專利名稱：日本血吸蟲疫苗抗原基因的克隆、表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，尤其涉及日本血吸蟲抗原基因SjE16和SjP50的核酸序列、其編碼蛋白；此外，本發(fā)明還涉及以日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白為疫苗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前主要的防治策略是在易感地區(qū)大規(guī)?；熂皽缏莺徒】到逃６嗄陮?shí)踐證明，反復(fù)化療在疫區(qū)能暫時降低發(fā)病，但難以阻斷傳播。同時化療還存在下列缺點(diǎn)1)化療對已造成的組織損害沒有修復(fù)作用；2)化療后病人、病畜可反復(fù)感染，又需要重復(fù)化療和長期檢測，需要昂貴的費(fèi)用和專門人才；3)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些蟲株對化療藥物吡喹酮產(chǎn)生抗性。國際社會普遍認(rèn)為化療必須與一種具有更長期效果的輔助措施相結(jié)合。因此，發(fā)展血吸蟲疫苗是綜合防治血吸蟲病的一項(xiàng)具有戰(zhàn)略意義的輔助措施。為了推動血吸蟲疫苗的研制，世界衛(wèi)生組織—熱帶病研究培訓(xùn)特別規(guī)劃(TDR)將血吸蟲疫苗研制置于血吸蟲病防治研究的重要地位。包括中國、美國、法國、英國和巴西等國家在內(nèi)的政府和各研究機(jī)構(gòu)都在積極地開展血吸蟲疫苗的研究。
盡管血吸蟲疫苗研究難度很大，在短期內(nèi)很難成功，但前景廣闊。幾十年來，血吸蟲疫苗研究經(jīng)歷了從死疫苗、活疫苗，到基因工程疫苗等現(xiàn)代疫苗的一系列探索過程。自60年代起，包括同種或異種減毒活疫苗免疫取得了明顯的保護(hù)作用，但由于抗原的來源有限，保存和運(yùn)輸以及安全性等方面的問題，大規(guī)模的現(xiàn)場應(yīng)用受到限制，故目前多朝著分離及鑒定其保護(hù)性抗原分子，制備亞單位疫苗的方向努力。隨著免疫學(xué)研究進(jìn)展，加強(qiáng)了對血吸蟲病保護(hù)性免疫、發(fā)病機(jī)制以及肉芽腫形成調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，豐富了血吸蟲疫苗研究基礎(chǔ)知識，尤其近十幾年來現(xiàn)代生物化學(xué)及分子生物學(xué)在寄生蟲領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使得疫苗候選分子的鑒定、基因克隆及表達(dá)等方面得到迅速發(fā)展。血吸蟲病疫苗研究與發(fā)展可劃分為四個階段保護(hù)性抗原的鑒定、候選疫苗抗原的臨床前研究、疫苗抗原的臨床前研究、抗原工業(yè)化生產(chǎn)。
迄今已鑒定的血吸蟲抗原分子超過100種，動物試驗(yàn)保護(hù)性一般在30％-50％。其中已克隆表達(dá)的重組疫苗候選分子有20種以上，來源于血吸蟲尾蚴、童蟲、成蟲、卵等各階段，按其性質(zhì)劃分，包括(1)表面相關(guān)抗原22kDa，23kDa，25kDa，50kDa等表膜相關(guān)分子；(2)結(jié)構(gòu)蛋白副肌球蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白，α-微管蛋白；(3)酶谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST26/28kDa)、蘋果酸脫氫酶、谷胱苷肽過氧化物酶，糖酵解酶(TPI，GAPDH，醛縮酶，烯醇化酶)、蛋白酶(血紅蛋白酶，胰肽酶)；(4)生理蛋白脂肪酸結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、鈣網(wǎng)蛋白和熱激蛋白。TDR根據(jù)血吸蟲抗原分子-純化和重組蛋白的保護(hù)水平、誘導(dǎo)效應(yīng)、體內(nèi)的分布及生理功能等多個因素，確定了6個優(yōu)先發(fā)展的的曼氏血吸蟲候選分子谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、副肌球蛋白(Sm97)、輻射疫苗5號抗原(IrV-5)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、23kDa膜抗原(Sm23)、脂肪酸結(jié)合蛋白(Sm14)。此外，其它針對血吸蟲獨(dú)特生理和病理特性的新型疫苗也在探討之中，包括抗合抱疫苗、抗獨(dú)特性疫苗、抗升值疫苗、抗胚胎疫苗、抗免疫病理疫苗。
我國血吸蟲疫苗研究工作起步較晚，自1986年日本血吸蟲基因工程疫苗納入國家863高科技計劃的范疇時，才開始起步。1986-1994年為基礎(chǔ)研究準(zhǔn)備階段，主要是通過引進(jìn)國外曼氏血吸蟲疫苗研究的技術(shù)及成果進(jìn)行日本血吸蟲大陸株的比較研究，如開展日本血吸蟲大陸株26-28kDa的抗原性、免疫原性及免疫機(jī)制的研究，成蟲cDNA基因文庫的構(gòu)建與基因克隆、免疫篩選，Sj26kDa的重組、重組GST蛋白免疫小鼠的保護(hù)性研究，這些研究為我國進(jìn)一步進(jìn)行日本血吸蟲疫苗的研究打下了一定的基礎(chǔ)。
我國研究報道的日本血吸蟲(大陸株)候選抗原分子已超過30個。在曼氏血吸蟲或日本血吸蟲菲律賓株中被公認(rèn)為有希望的GST等10多個亞單位候選抗原，已全部在日本血吸蟲中國大陸株中獲得了克隆和表達(dá)，部分進(jìn)行了動物試驗(yàn)。Sj26GST重組抗原免疫兔、牛后，特異性抗GST抗體至少可持續(xù)56周；Sj28GST、Sj23和Sj97kDa在家蠶真核細(xì)胞核幼蟲表達(dá)后，用于免疫如綿羊、黃牛和水牛等大動物，再用尾蚴攻擊感染，多數(shù)獲得了明顯的減蟲和減卵的效果。Sj22.6、Sj62、SjTPI、Sj26等均已獲得基因克隆，并分別在原核或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。多價疫苗、核酸疫苗和合成肽疫苗也都在國內(nèi)不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行嘗試。
但事實(shí)上，由于血吸蟲能以多種方式逃避宿主的免疫攻擊，包括模擬宿主抗原、抑制宿主免疫反應(yīng)、蟲體表面抗原的改變或喪失表達(dá)等，血吸蟲病疫苗往往有誘導(dǎo)保護(hù)力或宿主保護(hù)性應(yīng)答降低，甚至完全無效等問題。由于日本血吸蟲與曼氏血吸蟲在生物學(xué)特征上有較大的差異，流行區(qū)人群對人本血吸蟲病人的保護(hù)免疫力要低弱，在持續(xù)時間上更短暫。在曼氏血吸蟲病中有希望的疫苗候選分子并未對日本血吸蟲大陸株獲得預(yù)期的保護(hù)力。迄今為止，我們還未獲得具有實(shí)用價值的血吸蟲疫苗。因此，制備有效的血吸蟲疫苗，特別是日本血吸蟲疫苗無疑面臨著巨大的挑戰(zhàn)，需要長期深入的研究。
我國日本血吸蟲病屬人畜共患病，根據(jù)我們最近歷時4年的現(xiàn)場研究—數(shù)學(xué)模式分析的結(jié)果表明，80％的血吸蟲病傳播是來自耕牛，牛是血吸蟲病的重要保蟲宿主和傳染原因。在目前研究人用疫苗難度較大的情況下，首先從獸用疫苗研究突破具有實(shí)際意義。發(fā)現(xiàn)潛在的疫苗靶點(diǎn)，進(jìn)一步開發(fā)牛用疫苗是我們目前血吸蟲疫苗研究的重點(diǎn)。牛用疫苗與其它措施相結(jié)合，將可為有效控制血吸蟲病提供新的途徑。
Sj16與曼氏血吸蟲的SME16基因具有較高的同源性。SME16被認(rèn)為是蟲卵階段特異的鈣結(jié)合蛋白，但其在蟲卵中的功能尚不清楚。1992年Moser在體外重組表達(dá)了曼氏血吸蟲蟲卵中的一種鈣結(jié)合蛋白Sm6(SME16)，該蛋白可為免疫兔血清識別，被認(rèn)為是一種具潛力的診斷抗原。其后Rao的研究發(fā)現(xiàn)Sm16具有抗感染的作用，是一種免疫調(diào)節(jié)蛋白在血吸蟲的免疫逃避中起著重要作用，重組表達(dá)的Sm16具有強(qiáng)烈的免疫活性可為多克隆的免疫兔血清所識別。值得注意的是，鈣結(jié)合蛋白是一類重要的參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的蛋白家族，該類蛋白與靶蛋白結(jié)合后可使后者發(fā)生構(gòu)象改變，從而激發(fā)一系列生物學(xué)反應(yīng)，如肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、酶激活和細(xì)胞生長等[Silva AC，Reinach FC.Calcium binding induces conformational changes in muscleregulatory proteins.Trends Biochem Sci 1991；16(2)53-7]。鑒于SME16在蟲卵中的高表達(dá)和鈣結(jié)合蛋白的重要生理功能，有理由認(rèn)為，SME16在調(diào)節(jié)蟲卵細(xì)胞活動過程中必然發(fā)揮著重要而獨(dú)特的作用。有意思的是SME16與童蟲、成蟲特異的鈣結(jié)合蛋白sm20[Avercroft JC，Huggins MC，Dunne DW，et al.Characterisation of Sm20，a 20-kilodalton calcium-binding protein of Schistosoma manoni.Mol BiochemParasitol 1990；38(2)211-9]以及尾蚴特異的8-KDa鈣結(jié)合蛋白[Am D，Grossman Z，Markovics A，et al.Rapid changes in the expression of a gene encoding a calciumbinding protein in Schistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol1989；34(2)167-75]除了具有相似的鈣結(jié)合位點(diǎn)外，相互之間并不具有明顯的同源性。
免疫素(Immunophilin)是免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的受體，屬FK506結(jié)合蛋白(FKBP)超家族，與熱休克結(jié)合免疫素p59等結(jié)構(gòu)相似。其具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，是蛋白折疊中重要的伴侶分子，并可與多種胞內(nèi)受體蛋白結(jié)合。存在于血吸蟲體內(nèi)的免疫素可與人體內(nèi)FKBP12相互作用，在血吸蟲感染中起重要作用。
由于Sjp50和Smp50在核苷酸水平氨基酸水平上的一致性達(dá)到了71％，可認(rèn)為他們很可能也具有相似的功能。Smp50的研究顯示P50屬FK506結(jié)合蛋白(免疫素)超家族，與熱休克結(jié)合免疫素P59等結(jié)構(gòu)相似，具有PPIase活性，可幫助血吸蟲體內(nèi)的蛋白組裝和蛋白折疊，而且能夠與熱休克蛋白90相互作用，一起構(gòu)成類固醇激素受體復(fù)合物的成分。已知宿主的激素對血吸蟲的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，但到目前為止，人們尚未直接證據(jù)表明血吸蟲體內(nèi)有類固醇激素受體存在。而Sjp50和Smp50的存在可能對驗(yàn)證類固醇受體提供一些支持。以前的研究顯示，P50可以被曼氏血吸蟲可溶性抽提物以及表皮抽提物所識別，說明Smp50可能存在于表皮，且抗P50的抗血清不能識別Hela細(xì)胞和大腸桿菌的抽提物，說明來源于不同物種的FKBP雖然在一般結(jié)構(gòu)上有許多相似性，但在全部結(jié)構(gòu)以及序列上的差異足以產(chǎn)生不同的抗體反應(yīng)。
在本發(fā)明之前，還沒有出現(xiàn)涉及本發(fā)明的新日本血吸蟲疫苗的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供新的日本血吸蟲抗原基因SjE16和SjP50，其分別編碼抗原SjE16和SjP50蛋白。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種制備日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白的方法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種日本血吸蟲病防治疫苗，該疫苗分別以日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白為目的抗原。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供日本血吸蟲病防治疫苗在制備預(yù)防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了兩種分離出的DNA分子，該分子分別包括編碼具有SEQ ID NO1中1-435的核苷酸序列；編碼具有SEQ ID NO3中12-1286的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO1中1-435的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2所示序列的蛋白，所述的SEQ ID NO3中12-1286的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的蛋白。
在本發(fā)明的另一方面，提供了兩種分離出的日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白，它們分別包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有針對日本血吸蟲免疫原性的蛋白，較佳地，該蛋白是具有SEQ ID NO.2序列的蛋白；具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有針對日本血吸蟲免疫原性的蛋白，較佳地，該蛋白是具有SEQ ID NO.4序列的蛋白。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)施例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種日本血吸蟲抗原蛋白的基因工程制備方法，該方法包括(1)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；(2)從培養(yǎng)物中分離出含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白。
在本發(fā)明中，“分離的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白時，可以將SjE16和SjP50蛋白的編碼序列分別可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成SjE16或SjP50蛋白表達(dá)載體。
在本發(fā)明中，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了分別以日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白為目的抗原，通過基因工程制備方法獲得的疫苗。
此外，本發(fā)明還提供了日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白的疫苗在制備預(yù)防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的日本血吸蟲抗原SjE16和SjP50蛋白的疫苗在血吸蟲病防治和治療中有著重要的作用。尤其是當(dāng)SjE16和SjP50抗原聯(lián)合免疫小鼠時，兩個抗原有協(xié)同作用，使小鼠體內(nèi)的日本血吸蟲成蟲數(shù)大幅下降，肝臟內(nèi)蟲卵數(shù)也下降，這一效果明顯優(yōu)于SjE16或SjP50抗原單獨(dú)免疫小鼠所產(chǎn)生的效果。


圖1是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pGEX4T-1-SjP50和pGEX4T-1-SjE16表達(dá)產(chǎn)物；圖2是本發(fā)明的酶切前后的SjP50和SjE16蛋白；圖3是本發(fā)明的RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定SjE16、SjP50在日本血吸蟲發(fā)育各階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)圖；圖4是本發(fā)明的抗原SjE16和抗原SjP50聯(lián)合免疫誘導(dǎo)血吸蟲特異抗原細(xì)胞免疫反應(yīng)柱狀圖；圖5是本發(fā)明的抗原SjE16和抗原SjP50聯(lián)合免疫可誘導(dǎo)宿主對金黃色葡萄球菌抗原(SEB)刺激無反應(yīng)的圖；圖6是本發(fā)明的日本血吸蟲感染或抗原SjE16和抗原SjP50聯(lián)合免疫引起宿主對凝集素(ConA)刺激無反應(yīng)的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1日本血吸蟲抗原SjE16和抗原SjP50基因的獲得。
1.引物的設(shè)計和合成根據(jù)Sj50基因與Sj16基因序列，經(jīng)Primerexpress軟件分析設(shè)計引物，由上海申友生物生物工程公司合成二對引物。
Sj50-F為5’CCGGAATTCATGTCGGAGACGCCAAAGC3’(SEQ ID NO5)，引入EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC；Sj50-R為5’CCGCTCGAGCAGAATTAAGCTCTCACAGGGCA3’(SEQ ID NO6)；引入Xho I酶切位點(diǎn)CTCGAG；引物Sj16-F為5’CCGGAATTCCTTCATCTCAGAATAATGTCGGA3’(SEQ ID NO7)，引入EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC；Sj16-R為5’CCGCTCGAGCATACGTTTGACGTACATAAGCT3’(SEQ ID NO8)，引入Xho I酶切位點(diǎn)CTCGAG。
引物貯存濃度50mM、工作濃度為10mM。
2.Sj50基因、Sj16基因的PCR擴(kuò)增以用常規(guī)方法制備的日本血吸蟲成蟲及蟲卵cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共計50μl，其中模板1.5μl、5’引物2μl、3’引物2μl、dNTP2.5μl、10×Pfu緩沖液5μl、Pfu DNA多聚酶0.5μl、去離子水36.5μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 5min；變性94℃ 1min；退火56℃ 1min；復(fù)性72℃ 2min；循環(huán)30次，最后一個循環(huán)復(fù)性再延長8min后，樣后存于4℃。PCR產(chǎn)物用QIAquick PCRPurification kit回收純化。
結(jié)果1％瓊脂糖凝膠電泳顯示Sj50基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有一條帶大小約1.1Kb與預(yù)計相同。Sj16基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有一條清晰的條帶大小約440bp與理論擴(kuò)增大小相符。
對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明，Sj16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，編碼一個全長為145aa的蛋白(SEQ ID NO2)。Sj50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3，其ORF位于12-1286位，編碼一個全長為425aa的蛋白(SEQ ID NO4)。
實(shí)施例2日本血吸蟲抗原SjE16和抗原SjP50基因的克隆表達(dá)。
1.表達(dá)載體的構(gòu)建回收純化的Sj50基因、Sj16基因和質(zhì)粒pGEX4T-1分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I進(jìn)行酶切。10μl模板加EcoR I 1μl、Xho I 1μl、EcoR I buffer 1.5μl、BSA 0.5μl和去離子水1μl，共計15μl于1.5ml Eppendorf管中37℃水浴過夜。
酶切后的Sj50基因、Sj16基因和質(zhì)粒pGEX4T-1，用QIAquick PCR Purificationkit回收純化。純化的目的基因片段和載體酶切片段，測定OD值，計算片段和載體片段濃度，目的片段和載體片段按3∶1摩爾比進(jìn)行連接。連接體系中含T4 DNA連接酶1μl、10×連接緩沖液1μl、去離子水、pGEX4T-1(80ng)、Sj50基因(60ng)或Sj16基因(20ng)，共計10μl于1.5ml Eppendorf管中12℃-14℃連接過夜，構(gòu)建成Sj50基因、Sj16基因表核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16。
結(jié)果經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切后的Sj50基因、Sj16基因分別和質(zhì)粒pGEX4T-1連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α內(nèi)擴(kuò)增。以擴(kuò)增細(xì)菌為模板，GST-5’、GST-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所獲條帶與目標(biāo)條帶大小一致。
2.表達(dá)載體的鑒定通過電轉(zhuǎn)將重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞，電壓2KV，電容25μF，電阻300Ω，轉(zhuǎn)化時間5.43mS。轉(zhuǎn)化后的菌體加入1ml LB培養(yǎng)液，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)1hr后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)過夜。
隨機(jī)挑取上述平板上的菌落進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系共計10μl，內(nèi)含模板3μl、GST-5’引物0.25μl、GST-3’引物0.25μl、dNTP 0.4μl、10×Pfu buffer 1μl、Tag DNA聚合酶0.1μl、去離子水5μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 3min；變性94℃ 1min；退火56℃ 1min；復(fù)性72℃ 1.5min；循環(huán)30次，最后一個循環(huán)復(fù)性再延長8min后，樣后存于4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測。
隨機(jī)挑取Sj50和Sj16陽性克隆分別加入含100μg/ml氨芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基5ml，37℃ 300rpm擴(kuò)增培養(yǎng)過夜。用Mini-MTM Plasmid DNA ExtractionSystem抽提并純化質(zhì)粒。對所抽質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Xho I酶切鑒定。
結(jié)果用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System從大腸桿菌中抽提并純化質(zhì)粒。對所抽質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Xho I酶切鑒定。結(jié)果顯示各有二條明顯的條帶(質(zhì)粒與目的基因)。
3.Sj16和Sj50重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)通過鈣轉(zhuǎn)法將以上抽提的pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21。內(nèi)含50μl BL21鈣轉(zhuǎn)感受肽細(xì)胞的1.5ml Eppendorf管中加入重組質(zhì)粒2μl，冰浴30min后，37℃熱休克5min，立即冰浴2min。每管加入預(yù)溫至37℃的LB培液，37℃ 300rpm培養(yǎng)1hr后，取100μl涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)過夜。
隨機(jī)挑取Sj16和Sj50陽性克隆接種于3ml含100μg/ml芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基，37℃搖至OD600＝0.6。取2ml加入IPTG至終濃度1mM，1ml不加誘導(dǎo)物作為對照，28℃ 250rpm，培養(yǎng)4hour。4℃ 4000g離心10min沉淀菌體。誘導(dǎo)管每管加入100μl PBS，對照管每管加入50μl PBS。每管取出15μl菌體加入3μl 6×SDS-PAGE樣品緩沖液2μl作SDS-PAGE電泳，濃縮膠4％，分離膠12％。電泳條件濃縮膠80V，分離膠100V。電泳結(jié)束膠于考氏亮藍(lán)R250染液中固定、染色，在乙醇-冰醋酸液中脫色。
結(jié)果pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前各出現(xiàn)一分子量約為80kDa和40kDa的條帶，即為Sj50基因產(chǎn)物與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體、Sj16基因產(chǎn)物與GST的融合體(圖1)。
應(yīng)用抗GST抗體，通過親和層析，純化GST-SjP50和GST-SjE16蛋白。用凝血酶(thrombin)酶切GST連接的蛋白。12％SDS-PAGE膠分析。結(jié)果如圖2所示1、GST-SjP50融合蛋白；2、酶切不完全GST-SjP50融合蛋白；3、酶切后的GST-SjP50融合蛋白；4、GST-SjE16融合蛋白；5、酶切不完全GST-SjE16融合蛋白；6、酶切后的GST-SjE16融合蛋白。
然后，分別用抗SjP50和SjE16抗體通過親和層析，純化SjP50和SjE16蛋白以取得純化蛋白抗原。
實(shí)施例3RT-PCR鑒定SjE16、SjP50在日本血吸蟲發(fā)育各階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
1.樣品準(zhǔn)備準(zhǔn)備日本血吸蟲的卵、尾蚴、雄蟲、雌蟲，以抽提其RNA。
2.總RNA抽提試劑盒抽提RNA試劑采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，該試劑基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)。用于抽提RNA所用器皿和水均要進(jìn)行無RNA酶處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無RNA酶環(huán)境。
3.RNA抽提步驟將碾杵和勻漿器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后液體轉(zhuǎn)入無RNA酶離管中，加入氯仿后，4℃離分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶離管中，加入氯仿后，4℃離分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶離管中，加異丙醇，4℃離沉淀RNA；用75％乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶去離子水溶解沉淀。抽提RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計測定260/20比值(比值均在1.7~2.0)；并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
4.cDNA合成取總RNA2μg，OligodT16 1μL，70℃保溫3min，立即冰上變性5min。加入5×buffer，DTT和50mg/LdNTP各2μL及1μL逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42℃2h。模板使用終濃度通常為1μg/100μL。
以β-actin作內(nèi)對照，PCR反應(yīng)混合物中各成分為β-actin、Sj50-F、Sj50-R、Sj16-F、Sj16-R、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后補(bǔ)充ddH2O使反應(yīng)體系為10μL。PCR反應(yīng)條件94℃變性5min；然后每個循環(huán)94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SjE16僅在日本血吸蟲的蟲卵中表達(dá)，而SjP50在雄蟲、雌蟲中表達(dá)(圖3)。
實(shí)施例4抗日本血吸蟲感染保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。
該實(shí)施例的動物實(shí)驗(yàn)方法步驟如下1.抗原免疫動物動物C57小鼠，6-8星期。
免疫次數(shù)和部位3次免疫(2周/次間隔)，背部皮下多點(diǎn)。
免疫劑量福氏佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只SjE16/福氏佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只SjP50/福氏佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只SjE16+SjP50/福氏佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只。
2.血吸蟲感染小鼠攻擊感染時間第三次免疫7天進(jìn)行日本血吸蟲尾蚴攻擊感染，另外一組動物體外細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)。
腹部皮膚感染40±2尾蚴/小鼠。
血吸蟲鑒定42天解剖小鼠，收集肝門靜脈和腸系膜靜脈處成蟲并計數(shù)。
血吸蟲蟲卵鑒定肝臟稱重后剪碎，5％KOH消化過夜，并計數(shù)。
體外細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)取小鼠脾臟，分離脾臟單個核細(xì)胞，備用。
3.細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)小鼠(n＝4)脾臟細(xì)胞。5×105細(xì)胞/ml/RPMI 1640/10％FCS血吸蟲抗原抗原SjE16 100ng/ml，抗原SjP50 100ng/ml，細(xì)菌抗原金黃色葡萄球菌enterotoxin B(SFB)100，30，10，3ng/ml，凝血素ConA 0.1ug/ml，細(xì)胞培養(yǎng)條件37CO，5％CO2，72小時。
細(xì)胞增殖反應(yīng)測定(3H)Thymidine DNA參入，培養(yǎng)6小時。Beta-液閃計數(shù)。
日本血吸蟲抗原SjE16、抗原SjP50免疫小鼠，激發(fā)宿主抗日本血吸蟲感染免疫反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見表1)1.SjE16抗原免疫小鼠，可以一定程度激發(fā)宿主抗血吸蟲免疫反應(yīng)，但是，僅僅小鼠體內(nèi)的成蟲數(shù)有所下降，而肝臟內(nèi)蟲卵數(shù)下降不多。
2.SjP50抗原免疫小鼠，可以激發(fā)一定程度的宿主抗血吸蟲免疫反應(yīng)，小鼠體內(nèi)的成蟲數(shù)有所下降，肝臟內(nèi)蟲卵數(shù)也有下降。
3.SjE16、SjP50抗原聯(lián)合免疫小鼠，兩個抗原有協(xié)同作用，小鼠體內(nèi)的成蟲數(shù)大幅下降，肝臟內(nèi)蟲卵數(shù)下降。
4.SjE16、SjP50單獨(dú)和聯(lián)合免疫小鼠，糞便蟲卵數(shù)有顯著下降。
表1.SjE16和SjP50抗原激發(fā)宿主抗日本血吸蟲免疫反應(yīng)

實(shí)施例5該實(shí)施例的動物實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例4所述的步驟，將抗原SjE16、抗原SjP50聯(lián)合免疫，可以誘導(dǎo)宿主對非血吸蟲抗原刺激無反應(yīng)(Anergy)，而兩個抗原分別免疫，不能誘導(dǎo)這一反應(yīng)。抗原SjE16和抗原SjP50聯(lián)合免疫，可誘導(dǎo)血吸蟲特異抗原細(xì)胞免疫反應(yīng)(見圖4)，同時，抗原SjE16和抗原SjP50聯(lián)合免疫，可以誘導(dǎo)宿主對金黃色葡萄球菌抗原(SEB)刺激無反應(yīng)(圖5)，且日本血吸蟲感染或抗原SjE16和抗原SjP50聯(lián)合免疫能引起宿主對凝集素(ConA)的刺激無反應(yīng)(圖6)。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>日本血吸蟲抗原基因的克隆、表達(dá)和疫苗<130>NP-10013<160>4<210>1<211>438<212>DNA<213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)<220>
<221>CDS<223>(1)..(435)<400>1atg tcg gat gaa aac cga tgg att gca gtt ttt aat tca cta gat aaa 48Met Ser Asp Glu Asn Arg Trp Ile Ala Val Phe Asn Ser Leu Asp Lys1 5 10 15gat gga aat aag tta tta aca cgt gat gaa att gag caa tgc ttg aaa 96Asp Gly Asn Lys Leu Leu Thr Arg Asp Glu Ile Glu Gln Cys Leu Lys20 25 30agt ctt ggc gtt tct gaa agt ttt gcc gaa aag ata atc aag gaa act 144Ser Leu Gly Val Ser Glu Ser Phe Ala Glu Lys Ile Ile Lys Glu Thr35 40 45gac ttg aat aaa gat gga aaa atc tct ttg gat gaa tac ctg aaa gca 192Asp Leu Asn Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Asp Glu Tyr Leu Lys Ala50 55 60cta aga aaa atc cct cca cgt gac aaa tgt tca agt gtt gaa cgt tgg 240Leu Arg Lys Ile Pro Pro Arg Asp Lys Cys Ser Ser Val Glu Arg Trp
65 70 75 80aaa gaa gta ttt caa tcc ata gat aaa gat aat tca ggc aaa gtt tct 288Lys Glu Val Phe Gln Ser Ile Asp Lys Asp Asn Ser Gly Lys Val Ser85 90 95gct aaa gaa ctg gac gaa ttt ttg aaa tca act ggt aat gat ata aac 336Ala Lys Glu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Ser Thr Gly Asn Asp Ile Asn100 105 110aaa agc tgt ttg gaa aat tgg atg gct aca aat gac aaa aac aag gat 384Lys Ser Cys Leu Glu Asn Trp Met Ala Thr Asn Asp Lys Asn Lys Asp115 120 125ggt gaa cta gat tat gcc gaa ttt tta gct tat gta cgt caa acg tat 432Gly Glu Leu Asp Tyr Ala Glu Phe Leu Ala Tyr Val Arg Gln Thr Tyr130 135 140gaa taa 438Glu145<210>2<211>145<212>PRT<213>日本血吸蟲 (Schistosoma japonicum)<400>2MSDENRWIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQC LKSLGVSESF AEKIIKETDL 50NKDGKISLDE YLKALRKIPP RDKCSSVERW KEVFQSIDKD NSGKVSAKEL 100DEFLKSTGND INKSCLENWM ATNDKNKDGE LDYAEFLAYV RQTYE 145<210>3<211>1413<212>DNA
<213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)<220>
<221>CDS<223>(12)..(1286)<400>3acgcagttga c atg tcg gag acg cca aag cag tct gaa gag gaa tat cta 50Met Ser Glu Thr Pro Lys Gln Ser Glu Glu Glu Tyr Leu1 5 10aaa gat ttc ata gac tta agc cca tct ggt gat cgt ggt att ctc aag 98Lys Asp Phe Ile Asp Leu Ser Pro Ser Gly Asp Arg Gly Ile Leu Lys15 20 25aaa gta gta cga gaa ggc tac tcg gac atc aaa cca tgc gat ggt gac 146Lys Val Val Arg Glu Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Cys Asp Gly Asp30 35 40 45acg gtc ata gta cat tat gtc ggt act aac ttc ggt ggt gaa aag cat 194Thr Val Ile Val His Tyr Val Gly Thr Asn Phe Gly Gly Glu Lys His50 55 60ggt gaa gta ttc gac tca agc aga gcc cga aat gaa aag ttt gaa ttt 242Gly Glu Val Phe Asp Ser Ser Arg Ala Arg Asn Glu Lys Phe Glu Phe65 70 75aca att ggg aaa ggt agt gta att aaa gct tgg gat atc ggt gtt gca 290Thr Ile Gly Lys Gly Ser Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala80 85 90act atg agg ttg gga gaa gtt tgt gaa ttg atc gcg tcg cct gaa tat 338Thr Met Arg Leu Gly Glu Val Cys Glu Leu Ile Ala Ser Pro Glu Tyr95 100 105gcg tac atg gat ggg aaa tct ctt aag ttt gag gtg gag ctt ttt gaa 386
Ala Tyr Met Asp Gly Lys Ser Leu Lys Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu110 115 120 125act atg ggc tct gat gtc agc aga aac aaa gat ggg agt att cgc aag 434Thr Met Gly Ser Asp Val Ser Arg Asn Lys Asp Gly Ser Ile Arg Lys130 135 140tca att att aaa aag gga aga gat atc cac aat cct gta gct ggg gct 482Ser Ile Ile Lys Lys Gly Arg Asp Ile His Asn Pro Val Ala Gly Ala145 150 155gaa gcc act att gtt ttc cgc aat ctt ttg aac ttg acg gag gaa aca 530Glu Ala Thr Ile Val Phe Arg Asn Leu Leu Asn Leu Thr Glu Glu Thr160 165 170gaa gtc aca tat tgt gtt ggc gac cct cca tca aac gta ccg gat gag 578Glu Val Thr Tyr Cys Val Gly Asp Pro Pro Ser Asn Val Pro Asp Glu175 180 185ttg gac caa tct gtt cgt cac atg aat aca ggt gaa gtc agc cgt att 626Leu Asp Gln Ser Val Arg His Met Asn Thr Gly Glu Val Ser Arg Ile190 195 200 205gtg gtt tac aaa gac ggt cat tca tta act tct gga gat tcg gat aaa 674Val Val Tyr Lys Asp Gly His Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Lys210 215 220gat aga ata gtt tac gaa cta aca ctg aag tct ttt gaa aag acc aaa 722Asp Arg Ile Val Tyr Glu Leu Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Thr Lys225 230 235cac ctc tct ggt att acg tct ttt cca gag cga ata gcc tat gca aat 770His Leu Ser Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu Arg Ile Ala Tyr Ala Asn240 245 250aca ctt aaa gag aag gcc aac aat ttc tta aag gat tct aaa ttt gat 818Thr Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asn Phe Leu Lys Asp Ser Lys Phe Asp255 260 265
tca gct atc gaa tta tat aaa cgt ttg gac gat gag ctg cag tac gta 866Ser Ala Ile Glu Leu Tyr Lys Arg Leu Asp Asp Glu Leu Gln Tyr Val270 275 280 285gtg gct aat ggg cct acc aga caa agg aat tgt ctg ggg ttc act gta 914Val Ala Asn Gly Pro Thr Arg Gln Arg Asn Cys Leu Gly Phe Thr Val290 295 300gct gtc caa ctc aat tta gct ctg gtc tat ctg aag ctt tgt aaa ccc 962Ala Val Gln Leu Asn Leu Ala Leu Val Tyr Leu Lys Leu Cys Lys Pro305 310 315aga caa tgt att gag ttt tgc aag aaa gtg ctc gat aat ttt agc gac 1010Arg Gln Cys Ile Glu Phe Cys Lys Lys Val Leu Asp Asn Phe Ser Asp320 325 330aac gaa aag gcg cta ttt aga att ggt cag gca cat tta cta cgt aag 1058Asn Glu Lys Ala Leu Phe Arg Ile Gly Gln Ala His Leu Leu Arg Lys335 340 345gac cat gaa gaa gca gtt gtt tac ttc aaa gga ttg tat cca aaa atc 1106Asp His Glu Glu Ala Val Val Tyr Phe Lys Gly Leu Tyr Pro Lys Ile350 355 360 365cta aca atg cat ctg ctg tat aac agg ttc aaa tct gtg agg aag aga 1154Leu Thr Met His Leu Leu Tyr Asn Arg Phe Lys Ser Val Arg Lys Arg370 375 380tta gaa gag cca aaa gat ata gaa cga aag aag ttt cgt cat att ttc 1202Leu Glu Glu Pro Lys Asp Ile Glu Arg Lys Lys Phe Arg His Ile Phe385 390 395gaa cgt tgt aaa gac acc ggg att aaa ctc gat gct caa aat cat gag 1250Glu Arg Cys Lys Asp Thr Gly Ile Lys Leu Asp Ala Gln Asn His Glu400 405 410gat ggg gtt gta gtg aat gat gaa aag tct gcc ctg tgagagctta1296Asp Gly Val Val Val Asn Asp Glu Lys Ser Ala Leu
415420 425attctgtgtg tggcatgaag ttagcacccc cgtgattttg taaatgtttc ttataattac 1356tggtttaatt tcaagttgct gaatacattt taaagcaacc aaaaaaaaaa aaaaaaa 1413<210>4<211>425<212>PRT<213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)<400>4MSETPKQSEE EYLKDFIDLS PSGDRGILKK VVREGYSDIK PCDGDTVIVH 50YVGTNFGGEK HGEVFDSSRA RNEKFEFTIG KGSVIKAWDI GVATMRLGEV 100CELIASPEYA YMDGKSLKFE VELFETMGSD VSRNKDGSIR KSIIKKGRDI 150HNPVAGAEAT IVFRNLLNLT EETEVTYCVG DPPSNVPDEL DQSVRHMNTG 200EVSRIVVYKD GHSLTSGDSD KDRIVYELTL KSFEKTKHLS GITSFPERIA 250YANTLKEKAN NFLKDSKFDS AIELYKRLDD ELQYVVANGP TRQRNCLGFT 300VAVQLNLALV YLKLCKPRQC IEFCKKVLDN FSDNEKALFR IGQAHLLRKD 350HEEAVVYFKG LYPKILTMHL LYNRFKSVRK RLEEPKDIER KKFRHIFERC 400KDTGIKLDAQ NHEDGVVVND EKSAL42權(quán)利要求
1.兩種分離出的DNA分子，它們是日本血吸蟲抗原基因，其特征在于，包括(1)具有SEQ ID NO1中1-435的核苷酸序列；(2)具有SEQ ID NO3中12-1286的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的(1)序列編碼具有SEQ IDNO.2所示序列的蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述(2)序列編碼具有SEQ IDNO.4所示序列的蛋白。
4.兩種分離出的日本血吸蟲抗原蛋白，其特征在于，包括(1)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有針對日本血吸蟲免疫原性的蛋白；(2)具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有針對日本血吸蟲免疫原性的蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白，其特征在于，(1)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸的序列；(2)具有SEQ ID NO.4所示氨基酸的序列。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子(1)或DNA分子(2)。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種日本血吸蟲抗原蛋白的基因工程制備方法，其特征在于，該方法包括(1)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(2)從培養(yǎng)物中分離出含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白。
9.一種日本血吸蟲病防治疫苗，其特征在于，所述疫苗以權(quán)利要求4所述的抗原蛋白為目的抗原，通過權(quán)利要求8所述的制備方法獲得。
10.權(quán)利要求9所述的疫苗在制備預(yù)防和治療日本血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的抗原基因SjE16和SjP50、其編碼蛋白、及重組表達(dá)并分離該蛋白的方法，本發(fā)明還公開了以抗原SjE16和抗原SjP50蛋白作為日本血吸蟲病防治的疫苗。本發(fā)明的日本血吸蟲抗原SjE16和抗原SjP50蛋白及其疫苗在血吸蟲病防治和治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P33/12GK1952140SQ20051003068
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者胡薇, 馮正, 王志勤, 韓澤廣, 王兆軍, 徐斌, 王升躍 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所, 上海人類基因組研究中心