的比較(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
3.6 PAI-1基因的表達PAI-1基因在五個治療組的表達均較脾虛胃癌模型組增強，其中中藥對照組、本發(fā)明藥物低中高三劑量組較脾虛胃癌模型組有顯著性差異(p＜0.05)，西藥對照組較脾虛胃癌模型組差異無顯著性。結(jié)果詳見表11。
表11 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌組織細胞內(nèi)PAI-1含量的比較(x±SD)

注與脾虛胃癌模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
四、結(jié)論經(jīng)本發(fā)明藥物治療后，脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠癌細胞重新分化，表現(xiàn)為異型性降低，分化程度增高；脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移降低，表現(xiàn)在癌組織內(nèi)ECM降解減少，其機制之一是降解酶及其激活劑較低，同時ECM降解酶抑制劑和激活劑抑制物較高。結(jié)果提示本發(fā)明藥物不僅具有誘導(dǎo)脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠胃癌細胞重新分化的作用，而且還可通過調(diào)節(jié)ECM降解酶系與其相應(yīng)抑制劑的分泌發(fā)揮拮抗ECM消溶，起到抗胃癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移的作用。
4、小結(jié)本發(fā)明藥物由人參(紅參)、白術(shù)組成，具有健脾、益氣、抑制胃癌癌前病變的作用，主治胃癌癌前病變脾氣虛證的作用。經(jīng)主要藥效學(xué)試驗，結(jié)果如下①本發(fā)明藥物能夠改善食醋脾虛大鼠的脾虛癥狀，增加尿液D-木糖的含量，升高胸腺小體的數(shù)量，擴大脾臟T、B細胞區(qū)，提高T-淋巴細胞轉(zhuǎn)換率，糾正胃腸組織病損，提高脾虛小鼠胃腸運動的能力。
②本發(fā)明藥物能夠延長脾虛小鼠的游泳時間，增加耐缺氧、耐寒、耐高溫的能力。
③本發(fā)明藥物能夠明顯糾正胃癌癌前病變大鼠、小鼠的脾虛癥狀，改善胃粘膜萎縮、充血水腫，胃腺體囊性擴張、異型增生、腸腺化生的病理變化，糾正腸組織的病理損害。
④本發(fā)明藥物有明顯糾正胃癌轉(zhuǎn)移鼠的脾虛癥狀，抑制胃癌病變，調(diào)控胃癌基因的作用。
上述試驗結(jié)果表明，本發(fā)明藥物具有健脾、益氣、抑制胃癌癌前病變，治療脾虛胃癌癌前病變的作用。
權(quán)利要求
1.一種益氣健脾的藥物組合物，其特征在于它是含有由下述重量配比的原料制備而成的藥劑人參總皂苷5-50份、白術(shù)油1-10份、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5-50份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的益氣健脾的藥物組合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料制備而成的藥劑人參總皂苷5-50份、白術(shù)油1-10份、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5-50份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的益氣健脾的藥物組合物，其特征在于所述的人參總皂苷中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總重量百分含量占0.5-5％，所述白術(shù)油中揮發(fā)油的重量百分比≥60％，每毫升白術(shù)油中含亞油酸≥30mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的益氣健脾的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑、口服液、注射劑。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的益氣健脾的藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、取紅參藥材，加50％～80％乙醇浸泡，回流提取，濾過，合并濾液，濾液通過大孔吸附樹脂，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮，得人參總皂苷；c、取白術(shù)，食用植物油為溶劑，提取，濾過，濾液回收溶劑植物油，所得產(chǎn)物為白術(shù)油；d、取白術(shù)藥渣，加乙醇提取濾過，藥渣再與紅參藥渣混合，加水煎煮，濾過，精制，備用，得紅參和白術(shù)復(fù)合多糖；e、將b、c、d制備的人參總皂苷、白術(shù)油、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖按如下重量配比，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。人參總皂苷5-50份、白術(shù)油1-10份、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖5-50份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的益氣健脾的藥物組合物的制備方法，其特征在于步驟c所述的白術(shù)油加入到β-環(huán)糊精水溶液中，超聲包合，冷藏，離心，沉淀即得經(jīng)包合后得白術(shù)油。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的益氣健脾的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述的紅參干浸膏中人參總皂苷的重量百分含量≥60％，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總重量百分含量≥6％，白術(shù)油中揮發(fā)油的重量百分含量≥60％；d步驟紅參和白術(shù)干浸膏中的復(fù)合多糖的重量百分含量以葡萄糖計≥60％。
8.權(quán)利要求1所述的藥物組合物在制備益氣健脾的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1所述的藥物組合物在制備治療胃癌的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述的藥物是抑制和/或治療胃癌癌前病變的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種益氣健脾的藥物組合物，它是由含有人參總皂苷、白術(shù)油、紅參和白術(shù)復(fù)合多糖為原料制備而成藥劑。本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法。本發(fā)明藥物具有治療胃癌癌前病變的作用，且四個有效部位組合，藥效明確，發(fā)揮了協(xié)同增效的作用，可控性強，質(zhì)量穩(wěn)定，為臨床提供了一種新的選擇。
文檔編號A61P1/14GK1872117SQ200510021020
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月2日
發(fā)明者彭成, 郭力, 張磊, 夏厚林, 萬麗, 曹小玉 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)