專利名稱：一種可提高免疫功能的厚殼貽貝提取物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫制劑技術領域，是一種可提高免疫功能的厚殼貽貝提取物。
背景技術：
厚殼貽貝(Mytilus coruscus)是一種海洋軟體動物，富產于浙江省嵊泗列島周圍海域，它富含粗蛋白、脂肪、碳水化合物，此外還有鈣、磷、鐵、維生素等多種營養(yǎng)物質，同時，貽貝又是補腎良藥，明顯功能是補腎壯陽，益精養(yǎng)血，消癭散結，素有“元淡”之稱，在明清時被列為進貢朝廷的貢品，號稱“貢干”，現(xiàn)今已和南移的紫貽貝和睦相處，并能大量地自然繁殖，每年的養(yǎng)殖產量已達近二萬噸。不僅原料充足，而且由于生長環(huán)境的水質良好，品質上乘。據(jù)上海市衛(wèi)生防疫站對嵊山貽貝的鑒定，甲肝病毒為陰性、未檢出副溶血性弧菌、揮發(fā)性鹽基氮和鎘等，均符合國家規(guī)定的指標。有報道，紫貽貝和翡翠貽貝的酶水解提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、降血壓、降血脂、提高免疫力等作用(洪鵬志等.翡翠貽貝肉酶解動物蛋白營養(yǎng)評價及其生理活性初探水產學報Vol.26，No.l，F(xiàn)eb.，2002；5-4貝類多糖抗腫瘤作用的研究胡健饒等.CarcinogenesisTemtogenesis and Mutagenesis Vol.11，No.6 1999)但至今未見有關厚殼貽貝的堿提取物具有提高免疫功能的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種厚殼貽貝堿提取物，經動物實驗，證明其具有提高免疫功能的作用。本發(fā)明提取物的制備方法如下1.制備勻漿液厚殼貽貝洗凈，去殼，將其軟組織用攪拌機打碎勻漿；
2.制備提取液將上述勻漿液離心取沉淀，加入1％的甲醇浸泡24小時去脂，離心取沉淀，加入1％NaOH煮沸10小時，趁熱抽濾得到濾液，再按濾液的1/2體積加入正丁醇分別萃取三次，將萃取后的水相用旋轉蒸發(fā)儀在50℃減壓濃縮，用0.5％活性炭脫色后加3倍體積的乙醇沉淀過夜，棄上清，沉淀自然干燥，得到塊狀及粉末狀灰白色固體，加雙蒸水在沸水浴中溶解，sevage法(氯仿與正丁醇的體積比為4∶1)萃取多次以去除蛋白至水相不含蛋白質，得到提取液；3.制備厚殼貽貝提取物將上述提取液加三倍體積的乙醇沉淀過夜，棄上清，自然干燥即得本發(fā)明厚殼貽貝提取物。
動物實驗是將上述提取物制成注射液，腹腔注射小鼠，能顯著提高免疫功能，因此本發(fā)明厚殼貽貝提取物可用于制備提高免疫力的制劑。


圖1為本發(fā)明厚殼貽貝提取物對正常小鼠免疫功能的影響2為本發(fā)明厚殼貽貝提取物對小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應的左右足掌體積差影響3為本發(fā)明厚殼貽貝提取物對小鼠溶血空斑數(shù)的影響4為本發(fā)明厚殼貽貝提取物對小鼠碳廓清能力的影響圖具體實施方式
現(xiàn)結合實施例，對本發(fā)明作詳細描述。
實施例1制備厚殼貽貝提取物厚殼貽貝洗凈，去殼，將其軟組織用攪拌機打碎勻漿；離心取沉淀44.5克，加入1升1％的甲醇浸泡24小時去脂，離心取沉淀，加入1升1％NaOH煮沸10小時后趁熱抽濾得到濾液1240ml，再加入1/2體積的正丁醇萃取三次，將萃取后的水相用旋轉蒸發(fā)儀在50℃減壓濃縮至600ml，加入0.5％活性炭脫色后加3倍體積乙醇沉淀過夜，棄上清，沉淀放入蒸發(fā)皿中自然干燥，得到塊狀及粉末狀灰白色固體3.2g，加入250ml雙蒸水在沸水浴中溶解，sevage法(氯仿與正丁醇的體積比為4∶1)萃取8次除去蛋白至水相不含蛋白質，得到提取液160ml；加三倍體積量的乙醇沉淀過夜，棄上清，沉淀自然干燥，得厚殼貽貝提取物1.421g。
實施例2小鼠免疫實驗1.試劑甲醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、酸化異丙醇、印度墨汁、Na2CO3華美試劑公司產品；MTT、PHA、瑞氏染液、NP40、percoll分離液生工生物工程有限公司產品；新鮮綿羊紅血球(SRBC)由上海長海醫(yī)院檢驗科提供；LDH試劑盒南京建成生物試劑有限公司產品；Earles液NaCl6.8g，KCl0.4g，NaH2PO4·H2O0.14g，MgSO4·7H2O0.2g，葡萄糖1g，10％酚紅1ml，加雙蒸水至100ml，再加2％CaCl210ml，加雙蒸水至1000ml，加熱溶解后濾過分裝，8磅高壓滅菌，4℃保存；腸毒內毒素由上海長海醫(yī)院中心實驗室提供；Alsever液葡萄糖2.05g，NaCl0.42g，枸櫞酸鈉·H2O0.8g，檸檬酸0.55g加雙蒸水到100ml，加熱溶解后濾過分裝，8磅高壓滅菌，4℃保存；2.厚殼貽貝產自浙江省嵊泗市嵊山鎮(zhèn)海域；3.昆明種小鼠、Balb/c小鼠、豚鼠血清由第二軍醫(yī)大學動物中心提供；4.K562細胞株由中科院細胞所提供；
5.實驗方法5.1.小鼠脾淋巴細胞轉化實驗昆明種小鼠24只，體重18-20g，雌性，隨機分成4組，每組6只，除對照組外，其它3組為本發(fā)明提取物低、中、高劑量組，濃度分別為2mg/ml、4mg/ml、7.5mg/ml，每鼠均注射0.1ml，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射13天，第14天引頸法處死小鼠，剖取小鼠脾臟，將其通過200目鋼絲網，用Hank’s液清洗后離心，用Hank’s液制成脾淋巴細胞懸液(1×106/ml)，將脾淋巴細胞用RPMI-1640(10％胎牛血清及20μg/mlPHA)1ml懸浮，37℃，5％CO2培養(yǎng)48小時后離心，去上清，取細胞涂片，干燥，瑞氏染色。觀察計數(shù)200個淋巴細胞，根據(jù)轉化的形態(tài)學指標，計算出由母細胞轉化為具有免疫作用的淋巴細胞的轉化百分率。
以轉化百分率作圖，見圖1。由圖1可見，隨本發(fā)明提取物濃度增高，脾淋巴細胞轉化率增強(P＜0.01)，說明厚殼貽貝提取物能提高動物體非特異性的細胞免疫功能。
5.2.NK細胞活性測定Balb/c小鼠24只，體重18-20g，雌雄各半，隨機分成4組，每組6只，除對照組外，其它3組為本發(fā)明提取物低、中、高劑量組，注射劑量同前，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射10天，第11天從小鼠內眥靜脈叢取血2ml，加入肝素抗凝血的PBS中，用percoll分離其中的NK細胞，Hank’s液洗滌兩次后用含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度至1×107/ml。將培養(yǎng)24h的對數(shù)生長期的K562細胞，Hank’s液洗滌一次，用含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度至1×105/ml。在40孔板中每孔加K562細胞100μl，再加入NK細胞100μl，各孔總體積為200μl。自然釋放組以含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液代替NK細胞，最大釋放組為1％NP40代替NK細胞，每個標本需三個復孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時后離心，各孔吸出液體于EP管中，用LDH試劑盒于570nm處測定LDH釋放率，按下式計算NK細胞自然殺傷率自然殺傷率(％)＝(樣品釋放平均OD值-自然釋放平均OD值)/(最大釋放平均OD值-自然釋放平均OD值)×100％以NK細胞的自然殺傷率作圖，見圖1。由圖1可見，隨本發(fā)明提取物濃度增高，NK細胞的自然殺傷率增高(P＜0.01)，說明不同濃度的厚殼貽貝提取物均有增強小鼠NK細胞活性作用。
5.3.腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗昆明種小鼠24只，體重18-20g，雌性，隨機分成4組，每組6只，除對照組外，其它3組為本發(fā)明提取物低、中、高劑量組，注射劑量同前，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射10天后，第11天放血處死小鼠，消毒腹部，沿腹中線注入3ml冰中預冷的無菌PBS-H(含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS)，輕輕按摩腹部5分鐘，剪開腹壁，吸出滲出液，再用同樣容量的預冷PBS-H沖洗腹腔3次，合并滲出液于離心管中，離心，棄上清，用預冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞三次并懸浮細胞(106/ml)，即得巨噬細胞懸液；由雞翼下抽取靜脈血，加入5倍量的Alsever液，用PBS將紅細胞比容配成5％的濃度制成雞紅細胞懸液，用巨噬細胞懸液1ml，加入0.04ml雞紅細胞懸液，離心，棄上清。涂片，Gimsa染色，計數(shù)，計算吞噬百分比，以吞噬百分比作圖，見圖1。由圖1可見，隨本發(fā)明提取物濃度增高，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞活性增強(P＜0.01)，說明厚殼貽貝提取物也能促進單核-巨噬細胞功能。
5.4.遲發(fā)型變態(tài)反應昆明種小鼠12只，體重18-20g，雌性，隨機分成2組，每組6只，于第1天以10％SRBC 0.5ml/鼠腹腔注射致敏，實驗組注射厚殼貽貝提取物溶液0.1ml(濃度為7.5mg/ml)，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射6天，于第7天在小鼠左足掌注射50μl 10％SRBC，右足掌注射等量生理鹽水，24h后測量左右足掌之體積，以左右足掌的體積差作圖，詳見圖2。由圖2可見，隨本發(fā)明提取物濃度增高，小鼠左右足掌體積差增大(P＜0.01)，說明厚殼貽貝提取物能非常顯著地增強正常小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應。
5.5.抗體生成細胞的檢測昆明種小鼠24只，體重18-20g，雌雄各半，隨機分成4組，每組6只，除對照組外，其它3組為本發(fā)明提取物低、中、高劑量組，注射劑量同前，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射10天后，第11天給小鼠腹腔注射5％ SRBC 1ml以免疫小鼠，將免疫4天的小鼠脫頸椎法處死，剖取小鼠脾臟，將其通過200目鋼絲網，用Earles液清洗后離心，用Earles液制成細胞懸液(1×107/ml)，取試管，加入10％SRBC 0.05ml，脾淋巴細胞懸液0.1ml后置45℃水浴中混勻，再加1640瓊脂糖液(1％瓊脂糖加熱溶化后，加入等量預熱的雙倍1640液，搖勻)0.4ml，仍在水浴中混勻，迅速倒于載玻片上，置于濕盒中，溫育后加入稀釋的豚鼠血清，繼續(xù)溫育2小時，即可出現(xiàn)肉眼可見的溶血空斑。計算每個小鼠脾臟的溶血空斑數(shù)。以脾臟的溶血空斑數(shù)作圖，詳見圖3。由圖3可見，隨本發(fā)明提取物濃度增高，小鼠抗體形成細胞活性作用增強(P＜0.01)，說明厚殼貽貝提取物還能促進機體特異性的體液免疫功能。
5.6.碳廓清實驗
昆明種小鼠24只，體重18-20g，雌雄各半，隨機分成4組，每組6只，除對照組外，其它3組為本發(fā)明提取物低、中、高劑量組，注射劑量同前，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射10天后，第11天在小鼠尾靜脈注射印度墨汁0.1ml，立即計時。注入后2分鐘及10分鐘分別從內眥靜脈叢取血，加入Na2CO3，測OD值。以吞噬指數(shù)K為指標，計算白細胞對碳粒的廓清作用K＝(logOD1-logOD2)/(t2-t1)以白細胞對碳粒的廓清作用的吞噬指數(shù)K作圖，見圖4。由圖4可見，隨本發(fā)明提取物濃度增高，小鼠白細胞對碳粒的廓清作用增強(P＜0.01)。說明厚殼貽貝提取物也能促進單核—巨噬細胞功能。
本發(fā)明制備方法簡單，上述實驗證實了厚殼貽貝提取物能提高免疫系統(tǒng)中的自然殺傷細胞、巨噬細胞、淋巴細胞，促成抗體和補體的生成，增強機體非特異性的細胞免疫功能，因此本發(fā)明提取物可用于制備提高機體免疫功能的制劑。
權利要求
1.一種厚殼貽貝提取物，制備方法如下(1)制備厚殼貽貝提取液將厚殼貽貝的軟組織打碎勻漿，離心取沉淀，用1％甲醇浸泡24小時去脂，離心取沉淀，加1％NaOH煮沸10小時，趁熱抽濾得濾液，再按濾液體積的一半量加入正丁醇分別萃取3次，將萃取后的水相在50℃下減壓濃縮，用活性炭脫色后加3倍體積的乙醇沉淀過夜，棄上清，沉淀自然干燥，得灰白色固體，加雙蒸水在沸水浴中溶解，再用氯仿∶正丁醇＝4∶1進行多次萃取，以除去蛋白質，得厚殼貽貝提取液；(2)制備厚殼貽貝提取物將上述提取液加入3倍體積量的乙醇沉淀過夜，棄上清，自然干燥，得厚殼貽貝提取物。
2.權利要求1所述厚殼貽貝提取物在制備提高免疫功能制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫制劑技術領域，是一種可提高免疫功能的厚殼貽貝提取物。本發(fā)明用堿提取法從厚殼貽貝軟組織勻漿中提取有效成分，經動物試驗及細胞免疫學試驗，證明能提高免疫系統(tǒng)中的自然殺傷細胞、巨噬細胞、淋巴細胞，促進抗體和補體的生成，增強機體非特異性細胞免疫功能，因此可用于制備提高機體免疫功能的制劑。
文檔編號A61P37/04GK1682769SQ20051002439
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月15日 優(yōu)先權日2005年3月15日
發(fā)明者馮偉華, 焦炳華, 張建鵬, 劉軍華, 姚瀅, 王俊, 魏江洲 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學