專利名稱：賽米司酮類化合物用于治療艾滋病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及賽米司酮類化合物用于制備治療艾滋病藥物的用途。
背景技術(shù)：
艾滋病(Acquired Immuno-deficiency Syndrome，AIDS，獲得性免疫缺損綜合癥)是當(dāng)今世界威脅人類健康與生命的重大傳染性疾病之一。導(dǎo)致艾滋病的病原體，即人類免疫缺損病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)，分為HIV-1和HIV-2兩種亞型。HIV-1的致病力強，是引起全球艾滋病流行的主要病原；HIV-2的傳播力和致病性都低于HIV-1，其潛伏期和病程較長，癥狀較輕，有的感染者甚至不發(fā)展成為艾滋病。HIV-1感染者占艾滋病患者的絕大多數(shù)，HIV-2感染僅局限在西非地區(qū)。因此，目前關(guān)于艾滋病毒的研究主要是針對HIV-1進行的。
在HIV感染人體的初期會有病毒血癥的出現(xiàn)，并有輕度發(fā)熱及淋巴結(jié)腫大等現(xiàn)象。隨后，病毒血癥大幅降低至難以檢測的水平，抗核心蛋白及抗包膜蛋白抗體陸續(xù)出現(xiàn)，病程進入無癥狀帶毒期，即潛伏感染期，時間可長達數(shù)年甚至十多年，而這種長期潛伏的機制目前尚不清楚。在某些因素作用下，病毒可大量復(fù)制，機體再次出現(xiàn)病毒血癥并表現(xiàn)出艾滋病癥狀，體內(nèi)大量的輔助性T淋巴細胞被病毒破壞，造成機體細胞和體液免疫功能降低，無法抵御外界病原微生物的侵襲，進而發(fā)展成為免疫缺陷綜合癥。
HIV增殖過程大致可分九個步驟吸附、穿入、脫殼、早期蛋白合成、病毒基因組核酸復(fù)制、晚期蛋白合成、核殼體裝配、病毒體成熟、釋放等。從理論上說，上述過程中的每一個步驟都能作為篩選抗HIV藥物的靶點。通過多年的努力，人們在涉及HIV增殖的每一個環(huán)節(jié)都發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的抑制劑，不同類型的化合物相繼進入臨床前或臨床研究階段，或經(jīng)藥事管理部門批準上市用于治療艾滋病。目前已經(jīng)開發(fā)成功的抗艾滋病藥物主要包括(1)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(如，齊多夫定、去羥肌苷、扎西他濱、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韋、奈韋拉平、地拉夫定和依法韋倫等)和(2)蛋白水解酶抑制劑(如，沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、奈非那韋和安普那韋等)兩大類。由于HIV具有高度的抗原變異特性，極易產(chǎn)生耐藥性，單獨使用上述一種藥物往往因耐藥性的快速產(chǎn)生而導(dǎo)致治療失敗。同時使用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白水解酶抑制劑(雞尾酒療法)雖然可以推遲耐藥性的出現(xiàn)，延長艾滋病患者的生命，但不能根本解決耐藥性問題和完全治愈艾滋病。雞尾酒療法可以產(chǎn)生嚴重的毒副作用(如骨髓抑制和健忘等)和導(dǎo)致抗藥病毒株的出現(xiàn)。因此，臨床上急需一種具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機理的抗HIV新藥。尋找新的抗HIV藥物作用靶點為實現(xiàn)這一目標的關(guān)鍵所在。
HIV的基因組主要由Gag、Pol、Env基因所組成。此外，還有6個輔助性基因(Tat、Vpr、Vpu、Nef、Rev和Vif)。其中，Vpr編碼一個含96個氨基酸、分子量大約為14kDa的蛋白。
大量的研究表明，HIV感染宿主細胞后，Vpr與細胞內(nèi)多種蛋白相互作用，對病毒復(fù)制、宿主細胞周期及分化產(chǎn)生一系列的影響，如Vpr蛋白在HIV引起的細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。由于HIV病毒致病機理的某些方面是因Vpr誘導(dǎo)細胞調(diào)控失常所致(魏強等，《中國生物工程雜志》2003，Vol.23，6)。因此，Vpr蛋白具有成為抗艾滋藥物作用新靶點的潛力。
在對Vpr蛋白的研究中，科學(xué)家注意到其和糖皮質(zhì)激素(如地塞米松和氫化可的松等)均可以阻斷細胞的增殖，且二者作用程度相似，由此推測Vpr對細胞增殖的抑制效應(yīng)至少部分類似于糖皮質(zhì)激素的作用途徑(Ayyavoo V.等，《Nature Medicine》1997，Vol.3，1117)。
在調(diào)節(jié)細胞對不同病原體的免疫反應(yīng)過程中，多種細胞因子介導(dǎo)了許多重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，因而對細胞的免疫反應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用。糖皮質(zhì)激素通過干擾TCGF(白介素2)和其他細胞因子的合成或功能來實現(xiàn)其抗炎和免疫抑制的效應(yīng)。研究顯示，Vpr也同樣具有干擾細胞因子的作用，因此推測Vpr的抗細胞增殖功能可能部分取決于它對細胞因子(包括白介素2和12)所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)。由于細胞因子的早期反應(yīng)對抑制受感染細胞中HIV的復(fù)制至關(guān)重要，Vpr對細胞因子的負面影響可以破壞宿主的免疫反應(yīng)，尤其是破壞那些尚未被HIV-1感染的細胞之免疫反應(yīng)(Ayyavoo V.等，《Nature Medicine》1997，Vol.3，1117)。
實驗結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素經(jīng)NF-κB反應(yīng)元件的介導(dǎo)，通過抑制細胞因子促進劑來抑制細胞因子的產(chǎn)生。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)IκB的基因轉(zhuǎn)錄，翻譯生成的IκB因產(chǎn)生無活性的NF-κB-IκB復(fù)合物而抑制了NF-κB的活性。此外，無論是細胞本身表達的或是作為外源蛋白引入的Vpr均可通過誘導(dǎo)IκB的轉(zhuǎn)錄而部分抑制NF-κB介導(dǎo)的基因活化。由于NF-κB是活化細胞因子基因的關(guān)鍵因素，對其功能的阻斷可以有效地避免或減少細胞因子的產(chǎn)生，這就部分解釋了Vpr的作用機理。
Vpr蛋白作為糖皮質(zhì)激素的相似物，可以調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡，進而有助于HIV在細胞內(nèi)的復(fù)制。糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)Vpr的作用，抑制HIV在細胞內(nèi)的復(fù)制，保護細胞避免進入Vpr介導(dǎo)的細胞凋亡進程(Ayyavoo V.等，《Nature Medicine》1997，Vol.3，1117)。本發(fā)明人嘗試用糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑--賽米司酮開展體外抑制HIV-1病毒生長的實驗，發(fā)現(xiàn)賽米司酮對HIV-1具有明顯的生長抑制作用。
本發(fā)明人獲準的中國專利(ZL 99116829.1，公開號CN 1287123A)公開了本發(fā)明的賽米司酮(Cymipristone)類化合物及其制備方法，以及該類化合物用于制備治療與孕激素依賴性有關(guān)的疾病、抗生育、流產(chǎn)或避孕和抗腫瘤等藥物方面的用途。該專利被本申請引用為參考文獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及的賽米司酮類化合物是如下式的甾體化合物 其中，R1是環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基；R2是氫或C1-C6烷基；R3選自-C≡C-R5、或-CH＝CH-R6，其中R5是氫、C1-C6烷基或羥甲基，R6是氫、C1-C6烷基或羥甲基；R4是氫或羥亞甲基(＝CHOH)。
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，賽米司酮類化合物是一種新型的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑。藥理學(xué)試驗顯示，賽米司酮具有抗糖皮質(zhì)激素活性；賽米司酮類化合物與糖皮質(zhì)激素受體具有很強的親和力。上述試驗證明賽米司酮是一種受體水平的糖皮質(zhì)激素拮抗劑，能夠阻斷糖皮質(zhì)激素受體的功能。
本發(fā)明人應(yīng)用賽米司酮進行了體外抑制艾滋病毒生長的實驗，在MT-4細胞培養(yǎng)液中，賽米司酮對HIV-1 IIIB P24抗原半數(shù)抑制劑量(IC50)為1.30μg/ml(2.62μM)，說明賽米司酮對艾滋病的病原體HIV-1具有明顯的生長抑制作用。由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了賽米司酮類化合物或其鹽或溶劑化物用于制備治療艾滋病藥物的用途。
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，賽米司酮類化合物可以用于治療艾滋病。本發(fā)明涉及的賽米司酮類化合物或其鹽或溶劑化物是一種已知的甾體化合物，具有下述通式(I) 其中，R1是環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基；R2是氫或C1-C6烷基；R3選自-C≡C-R5、或-CH＝CH-R6，其中R5是氫、C1-C6烷基或羥甲基，R6是氫、C1-C6烷基或羥甲基；R4是氫或羥亞甲基(＝CHOH)。
本發(fā)明的化合物可以根據(jù)中國專利CN 1287123A提供的方法制備得到。
本發(fā)明的化合物可以以鹽形式存在，或者以溶劑化物存在，并且由于其中有多個不對稱碳原子，該化合物可以有多個異構(gòu)體，這些鹽和異構(gòu)體都屬于本發(fā)明化合物用途要求保護的使用范圍。
本發(fā)明的式(I)化合物優(yōu)選其中R2是氫或甲基，R3是-C≡C-CH3或-C≡C-CH2OH，R4是氫的化合物。
本發(fā)明更優(yōu)選的化合物包括11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基]-17α-(1-丙炔基)-17β-羥基-4，9-雌甾二烯-3-酮，即賽米司酮化合物。
本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，賽米司酮類化合物是一種糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，對HIV-1具有明顯的生長抑制作用，可以用于治療艾滋病。
HIV對現(xiàn)有的治療藥物(包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白水解酶抑制劑)已經(jīng)產(chǎn)生嚴重的抗藥性，而賽米司酮類化合物抑制HIV生長的機理與上述藥物完全不同，因此既可以治療因非抗藥性HIV感染引起的疾病，也能夠治療對現(xiàn)有抗HIV藥物(包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白水解酶抑制劑)已經(jīng)產(chǎn)生抗性的艾滋病患者。
HIV是一種復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，同時使用具有不同作用機制的藥物是治療艾滋病的一種有效手段。在本發(fā)明中，一種更優(yōu)選的實施方法是聯(lián)合使用賽米司酮類化合物與其他可有效治療HIV感染的一種或多種藥物，這些藥物優(yōu)選但不局限于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和/或蛋白水解酶抑制劑，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑選自齊多夫定(zidovudine，AZT)、去羥肌苷(didanosine，DDI)、扎西他濱(zalcitabine，DDC)、司他夫定(stavudine，D4T)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿巴卡韋(abacavir，ABC)、奈韋拉平(nevirapine)、地拉夫定(delavirdine)、及依法韋倫(efavirenz，EFV)等中的一種或多種；所述蛋白水解酶抑制劑選自沙奎那韋(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)、印地那韋(indinavir)、奈非那韋(nelfinavir)和安普那韋(amprenavir)等中的一種或多種。
本發(fā)明的治療用途可以通過藥物組合物形式實施。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種用于治療艾滋病的藥物組合物，這種藥物組合物可以使用制藥學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)制備得到。這種組合物可以以片劑、膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑等固體制劑的形式，也可以以注射劑、混懸劑、乳劑、溶液劑等液體制劑的形式，還可以以各種經(jīng)皮給藥制劑的形式，包括相應(yīng)的具有緩釋、控釋、靶向、脈沖等特殊作用的制劑形式存在。
具體實施例方式
下面通過實施例進一步說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的改進都屬于本發(fā)明的保護范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分數(shù)是重量百分數(shù)。
實施例1賽米司酮的制備方法賽米司酮的合成路線 環(huán)氧物 加成物 賽米司酮(1)4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基溴化鎂的制備在四頸瓶中，投入1.4克鎂片(Mg)和10毫升無水四氫呋喃(THF)，不用加碘或加少許碘，于50℃左右，滴加10.86克4-溴-N-甲基-N-環(huán)己基苯胺(溶于24毫升無水四氫呋喃)，滴畢，繼續(xù)保溫攪拌1小時，得4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基溴化鎂的四氫呋喃溶液(待下步加成反應(yīng)用)。
(2)3，3-乙撐二氧-5α，17β-二羥基-11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基]-17α-(1-丙炔基)-9(10)-雌甾烯(加成物)的制備在四頸瓶中，投入5克3，3-乙撐二氧-5，10-環(huán)氧-17α-(1-丙炔基)-17β-羥基-9(11)-雌甾烯(環(huán)氧物)，29.1毫升無水四氫呋喃(THF)和0.1克氯化亞銅(Cu2Cl2)后，滴加4-(N-甲基-N環(huán)己基氨基)苯基溴化鎂的四氫呋喃溶液，控制溫度5℃以下，滴畢，繼續(xù)保溫反應(yīng)5小時，反應(yīng)畢，反應(yīng)液傾入飽和氯化銨水溶液中，分去水層，有機層用飽和氯化銨溶液洗滌，其水層用乙酸乙酯提取數(shù)次，合并有機層，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，硅膠柱分離，展開劑為環(huán)己烷∶丙酮＝(5∶1)，得3，3-乙撐二氧-5α，17β-二羥基-11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基]-17α-(1-丙炔基)-9(10)-雌甾烯(加成物)固體6克。
IR(KBr)cm-13515(C5-OH，C17-OH)，1612，1515(苯骨架)，819(芳氫)。
1H NMR(CDCl3)δppm0.47(3H，S，C13-CH3)，1.88(3H，S，C≡C-CH3)，2.72(3H，S，N-CH3)，6.65-7.03(4H，ArH)。
(3)11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基]-17α-(1-丙炔基)-17β-羥基-4，9-雌甾二烯-3-酮(賽米司酮)的制備將2.5克對甲苯磺酸(PTS)和5克3，3-乙撐二氧-5α，17β-二羥基-11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基]-17α-(1-丙炔基)-9(10)-雌甾烯(加成物)溶于50毫升90％乙醇(V/V)中，于5℃-40℃攪拌反應(yīng)3小時，反應(yīng)液傾入稀氫氧化鈉水溶液中，析出固體，抽濾，水洗至中性，濾餅溶于50毫升乙酸乙酯，再用飽和氯化鈉水溶液洗，分去水層，蒸去部分溶劑，析出固體，抽濾，干燥，得淡黃色固體11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)]-17α-(1-丙炔基)-17β-羥基-4，9-雌甾二烯-3-酮(賽米司酮)3克。
IR(KBr)cm-13447(C17-OH)，1655(不飽和酮)，1607，1513(苯骨架)，865，819(芳氫)。
1H NMR(CDCl3)δppm0.56(3H，S，C13-CH3)，1.89(3H，S，-C≡C-CH3)，2.74(3H，S，N-CH3)，4.34(1H，S，C11-H)，5.75(1H，S，C4-H)，6.68-6.99(4H，ArH)。
實施例2人源性糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合活力測定試驗?zāi)康臋z測賽米司酮對人源性糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合力并與具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的米非司酮(Mifepristone)進行比較。
(1)試驗方法反應(yīng)緩沖液由25mM NaPO4、20mM NaMoO4、10mM KF和10％Glycerol組成(pH＝7.3)，4℃儲藏備用。儲備液由CHAPS和DTT配制，-20℃儲藏備用。按一定的濃度梯度配制陽性藥(Dexamethasone)以及待測化合物溶液，在96孔板中每孔加入2.5μl。取出需用量的反應(yīng)緩沖液加入儲備液中，使其終濃度達到CHAPS 0.25mM，DTT 2mM。加入蛋白酶抑制劑(Aprotinin和Leupeptin)，使其終濃度達到1μg/μl，置于冰浴中。將人源性核受體GR(1∶8)、PR(1∶100)、ER(1∶2000)、AR(1∶200)和MR(1∶40)分別加入反應(yīng)體系后，將適量的[3H]-dexamethasone、[3H]-progesterone、[3H]-estradiol和[3H]-DHT(購自Amersham)充分混勻，迅速加到96孔板中(每孔100μl)，于4℃孵育過夜。次日，在每孔中加入25μl羥基磷灰石混懸液，震蕩混勻，孵育10分鐘后以2500rpm轉(zhuǎn)速于離心3分鐘。沉淀物用100μl反應(yīng)緩沖液沖洗、離心2次，每孔加入150μl閃爍液(購自PerkinElmer)，震蕩混勻，在MicroBeta計數(shù)儀讀數(shù)。
(2)試驗結(jié)果如表1所示，賽米司酮對糖皮質(zhì)激素受體(GR)的結(jié)合活力遠遠大于孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)和鹽糖皮質(zhì)激素受體(MR)；并且賽米司酮對人源性糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合活力大于米非司酮。
表1、賽米司酮對不同核受體的結(jié)合活力(mean±SD，n＝4)

實施例3賽米司酮對大鼠肝細胞漿糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合活力檢測試驗?zāi)康臋z測賽米司酮對動物糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合力并與具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的米非司酮(Mifepristone)進行比較。
(1)試驗方法雌性清潔型SD大鼠，體重200～250克，定量喂養(yǎng)，自由取水。飼養(yǎng)溫度控制在攝氏24度左右，光照為白天11小時—夜晚13小時周期。所有實驗動物實驗前均觀察1周。
在鼠背側(cè)位肋弓下雙側(cè)切口，摘除大鼠雙側(cè)腎上腺，術(shù)后飼以生理鹽水維持水電解質(zhì)平衡。
手術(shù)后第三天急性處死動物，迅速取出肝臟置于冰冷緩沖液中，盡量洗凈血液。取一定量組織按1∶4比例加入緩沖液，并剪碎組織，低溫間歇勻漿組織，175000g離心1小時，取上清液備用。
測定上清液中蛋白濃度，調(diào)配蛋白濃度至2mg/ml。將溶于乙醇的標記、非標記地塞米松、賽米司酮和米非司酮于37℃揮干，然后進行競爭性抑制實驗。
競爭性分析取0.2ml胞漿加固定濃度[3H]-地塞米松作為示蹤物，加不同濃度受試物(賽米司酮、米非司酮和地塞米松)，4℃孵育24小時，用DCC分離游離和結(jié)合[3H]-地塞米松，液閃測定上清和沉淀放射性。
(2)數(shù)據(jù)處理相對結(jié)合親和力(RBA)以地塞米松的RBA等于100％為標準，計算公式

(3)試驗結(jié)果競爭抑制實驗各化合物在16×10-10～5×10-7mol/L濃度范圍可抑制[3H]-地塞米松(7.87nml/L)與大鼠肝胞漿糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，其抑制率見表2。
表2.、賽米司酮對[3H]-地塞米松受體結(jié)合的抑制率并與米非司酮比較(mean±SD，％，n＝4)

按上述計算方法，計算各化合物的受體藥理特性指標見表3。
表3、賽米司酮與大鼠肝細胞漿糖皮質(zhì)激素受體的相對結(jié)合活力(RBA)(mean±SD，n＝4)

注以地塞米松的結(jié)合活力為100計算。
地塞米松、賽米司酮和米非司酮的RBA比值為1∶5.6∶3.4，IC50分別為14.50、2.60、4.21nmol/L，賽米司酮與米非司酮的IC50比值為1.00∶1.62，表明賽米司酮與糖皮質(zhì)激素受體有很強的結(jié)合力，并且此結(jié)合力強于米非司酮。實施例2、3的試驗結(jié)果說明賽米司酮是一種比米非司酮作用更強的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，具有更強的治療艾滋病之潛力。
實施例4賽米司酮對人源性糖皮質(zhì)激素受體的拮抗作用試驗?zāi)康臋z測賽米司酮對糖皮質(zhì)激素受體的拮抗作用。
(1)試驗方法取CV-1細胞(6×105個)接種于直徑為60mm的細胞培養(yǎng)皿中，使用含10％FBS的無酚紅低糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下孵育過夜。按1∶5比例吸取攜帶GR基因的質(zhì)粒和熒光素酶報告基因質(zhì)粒2μg，使用FuGene6轉(zhuǎn)染試劑(購自Roche)共轉(zhuǎn)染CV-1細胞，按上述條件孵育8小時。將轉(zhuǎn)染后的細胞以8000個/100μl/孔接種于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細胞貼壁。用培養(yǎng)基將陽性化合物(Dexamethasone；終濃度為10nM)與待測化合物按一定濃度稀釋，以10μl/孔加入上述培養(yǎng)板中，孵育24小時。棄去培養(yǎng)液，用PBS兩次清洗細胞，吸盡殘留的PBS。使用CCLR Assay Kit(購自Progema)裂解細胞15分鐘。取裂解液20μl加到白邊白底的96孔細胞培養(yǎng)板中，加入100μl/孔CCLR底物(購自Progema)，立即于WALLAC 1420Multilabel Counter上檢測由活化熒光素酶引起的化學(xué)發(fā)光計數(shù)值。
(2)試驗結(jié)果如表4所示，賽米司酮在基因共轉(zhuǎn)染的活細胞中對由地塞米松引起的人源性糖皮質(zhì)激素受體功能具有顯著的拮抗活性。
表4、賽米司酮對地塞米松在細胞水平的拮抗作用(mean±SD，n＝4)

實施例5賽米司酮抗糖皮質(zhì)激素活性試驗試驗?zāi)康臋z測賽米司酮的抗糖皮質(zhì)激素活性。
(1)試驗方法雌性清潔型SD大鼠，體重200～250克，定量喂養(yǎng)，自由取水。飼養(yǎng)溫度控制在攝氏24度左右，光照為白天11小時—夜晚13小時周期。所有實驗動物實驗前均觀察1周。
用乙醚麻醉大鼠，鼠背側(cè)肋弓下雙側(cè)切口，完整摘除雙側(cè)腎上腺，術(shù)后飼以生理鹽水。第7天急性處死動物，取胸腺于HBSS緩沖液中，洗滌二次，并除去結(jié)締組織，然后剪碎，用勻漿器輕輕研磨，三層紗布過濾，過濾液低速離心5分鐘(500轉(zhuǎn)/分)，沉淀細胞再用HBSS洗滌二次，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，作細胞計數(shù)和細胞存活率測定，調(diào)整細胞濃度至107/ml。
抗糖皮質(zhì)激素活性測定將受試化合物加入培養(yǎng)液中，使其反應(yīng)濃度為6×10-8～2×10-6mol/L，37℃培養(yǎng)箱預(yù)置3小時，然后加入胸腺細胞，使細胞濃度達到107/ml，37℃預(yù)培養(yǎng)3小時，加1μCi標記物混勻后再培養(yǎng)1小時，加冰冷5％三氯醋酸100μl終止反應(yīng)。將試管放置于冰上，然后用冰冷的2ml 5％三氯醋酸，以500rpm×5分鐘離心洗滌2次，沉淀細胞加1N NaOH 0.5ml，溶解細胞，將溶解液吸出，同時用棉簽將殘留物搽干，置同一閃爍瓶內(nèi)，液閃測定放射活性。本試驗選擇地塞米松濃度6×10-8mol/L檢測抗糖皮質(zhì)激素活性，受試化合物濃度為6×10-8～2×10-6mol/L。
(2)數(shù)據(jù)處理計算[3H]-TdR摻入率

其中，T為沒有化合物存在時的[3H]-TdR的計數(shù)，Td為有化合物存在時的計數(shù)，NSB為非特異性吸附。
根據(jù)公式計算出賽米司酮抗糖皮質(zhì)激素活性，包括[3H]-TdR摻入率和殘余抑制率。其中地塞米松濃度為6×10-8mol/L時，殘余抑制率以100％計算。
抑制率＝100％-摻入率

(3)試驗結(jié)果單用6×10-8mol/L濃度地塞米松時，[3H]-TdR摻入率為43.2±3.7％，當(dāng)合并使用受試化合物時，其作用受到不同程度的拮抗(表5)。用殘余抑制率顯示了賽米司酮在抗糖皮質(zhì)激素作用方面的性能(表6)。
表5、賽米司酮對地塞米松的拮抗作用(Mean±SD，％，n＝4)

表6、賽米司酮對地塞米松殘余抑制率的影響(Mean±SD，％，n＝4)

試驗結(jié)果顯示，賽米司酮具有抗糖皮質(zhì)激素活性。
實施例6賽米司酮對HIV-1的生長抑制作用試驗?zāi)康臋z測賽米司酮的抗HIV-1作用一.試驗方法1、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)中的細胞毒性和抑制HIV-1 P24抗原生成的作用(1)MT-4細胞以1×105個/ml接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，用HIV-1/IIIB約100TCID50病毒株感染，同時加入賽米司酮藥液，濃度在100μg/ml以下3倍稀釋至8個濃度；設(shè)病毒TCID50測定和細胞對照組。每濃度重復(fù)雙孔。在37℃、5％CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(2)細胞病變法測定賽米司酮對細胞的毒性(TC50和TC0)將上述培養(yǎng)板每天置顯微鏡下觀察細胞病變，以常規(guī)方法記錄細胞病變程度，按Reed&Muench法計算藥物半數(shù)有毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。
(3)實驗加藥細胞培養(yǎng)板吸取上清液測定HIV-1 P24抗原上法加藥細胞培養(yǎng)第4天(96小時)后，吸出上清液冰凍待測HIV-1P24抗原。
(4)MTT染色法測定賽米司酮對細胞的毒性(TC50和TC0)吸取上清液的細胞培養(yǎng)板每孔加入MTT染色，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后加入脫色液，在酶聯(lián)儀上測定波長為570nm的OD值，如上法計算TC50和TC0。
(5)HIV-1 P24抗原測定和賽米司酮對HIV-1 P24抗原的抑制作用取第4天細胞上清液，雙孔合并，進行1∶100稀釋。按HIV-1 P24抗原試劑盒說明書用ELISA方法測定HIV-1 P24抗原滴度(OD值)。待試藥物組的OD值與病毒對照組的OD值進行比較，計算抑制％和半數(shù)有效濃度(IC50)，并計算藥物的選擇指數(shù)(SI)。同時測定HIV-1/IIIB病毒株在MT-4細胞的半數(shù)感染濃度，計算實驗病毒感染量(TCID50)。
2、半數(shù)毒性濃度(TC50)、半數(shù)有效濃度(IC50)及選擇指數(shù)(SI)計算方法(1)Reed&Muench法計算藥物在細胞培養(yǎng)中的TC50和IC50及SI的方法 (2)SI＝TC50/IC50二.結(jié)果1、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)液中的細胞毒性(表7)(1)細胞病變(CPE)法的細胞毒性TC50賽米司酮為7.704μg/ml(15.50μM)。
(2)MTT染色法的細胞毒性TC50賽米司酮為30.26μg/ml(60.89μM)
表7、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)中的細胞毒性

2、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)中對HIV-1 IIIB P24抗原的抑制作用(表8)在MT-4細胞培養(yǎng)中，賽米司酮對HIV-1 IIIB P24抗原的生成抑制活力(IC50)為1.30μg/ml(2.62μM)。
表8、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)中對HIV-1 P24抗原的抑制作用

3、選擇指數(shù)(SI；表9)以CPE細胞毒性計算SI賽米司酮為5.93；以MTT細胞毒性計算SI賽米司酮為23.28。
表9、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)液中抑制HIV-1的選擇指數(shù)(SI)

三.結(jié)論1、賽米司酮對培養(yǎng)的人T-淋巴細胞MT-4無明顯的毒性。
2、賽米司酮在傳代MT-4細胞培養(yǎng)中對HIV-1病毒IIIB實驗株的感染有明顯的抑制作用。
3、賽米司酮在MT-4細胞培養(yǎng)中對HIV-1 P24抗原的生成具有顯著的抑制效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物或其鹽或溶劑化物用于制備治療艾滋病的藥物的用途 其中，R1是環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基；R2是氫或C1-C6烷基；R3選自-C≡C-R5、或-CH＝CH-R6，其中R5是氫、C1-C6烷基或羥甲基，R6是氫、C1-C6烷基或羥甲基；R4是氫或羥亞甲基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中式(I)化合物中R2是氫或甲基，R3是-C≡C-CH3或-C≡C-CH2OH，R4是氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中式(I)化合物是11β-[4-(N-甲基-N-環(huán)己基氨基)苯基]-17α-(1-丙炔基)-17β-羥基-4，9-雌甾二烯-3-酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的用途，其中式(I)化合物或其鹽或溶劑化物與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和/或蛋白水解酶抑制劑聯(lián)合使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑選自齊多夫定、去羥肌苷、扎西他濱、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韋、奈韋拉平、地拉夫定或依法韋倫中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述蛋白水解酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、奈非那韋或安普那韋中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的賽米司酮類化合物或其鹽或溶劑化物用于制備治療艾滋病的藥物的用途。賽米司酮類化合物是一種新型的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑。藥理學(xué)試驗顯示，賽米司酮具有抗糖皮質(zhì)激素活性，賽米司酮類化合物與糖皮質(zhì)激素受體具有很強的親和力，試驗表明賽米司酮是一種受體水平的糖皮質(zhì)激素拮抗劑，能夠阻斷糖皮質(zhì)激素受體的功能。本發(fā)明人應(yīng)用賽米司酮進行了體外抑制艾滋病毒生長的實驗，說明賽米司酮對艾滋病的病原體HIV－1具有明顯的生長抑制作用。
文檔編號A61K31/567GK1899289SQ20051002805
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者王明偉, 左林, 應(yīng)明華 申請人:上海三合生物技術(shù)有限公司