專利名稱：那卡呋喃－8內(nèi)酯的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從中國南海一種倔海綿屬海綿(Dysidea sp.)中分離得到的化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8Lactone)。經(jīng)過生物活性測試，結(jié)果表明該化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的活性。該化合物可作為PTP1B抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療各種糖尿病、肥胖癥及其由此引起的并發(fā)癥。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水、和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。在糖尿病人群中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴(yán)重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。
目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90％以上是II型糖尿病。WHO預(yù)計(jì)，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。
I型糖尿病病人由于第6對染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學(xué)毒性物質(zhì)刺激的反應(yīng)異常，直接或間接通過自身免疫反應(yīng)，引起胰島β細(xì)胞破壞，以致胰島素不足，必須依賴胰島素治療維持生命。
II型糖尿病也有很強(qiáng)的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異?？偟膩碚f可概括為胰島素分泌的相對不足和胰島素抵抗。對II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究證實(shí)，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。在研究脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點(diǎn)，也是其主要方向之一。
II型糖尿病的特征是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵抗。雖然其具體機(jī)制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷必定是直接因素。胰島素通過與其受體胞外α亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)β亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過磷酸化其底物將信號傳遞下去。隨著對細(xì)胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認(rèn)識的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強(qiáng)和延長胰島素信號，成為越來越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。
PTPases包括一大家族跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達(dá)，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能在胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)影響正常胰島素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2和PTP1B。
PTP1B是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中，將減少胰島素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達(dá)；用滲透休克的方法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC-7肝細(xì)胞經(jīng)胰島素刺激時DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實(shí)驗(yàn)中也對IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細(xì)胞中PTP1B的高表達(dá)能明顯降低配體誘導(dǎo)的IR磷酸化水平；用腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細(xì)胞L6肌細(xì)胞和Fao細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并從而顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復(fù)合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導(dǎo)的糖原合成也被抑制[Egawa K.et al.J.Biol.Chem.276(13)，10207-10211.]。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44 MAPK磷酸化水平也明顯降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影響[Venable C.L.et al.J.Biol.Chem.275(24)，18318-18326.]。PTP1B的高表達(dá)對基本的、中等的及最大量胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)無影響，對轉(zhuǎn)運(yùn)的EC50胰島素濃度無影響。這些研究證明PTP1B能夠負(fù)調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并主要作用于胰島素受體。更為重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報道，運(yùn)用同源重組的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠生長正常，有生殖力，對胰島素敏感性顯著增強(qiáng)，而且這一增強(qiáng)作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物1磷酸化水平的增強(qiáng)相關(guān)[Elchebly M.，et al.Science，283，1544-1548.]。這些實(shí)驗(yàn)更加有力地證明了PTP1B在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療二型糖尿病和肥胖癥的一個潛在藥物作用靶點(diǎn)。
海綿(marine sponge)屬多孔動物門(porifera)，它們是低等的多細(xì)胞動物，機(jī)體沒有器官的分化，只有個別細(xì)胞存在機(jī)能上的差異，海綿體內(nèi)存在一種高效的過濾管系統(tǒng)，大量海水連同各種營養(yǎng)物質(zhì)從中通過，經(jīng)過濾后在各個功能細(xì)胞區(qū)被消化，進(jìn)而為海綿的生存與生長提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。這種高度發(fā)達(dá)的微管系統(tǒng)也為許多海洋微藻、細(xì)菌、真菌以及其它生物提供了生長的空間，自然界的海綿幾乎全部存在共生體。海綿生物種類的多樣性，代謝途徑的獨(dú)特性，生存環(huán)境的復(fù)雜性以及共生體的不確定性，決定了其次生代謝產(chǎn)物的豐富多樣。
那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)是首次從南海倔海綿屬海綿(Dysidea sp.)中分離得到的新型化合物，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見有相同結(jié)構(gòu)和活性方面的報道。經(jīng)多次蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B實(shí)驗(yàn)研究表明，該化合物具有抑制PTP1B的顯著活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8Lactone)的用途。
本發(fā)明的化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式

如圖所示結(jié)構(gòu)，該化合物系首次從南海倔海綿屬海綿(Dysidea sp.)中分離得到，故命名為那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)。該化合物的理化性狀如下無色晶體狀，光學(xué)活性{[α]25D-58°(c 0.16MeOH)}；負(fù)離子模式電噴霧離子質(zhì)譜m/z 262.1567[M]+；分子式為C16H22O3。1H與13CNMR譜數(shù)據(jù)見表1。
表1 化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)的1H，13CNMR數(shù)據(jù)對照表

從南海倔海綿屬海綿(Dysidea sp.)中提取化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)的方法，其步驟如下將風(fēng)干的倔海綿屬海綿(Dysidea sp.)切碎，在室溫下用甲醇提取4次，低溫減壓蒸餾得到甲醇浸膏，隨后用水把浸膏分散開，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯浸膏經(jīng)過硅膠柱層析，用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1洗脫得到化合物，再經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱純化得到化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methylNakafuran-8 Lactone)。
參考文獻(xiàn)Z.-Y.Shao，D.-Y.Zhu，Y.-W.Guo(2002).J.Nat.Prod.，65，1675-1677。
本發(fā)明對所得化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)進(jìn)行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性實(shí)驗(yàn)，表明其有明顯的抑制活性。
測試原理利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTP1B)催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后的hPTP1B重組蛋白能水解底物pNPP的磷酯鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此可以通過直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標(biāo)準(zhǔn)的測活體系如下10mM Tris.Cl，PH7.6，10mM PNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B。

觀察指標(biāo)動態(tài)測定波長為410nm處的光吸收，時間為3分鐘，其動力學(xué)曲線一級反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評判與解釋篩選結(jié)果是當(dāng)化合物的濃度為10μg/ml時對酶活性的百分抑制率，抑制活性高于50％時，按常規(guī)篩選得出IC50，陽性對照正釩酸鈉的IC50為2μM。

具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
1H-NMR用Varian Inova 600MHz型儀測定；MS用LCQ-DECA測定；紅外用Nicolet Magna FT-IR 750測定；所使用的硅膠，包括200-300目和GF254為青島海洋化工廠或煙臺緣博硅膠公司生產(chǎn)；所使用的凝膠Shephadex LH-20為E.Merck公司生產(chǎn)；實(shí)施例一化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)的制備(1)提取將風(fēng)干的海綿(635g)切碎，在室溫下用甲醇提取4次，低溫減壓蒸餾得到甲醇浸膏，隨后用水把浸膏分散開，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯浸膏(12g)(2)分離乙酸乙酯浸膏(12g)經(jīng)過硅膠柱層析，用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1洗脫得到化合物，再經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱純化得到化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)(7.1mg)。
實(shí)施例二化合物那卡呋喃-8內(nèi)酯(O-methyl Nakafuran-8 Lactone)的PTP1B抑制活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法用于篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B基因通過分子克隆的方法構(gòu)建到pGEX-KG載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并破胞后經(jīng)glutathione agarose親和層析柱純化得到GST融合蛋白。經(jīng)12％SDS-PAGE膠分離鑒定，其純度均達(dá)到90％以上。進(jìn)一步分析其酶學(xué)性質(zhì)(Km、kcat)均與文獻(xiàn)報道的重組蛋白一致。
采用紫外底物pNPP(發(fā)明內(nèi)容中測試原理)，PTP1B水解底物pNPP的磷脂得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收?？梢灾苯颖O(jiān)測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對其的抑制情況。陽性對照正釩酸鈉的IC50為2μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的那卡呋喃-8內(nèi)酯的用途在制備預(yù)、治療蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B活性亢進(jìn)引起的疾病的藥物中應(yīng)用
2.根據(jù)權(quán)利要求1所的那卡呋喃-8內(nèi)酯的用途，其特征在于治療各種糖尿病、肥胖癥及其由其引起的并發(fā)癥的藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所的那卡呋喃-8內(nèi)酯的用途，其特征在于作為胰島素增敏劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了那卡呋喃－8內(nèi)酯的用途，那卡呋喃－8內(nèi)酯具有如圖結(jié)構(gòu)式。經(jīng)多次體外蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制實(shí)驗(yàn)表明，該類化合物具有明顯的PTP1B抑制活性，可在制備糖尿病、肥胖癥及并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。對開發(fā)利用中國的藥用植物資源具有重要意義。
文檔編號A61P3/10GK1903193SQ200510028288
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者郭躍偉, 李佳, 邵志宇, 南發(fā)俊 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所