專利名稱：一種重組卡介苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程疫苗領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明提供了一種新型的結(jié)核桿菌的重組疫苗，即將結(jié)核桿菌ag85b、esat-6及小鼠/人的IFN-γ基因克隆入BCG。
背景技術(shù)：
結(jié)核病仍對人類構(gòu)成巨大的威脅。目前全球接近32％的人口已感染了結(jié)核桿菌。每年約有270萬人死于結(jié)核病，平均每天死亡超過7000人。世界衛(wèi)生組織已于1993年宣布結(jié)核病為全球健康緊急狀態(tài)。
我國結(jié)核病疫情較嚴重，是全球22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。2000年我國第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果分析，受感染人數(shù)超過4億。在未來的十年內(nèi)可能有3000萬人發(fā)生結(jié)核病。調(diào)查顯示，我國結(jié)核病疫情仍相當(dāng)嚴重，且部分地區(qū)有蔓延趨勢。
結(jié)核病流行難以遏制主要與多重耐藥結(jié)核菌株增多以及艾滋病流行有關(guān)。
卡介苗(BCG)問世已80余年，全球大多數(shù)國家將其列入計劃免疫接種項目。實踐表明，卡介苗是一種安全的疫苗，它的副作用輕微，人體可忍受。目前已有30億以上的人接種了BCG，并且每年有1億左右的新生兒接種此疫苗。它可較好的阻止年幼兒粟粒型結(jié)核及結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生。然而，它不能保護最常見的成人肺結(jié)核的發(fā)生。有資料表明BCG對成人的保護效果有印度南部的0％到英國的80％不等。盡管發(fā)表文獻綜合有效值為50％，但據(jù)估計其對結(jié)核病死亡的預(yù)防效果僅占5％，因此，有必要開發(fā)更有效的疫苗取代現(xiàn)行BCG疫苗。
國內(nèi)外對新型結(jié)核桿菌疫苗的研究方興未艾。目前著手研究的疫苗不外乎核酸疫苗、蛋白亞單位疫苗、減毒活疫苗、重組卡介苗等。目前重組卡介苗的研究主要集中以下三方面1.重組細胞因子如IFN-γ，IL-2，IL-12及GM-CSF，能刺激更強的潛在免疫反應(yīng)；2.重組結(jié)核桿菌的保護性抗原如Ag85B，增加抗原性保護量；3.重組卡介苗缺失的保護性抗原如ESAT-6，CFP-10。最近也有報道將Ag85B和ESAT-6融合后重組進卡介苗，且對結(jié)核桿菌的保護效果比單一基因重組的好。但將結(jié)核桿菌ag85b、esat-6及小鼠(人)的IFN-γ基因克隆入BCG經(jīng)查新無相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種由上述重組質(zhì)粒制備的疫苗。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種重組疫苗的制備方法。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的重組質(zhì)粒，即將ag85b、esat-6和IFN-γ基因序列插入同一大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒序列中，從而形成重組穿梭質(zhì)粒。
上述重組質(zhì)粒中，通常將ag85b、esat-6和IFN-γ都插入同一大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的多克隆位點處，以利于插入基因的穩(wěn)定表達。
在本發(fā)明的一個實施例中，將ag85b、esat-6和IFN-γ依次插入同一大腸桿菌一結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的多克隆位點處。
本發(fā)明中，ag85b、esat-6來自結(jié)核分枝桿菌(H37RV)，IFN-γ可以是人源的，亦可以是非人源的。在本發(fā)明的一個實施例中，IFN-γ是鼠源的。
本發(fā)明的重組質(zhì)粒制備過程中，可采用的大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒有pWV261、pWV361、pSD7等。在本發(fā)明的一個實施例中，所用大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒為pWV261。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種新型的結(jié)核桿菌重組疫苗，即將上述含有ag85b、esat-6及IFN-γ基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入卡介苗，從而得到rBCG∷AEI重組疫苗。
Ag85B是Ag85復(fù)合體的一個組成部分。Ag85復(fù)合體是BCG及結(jié)核桿菌培養(yǎng)液中的主要組成部分及保護性抗原，很容易結(jié)合于人纖維連接蛋白，結(jié)合后參與疾病的形成。它也與分支桿菌細胞壁的合成有關(guān)。Ag85B是抗原性最強的一種。Ag85B在致敏的豚鼠中可誘導(dǎo)強烈的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，與PPD很相似。給鼠注射編碼Ag85B的質(zhì)粒可誘導(dǎo)針對Ag85復(fù)合體的強烈的Th1樣反應(yīng)，可特異性升高IL-2，IFN-γ及IFN-α的水平。
在Mtuberculosis.bovis傳代形成卡介苗的過程中，出現(xiàn)毒力降低，伴隨部分抗原丟失。丟失的抗原中即包括EAST-6。結(jié)核桿菌分泌蛋白ESAT-6是一種重要的T細胞抗原，是T淋巴細胞所識別的主要抗原靶位?？杀桓腥玖私Y(jié)核分支桿菌的動物模型及結(jié)核病人的保護性T淋巴細胞所識別。在鼠模型亦可誘導(dǎo)強烈的T細胞反應(yīng)；在自然感染結(jié)核分枝桿菌病例，體外實驗發(fā)現(xiàn)T細胞有強烈的針對此抗原的IFN-γ反應(yīng)。
IFN可用于治療非病毒性感染，多數(shù)為胞內(nèi)寄生菌感染。其機理并非直接殺死病原體，而是通過增強細胞免疫功能而起作用。IFN-γ治療結(jié)核桿菌感染的機理1.激活淋巴細胞非特異性細胞毒作用IFN可激活自然殺傷細胞(NK細胞)，而NK細胞是淋巴因之激活的殺傷細胞(LAK細胞)的前提之一，而γ-干擾素是刺激NK細胞，活化LAK細胞的淋巴因子，這兩種細胞都具有非特異性細胞毒活性。2.激活巨噬細胞IFN-γ是巨噬細胞活化因子(MAF)，通過激活巨噬細胞而在消除結(jié)核桿菌中發(fā)揮作用。它的功能有(1)增強巨噬細胞的粘附性、吞噬功能及胞飲活性；(2)促進巨噬細胞對葡萄糖胺的攝取；(3)通過增強胞內(nèi)氧自由基活性起抑菌或殺菌作用。3.調(diào)控主要組織相容性(MHC)抗原表達α，β干擾素能正調(diào)節(jié)I類MHC抗原(HLA-A，B，C)的表達，對II類(HLA-DR)的表達無調(diào)節(jié)作用，IFN-γ能調(diào)節(jié)某些細胞的兩類(I，II)抗原表達，這些細胞包括巨噬細胞，星膠質(zhì)細胞及成纖維細胞，其結(jié)果是大大增強了T細胞免疫應(yīng)答功能，進而又產(chǎn)生IFN-γ，這樣就形成正性反饋，逐步增強免疫功能。干擾素也能調(diào)節(jié)細胞膜上其它細胞因子受體表達，IL-2，TNF-α以及巨噬細胞Fc受體，間接增強免疫功能。因此，對于結(jié)核病患者，尤其是機體免疫功能低下的患者，用干擾素治療，為一種有效的方法。
用rBCG∷AEI重組疫苗(BCG即卡介苗，“∷”表示重組，A即Ag85B，E即ESAT-6，I即IFN-γ)免疫C57BL/c小鼠，同時分別用卡介苗(BCG)和PBS做為對照。結(jié)果顯示，所誘導(dǎo)的血清Ag85B抗體水平、ESAT-6抗體水平和脾細胞IFN-γ表達均有增高。這說明rBCG∷AEI重組疫苗可以誘導(dǎo)較BCG高的體液和細胞免疫水平，具有更好的免疫效果。
在另一方面，本發(fā)明提供上述rBCG∷AEI重組疫苗的制備方法。主要包括以下步驟
(1)結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA的制備；(2)ag85b，esat-6及IFN-γ基因的擴增；(3)ag85b、sat-6及IFN-γ基因分別插入同一個載體；(4)用含有ag85b、sat-6及IFN-γ基因的重組子轉(zhuǎn)化入卡介苗。
各種實驗參數(shù)均按常規(guī)操作選擇，可視具體的實驗條件而定。
此疫苗具有下列優(yōu)勢1.抗原譜接近結(jié)核桿菌重組BCG內(nèi)克隆入了esat-6基因，表達抗原ESAT-6，其中ESAT-6為卡介苗丟失的保護性抗原。
2.增強了保護性抗原量重組BCG內(nèi)克隆入了ag85b基因。
3.效果優(yōu)于BCG因為重組BCG是活疫苗，可持久分泌抗原，故可維持較長期的免疫效果。DNA疫苗及蛋白亞單位疫苗效果均不優(yōu)于BCG。而此新開發(fā)的疫苗由于既保留了原BCG的抗原，又增加了重要的T細胞抗原及其丟失的抗原，還融合了IFN-γ的基因，可表達IFN-γ。IFN可間接發(fā)揮抗菌作用，故效果優(yōu)于BCG。


圖1為PAEI酶切鑒定圖。1，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2，重組質(zhì)粒；3，Ag85B雙酶切；4，Esat-6雙酶切；5，IFN-γ雙酶切。
圖2為rBCG∷AEI PCR鑒定圖。6，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；7，Esat-6PCR條帶；8，IFN-γPCR條帶。
圖3為rBCG∷AEI Western blotting(蛋白質(zhì)印記雜交)圖。9，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；10，BCG條帶；11，rBCG∷AEI條帶。
具體實施例方式
實施例1重組子PAEI的構(gòu)建(1)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組DNA的制備結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)在7H9Broth液體培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)2周。80℃，2小時滅活。用細菌DNA(小量)抽提試劑盒抽提基因組DNA。其中因結(jié)核菌的壁厚，細菌的消化時間延長至3-5小時。
(2)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株ag85b，esat-6及小鼠的IFN-γ基因的擴增根據(jù)ag85b，esat-6及小鼠的IFN-γ基因及載體多克隆位點設(shè)計引物Ag85B5’端引物P1ATATGGCCAATGACAGACGTGAGCC3’端引物P2TATGAATTCGCCGGCGCCTAACGEsat-6 5’端引物P1TATTGGCCAGAATTCATGACAGAGCAGCAGTGG3’端引物P2TTAGTCGACTGCGAACATCCCAGTG小鼠的IFN-γ基因5’端引物P1AATGTCGACATGCAGGACCCGTAC3’端引物P2ATTGTTAACCTATTACTGAGAAGCACGPCR反應(yīng)體系10×buffer 5μl，dNTPs 5μl，DNA模板1μl，引物各1μl，Tag酶0.25μl，水36.75μl。反應(yīng)條件94℃1min，66℃1min，72℃3min，共30個循環(huán)，然后72℃延伸10min。產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
(3)載體pWV261、ag85b的酶切、連接及轉(zhuǎn)化載體pWV261質(zhì)粒、ag85b的PCR產(chǎn)物使用BalI和EcorI雙酶切，37℃，4小時。用膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。T4DNA連接酶連接，16℃，過夜。
制備E.coliDH5α感受態(tài)細胞取DH5α單菌落于3mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接于30mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時，0℃冷卻放置10min，5kr/min 4℃離心5min收集菌體，重懸于10ml0.1mol/LCaCl2中。冰浴20min，5kr/min 4℃離心5min收集菌體。加預(yù)冷0.1mlmol/LCaCl2冰浴放置1小時以上備用。
轉(zhuǎn)化將10ml連接產(chǎn)物加入200mlE.coliDH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min，37℃熱休克5min，立即冰浴2min，加入LB培養(yǎng)液800ml，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，然后涂布于含50μg/ml Kana的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑選單菌落分別接種于3ml含50μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心收菌，抽提質(zhì)粒DNA。用BalI和EcorI雙酶切鑒定。選取正確的重組子(簡稱PA)進行下一步實驗。
(4)重組子(PA)、esat-6的酶切、連接及轉(zhuǎn)化重組子(PA)、esat-6的PCR產(chǎn)物使用EcorI和SalI雙酶切。然后連接，轉(zhuǎn)化(同上)。選取正確的重組子(簡稱PAE)進行下一步實驗。
(5)重組子(PAE)、小鼠的IFN-γ基因的酶切、連接及轉(zhuǎn)化重組子(PAE)、小鼠的IFN-γ的PCR產(chǎn)物使用SalI和HpaI雙酶切。然后連接，轉(zhuǎn)化(同上)。選取正確的重組子(簡稱PAEI)進行下一步實驗。對最終的重組子(PAEI)進行了酶切鑒定(如圖1)，也進行測序鑒定，表明所插入序列和Gene Bank中結(jié)核全基因組相應(yīng)基因序列一致。
(6)重組子(PAEI)電轉(zhuǎn)化入卡介苗BCG感受態(tài)細胞的制備BCG在100ml7H9Broth液體培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)2周。然后將其冰浴2小時，8000g，4℃，15min離心收菌；加入預(yù)冷的10％的甘油5ml/管，8000g，4℃，15min離心收菌；重復(fù)上述步驟5次；最后加入預(yù)冷的10％的甘油500μl/管，冰浴1小時以上備用。
取重組子(PAEI)10μl加入400μl BCG感受態(tài)細胞中，冰浴30min，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯中，進行電轉(zhuǎn)，參數(shù)為電壓2500V，電阻1000Ω，電容25μF。加入7H9Broth液體培養(yǎng)基800ml，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，然后涂布于含50μg/ml Kana的平板上7H10培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3-4周，有菌落長出。挑選單菌落分別接種于5ml含50μg/ml Kana的7H9Broth液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)2-3周，取菌保種。
實施例2重組BCG(rBCG∷AEI)基因水平的鑒定取上述培養(yǎng)的菌200ml離心收菌，加20μl水沸水煮30min，離心取上清作為模板，進行PCR。
結(jié)果顯示，PCR擴增得到的條帶與esat-6(306bp)和小鼠的IFN-γ基因(467bp)條帶大小相符(如圖2)。因BCG本身含有ag85b基因，故即使PCR擴增得到ag85b條帶，也無法確定其中是否含有外源的ag85b基因。
實施例3重組BCG(rBCG∷AEI)蛋白水平的鑒定取重組BCG(rBCG∷AEI)的菌接種到100ml改良羅氏培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)4-6周。8000g，4℃，30min離心收上清。然后冷凍抽干，透析，再冷凍抽干。
Western-blot結(jié)果顯示，所得的條帶約為60KD，與預(yù)測的大小相符。(如圖3)。
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，將ag85b、esat-6和IFN-γ基因序列插入同一大腸桿菌—結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒序列中，形成重組穿梭質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒，其特征在于，ag85b、esat-6和IFN-γ都插入同一大腸桿菌—結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的多克隆位點處。
3.如權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒，其特征在于，所用大腸桿菌—結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒為pWV261。
4.一種結(jié)核桿菌的重組疫苗，其特征在于，將如權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入卡介苗，從而得到rBCG∷AEI重組疫苗。
5.如權(quán)利要求1所述重組rBCG∷AEI重組疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA的制備；(2)ag85b，esat-6及IFN-γ基因的擴增；(3)ag85b、sat-6及IFN-γ基因分別插入同一個載體；(4)用含有ag85b、sat-6及IFN-γ基因的重組子轉(zhuǎn)化入卡介苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和結(jié)核疫苗領(lǐng)域。近十幾年來由于結(jié)核耐藥株增多和HIV/AIDS的蔓延，結(jié)核病發(fā)病率增高，成為繼HIV之后人類的第二大殺手。目前全球廣泛使用的唯一的結(jié)核病疫苗是BCG。本發(fā)明將結(jié)核分枝桿菌ag85b、esat－6和IFN－γ基因序列插入大腸桿菌－結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入BCG中形成重組結(jié)核疫苗。本發(fā)明的重組疫苗應(yīng)用于結(jié)核病的防治，將會產(chǎn)生比BCG更理想的免疫效果。
文檔編號A61K39/04GK1737153SQ20051002796
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者王洪海, 徐穎, 王寶林, 祝秉東, 王慶忠, 郄亞卿, 王九齡 申請人:復(fù)旦大學(xué)