專利名稱：粗枝藻甲素的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從中國(guó)海洋紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中提取分離得到的化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)，經(jīng)過(guò)生物活性測(cè)試，結(jié)果表明該化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的活性。該化合物可作為PTP1B抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療各種糖尿病、肥胖癥及其由此引起的并發(fā)癥。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足以及靶組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水、和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。在糖尿病人群中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴(yán)重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。
目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90％以上是II型糖尿病。WHO預(yù)計(jì)，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。
I型糖尿病病人由于第6對(duì)染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對(duì)環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學(xué)毒性物質(zhì)刺激的反應(yīng)異常，直接或間接通過(guò)自身免疫反應(yīng)，引起胰島β細(xì)胞破壞，以致胰島素不足，必須依賴胰島素治療維持生命。
II型糖尿病也有很強(qiáng)的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異。總的來(lái)說(shuō)可概括為胰島素分泌的相對(duì)不足和胰島素抵抗。對(duì)II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究證實(shí)，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵因素。在研究脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點(diǎn)，也是其主要方向之一。
II型糖尿病的特征是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對(duì)胰島素作用的抵抗。雖然其具體機(jī)制尚不清楚，但胰島素信號(hào)在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷必定是直接因素。胰島素通過(guò)與其受體胞外α亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)β亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過(guò)磷酸化其底物將信號(hào)傳遞下去。隨著對(duì)細(xì)胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認(rèn)識(shí)的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來(lái)越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個(gè)環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過(guò)尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強(qiáng)和延長(zhǎng)胰島素信號(hào)，成為越來(lái)越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。
PTPases包括一大家族跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過(guò)程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達(dá)，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能在胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)影響正常胰島素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2和PTP1B。
PTP1B是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長(zhǎng)大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來(lái)源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中，將減少胰島素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達(dá)；用滲透休克的方法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC-7肝細(xì)胞經(jīng)胰島素刺激時(shí)DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實(shí)驗(yàn)中也對(duì)IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細(xì)胞中PTP1B的高表達(dá)能明顯降低配體誘導(dǎo)的IR磷酸化水平；用腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細(xì)胞L6肌細(xì)胞和Fao細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并從而顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復(fù)合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導(dǎo)的糖原合成也被抑制[Egawa K.et al.J.Biol.Chem.276(13)，10207-10211.]。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44MAPK磷酸化水平也明顯降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影響[Venable C.L.et al.J.Biol.Chem.275(24)，18318-18326.]。PTP1B的高表達(dá)對(duì)基本的、中等的及最大量胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)影響，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的EC50胰島素濃度無(wú)影響。這些研究證明PTP1B能夠負(fù)調(diào)控胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并主要作用于胰島素受體。更為重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報(bào)道，運(yùn)用同源重組的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠生長(zhǎng)正常，有生殖力，對(duì)胰島素敏感性顯著增強(qiáng)，而且這一增強(qiáng)作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物1磷酸化水平的增強(qiáng)相關(guān)[Elchebly M.，et al.Science，283，1544-1548.]。這些實(shí)驗(yàn)更加有力地證明了PTP1B在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲(chǔ)存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療二型糖尿病和肥胖癥的一個(gè)潛在藥物作用靶點(diǎn)。
紅藻的藻體呈紫色或紫紅色，大多數(shù)為多細(xì)胞，有絲狀、片狀和分枝狀。形態(tài)多姿，有圓形、橢圓形、帶形。紅藻多數(shù)喜居深海，生長(zhǎng)在低潮線附近和低潮線以下30～60米處，少數(shù)種類可在200米的海底生長(zhǎng)。紅藻類約有2500多種，其中最為常見(jiàn)的種類有紫菜、石花菜、紅毛藻、海索面、雞毛藻、粘管藻、海蘿、蜈蚣藻、海頭紅、多管藻、鷓鴣菜等。其中在浙江南麂一帶分部較多。
粗枝藻甲素(Crassicaulisine)是首次從紅藻粗枝軟骨藻(Chondriacrassicaulis Harv.)中分離得到的新型糖脂類化合物，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)有相同結(jié)構(gòu)和活性方面的報(bào)道。經(jīng)多次蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B實(shí)驗(yàn)研究表明，該化合物具有抑制PTP1B的顯著活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的用途。
本發(fā)明的化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式

該化合物系首次從紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中分離得到，故命名為粗枝藻甲素(Crassicaulisine)。粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的理化性狀如下白色粉末狀，光學(xué)活性{[α]D+43.0(c 0.13，MeOH)}；負(fù)離子模式電噴霧離子質(zhì)譜m/z 789(M+H)+，m/z 811(M+Na)+；分子式為C39H73O12SNa。1H與13C NMR譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
表1 化合物Crassicaulisine的1H，13C NMR數(shù)據(jù)對(duì)照表

從紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中提取化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的方法，其步驟如下將風(fēng)干的粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)用工業(yè)甲醇室溫浸泡提取完全。減壓濃縮提取液得甲醇浸膏。將甲醇浸膏溶于水中，成混懸液后用CH2Cl2提取，濃縮萃取液得到CH2Cl2浸膏。CH2Cl2浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇，洗脫梯度逐漸增大，收集用MeOH∶EtOAc＝1∶4時(shí)洗脫下來(lái)的流分，然后再上硅膠柱，用CHCl3∶MeOH＝9∶1洗脫，得到化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)。
參考文獻(xiàn)Z.-Y.Shao，J.-N.Cai，Q.-Z.Ye and Y.-W.Guo.J.Nat.Prod.，2002，Vol.4(3)，pp.205-209。
本發(fā)明對(duì)所得化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)進(jìn)行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性實(shí)驗(yàn)，表明其有明顯的抑制活性。
測(cè)試原理利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTP1B)催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后的hPTP1B重組蛋白能水解底物pNPP的磷酯鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此可以通過(guò)直接檢測(cè)410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對(duì)酶活性的抑制情況。標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)活體系如下10mM Tris.Cl，PH7.6，10mM PNPP，2％ DMSO，100nMhPTP1B。

觀察指標(biāo)動(dòng)態(tài)測(cè)定波長(zhǎng)為410nm處的光吸收，時(shí)間為3分鐘，其動(dòng)力學(xué)曲線一級(jí)反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)判與解釋篩選結(jié)果是當(dāng)化合物的濃度為10μg/ml時(shí)對(duì)酶活性的百分抑制率，抑制活性高于50％時(shí)，按常規(guī)篩選得出IC50，陽(yáng)性對(duì)照正釩酸鈉的IC50為2μM。

具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
1H-NMR用Bruker DRX-400型儀測(cè)定；MS用VG ZAB-HS或VG-7070型儀測(cè)定，除注明外均為EI源(70ev)；所使用的硅膠，包括200-300目和GF254為青島海洋化工廠或煙臺(tái)緣博硅膠公司生產(chǎn)；所使用的Shephadex LH-20為E.Merck公司生產(chǎn)；實(shí)施例一化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的制備(1)提取將風(fēng)干的粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)4.6(kg)用工業(yè)甲醇室溫浸泡提取完全。減壓濃縮提取液得甲醇浸膏。將甲醇浸膏溶于水中，成混懸液后用CH2Cl2提取，濃縮萃取液得到CH2Cl2浸膏(70g)。
(2)分離CH2Cl2浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇，洗脫梯度逐漸增大，收集用MeOH∶EtOAc＝1∶4時(shí)洗脫下來(lái)的流份，然后再上硅膠柱，用CHCl3∶MeOH＝9∶1洗脫，得到化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)(538mg)。
實(shí)施例二化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的PTP1B抑制活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法用于篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B基因通過(guò)分子克隆的方法構(gòu)建到pGEX-KG載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并破胞后經(jīng)glutathione agarose親和層析柱純化得到GST融合蛋白。經(jīng)12％SDS-PAGE膠分離鑒定，其純度均達(dá)到90％以上。進(jìn)一步分析其酶學(xué)性質(zhì)(Km、kcat)均與文獻(xiàn)報(bào)道的重組蛋白一致。
采用紫外底物pNPP(發(fā)明內(nèi)容中測(cè)試原理)，PTP1B水解底物pNPP中的磷酯鍵得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，可以直接監(jiān)測(cè)410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化，考察粗枝藻甲素對(duì)重組酶的活性的抑制情況，以初步評(píng)價(jià)化合物的生物活性。陽(yáng)性對(duì)照正釩酸鈉的IC50為2μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的粗枝藻甲素的用途在制備預(yù)防、治療蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B活性亢進(jìn)引起的疾病的藥物中應(yīng)用
2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的粗枝藻甲素的用途，其特征在于在制備預(yù)防、治療各種糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所示的粗枝藻甲素的用途，其特征在于在它作為胰島素增敏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一類從中國(guó)海洋紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中提取、分離獲得的新型的具有蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性的化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)，結(jié)構(gòu)如上。經(jīng)多次體外蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制實(shí)驗(yàn)表明，該類化合物具有明顯的PTP1B抑制活性，可在制備糖尿病、肥胖癥及并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。對(duì)開發(fā)利用中國(guó)的藥用植物資源具有重要意義。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1903210SQ20051002828
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者郭躍偉, 李佳, 邵志宇, 南發(fā)俊, 姚勵(lì)功 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所