專利名稱：一種牛蒡子提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取物及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種牛蒡子提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第三大嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，被WHO列為世界三大頑癥之一。在糖尿病患者中，病程超過(guò)15年以上的I型糖尿病患者有30％～40％發(fā)生腎病變，II型糖尿病患者的這一比例約為25％，如果發(fā)展到“顯性腎病”期，則病情不可逆轉(zhuǎn)。
牛蒡子為《中國(guó)藥典》2000年版一部收載的中藥，原屬于辛涼解表類中藥，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽的功能，用于風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風(fēng)疹、咽喉腫痛等癥，用量6～12g/日。
研究表明，牛蒡子具有顯著的降血糖和抗糖尿病腎病作用，但對(duì)其具有這兩種藥理作用的活性部位至今缺乏精確的定位，對(duì)其活性部位的成分組成更未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了提供一種牛蒡子提取物及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種牛蒡子提取物，其特征在于該提取物中包括以牛蒡苷元為主的總木脂素類化合物和牛蒡苷，提取物中總木脂素類化合物和牛蒡苷的重量含量占51％～80％(紫外分光光度法測(cè)定)，其它成分的重量含量占20％～49％。
所述的提取物中，牛蒡苷元的重量含量占3％～40％(高效液相色譜法測(cè)定)，牛蒡苷的重量含量占8％～60％(高效液相色譜法測(cè)定)，牛蒡苷和牛蒡苷元兩者的總重量含量占45％～75％，其余木脂素類化合物的重量含量占6％～35％(紫外分光光度法測(cè)定)。
所述的其它成分包括有機(jī)酸類化合物、不飽和烴類化合物、β-谷甾醇和胡蘿卜苷。
一種牛蒡子提取物的制備方法，其特征在于取牛蒡子藥材，粉碎成粗粉，加6～10倍重量50％～95％乙醇，回流提取2～3次，每次3～6h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至濃縮浸膏無(wú)醇味；所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，將其下層干浸膏混懸于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液無(wú)色；將萃取液減壓濃縮成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于重量5％、收率為重量8％～20％的牛蒡子提取物。
一種牛蒡子提取物的應(yīng)用，其特征在于該牛蒡子提取物應(yīng)用于制備降血糖和抗糖尿病腎病藥物。
按上述方法制備的牛蒡子提取物中含有牛蒡苷(arctiin)，牛蒡苷元(arctigenin)，羅漢松脂素(matairesinol)，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，LappaolH、Arctignan E、-谷甾醇和胡蘿卜苷10種化合物。
本發(fā)明所述的牛蒡子提取物，經(jīng)藥理試驗(yàn)證明，具有顯著的降血糖和抗糖尿病腎病作用。
本發(fā)明所述的牛蒡子提取物，經(jīng)小鼠的急性毒性試驗(yàn)表明，其小鼠的口服LD50為140.7g生藥/kg，LD50的95％可信限為154.3～128.4g生藥/kg。LD50的平均可信限為140.7±12.94g生藥/kg。
藥理和毒理試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的牛蒡子提取物藥理活性強(qiáng)，毒副作用小，可以用于制備降血糖和抗糖尿病腎病藥物。
綜上所述，我們結(jié)合藥理學(xué)、植物化學(xué)和分析化學(xué)等研究手段，首次確定了牛蒡子降血糖和抗糖尿病腎病的活性部位為其所含的總木脂素類和牛蒡苷(arctiin)，并明確了其成分組成及組成比例。
由該活性部位所構(gòu)成的牛蒡子提取物，經(jīng)小鼠的急性毒性試驗(yàn)表明，毒副作用小，在制備降血糖和抗糖尿病腎病藥物中將有較為廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為牛蒡苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖2為牛蒡苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
圖3為牛蒡苷元檢測(cè)波長(zhǎng)掃描圖；圖4為牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為牛蒡苷的HPLC圖譜；圖6為牛蒡苷元的HPLC圖譜；圖7-9為牛蒡子3批提取物的含量測(cè)定HPLC圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1一種牛蒡子提取物，其制備方法為取牛蒡子藥材，粉碎成粗粉，加5倍量50％乙醇，回流提取2次，每次3h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至濃縮浸膏無(wú)醇味。所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，將其下層干浸膏混懸于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液無(wú)色。將萃取液減壓濃縮成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。
該牛蒡子提取物干粉經(jīng)紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定(具體操作參見(jiàn)本發(fā)明實(shí)施例5)，其總木脂素類化合物和牛蒡苷的重量含量為51％～60％。
實(shí)施例2一種牛蒡子提取物，其制備方法為取牛蒡子藥材，粉碎成粗粉，加8倍量80％乙醇，回流提取3次，每次4h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至濃縮浸膏無(wú)醇味。所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，將其下層干浸膏混懸于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液無(wú)色。將萃取液減壓濃縮成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。
該牛蒡子提取物干粉經(jīng)紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定(具體操作參見(jiàn)本發(fā)明實(shí)施例5)，其總木脂素類化合物和牛蒡苷的重量含量為55％～70％。
實(shí)施例3一種牛蒡子提取物，其制備方法為取牛蒡子藥材，粉碎成粗粉，加10倍量95％乙醇，回流提取2次，每次6h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至濃縮浸膏無(wú)醇味。所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，將其下層干浸膏混懸于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液無(wú)色。將萃取液減壓濃縮成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于5％的牛蒡子提取物。
該牛蒡子提取物干粉經(jīng)紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定(具體操作參見(jiàn)本發(fā)明實(shí)施例5)，其總木脂素類化合物和牛蒡苷的重量含量為65％～80％。
實(shí)施例4一種牛蒡子提取物，進(jìn)行化學(xué)成分研究，得到牛蒡苷，牛蒡苷元，羅漢松脂素，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡蘿卜苷10種化合物，經(jīng)定性反應(yīng)鑒別，證明該提取物中還含有有機(jī)酸類化合物和不飽和烴類化合物。
具體分離流程如下將所得的牛蒡子提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以乙醚、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫，分別得到乙醚、乙酸乙酯和甲醇3個(gè)洗脫部位。
將其中的乙醚洗脫部位進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(100∶1→10∶1)梯度洗脫，100ml收集一個(gè)流份。其中流份15-16經(jīng)分離純化得到-谷甾醇，55-60經(jīng)分離純化得到羅漢松脂素和牛蒡苷元。
將其中的乙酸乙酯洗脫部位進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(50∶1→10∶1)梯度洗脫，100ml收集一個(gè)流份，流份62-73經(jīng)分離純化得到Lappaol A，流份105-106經(jīng)分離純化得到Lappaol F，流份117-120經(jīng)分離純化得到Lappaol C，流份141-142經(jīng)分離純化得到Arctignan E，流份156-160經(jīng)分離純化得到胡蘿卜苷和牛蒡苷，流份169-171經(jīng)分離純化得到Lappaol H。
取所得的牛蒡子提取物30mg，溶于95％乙醇，定容至100ml，得牛蒡子提取物的乙醇溶液。以該溶液進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分檢測(cè)，結(jié)果表明，除了上述分離得到的化合物外，該提取物中還含有有機(jī)酸類化合物和不飽和烴類化合物。具體操作如下點(diǎn)一滴上述溶液于濾紙片上，噴灑0.1％溴酚藍(lán)溶液(溶于70％乙醇中)，立即在藍(lán)色背景上顯示出黃色的斑點(diǎn)。再噴灑氨水，然后暴露在鹽酸氣體中，背景逐漸由藍(lán)色變?yōu)辄S色，而有機(jī)酸鹽的斑點(diǎn)仍為藍(lán)色，證明該牛蒡子提取物中含有有機(jī)酸類化合物。
取上述溶液1ml于試管中，加入適量溴水，振蕩，溴水褪色，證明該牛蒡子提取物中含有不飽和烴類。
實(shí)施例5將本發(fā)明所述的牛蒡子提取物，采用紫外分光光度法，以牛蒡苷元為外標(biāo)，于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定其總木脂素類及牛蒡苷的含量，相應(yīng)得出該提取物中其他成分的百分含量。具體操作如下1儀器與材料1.1材料本項(xiàng)研究所用牛蒡子原藥材購(gòu)自徐州醫(yī)藥股份有限公司藥材分公司，產(chǎn)地江蘇徐州。經(jīng)上海交通大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)課題組劉忠副教授鑒定，確定為菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)，研究所用藥物為牛蒡子提取物；牛蒡苷元對(duì)照品購(gòu)自Sigma公司。
1.2儀器FA2004N型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UNICO UV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；2方法學(xué)考察2.1對(duì)照品溶液的配制精密稱取干燥至恒重的牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品9.2mg，置于干燥的100ml容量瓶中，用甲醇超聲溶解，濾過(guò)后定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。
2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定用紫外分光光度法在200nm～600nm范圍內(nèi)對(duì)以上配制的牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3。
由圖3確定牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)品紫外分光光度法的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。
2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對(duì)照品溶液，分別稀釋定容至以下濃度4.6、2.3、1.15、0.575(×10-2mg/ml)，于波長(zhǎng)280nm處測(cè)定吸收度，隨行試劑空白，結(jié)果見(jiàn)表1。以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖4。
表1吸光度—濃度值數(shù)據(jù)


得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A＝0.157×C-0.014，r＝0.9999(n＝5)，線性范圍在(0.575～9.2)×10-2mg/ml之間。
2.4精密度試驗(yàn)精密吸取牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項(xiàng)下方法操作，測(cè)試儀器精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。連續(xù)重復(fù)測(cè)定5次，RSD為0.962％。
表2精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.5重現(xiàn)性考察分別精密稱取相同質(zhì)量的牛蒡子提取物5份，用甲醇定容于100ml容量瓶中。取適量樣品液，于波長(zhǎng)280nm處測(cè)定吸收度，見(jiàn)表3。該批樣品的RSD為0.98％.
表3重現(xiàn)性考察數(shù)據(jù)

2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別取3份已知含量的樣品液1.5ml，分別加入0.5ml、1ml、1.5ml對(duì)照品溶于治療哮喘，該制劑在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，可以很方便的用于病人。
取本發(fā)明制劑樣品1支，用0.9％氯化鈉溶液100ml、5％葡萄糖溶液100ml溶解，放置。分別于第0、4、8小時(shí)測(cè)定，與0小時(shí)比較。結(jié)果見(jiàn)下表。
配伍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明注射用多索茶堿配伍使用時(shí)，溶液的pH值、含量、澄明度及有關(guān)物質(zhì)未發(fā)生明顯變化，表明制劑在使用過(guò)程能保持穩(wěn)定。
為進(jìn)一步研究本發(fā)明注射用多索茶堿的穩(wěn)定性，對(duì)其進(jìn)行了影響因素試驗(yàn)，我們按制劑處方2加工樣品，進(jìn)行影響因素試驗(yàn)。
1、高溫試驗(yàn)取本品置于60℃條件，放置10天，于0、5、10天測(cè)定樣品，比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果見(jiàn)下表。
注射用多索茶堿高溫考察結(jié)果

結(jié)論本發(fā)明注射用多索茶堿在高溫60℃條件下的外觀性狀，含量、有關(guān)物質(zhì)、pH值、澄明度基本無(wú)變化。
2、高濕試驗(yàn)取本品置于濕度95％±5條件，放置10天，于0、5、10天測(cè)定樣品，比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)。<p>實(shí)施例6將本發(fā)明所述的牛蒡子提取物，采用高效液相色譜法，以牛蒡苷、牛蒡苷元為外標(biāo)，通過(guò)積分面積比，測(cè)定其牛蒡苷元和牛蒡苷的含量。將實(shí)施例2中所測(cè)得的總木脂素類及牛蒡苷的含量減去本實(shí)施例中測(cè)得的牛蒡苷元和牛蒡苷的總含量，即得本提取物中其余總木脂素類的含量。具體操作如下1材料與儀器1.1實(shí)驗(yàn)材料本項(xiàng)研究所用牛蒡子原藥材購(gòu)自徐州醫(yī)藥股份有限公司藥材分公司，產(chǎn)地江蘇徐州。經(jīng)上海交通大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)課題組劉忠副教授鑒定，確定為菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)，研究所用藥物為牛蒡子提取物。
1.2儀器島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp型，SPD-10AVP紫外檢測(cè)器，CLASS-VPVer.6.12色譜工作站，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器)，F(xiàn)A2004N型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，UNICO UV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)。
1.3試劑牛蒡苷元對(duì)照品(Sigma公司)，牛蒡苷對(duì)照品(自制，經(jīng)UV、IR、MS、NMR完成結(jié)構(gòu)鑒定，HPLC含量測(cè)定，純度為98.5％)。試劑均為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)。
2方法2.1色譜條件色譜柱SymmetryshieldTM RP18(4.6×150mm，5μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相甲醇—乙腈—水(20∶20∶60)；流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫30℃，量程1.0AU/FS。
在以上色譜條件下，樣品液相色譜圖中，牛蒡苷及牛蒡苷元與其它組分的色譜峰分離度良好。
2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇將配制的牛蒡苷元對(duì)照品溶液在UNICO UV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行掃描，測(cè)定其吸收波長(zhǎng)，在230nm和280nm處均有較強(qiáng)吸收。選擇不同的波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在230nm處測(cè)定，色譜基線易波動(dòng)，故選擇確定280nm成；記錄室性早搏(VP)的發(fā)生時(shí)間，并統(tǒng)計(jì)室性心動(dòng)過(guò)速(VT)、室顫(VF)的發(fā)生率和竇性節(jié)律恢復(fù)率。各組大鼠VP發(fā)生時(shí)間、VT發(fā)生率、VF發(fā)生率和竇性節(jié)律恢復(fù)率如表2所示。
表2

第3和4組與第1組相比具有顯著差異P＜0.05。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明掛金燈甾類化合物具有抗烏頭堿誘發(fā)的心律失常作用。
(3)掛金燈甾類化合物對(duì)氯仿誘發(fā)的室顫的影響本實(shí)驗(yàn)分4組進(jìn)行，每組10只、體重為18～22g的昆明種小鼠，第1組小鼠按體重每千克靜脈注射10mL生理鹽水；第2組小鼠按體重每千克靜脈注射5mg掛金燈甾類化合物；第3組小鼠按體重每千克靜脈注射15mg掛金燈甾類化合物；第4組小鼠按體重每千克靜脈注射75mg掛金燈甾類化合物；注射2～3min內(nèi)將小鼠逐個(gè)放入含有氯仿、倒置的燒杯中(用5mL氯仿浸濕棉球后放入500mL的燒杯，每次換鼠向棉球補(bǔ)加0.5mL氯仿)，小鼠停止呼吸后立即取出，與BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連掃描心電，記錄室顫發(fā)生率。各組小鼠室顫發(fā)生率如表3所示。
表3

第2、3和4組與第1組相比具有顯著差異P＜0.05。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明掛金燈甾類化合物具有抗氯仿誘發(fā)的心律失常作用。
(4)掛金燈甾類化合物對(duì)垂體后葉素誘發(fā)的心肌缺血的保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)分4組進(jìn)行，每組14只、體重為200～230g的健康Wistar大鼠，第1組健康Wistar大鼠按體重每千克靜脈注射10mL生理鹽水；第2組健康、對(duì)垂體后葉素敏感(按體重每千克舌下靜脈注射垂體后葉素1U后心電圖T波明顯抬高，ST段抬高超過(guò)0.1mV)的Wistar大鼠按體重每千克靜脈注射10mL生理鹽水；第3組健康、對(duì)垂體后葉素敏感的Wistar大鼠按體重每千克靜脈注射5mg掛考察結(jié)果可見(jiàn)，精密度良好，說(shuō)明HPLC法系統(tǒng)誤差小。
3.4重現(xiàn)性試驗(yàn)取六份(沈陽(yáng))的樣品，分別按含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表10表10重現(xiàn)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好。
3.5加樣回收率試驗(yàn)取樣品(牛蒡苷含量5.62％)0.25g，精密稱定，置50ml具塞三角瓶中，加入牛蒡苷對(duì)照品液10.0ml(1.005mg/ml)。按樣品制備方法進(jìn)行操作，結(jié)果見(jiàn)表11表11牛蒡苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果

取樣品(苷元含量為1.00％)0.5g，精密稱定，置50ml具塞三角瓶中，加入牛蒡苷元對(duì)照品溶液5.0ml(0.9906mg/ml)，按樣品制備方法進(jìn)行操作，結(jié)果見(jiàn)表12表12牛蒡苷元加樣回收率測(cè)定結(jié)果

具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十一的不同點(diǎn)是含掛金燈甾類化合物的藥物組合物按重量百分比由70％的掛金燈甾類化合物、20％的苦參堿和10％的大黃制成。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式含掛金燈甾類化合物的藥物組合物按重量百分比由45～55％的掛金燈甾類化合物、25～35％的苦參堿和15～25％的小檗堿制成。
本實(shí)施方式制成的藥物組合物用于治療心律失常。表6是本實(shí)施方式藥物組合物治療心律失常的臨床藥效學(xué)報(bào)告。
用法用量每日服三次，每次按病人體重每千克服用本實(shí)施方式藥物組合物45mg。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，昆明種小白鼠58只，6周齡，體重25±2g，雌雄各半，隨機(jī)分組。由中科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
1.2實(shí)驗(yàn)藥物本項(xiàng)研究所用牛蒡子原藥材購(gòu)自徐州醫(yī)藥股份有限公司藥材分公司，產(chǎn)地江蘇徐州。經(jīng)本院生藥學(xué)課題組劉忠副教授鑒定，確定為菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)，研究所用藥物為牛蒡子提取物；陽(yáng)性對(duì)照藥為優(yōu)降糖(上海信誼藥業(yè)有限公司)，葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司)。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物分組空白對(duì)照組雌雄各4只。不造模，不給藥，給等量生理鹽水。
陰性對(duì)照組雄性7只，雌性3只。造模，不給藥，給等量生理鹽水。
陽(yáng)性對(duì)照組雌雄各5只。造模，給陽(yáng)性藥。
實(shí)驗(yàn)藥物組雌雄各5只。造模，給牛蒡子提取物。
2.2糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立小鼠禁食12小時(shí)后，腹腔注射四氧嘧啶(ALX)100mg/kg。即配制ALX溶液10mg/ml，以小鼠體重×0.01計(jì)注射量(如25g小鼠注射0.25ml ALX)。但最大計(jì)量不宜超過(guò)0.3ml。
造模當(dāng)晚及第二日注意觀察小鼠狀態(tài)，急救因血糖過(guò)低明顯發(fā)生痙攣的小鼠，即以飽和葡萄糖溶液灌胃0.2ml/只。
2.3給藥造模2天后開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥8天，給藥途徑為灌胃。
據(jù)藥典，給藥量人以10g/60kg計(jì)算，換算為小鼠140g/60kg，即2.3g/kg。
稱取牛蒡子提取物4.8g溶于15ml水中，即得0.32g/ml。給藥前每只小鼠先稱重，如體重30g的灌胃0.2ml、20g的灌胃0.13ml，依此類推。給藥量為2.1g藥/kg小鼠。
優(yōu)降糖取4片(2.25mg/片)，即4×2.25＝9mg溶于15ml雙蒸水中，得到0.6mg/ml，以“小鼠體重/2×0.01”計(jì)量給藥，如體重26g的給藥0.13ml。給藥量為3mg藥/kg小鼠。
2.4血糖測(cè)定第8天給藥1小時(shí)后，小鼠眼內(nèi)眥取血1ml左右于appendoff管中，而后處垂直彎折延伸。一抵靠部自彈性臂一端向收容空間側(cè)凸伸彎折，其可卡設(shè)于電子卡側(cè)設(shè)置的凹口而將電子卡鎖定。第二接觸部是自彈性臂向下凸伸的弧形凸起。第一檢測(cè)端子的彈性臂所在平面與第二檢測(cè)端子的彈性臂所在平面大致垂直。
本實(shí)用新型較現(xiàn)有電子卡連接器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，檢測(cè)準(zhǔn)確，且在電子卡插入正確位置后能將其鎖定。

圖1是一現(xiàn)有技術(shù)電子卡連接器的分解圖；圖2是一根據(jù)本實(shí)用新型的電子卡連接器的立體圖；圖3是圖2中電子卡連接器除去遮蔽殼體的俯視圖；圖4是圖3中的電子卡連接器拆下檢測(cè)開(kāi)關(guān)時(shí)的立體分解圖；圖5是圖3中檢測(cè)開(kāi)關(guān)的立體圖；圖6是圖5中檢測(cè)開(kāi)關(guān)的前視圖；圖7是圖5中檢測(cè)開(kāi)關(guān)的后視圖；圖8(a)是圖5中檢測(cè)開(kāi)關(guān)檢測(cè)一電子卡插入前的立體圖；圖8(b)是圖5中檢測(cè)開(kāi)關(guān)檢測(cè)一電子卡插入后的立體圖。
圖中符號(hào)說(shuō)明

2實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物分組空白對(duì)照組雌雄各5只。不造模，不給藥，給等量生理鹽水。
陰性對(duì)照組雌雄各5只。造模，不給藥，給等量生理鹽水。
陽(yáng)性對(duì)照組雌雄各5只。造模，給陽(yáng)性藥。
實(shí)驗(yàn)藥物組雌雄各5只。造模，給牛蒡子提取物。
2.2糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立造模前大鼠禁食12h，鏈脲佐茵素(STZ)臨用前用0.1mol/L，PH4.0的枸櫞酸酸緩沖液配成1％的濃度，以55mg/kg體重的劑量，腹腔內(nèi)一次性注射。72h后檢測(cè)空腹血糖和尿糖水平，以血糖＞16.7mmol/L且尿糖檢測(cè)在+++～++++以上作為模型入選?？瞻讓?duì)照組僅予以等量的枸櫞酸緩沖波腹腔注射。
2.3動(dòng)物的給藥確定造模大鼠達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)后，穩(wěn)定3天后開(kāi)始灌胃用藥。實(shí)驗(yàn)藥物組每只鼠每日予0.5ml藥液(相當(dāng)于2.5g生藥的提取物)灌胃，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組每只予0.5ml自來(lái)水灌胃。每天統(tǒng)計(jì)各籠大鼠的飲水量，每周統(tǒng)計(jì)各籠大鼠的進(jìn)食量，每周稱量各大鼠的體重變化。
2.4標(biāo)本收集與處理用藥后第6周時(shí)用代謝籠收集大鼠24h尿液，離心，計(jì)總量，保存于-30冰箱中。第6周末稱量大鼠的體重，在無(wú)菌條件下，以戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血約6ml，分別用于血肌酐及血脂等生化指標(biāo)(2ml)、血常規(guī)及糖化血紅蛋白(2ml)檢測(cè)，所用的試管分別為普通管、肝素抗凝管。取雙腎稱重，用于計(jì)算腎重/體重比(即腎臟肥大指數(shù))。雙腎沿正中剖開(kāi)，左腎置于10％中性福爾馬林液中固定，用于病理檢測(cè)。
2.5常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)血肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及甘油三酯、膽固醇等生化指標(biāo)采用日立7170型自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。外周血糖化血紅蛋白(HbA1C)采用羅氏(Roche)診斷試劑有限公司的糖化血紅蛋白試劑盒檢測(cè)。尿肌酐采用堿性苦味酸法，尿蛋白用考馬斯亮蘭法。
2.6腎組織病理學(xué)檢查

測(cè)定溶出度方法為轉(zhuǎn)籃法，溶出介質(zhì)為500ml水，溫度37℃，轉(zhuǎn)速為100r/min，以薯蕷皂苷元計(jì)算。
以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明范圍加以限制。
實(shí)施例1滴丸(未包衣丸即素丸1)

制劑工藝將22g聚乙二醇6000、8g泊洛沙姆置化料罐中，化料罐溫度為85℃，使其熔融，攪拌均勻，加入10g處方量(原藥材穿山龍、槐米、雪膽3.03∶4.54∶1)的穿山龍、槐米、雪膽提取浸膏，攪拌均勻；將滴丸機(jī)預(yù)熱，貯液室溫度即滴制溫度恒溫為90℃，冷凝介質(zhì)采用大豆油，預(yù)冷至溫度為6-10℃，調(diào)節(jié)滴頭至冷凝液距離30cm。將藥液倒入貯液室，啟動(dòng)閥門，將藥液滴入至冷凝液當(dāng)中，于收集口收集滴丸，吸除表面冷凝液，即得。
實(shí)施例2滴丸(未包衣丸即素丸2)

制劑工藝將25g聚乙二醇6000置化料罐中，化料罐溫度為90℃，使其熔融，攪拌均勻，加入10g處方量(原藥材穿山龍、槐米、雪膽3.03∶4.54∶<p>3.2.2第4周末及6周末尿白蛋白的變化見(jiàn)表17。
表17第4周末及6周末尿白蛋白的變化

與空白對(duì)照組比較#P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較★P＜0.05。
3.3組織病理學(xué)檢查結(jié)果3.3.1HE及PAS染色光鏡下顯示正常大鼠腎小球血管開(kāi)放，結(jié)構(gòu)清晰，HE染色后腎小球膠原組織呈細(xì)線型分布。6周糖尿病陰性對(duì)照組大鼠腎小球系膜細(xì)胞輕中度增生，伴基質(zhì)輕度增多，部分呈局灶節(jié)段樣基質(zhì)增多，PAS染色物質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張；腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)張力空泡、脂肪變和水樣變性；間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴腎小管細(xì)胞再生。腎細(xì)動(dòng)脈管壁增厚。實(shí)驗(yàn)藥物組上述病理改變較輕，僅見(jiàn)基質(zhì)輕度增多，系膜細(xì)胞多為正常，腎小動(dòng)脈無(wú)明顯病變，多數(shù)可見(jiàn)腎小球形態(tài)基本正常者，少數(shù)腎小球毛細(xì)血管壁有增厚現(xiàn)象，但未見(jiàn)腎小球基底膜斷裂，亦未見(jiàn)全部硬化的廢棄腎小球，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，間質(zhì)炎癥不明顯。
3.3.2u-PA、PAI-1、c-fos、c-jun的變化見(jiàn)表18。
表18大鼠腎組織u-PA、PAI-1和c-fos、c-jun免疫組化染色半定量結(jié)果

與空白對(duì)照組比較#P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較★P＜0.05。
本實(shí)驗(yàn)c-fos、c-jun免疫組化染色半定量結(jié)果大體為陰性對(duì)照組＞實(shí)驗(yàn)藥物組＞空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組陽(yáng)性染色主要分布在腎小球系膜細(xì)胞腦漿及部分毛紉血管壁，實(shí)驗(yàn)藥物組上述病變程度與陰性對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.05)。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明牛蒡子提取物可促進(jìn)糖尿病大鼠腎組織u-PA的表達(dá)，減輕腎組織PAI-1的表達(dá)，對(duì)減輕細(xì)胞外基質(zhì)有一定的作用。
綜合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，牛蒡子提取物可有效降低糖尿病大鼠的腎重/體重比，減少其尿微量白蛋白及24小時(shí)尿蛋白、內(nèi)生肌酐清除率，減少尿蛋白的排泄率，說(shuō)明它可能通過(guò)減輕DN大鼠腎臟的高濾過(guò)、高灌注，從而保護(hù)腎功能。
實(shí)施例9將本發(fā)明所述的牛蒡子提取物用于進(jìn)行小鼠的急性毒性試驗(yàn)，得小鼠的口服半數(shù)致死率LD50為140.7g生藥/kg。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前述試驗(yàn)有效劑量，表明該牛蒡子提取物毒副作用小，在開(kāi)發(fā)制備臨床用藥方面前景廣闊。
方法昆明種小鼠，SPF級(jí)，6-8周齡，18-22g。適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察2天后，禁食不禁水過(guò)夜，次日稱重、編號(hào)，給藥組分為5個(gè)劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。以“不等濃度等容積”的原則給藥，各組小鼠按等比級(jí)數(shù)1∶0.85分別灌胃給予受試藥物32ml/kg。以后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7天動(dòng)物的毛色、自發(fā)活動(dòng)、飲食、體重等，記錄死亡癥狀和時(shí)間，7天后處死動(dòng)物，解剖觀察小鼠各組織、臟器有無(wú)異常變化。
表19小鼠死亡率

注表內(nèi)為“死亡數(shù)/動(dòng)物數(shù)”。
表20藥物對(duì)雄性小鼠體重的影響(X±s，g)


注“()”內(nèi)為動(dòng)物數(shù)，下同。
表21藥物對(duì)雌性小鼠體重的影響(X±s，g)

表22藥物對(duì)小鼠耗食量的影響(g/只)

結(jié)論牛蒡子提取物的小鼠口服LD50為140.7g生藥/kg。LD50的95％可信限為154.3～128.4g生藥/kg。LD50的平均可信限為140.7±12.94g生藥/kg。
參考實(shí)施例4和實(shí)施例5，牛蒡子提取物的小鼠LD50遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其有效劑量，表明其毒副作用小，在開(kāi)發(fā)制備臨床用藥方面前景廣闊。
權(quán)利要求
1.一種牛蒡子提取物，其特征在于該提取物中包括以牛蒡苷元為主的總木脂素類化合物和牛蒡苷，提取物中總木脂素類化合物和牛蒡苷的重量含量占51％～80％(紫外分光光度法測(cè)定)，其它成分的重量含量占20％～49％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛蒡子提取物，其特征在于所述的提取物中，牛蒡苷元的重量含量占3％～40％(高效液相色譜法測(cè)定)，牛蒡苷的重量含量占8％～60％(高效液相色譜法測(cè)定)，牛蒡苷和牛蒡苷元兩者的總重量含量占45％～75％，其余木脂素類化合物的重量含量占6％～35％(紫外分光光度法測(cè)定)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛蒡子提取物，其特征在于所述的其它成分包括有機(jī)酸類化合物、不飽和烴類化合物、β-谷甾醇和胡蘿卜苷。
4.一種牛蒡子提取物的制備方法，其特征在于取牛蒡子藥材，粉碎成粗粉，加6～10倍重量50％～95％乙醇，回流提取2～3次，每次3～6h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至濃縮浸膏無(wú)醇味；所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，將其下層干浸膏混懸于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液無(wú)色；將萃取液減壓濃縮成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于重量5％、收率為重量8％～20％的牛蒡子提取物。
5.一種牛蒡子提取物的應(yīng)用，其特征在于該牛蒡子提取物應(yīng)用于制備降血糖和抗糖尿病腎病藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛蒡子提取物及其制備方法和應(yīng)用，該提取物中包括以牛蒡苷元為主的總木脂素類化合物和牛蒡苷，提取物中總木脂素類化合物和牛蒡苷的重量含量占51％～80％(紫外分光光度法測(cè)定)，其它成分的重量含量占20％～49％。經(jīng)藥理和毒理試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明牛蒡子提取物藥理活性強(qiáng)，毒副作用小，可以用于制備降血糖和抗糖尿病腎病藥物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1864705SQ20051002583
公開(kāi)日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月16日
發(fā)明者徐朝暉, 賈偉, 邱明豐, 趙愛(ài)華 申請(qǐng)人:上海諾仁生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司