專利名稱：對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種中藥制備技術領域的方法，具體地說，是一種對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法。
背景技術：
買麻藤主要分布于我國云南南部，廣東等省及東南亞地區(qū)，在民間與小葉買麻藤混用，治療風濕性關節(jié)炎，腰肌老損，筋骨酸軟，跌打損傷，潰瘍出血，支氣管炎等疾病。經(jīng)藥理動物實驗證實買麻藤乙醇提取物對大鼠蛋清性及酵母性關節(jié)炎有明顯的抗炎作用，但在抗腫瘤方面并沒有文獻報道。
經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，陳浩、林茂在1999年《中草藥》第8期“大葉買麻藤化學成分研究”一文中提到，對大葉買麻藤粗提液采用聚酰胺、硅膠為固定相，水-乙醇、氯仿-甲醇、甲醇-水為流動相進行多次柱層析，得到15個化合物，但用該方法所制備的物質(zhì)是否具有抗腫瘤效果尚未明確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，使其經(jīng)過加熱回流提取以及柱層析淋洗后，提高其洗脫液對人肝癌細胞株BEL-7402的抑制效果。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明以買麻藤藤為原料，采用溶劑提取法、真空濃縮、溶劑萃取法、冷凍干燥和柱層析工藝方法制備而成。
本發(fā)明具體步驟如下(1)將買麻藤的藤晾干后，在20-30℃下干燥，再粉碎成40目顆粒；(2)用10倍于買麻藤藤粉碎物重量的混合溶劑，混合溶劑中的乙醇∶去離子水的體積比為7∶3；(3)50-90℃下加熱回流提取四次，1次2小時，45℃下真空濃縮，將混合溶劑提取物濃縮成浸膏；(4)利用頻率為100KHZ的超聲波，用去離子水溶解膏狀物后，等體積乙酸乙酯萃取6次；(5)將乙酸乙酯萃取物45℃下真空濃縮至干后，聚酰胺(14-100目)為固定相，去離子水—乙醇為流動相梯度洗脫；(6)洗脫液45℃下真空濃縮，-40℃下冷凍干燥，得到深褐色粉末狀物；(7)用5％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成懸液。
從對買麻藤藤莖進行化學成分研究發(fā)現(xiàn)，其中含有異丹葉大黃素、白藜蘆醇、胡蘿卜苷、硬脂酸、買麻藤戊素、買麻藤醇、β-谷甾醇、買麻藤丙素和異丹葉大黃素-3-O-β-D-葡萄糖苷等成分。其中異丹葉大黃素和白藜蘆醇等屬于二苯乙烯單體化合物，眾所周知，二苯乙烯單體化合物有抗菌、降血脂、降血壓、抗氧化、抗自由基以及蛋白激酶抑制作用等活性，此外尚有不同程度的抗炎活性，特別是異丹葉大黃素和白藜蘆醇具有很強的白三烯生成抑制和受體作用等活性，這可能是此洗脫液具有抑制人肝癌細胞株BEL-7402活性效果的原因。
本發(fā)明以多年生的野生植物買麻藤的藤為原料，利用其再生性優(yōu)勢，可以提供豐富的植物資源；提取工藝簡單，無需特別儀器；用人腫瘤細胞株的體外試驗表明0.063mg/ml的濃度對人肝癌細胞株BEL-7402具有顯著的抑制效果。
具體實施例方式
實施例1稱取20℃干燥后粉碎的買麻藤藤粉200g(40目粒度的細粉)，選取無水乙醇∶去離子水＝7∶3混合溶劑2000ml，50℃下加熱回流提取三次，每次2小時，45℃下真空濃縮回收溶劑，得膏狀物80.9g，用去離子水溶解，等體積乙酸乙酯萃取6次，濃縮得10.8g浸膏。取其中的1g物質(zhì)，以去離子水-乙醇為淋洗液，聚酰胺(14目)進行柱層析得有效組分，濃縮，-40℃冷凍干燥得81.4mg。
體外該組分0.063mg/ml采用磺酰羅丹明B蛋白染色法，對人肝癌細胞株BEL-7402的抑制率為87.0％。
實施例2稱取25℃下干燥后粉碎的買麻藤藤粉200g(40目粒度的細粉)，選取無水乙醇∶去離子水＝7∶3混合溶劑2000ml，70℃下加熱回流提取三次，每次2小時，45℃下真空濃縮回收溶劑，得膏狀物80.9g，用去離子水溶解，等體積乙酸乙酯萃取6次，濃縮得10.8g浸膏。取其中的1g物質(zhì)，以去離子水-乙醇為淋洗液，聚酰胺(100目)進行柱層析得有效組分，濃縮，-40℃冷凍干燥得62.3mg。
體外該組分0.25mg/ml采用磺酰羅丹明B蛋白染色法，對人肝癌細胞株BEL-7402的抑制率為63.7％。
實施例3稱取30℃干燥后粉碎的買麻藤藤粉200g(40目粒度的細粉)，選取無水乙醇∶去離子水＝7∶3混合溶劑2000ml，90℃下加熱回流提取三次，每次2小時，45℃下真空濃縮回收溶劑，得膏狀物80.9g，用去離子水溶解，等體積乙酸乙酯萃取6次，濃縮得10.8g浸膏。取其中的1g物質(zhì)，以去離子水-乙醇為淋洗液，聚酰胺(40目)進行柱層析得有效組分，濃縮，-40℃冷凍干燥得71.5mg。
體外該組分0.016mg/ml采用磺酰羅丹明B蛋白染色法，對人肝癌細胞株BEL-7402的抑制率為63.1％。
權利要求
1.一種對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將買麻藤的藤晾干后，干燥，再粉碎成40目顆粒；(2)用10倍于買麻藤藤粉碎物重量的混合溶劑，混合溶劑中的乙醇∶去離子水的體積比為7∶3；(3)加熱回流提取，真空濃縮，將混合溶劑提取物濃縮成浸膏；(4)利用超聲波，用去離子水溶解膏狀物后，等體積乙酸乙酯萃??；(5)將乙酸乙酯萃取物真空濃縮至干后，聚酰胺為固定相，去離子水—乙醇為流動相梯度洗脫；(6)洗脫液真空濃縮，冷凍干燥，得到深褐色粉末狀物；(7)用胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成懸液。
2.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的步驟(1)，其干燥溫度為20-30℃。
3.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的加熱回流提取，其溫度為50-90℃。
4.根據(jù)權利要求3所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的加熱回流提取，為四次，1次2小時。
5.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的真空濃縮，其溫度為45℃。
6.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的聚酰胺為14-100目。
7.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的超聲波，其頻率為100KHZ。
8.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的萃取，為6次。
9.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的步驟(6)，其冷凍干燥溫度為-40℃。
10.根據(jù)權利要求1所述的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，其特征是，所述的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，其濃度為5％。
全文摘要
一種屬于中藥制備技術領域的對人肝癌細胞株具有抑制效果的買麻藤提取液的制備方法，本發(fā)明包括以下步驟將買麻藤的藤晾干后，干燥，再粉碎成40目顆粒；用10倍于買麻藤藤粉碎物重量的混合溶劑，混合溶劑中的乙醇∶去離子水的體積比為7∶3；加熱回流提取，真空濃縮，將混合溶劑提取物濃縮成浸膏；利用超聲波，用去離子水溶解膏狀物后，等體積乙酸乙酯萃??；將乙酸乙酯萃取物真空濃縮至干后，聚酰胺為固定相，去離子水―乙醇為流動相梯度洗脫；洗脫液真空濃縮，冷凍干燥，得到深褐色粉末狀物；用胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成懸液。本發(fā)明提取工藝簡單，無需特別儀器；用人腫瘤細胞株的體外試驗表明0.063mg/ml的濃度對人肝癌細胞株BEL－7402具有顯著的抑制效果。
文檔編號A61P35/00GK1732999SQ200510027940
公開日2006年2月15日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權日2005年7月21日
發(fā)明者代光輝, 姚柳利, 張永煜 申請人:上海交通大學