專利名稱:L-谷氨酰胺在制備防治細(xì)胞缺糖損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種條件必需氨基酸-谷氨酰胺的新用途,具體涉及L-谷氨酰胺在制備防治細(xì)胞缺糖損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
細(xì)胞缺糖損傷是伴隨著細(xì)胞缺血性損傷和細(xì)胞缺氧性損傷而發(fā)生的一種常見的、嚴(yán)重的細(xì)胞損傷類型,腦缺血、心肌缺血都是臨床上常見的以細(xì)胞缺糖損傷伴有細(xì)胞缺氧性損傷為病理基礎(chǔ)的的疾病,嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡;文獻還報道一些神經(jīng)退行性病變的疾病如阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等也與缺糖引起的損傷相關(guān)。因此研究細(xì)胞缺糖性損傷的干預(yù)及其分子機制是目前國內(nèi)外關(guān)注的熱點之一,特別是尋找有效的干預(yù)藥物有著重要的理論意義和應(yīng)用價值。
谷氨酰胺(Glutamine,Gln)為一種條件必需氨基酸,在組織嚴(yán)重?fù)p傷和疾病時表現(xiàn)為必需氨基酸,參與損傷組織的修復(fù)過程(Byrne TA,RL Persinger,LS Young,TR Ziegler,DW Wilmore,1995,Ann Surg.222(3)243-255;Ziegler,R Thomas,Bazargan,Niloofar,Leader,M Lorraine,Martindale,G Robert,2000,Current Opinion in Clinical Nutrition& Metabo-lic Care.(5)355-362)。近年來Gln作為一個高安全性的藥物被越來越多地應(yīng)用于臨床,如谷氨酰胺在腫瘤治療中的應(yīng)用、對心功能不全的治療、對胰島素抗藥性影響、抗疲勞作用等等。近年來有報道都顯示谷氨酰胺能通過增強熱休克蛋白(heat shock protein,hsp)家族成員的表達而發(fā)揮其藥理作用。Sanders和Kon發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺在熱應(yīng)答的條件下可增強hsp70的表達(Sanders MM,C Kon.1991,J Cell Physiol.146180;1992,J Cell Ph.150(3)620-631),將其直接注射入CHO細(xì)胞質(zhì),經(jīng)Northern和Western實驗也證實hsp70表達增強(Wischmeyer PE,J Riehm,KD Singleton,H Ren,MW Musch,M Kahana,EB Chang.2003,Glutamine Attenuates TumorNecrosis Factor-_Release and Enhances Heat Shock Protein 72in Human Peripheral BloodMononuclear Cells Nutrition.19(1)1-6;Paul E,MD Wischmeyer.2002,Glutamine and HeatShock Protein ExpressionNutrition 18225-228)。Wischmeyer報道谷氨酰胺也可引起熱激后的IEC-18細(xì)胞中hsp70和hsp72的表達增強(Wischmeyer PE.Glutamine inducesheat shock protein expression.[J].Nutrition,2002,18225-228.;Musch MW,Hayden D,Sugi K,Straus D,Chang EB.Cell-specific induction ofhsp72-mediated protection by glutamine againstoxidant injury in IEC18 cells.[J].Proc Assoc Am Phys,1998,110136)。同時也有研究顯示外源性谷胺酰胺能增強大鼠腸上皮細(xì)胞hsp72的表達,從而對氧化劑和熱激引起的腸上皮細(xì)胞的損傷起到保護作用(Chow A,Zhang R.Glutamine reduces heatshock-induced cell death on rat intestinal epithelial cells.[J].J Nutr,1998,1281296)。谷氨酰胺這種增強作用較谷氨酸——谷氨酰胺的前體物質(zhì)和代謝產(chǎn)物要強100倍,以谷氨酰胺的類似物6-重氮-5-氧-左旋正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)代替谷氨酰胺作用于體外培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)具有同樣的效應(yīng)(Paul E,Wischmeyer,Jacob,Riehm et al.Glutamine attenuates tumor necrosis factor-alpha release and enhances heat shock protein 72 inhuman peripheral blood mononuclear cells.[J].Nutrition,2003,19(1)l-6),因此證實了谷氨酰胺的這一作用與其代謝過程無關(guān)。雖然已有大量的報道顯示谷氨酰胺通過上調(diào)熱休克蛋白的報道而對多種因素引起的細(xì)胞損傷有保護作用,但谷氨酰胺對細(xì)胞缺糖損傷的保護作用卻鮮見報道。
葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(grp75)是細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的一種重要的分子伴侶,在缺糖、輻射等應(yīng)激條件下,grp75呈上調(diào)表達,尤其是對細(xì)胞缺糖的刺激反應(yīng)最為明顯,以起到保護蛋白質(zhì),協(xié)助蛋白質(zhì)(特別是線粒體蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)運,提高細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)耐受性的作用(YanLIU,WenLIU,XiaodongSONG,JiZUO.Effect ofgrp75overexpression on intracellular ATP level,mitochondrial membrane potential and ROSaccumulation following glucose deprivation in PC 12 cells[J].Molecular andCellularBiochemistry2005,(268)45-51;Zuo J,Xia Bl,Massa SM,et al.grp75 is upregulated in ischemic brain.[J].J.Neurochem.1996,67S33A.)。grp75的這種生物學(xué)特性和對細(xì)胞缺糖損傷的保護作用,對于臨床上各種以細(xì)胞缺糖損傷的病理基礎(chǔ)的疾病的治療提供了一種新的思路。然而誘導(dǎo)grp75上調(diào)的因素多為有害因子,如缺氧,變性蛋白,射線等,由此激發(fā)的grp75的上調(diào)表達而產(chǎn)生的對細(xì)胞的保護作用也是很有限的;而就目前的技術(shù),利用轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)其臨床治療作用也具有極高的難度,缺乏可操作性。因此尋找一種安全性高的grp75表達增強劑實現(xiàn)其對細(xì)胞缺糖損傷的保護將具有相當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供條件必需氨基酸-谷氨酰胺的新用途,具體涉及L-谷氨酰胺在制備防治細(xì)胞缺糖損傷藥物中的應(yīng)用。
grp75是細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的一種重要的分子伴侶,其N端1-23位點為線粒體的穿膜信號,可以幫助蛋白正確折疊、協(xié)助蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運。在細(xì)胞能量代謝過程中g(shù)rp75可以幫助與能量代謝相關(guān)的生物大分子穿過線粒體參與能量代謝的各種反應(yīng),故而其表達的增強可起到對細(xì)胞缺糖損傷的保護作用,由于谷氨酰胺可上調(diào)hsp家族成員hsp70、hsp72的表達,如果也能上調(diào)grp75的表達,并因此對缺糖損傷的細(xì)胞產(chǎn)生保護作用,則可將分子保護機制轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂信R床可操作性強的手段,對細(xì)胞缺糖性損傷的防治具有重要意義本發(fā)明進行了谷氨酰胺對grp75的表達的影響,以及因此產(chǎn)生的對細(xì)胞缺糖損傷和以細(xì)胞缺糖損傷為病理基礎(chǔ)的動物缺血性腦損傷的保護、治療作用實驗。
本發(fā)明采用PC12細(xì)胞為研究對象,通過DMEM無糖培養(yǎng)液培養(yǎng)建立細(xì)胞缺糖損傷模型。用免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法對比正常細(xì)胞、缺糖損傷模型和谷胺酰胺作用下的grp75蛋白的表達情況;用RT-PCR法在mRNA水平檢測谷氨酰胺對grp75表達的作用。以MTT法檢測谷氨酰胺對缺糖損傷細(xì)胞的存活率的影響;流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞在缺糖條件下和谷氨酰胺保護下細(xì)胞凋亡率的變化、線粒體跨膜電位的改變。并以大腦中動脈線栓法制作動物腦缺血模型,觀察谷氨酰胺對模型動物的治療作用。結(jié)果表明,谷氨酰胺對應(yīng)激基因grp75表達有調(diào)控作用;谷胺酰胺可以通過增強grp75的表達對細(xì)胞缺糖損傷產(chǎn)生保護作用;谷氨酰胺對動物缺血性損傷也具有治療作用。本發(fā)明為尋找細(xì)胞缺糖損傷保護性藥物、為臨床上缺血性疾病的治療提供了依據(jù);也為進一步分析grp75表達調(diào)控的機制奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明通過下述方法和步驟實現(xiàn)1、細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),PC12細(xì)胞無糖培養(yǎng)(建立細(xì)胞缺糖損傷模型),不同濃度谷氨酰胺分別作用于常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞和無糖培養(yǎng)細(xì)胞;2、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)grp75的表達細(xì)胞培養(yǎng)與分組,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測;3、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測細(xì)胞內(nèi)grp75的表達細(xì)胞培養(yǎng)與分組,蛋白質(zhì)免疫印跡實驗分別檢測谷氨酰胺對常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞和無糖培養(yǎng)細(xì)胞中g(shù)rp75的表達的影響,檢測不同濃度谷氨酰胺對常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞的grp75的表達的影響,檢測谷氨酰胺不同作用時間下對常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞grp75表達的影響;4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)檢測細(xì)胞內(nèi)grp75mRNA含量細(xì)胞培養(yǎng)與分組,設(shè)計引物grp75基因的擴增引物sense5′-TCAACTGATGCCTTGCA-3′antisense5′-AACCGTACATACGACCT-3′產(chǎn)物片段為406bp,β-actin基因的擴增引物sense5′-AACCGTGAAAAGATGACCCAG-3′antisense5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′產(chǎn)物片段為741bp;RT-PCR實驗;5、反義grp75轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞pcDNA3/antigrp75表達載體構(gòu)建,帶有EcoR I和BamH I酶切位點的目的基因PCR擴增引物sense5’AGTGAATTCaggtgccagaactacccctt3’antisense5’GATTAagctttacttggggctctg3’,表達載體質(zhì)粒擴增、提取與鑒定,antigrp75的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和鑒定;6、MTT檢測細(xì)胞活率細(xì)胞培養(yǎng)與分組,MTT檢測谷氨酰胺對細(xì)胞活率的影響檢測谷氨酰胺對常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞的活率的影響,檢測谷氨酰胺對無糖培養(yǎng)細(xì)胞活率的影響,檢測氨酰胺對無糖培養(yǎng)grp75失表達細(xì)胞活率的影響;7、細(xì)胞亞二倍體率檢測細(xì)胞分組與培養(yǎng),流式細(xì)胞法檢測谷氨酰胺作用下細(xì)胞凋亡率的變化;8、線粒體跨膜電位檢測細(xì)胞培養(yǎng)與分組,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化;9、動物腦缺血模型(MCAO)制作MCAO大鼠模型建立,谷氨酰胺對模型動物的治療;10、谷氨酰胺治療作用觀察手術(shù)后連續(xù)進行實驗動物的神經(jīng)功能缺損評分,動物腦組織切片觀察,腦片焦油紫染色后計算梗死灶面積。
本發(fā)明所采用的材料為大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞系(PC12細(xì)胞系)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;大腸桿菌JM109株;Taq DNA聚合酶(上海生工生物工程公司);4×dNTPs(上海生工生物工程公司);pcDNA3pcDNA3表達載體夠自美國Invitrofen公司;HindIII限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)緩沖液(華美生物工程公司);EcoR I限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)緩沖液(華美生物工程公司);T4 DNA連接酶及緩沖液(Promega公司);DNA回收試劑盒(Clontech公司);.lipofectamine 2000(invitrogen公司);G418(Lnvitrogen公司)DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM無糖培養(yǎng)基(GiBco公司),胎牛血清、馬血清(GiBco公司);谷氨酰胺(Sigma公司);羊抗鼠grp75多克隆抗體(Santa Craz公司);免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(博士德公司);HRP-驢抗羊二抗、ECL試劑盒(普飛公司);逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLVRT,10×M-MLVRT Buffer(Promega公司)、TRIZOL(華舜試劑公司)、Oligo d(T)16、10×PCR反應(yīng)緩沖液(上海生工生物工程公司);MTT、DMSO DiOC6(3)(Sigma公司);焦油紫(Sigma公司)。
圖1是谷氨酰胺作用下PC12細(xì)胞中g(shù)rp75表達的變化免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(200×)其中APC12經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)液作用24h,BPC12細(xì)胞無糖培養(yǎng)24h,胞質(zhì)中棕色顆粒為grp75蛋白,CPC12細(xì)胞經(jīng)谷氨酰胺常規(guī)培養(yǎng)液作用24h,DPC12經(jīng)含谷氨酰胺無糖培養(yǎng)基作用24h。
圖2是免疫印跡法檢測谷氨酰胺作用下PC12細(xì)胞中g(shù)rp75表達其中A無糖培養(yǎng)24h,B、C常規(guī)培養(yǎng)24h,DPC12經(jīng)谷氨酰胺常規(guī)培養(yǎng)液作用24h,EPC12經(jīng)含谷氨酰胺無糖培養(yǎng)基作用24h。
圖3是不同濃度谷氨酰胺作用下PC12細(xì)胞內(nèi)grp75的表達其中A0.2mmol/LB0.4mmol/LC4mmol/LD8mmol/L。
圖4是谷氨酰胺不同作用時間下PC12細(xì)胞內(nèi)grp75的表達其中A6hB12hC18hD24h。
圖5是谷氨酰胺作用下PC12細(xì)胞中g(shù)rp75mRNA水平的變化其中APC12經(jīng)含谷氨酰胺無糖培養(yǎng)基作用24h,BPC12經(jīng)谷氨酰胺常規(guī)培養(yǎng)液作用24h CPC12經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)液作用24h,DPC12經(jīng)無糖培養(yǎng)基作用24h正常細(xì)胞,圖6是谷氨酰胺對grp75低表達細(xì)胞缺糖損傷活率的影響圖7是谷氨酰胺對缺糖損傷細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響其中APC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h,BPC12細(xì)胞無糖培養(yǎng)24h,C、DPC12細(xì)胞含谷氨酰胺無糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。
圖8是各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分圖9是各組大鼠腦組織切片顯示梗死面積其中A正常腦組織皮層,B缺血14d皮層,C谷氨酰胺處理后皮層,D正常腦組織海馬,E缺血14d海馬,F(xiàn)谷氨酰胺處理后海馬。
具體實施例方式
實施例1離體細(xì)胞實驗谷氨酰胺調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞grp75表達實驗;谷氨酰胺對細(xì)胞缺糖損傷保護作用實驗1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞的正常培養(yǎng)10ml培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板用0.1mg/ml多聚賴氨酸,PC12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱適時換液、傳代。
PC12細(xì)胞的無糖培養(yǎng)待細(xì)胞生長到1×105密度,吸去正常培養(yǎng)基,以DMEM無糖培養(yǎng)液洗細(xì)胞兩次,加入DMEM無糖培養(yǎng)基,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
谷氨酰胺作用PC12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基,待細(xì)胞鋪滿后,分別換入含不同濃度谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基,和含不同濃度谷氨酰胺的DMEM無糖培養(yǎng)基。
2免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)grp75的表達細(xì)胞培養(yǎng)與分組細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板,分為陰性對照組,正常對照組,無糖培養(yǎng)組,谷氨酰胺組(4mmol/L),谷氨酰胺無糖(4mmol/L)組各4個復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后進行免疫細(xì)胞化學(xué)實驗。
免疫細(xì)胞化學(xué)檢測培養(yǎng)細(xì)胞以甲醇固定15min,PBS浸洗。.正常兔血清37℃封閉30min,grp75抗體以(1∶50)37℃孵育1h,PBS浸洗15min,陰性對照組以PBS代替一抗。生物素化二抗、SABC混合液,37℃各孵育1h;DAB顯色、鏡檢。
3、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測細(xì)胞內(nèi)grp75的表達細(xì)胞培養(yǎng)與分組細(xì)胞培養(yǎng)于10ml培養(yǎng)瓶,分為陰性對照組,正常對照組,無糖培養(yǎng)組,谷氨酰胺組(4mmol/L),谷氨酰胺無糖(4mmol/L)組37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
細(xì)胞培養(yǎng)于10ml培養(yǎng)瓶,待生長至一定密度后,換入含不同濃度的谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液,37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
細(xì)胞培養(yǎng)于10ml培養(yǎng)瓶,待生長至一定密度后,換入含4mmol/L谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液,37℃CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)6h、12h、18h和24h。
蛋白質(zhì)免疫印跡實驗上述各組細(xì)胞提取蛋白質(zhì),進行SDS-PAGE電泳,半干式轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜15min(電源電流≤0.8mA/cm2)。grp75的抗體以pBS按1∶100稀釋,37℃平緩搖動孵育1h。4℃過夜。TTBS洗膜后加入二抗工作液(1∶1000),室溫?fù)u動孵育45min。按ECL試劑盒說明書曝光顯影。
4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)檢測細(xì)胞內(nèi)grp75mRNA含量細(xì)胞培養(yǎng)與分組細(xì)胞培養(yǎng)于10ml培養(yǎng)瓶,分為陰性對照組,正常對照組,無糖培養(yǎng)組,谷氨酰胺組(4mmol/L)和谷氨酰胺無糖組(4mmol/L),37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
引物設(shè)計grp75基因的擴增引物sense5′-TCAACTGATGCCTTGCA-3′antisense5′-AACCGTACATACGACCT-3′產(chǎn)物片段為406bp,β-actin基因的擴增引物sense5′-AACCGTGAAAAGATGACCCAG-3′antisense5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′產(chǎn)物片段為741bp,RT-PCR實驗Trizol抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA,測定OD260和OD280值以計算純度。4ugRNA加oligdT1μl,加DEPC水至13μl,70℃加熱10min,冰浴1min。加入5×緩沖液5μl、dNTPS 5ul、M-MLVRT1μl、Rasin(inhibitor)1μl,混勻37℃恒溫水浴1h,90℃2-3min合成cDNA第一鏈的合成。50ulPCR反應(yīng)體系,包括cDNA、grp75引物、Actin引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、水。設(shè)置PCR循環(huán)參數(shù)預(yù)變性94℃7min,變性94℃60s,復(fù)性55℃60s,延伸72℃60s,35個循環(huán)后延伸,72℃5min。瓊脂糖電泳,Eagle Eye凝膠成像儀檢測結(jié)果。
5、反義grp75轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞grp75反義表達載體構(gòu)建反義表達載體的構(gòu)建通過擴增grp75編碼區(qū)的一段986bp的片斷,再將其反向插入pcDNA3載體。
擴增引物sense5’AGTGAATTCaggtgccagaactacccctt3’antisense5’GATTAagctttacttggggctctg3’PCR反應(yīng)體系包括引物、grp75plasmid、10×buffer、dNTPs、Taq酶等。PCR循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性94℃90s、變性94℃45s、退火60℃45s、延伸72℃60s、再延伸72℃300s,循環(huán)次數(shù)為32次。PCR產(chǎn)物與pCDNA3載體以EcoR I和BamH I酶切,DNA回收試劑盒回收DNA;2μl5×反應(yīng)緩沖液,1μlT4連接酶,20ng PCR酶切回收產(chǎn)物和60ngpCDNA3酶切產(chǎn)物,加ddH2O至10μl,4℃過夜,以將目的基因與pCDNA3酶切產(chǎn)物連接。
表達載體質(zhì)粒擴增、提取與鑒定制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,使質(zhì)粒pcDNA/antigrp75穿過細(xì)菌細(xì)胞膜進入大腸桿菌,并在選擇性培養(yǎng)基中生長成菌落。挑取單個菌落,接種至含氨芐青霉素60μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中,質(zhì)粒擴增、提取后以HindIII限制酶和EcoRI限制酶進行酶切鑒定。
antigrp75的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和鑒定PC12培養(yǎng)于24孔板內(nèi),至生長密度為80%,將脂質(zhì)體(.lipofectamine 2000)-目的DNA復(fù)合物緩慢滴加入培養(yǎng)板中。培養(yǎng)6h后換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h,換液并加入G418至終濃度為400μg/ml篩選,至獲得細(xì)胞克隆。蛋白質(zhì)印跡法鑒定低表達grp75細(xì)胞克隆的。
6、MTT檢測谷氨酰胺對無胞活率的影響細(xì)胞培養(yǎng)與分組PC12細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板,接種密度為1×105個/ml;待細(xì)胞密度到70%左右,分別換以DMEM高糖培養(yǎng)液、DMEM無糖培養(yǎng)液以及含不同濃度谷氨酰胺的DMEM無糖培養(yǎng)液,每組各6個復(fù)孔。grp75低表達細(xì)胞每組6個復(fù)孔,共5組以同樣密度接種于96孔板,待細(xì)胞密度到70%左右,換以含不同濃度谷氨酰胺(0.2mM、0.4mM、4mM、8mM和40mM)的DMEM無糖培養(yǎng)液(0.2mM、0.4mM、4mM、8mM和40mM)。
MTT檢測細(xì)胞活率上述各孔細(xì)胞培養(yǎng)24h,每孔加10μlMTT染料溶液,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。吸棄上述溶液后,加100μl DMSO溶解沉淀,室溫30min。酶標(biāo)儀上570nm處測定OD值。
7、細(xì)胞亞二倍體率檢測PC12細(xì)胞培養(yǎng)于10ml培養(yǎng)瓶,生長密度為106個/ml。分別換以DMEM高糖培養(yǎng)液、DMEM無糖培養(yǎng)液以及含谷氨酰胺(4mM)的DMEM無糖培養(yǎng)液,作用24h,流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡率。
8、線粒體跨膜電位檢測細(xì)胞培養(yǎng)與處理同細(xì)胞亞二倍體率檢測,胰酶消化細(xì)胞,0.25ml相應(yīng)的培養(yǎng)液吹打細(xì)胞成細(xì)胞懸液,加入DiOC6(3),至細(xì)胞終濃度為2nM,37℃避光孵育15min,流式細(xì)胞儀檢測DiOC6(3)的熒光強度,激發(fā)波長484nm,發(fā)射波長501nm。
結(jié)果顯示免疫化學(xué)染色顯示谷氨酰胺上調(diào)grp75表達細(xì)胞在缺糖損傷24h后活細(xì)胞數(shù)量減少,胞體變小、變圓,細(xì)胞皺縮。而在含有谷氨酰胺的無糖培養(yǎng)液中生長24h后細(xì)胞數(shù)量和性狀與正常細(xì)胞相似。
細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示grp75蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,grp75在缺糖刺激后呈上調(diào)表達(與對照組比P<0.05=;經(jīng)谷氨酰胺作用后grp75蛋白表達量較高,結(jié)果顯示無論在正常培養(yǎng)液或無糖培養(yǎng)液中生長的細(xì)胞經(jīng)谷氨酰胺的作用,grp75均呈上調(diào)表達,經(jīng)灰度分析,并以SPSS軟件統(tǒng)計P<0.01。在無糖培養(yǎng)液中生長的細(xì)胞經(jīng)谷氨酰胺的作用后上調(diào)表達更明顯(圖1),表1是谷氨酰胺作用下PC12細(xì)胞中g(shù)rp75表達免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果灰度值分析。
表1
*與對照組比P<0.05**與對照組比P<0.01
蛋白質(zhì)免疫印跡顯示谷氨酰胺上調(diào)grp75表達PC12細(xì)胞分別經(jīng)DMEM、DMEM無糖培養(yǎng)基、含谷氨酰胺的DMEM及DMEM無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,提取蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測細(xì)胞中g(shù)rp75的表達情況。結(jié)果顯示grp75蛋白在無糖培養(yǎng)24h(模型組)后,表達明顯升高;而經(jīng)谷氨酰胺作用后,grp75呈明顯的上調(diào)表達,且這種上調(diào)表達對缺糖損傷的細(xì)胞更為明顯(圖2)。
PC12細(xì)胞分別以不同濃度的谷氨酰胺無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,提取蛋白質(zhì)進行免疫印跡檢測,觀察谷氨酰胺的劑量與其上調(diào)grp75的作用之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)印跡顯示谷氨酰胺濃度為4mmol/L和8mmol/L時grp75表達條帶明顯較濃度較低時明顯(圖3)。
以含4mmol/L濃度谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)PC12細(xì)胞,分別于換入谷氨酰胺培養(yǎng)液后6h、12h、18h、24h后收獲細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白質(zhì),通過蛋白質(zhì)印跡法鑒定谷氨酰胺作用時間不同,細(xì)胞內(nèi)grp75表達情況。實驗結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)的grp75的表達并不隨著谷氨酰胺作用時間的延長也增強(圖4)。
RT-PCR測定谷氨酰胺提高grp75mRNA水平本發(fā)明以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法在mRNA水平檢測細(xì)胞在谷氨酰胺作用下grp75表達的,驗證了谷氨酰胺對grp75的表達影響。用β-actin作為內(nèi)參照,結(jié)果顯示谷氨酰胺作用下細(xì)胞內(nèi)grp75mRNA量明顯增高,這種增高作用在無糖條件下更為顯著(圖5)。
反義grp75表達載體轉(zhuǎn)染降低PC12細(xì)胞內(nèi)grp75表達grp75的反義表達載體經(jīng)HindIII和EcoRI酶切,瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)符合5.4kb和986bp的條帶,反義載體的序列和插入方向都符合要求。
將反義grp75轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,提取蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗,可見細(xì)胞內(nèi)的grp75表達量降低。
MTT法檢測谷氨酰胺對缺糖損傷細(xì)胞活率的影響為觀察谷氨酰胺對細(xì)胞是否具有毒性,以含不同濃度的谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞24h,以MTT法檢測了不同濃度谷氨酰胺對正常細(xì)胞活率的影響。結(jié)果各濃度組的OD與對照組相比P>0.05,表明谷氨酰胺對正常細(xì)胞的生長沒有影響,顯示了谷氨酰胺作為藥物的高安全性。表2是谷氨酰胺對細(xì)胞活率的影響。
表2
*與對照組比P>0.05 無糖組比P<0.01細(xì)胞經(jīng)無糖培養(yǎng)24h后,MTT值僅為正常培養(yǎng)細(xì)胞的26%,而經(jīng)谷氨酰胺作用的細(xì)胞其MTT值明顯高于模型細(xì)胞,而且在濃度僅為0.2mmol/L時即出現(xiàn)了一定程度的保護作用,并隨著谷氨酰胺的濃度上升而增強。表3是谷氨酰胺對缺糖細(xì)胞活率的影響。
表3
△與正常對照組比P<0.01*與模型組比P<0.01本發(fā)明以MTT法檢測grp75低表達的細(xì)胞在含不同濃度的谷氨酰胺的無糖培養(yǎng)液中的活率。結(jié)果顯示grp75的低表達與對照組細(xì)胞相比,經(jīng)谷氨酰胺作用下兩組細(xì)胞的存活率均有所提高,但是與對照組相比,grp75失表達后,谷氨酰胺對細(xì)胞的保護作用明顯降低(圖6),證實谷氨酰胺對缺糖損傷細(xì)胞的保護效應(yīng)確實是通過調(diào)節(jié)grp75的表達所起作用的。
細(xì)胞亞二倍體率檢測結(jié)果本發(fā)明中,細(xì)胞缺糖24h,培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率達到33.42%,而細(xì)胞在含4mM的無糖培養(yǎng)液中生長同樣的時間,凋亡率僅為7.97%(圖7)。
線粒體跨膜電位檢測結(jié)果細(xì)胞在缺糖24h后,線粒體的跨膜電位明顯降低,而在含谷氨酰胺(4mM)無糖培養(yǎng)液中生長的細(xì)胞則未見這種線粒體跨膜電位崩潰的情況(圖7)。
實施例2整體動物實驗谷氨酰胺對大鼠缺血性腦損傷的保護作用實驗1、建立大鼠腦缺血模型(MCAO)動物分組實驗用大鼠均飼養(yǎng)于室溫22℃,相對濕度55%的動物房,12h晝夜節(jié)律,自由進食及飲水,適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。術(shù)前所有實驗動物均禁食12h,大鼠隨機分為對照組、模型組(MCAO)和谷氨酰胺處理組。
建立MCAO模型;模型組和谷氨酰胺處理組大鼠,均選擇左側(cè)大腦中動脈(MCA)區(qū)作為梗死側(cè),10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉.;正中切開頸部皮膚,暴露頸總動脈并向上分離出頸內(nèi)動脈和頸外動脈主干及其分支,雙極射頻電凝器電凝并剪斷頸外動脈分出的枕動脈和甲狀腺上動脈,在舌動脈和頜動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈,動脈夾夾閉頸外動脈和頸內(nèi)動脈的分叉處。頸外動脈遠端結(jié)扎處附近剪一小口,插入尼龍線并疏松結(jié)扎,2h后緩慢退出尼龍線,縫合皮膚。
2、谷氨酰胺治療谷氨酰胺處理組動物于手前24h后開始處理,按動物體重以0.75g/kg劑量腹腔注射,每天一次至動物處死。
3、谷氨酰胺治療后動物的神經(jīng)功能缺損評分手術(shù)后連續(xù)評定實驗動物的神經(jīng)功能缺損評分,每天一次至動物處死。動物于手術(shù)后14天處死。
評分標(biāo)準(zhǔn)0分正常;1分對側(cè)肢體屈曲2分拖住尾巴后拉時,對側(cè)肢體無力;3分拉住鼠尾,向病側(cè)轉(zhuǎn)圈;4分自發(fā)向病側(cè)轉(zhuǎn)圈;5分不能自發(fā)運動(Zea-longa E,Weinstein PR,Carlson,et al.[J].Stroke,1989,20(1)84-91)。
4、腦組織切片梗死灶面積計算腦片制作分別于手術(shù)后4、7、14天處死動物。0.9%的生理鹽水心內(nèi)灌注沖洗,4%多聚甲醛固定約30min,斷頭取腦,4%多聚甲醛固定液過夜,取腦做連續(xù)冠狀切片,切片自大鼠前囟嘴側(cè)1.4mm開始,切至前囟尾側(cè)4.8mm,每片厚度為40um。并觀察腦組織損傷情況。
腦片焦油紫染色后計算梗死灶面積連續(xù)切片后每隔10片取一張作焦油紫染色,計算腦缺血梗死體積,照片掃描后用Leica圖像處理系統(tǒng)測定切片的腦梗塞面積,利用公式(Ekdahl CT,MohapelP,Elmer E,et al.Eur J Neurosci,2001;14(6)937-45)算出梗塞區(qū)及缺血對側(cè)腦片體積,利用梗塞體積百分比(梗塞體積/對側(cè)腦片體積×100%)表示損傷程度。
結(jié)果顯示谷氨酰胺治療后動物的神經(jīng)功能缺損評分正常對照組動物未見神經(jīng)功能缺損。手術(shù)組大鼠術(shù)后出現(xiàn)一定程度的神經(jīng)功能缺損,隨著時間的推移大鼠神經(jīng)功能缺損程度逐漸降低,第7天后的神經(jīng)功能癥狀較第1天明顯減輕,但始終存在一定程度的神經(jīng)功能缺損,第14天的神經(jīng)功能缺損評分依然為1分。谷氨酰胺處理組大鼠的神經(jīng)功能癥狀在術(shù)后第2天起即有明顯地減輕,第2-6天其功能缺損評分均低于比模型組;第7天起即降低至0分(圖8)。
谷氨酰胺對MCAO大鼠腦梗死體積的影響正常腦組織的切片相比,缺血14天的腦組織缺血部位損傷嚴(yán)重,缺血14天的組織腦組織切片中前腦缺血區(qū)域的皮層、紋狀體均明顯壞死;損傷側(cè)海馬區(qū)破損嚴(yán)重,海馬呈空泡狀。注射谷氨酰胺后14天后腦組織缺血與缺血相同時間模型組相比腦組織切片中前腦缺血區(qū)域的皮層僅有少部分壞死,紋狀體損傷程度較輕,海馬區(qū)損傷側(cè)皮尺邊界模糊,出現(xiàn)破損但損傷程度明顯減輕;而海馬形態(tài)基本完整(圖9)。
焦油紫染色可見損傷組織的神經(jīng)元數(shù)量減少,形態(tài)改變,尼氏小體減少,而谷氨酰胺保護下,形態(tài)類似正常皮層;焦油紫染色顯示腦缺血大鼠左側(cè)大腦出現(xiàn)梗死灶。手術(shù)后14天,谷氨酰胺治療組的腦梗死體積明顯小于模型組。表4是Gln對MCAO大鼠腦梗死體積的影響(%)。
表4
權(quán)利要求
1.L-谷氨酰胺在制備防治缺糖損傷細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的谷胺酰胺通過增強grp75蛋白的表達防治缺糖損傷細(xì)胞。
3.L-谷氨酰胺在制備grp75表達增強劑中的應(yīng)用。
4.L-谷氨酰胺在制備防治缺血性疾病藥物中的應(yīng)用。
5.L-谷氨酰胺在制備防治缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種條件必需氨基酸-谷氨酰胺的新用途,具體涉及L-谷氨酰胺在制備防治細(xì)胞缺糖損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用PC12細(xì)胞,通過建立細(xì)胞缺糖損傷模型,對比正常細(xì)胞、缺糖損傷模型和谷胺酰胺作用下的grp75蛋白的表達情況;檢測谷氨酰胺對grp75表達的作用、對缺糖損傷細(xì)胞的存活率的影響和在缺糖條件下、谷氨酰胺保護下細(xì)胞凋亡率的變化、線粒體跨膜電位的改變以及對動物腦缺血模型治療實驗。結(jié)果表明,谷氨酰胺對應(yīng)激基因grp75表達有調(diào)控作用、可通過增強grp75的表達對細(xì)胞缺糖損傷產(chǎn)生保護作用、對動物缺血性損傷具有治療作用。本發(fā)明為制備細(xì)胞缺糖損傷保護性藥物、為臨床缺血性疾病的治療提供了依據(jù)。
文檔編號A61P25/28GK1947711SQ20051003043
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者劉雯, 左伋, 劉曉宇, 楊玲 申請人:復(fù)旦大學(xué)