專利名稱：馬抗血清的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬抗血清的制備方法，具體涉及馬抗血清的純化方法。
背景技術(shù)：
馬抗血清，也稱為抗毒素，是由相應(yīng)毒素或類毒素，細(xì)菌、病毒免疫動(dòng)物所得的免疫血清，或稱為血漿，經(jīng)胃蛋白酶消化、硫酸銨鹽析制得的免疫球蛋白制劑，如《中國(guó)生物制品規(guī)程》公開(kāi)的技術(shù)。
目前，馬抗血清的制備方法一般包括下述步驟1、用蒸餾水將各種抗血清的免疫血漿稀釋，并用胃酶進(jìn)行消化處理得消化液；2、將消化液進(jìn)行第一次沉淀及加溫處理，在消化液中加入硫酸銨，并調(diào)節(jié)pH值，然后將消化液加溫并保持，再降溫，過(guò)濾收集上清液，廢棄沉淀；3、將上述清液進(jìn)行第二次沉淀過(guò)濾，即在上述上清液中加入硫酸銨，靜置后過(guò)濾取沉淀物，棄上清液；4、明礬沉淀即將上述沉淀物稀釋，再在稀釋液中加明礬，靜置后過(guò)濾取上清液，沉淀物廢棄；5、將上述上清液濃縮，即可制得抗血清原液。
上述方法所獲得的抗血清原液的不足之處是，制備的抗血清純度[F(ab)2含量、比活性(IU/gp)]較低，馬血清過(guò)敏反應(yīng)率和血清病的發(fā)生率較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于公開(kāi)一種馬抗血清的制備方法，以克服上述技術(shù)的不足之處。
本發(fā)明的方法包括下述步驟將馬血清原液用注射用水調(diào)整蛋白濃度為40-60mg/ml，以600～1000ml/min的流速流過(guò)裝填有陰離子交換劑的離子交換吸附柱，柱體積為馬血清原液體積的0.5～1.5倍，上樣時(shí)間為1～3小時(shí)左右，然后用1～2倍的馬血清原液體積的磷酸鹽緩沖液(pH值6.0-7.0)洗柱，收集所有穿透液，并超濾濃縮至蛋白含量不超過(guò)170g/l，然后加入氯化鈉和防腐劑，用堿性或酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，用0.2～0.3um的濾膜過(guò)濾除菌，獲得產(chǎn)品；以超濾濃縮后的產(chǎn)物的總體積計(jì)，氯化鈉的加入量為750-950g/L；所說(shuō)的防腐劑選自三氯甲烷、硫柳汞或間甲酚中的一種；
以超濾濃縮后的產(chǎn)物的總體積計(jì)，三氯甲烷含量為4～6g/l，硫柳汞含量為0.05～0.15g/l，間甲酚含量為2～3g/l；所說(shuō)的堿性物質(zhì)為氫氧化鈉；所說(shuō)的酸性物質(zhì)為鹽酸；所說(shuō)的陰離子交換劑選自SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、CMSepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、ANX Sepharose Fast Flow中的一種，可采用商業(yè)化的產(chǎn)品，如Amersham Biosciences公司牌號(hào)為DEAE Sepharose Fast Flow的陰離子交換劑；陰離子交換劑裝柱后，先用5-10mM磷酸鹽緩沖液(pH值6.0-7.0，含0.05M NaCl)進(jìn)行平衡，然后上樣；所述的馬抗血清包括破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清等；所說(shuō)的馬血清原液是采用現(xiàn)有技術(shù)制備的，如《中國(guó)生物制品規(guī)程》文獻(xiàn)公開(kāi)的方法，簡(jiǎn)述如下(1)消化步驟用免疫血漿消化工藝將免疫血漿消化；(2)第一次沉淀過(guò)濾處理步驟將上述處理的消化液中加入硫酸銨形成混懸液，并調(diào)節(jié)pH值為4.8-5.2，然后將混懸液加溫并保持，再降溫，過(guò)濾收集上清液，廢棄沉淀；(3)第二次沉淀過(guò)濾處理步驟將上述(2)步的上述清液pH值為7.0-7.4，加入硫酸銨進(jìn)行第二次沉淀，靜置后過(guò)濾取沉淀物，棄上清液；(4)明礬沉淀即將上述(3)步的沉淀物稀釋至蛋白含量不超過(guò)2g/L，再調(diào)整稀釋液pH值為7.7-7.9，加明礬進(jìn)行沉淀，靜置后過(guò)濾取上清液，沉淀物廢棄；(5)將上述上清液用硫酸銨沉淀法或超濾法濃縮制得抗血清原液。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)能夠有效降低馬抗血清制劑由于異種蛋白引起的過(guò)敏反應(yīng)和血清病的發(fā)生率，能夠有效提高馬抗血清制劑的純度。其藥物的主要有效成分F(ab)2含量由改進(jìn)前的60-70％提高到80％以上(提高幅度20-30％)，產(chǎn)品純度(比活性)提高幅度達(dá)80-100％，此兩項(xiàng)主要質(zhì)量指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于《中國(guó)藥典》(2005年版)規(guī)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)計(jì)該產(chǎn)品的應(yīng)用將使馬抗血清(抗毒素)制劑由于異種蛋白引起的過(guò)敏反應(yīng)和血清病的發(fā)生率降低10-20倍，能夠更好地滿足廣大人民臨床用藥安全方面的需要。
具體的實(shí)施方式實(shí)施例1破傷風(fēng)抗毒素的純化制備1、消化取破傷風(fēng)免疫血漿40萬(wàn)ml用蒸餾水稀釋3倍，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.2，加入適量胃酶及甲苯0.2％(ml/ml)，于30℃消化1.5小時(shí)。
2、第一次沉淀及加溫處理將上述每100ml消化液中加入硫酸銨15g，用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.3；加溫至58℃保持30分鐘。加溫完畢，盡快降溫至45℃以下，過(guò)濾，取清液。
3、第二次沉淀上述清液用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，每100ml加硫酸銨20g；攪拌均勻后靜止30分鐘，過(guò)濾，取沉淀。
4、明礬沉淀上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過(guò)2g/L，每100ml加入10％明礬液10ml，用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.8，過(guò)濾，取清液。
5、超濾濃縮將上述清液混合，通過(guò)超濾裝置進(jìn)行超濾，濃縮至硫酸銨含量為0.1％(g/ml)以下，即為抗血清原液。
6、離子交換劑吸附純化1)用100000ml，Amersham Biosciences公司生產(chǎn)的牌號(hào)為DEAE Sepharose FastFlow的陰離子交換劑裝柱，用10mM磷酸鹽緩沖液(pH值6.8，含0.05M NaCl)約100000ml進(jìn)行平衡；2)將澄清過(guò)濾的100000ml抗血清原液，用注射用水調(diào)整蛋白濃度為40mg/ml，通過(guò)輸液泵加入柱體，控制流量在800ml/min上樣，然后用馬血清原液等體積的10mM磷酸鹽緩沖液(pH值6.0-7.0，含0.05M NaCl)洗柱，收集穿透液；3)將穿透液超濾濃縮調(diào)整抗血清濃度，使蛋白含量不超過(guò)170g/l，加氯化鈉使最終含量為750g/l，加三氯甲烷，使最終含量為5g/l，2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5，用0.22um濾膜除菌過(guò)濾，獲得產(chǎn)品。
采用《中國(guó)藥典》(2005年版)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下

實(shí)施例2抗狂犬病血清的純化制備1、消化取抗狂犬病免疫血漿40萬(wàn)ml用蒸餾水稀釋3倍，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，加入適量胃酶及甲苯0.2％(ml/ml)，于30℃消化1.5小時(shí)。
2、第一次沉淀及加溫處理將上述每100ml消化液中加入硫酸銨15g，用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.8；加溫至58℃保持30分鐘。加溫完畢，盡快降溫至45℃以下，過(guò)濾，取清液。
3、第二次沉淀上述清液用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，每100ml加硫酸銨20g；攪拌均勻后靜止30分鐘，過(guò)濾，取沉淀。
4、明礬沉淀上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過(guò)2g/L，每100ml加入10％明礬液10ml，用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.8，過(guò)濾，取清液。
5、超濾濃縮將上述清液混合，通過(guò)超濾裝置進(jìn)行超濾，濃縮至硫酸銨含量為0.1％(g/ml)以下，即為抗血清原液。
6、離子交換劑吸附純化用100000ml，Amersham Biosciences公司生產(chǎn)的牌號(hào)為DEAE Sepharose Fast Flow的陰離子交換劑裝柱，用10mM磷酸鹽緩沖液(pH值6.8，含0.05M NaCl)進(jìn)行平衡；2)將80000ml澄清過(guò)濾的抗血清原液通過(guò)輸液泵加入柱體，用注射用水調(diào)整蛋白濃度為60mg/ml控制流量在800ml/min上樣，上樣時(shí)間約為1.67小時(shí)，然后用馬血清原液體積1.5倍的10mM磷酸鹽緩沖液(pH值6.8，含0.05M NaCl)洗柱，收集所有穿透液；3)將穿透液超濾濃縮調(diào)整抗血清濃度，使蛋白含量為160g/l，加氯化鈉使最終含量為900g/l，加硫柳汞，使最終含量為0.1g/l，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5，用0.22um濾膜除菌過(guò)濾，獲得產(chǎn)品。
采用《中國(guó)藥典》(2005年版)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下

實(shí)施例3純化方法同實(shí)施例1。
采用《中國(guó)藥典》(2005年版)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一種馬抗血清的制備方法，其特征在于，包括下述步驟將馬血清原液流過(guò)裝填有陰離子交換劑的離子交換吸附柱上樣，然后用pH值6.0-7.0的磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液，并超濾濃縮至蛋白含量不超過(guò)170g/l，然后加入氯化鈉和防腐劑，用堿性或酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，用0.2～0.3um的濾膜過(guò)濾除菌，獲得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將馬血清原液用注射用水調(diào)整蛋白濃度為40-60mg/ml，以600～1000ml/min的流速流過(guò)裝填有陰離子交換劑的離子交換吸附柱，柱體積為馬血清原液體積的0.5～1.5倍，上樣，然后用1～2倍的馬血清原液體積的pH值6.0-7.0磷酸鹽緩沖液洗柱，收集穿透液，并超濾濃縮至蛋白含量不超過(guò)170g/l，然后加入氯化鈉和防腐劑，用堿性或酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，用0.2～0.3um的濾膜過(guò)濾除菌，獲得產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，上樣時(shí)間1～3小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的磷酸鹽緩沖液為5-10mM磷酸鹽緩沖液(pH值6.0-7.0，含0.05M NaCl)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以超濾濃縮后的產(chǎn)物的總體積計(jì)，氯化鈉的加入量為750-950g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的防腐劑選自三氯甲烷、硫柳汞或間甲酚中的一種，以超濾濃縮后的產(chǎn)物的總體積計(jì)，三氯甲烷含量為4～6g/l，硫柳汞含量為0.05～0.15g/l，間甲酚含量為2～3g/l。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的堿性物質(zhì)為氫氧化鈉溶液；所說(shuō)的酸性物質(zhì)為鹽酸溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的陰離子交換劑選自SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow、DEAE SepharoseFast Flow、ANX Sepharose Fast Flow中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～7所述的方法，其特征在于，所述的馬抗血清包括破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的馬抗血清包括破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬抗血清(抗毒素)制劑的規(guī)?；a(chǎn)純化制備方法，該方法包括免疫血漿消化處理、兩次硫酸銨沉淀、第三次明礬吸附沉淀、超濾濃縮和離子交換劑柱層析吸附純化等步驟。本發(fā)明將離子交換劑柱層析純化技術(shù)應(yīng)用于馬抗血清(抗毒素)制劑的規(guī)?；a(chǎn)純化制備，開(kāi)發(fā)出新型純化抗血清(抗毒素)系列產(chǎn)品。該系列產(chǎn)品與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，其藥物的主要有效成分F(ab)
文檔編號(hào)A61P31/00GK1947728SQ20051003039
公開(kāi)日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者李景玉, 范志和, 張 浩, 季沖 申請(qǐng)人:上海賽倫生物技術(shù)有限公司