專利名稱：Fk506納米微粒用于制備治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫抑制劑FK506納米微粒的用途，尤其是涉及FK506納米微粒用于制備治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物的用途。

背景技術(shù)：
各種炎癥、外傷和營(yíng)養(yǎng)不良等常導(dǎo)致不可恢復(fù)的角膜混濁。WHO調(diào)查顯示，我國(guó)的角膜眼表病盲目率占世界第一位，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)全球角膜盲的水平。絕大多數(shù)病人需要進(jìn)行角膜或角膜緣移植。角膜移植術(shù)后約30％發(fā)生移植排斥反應(yīng)，既往有角膜排斥反應(yīng)及角膜血管化的病例，角膜移植術(shù)后因排斥反應(yīng)失敗的病例高達(dá)50％-60％。多次手術(shù)角膜、全角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生率甚至達(dá)90％，角膜移植術(shù)后的排斥反應(yīng)是手術(shù)失敗的最主要原因。激素治療雖有一定的效果，但常常不能完全控制病情的發(fā)展，而且激素長(zhǎng)期大量使用，除全身嚴(yán)重的副反應(yīng)外，還可在眼部造成青光眼，白內(nèi)障，繼發(fā)感染和二重感染等。非甾體類藥物、烷化劑、細(xì)胞毒性等非特異性免疫抑制劑的治療效果均不理想?？沽馨图?xì)胞抗體治療對(duì)難治性急性排斥反應(yīng)有較高的逆轉(zhuǎn)率，但有嚴(yán)重的并發(fā)癥，如過(guò)敏、免疫過(guò)度抑制等。
FK506是一種新型強(qiáng)效免疫抑制劑，1989年成功用于肝移植排斥反應(yīng)的治療，使排斥反應(yīng)發(fā)生率大大降低，激素用量明顯減少，從而減少了激素治療時(shí)相關(guān)的危險(xiǎn)性。FK506免疫抑制作用較環(huán)孢素A強(qiáng)30-100倍，治療劑量比環(huán)孢霉素A低100倍。目前FK506用于防治各種器官移植術(shù)后的免疫相關(guān)性疾病并用于自身免疫性疾病的治療，成為難治性排斥或出現(xiàn)環(huán)孢素A毒副作用時(shí)首選治療藥物。國(guó)外于1992年開始FK506眼科領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。主要為口服治療CsA和激素治療失敗的葡萄膜炎、預(yù)防高危角膜/角膜緣移植術(shù)后排斥反應(yīng)、治療移植物抗宿主病所致的嚴(yán)重干眼等。一般治療初始劑量為0.15mg/kg/d，以后根據(jù)全血濃度和病人癥狀調(diào)整藥量。但FK506全身用藥具有與環(huán)孢素A類似的腎、神經(jīng)系統(tǒng)等毒性，免疫系統(tǒng)過(guò)度抑制還可誘發(fā)腫瘤。同時(shí)，血眼屏障的存在使FK506在眼部吸收大大減少，在眼科的臨床應(yīng)用受到很大限制。尤其是FK506全身用藥價(jià)格昂貴，膠囊1mg為500元人民幣，注射液5mg為1500元人民幣。每日治療費(fèi)用折合人民幣約為4500-6000元，對(duì)大多數(shù)中國(guó)人來(lái)說(shuō)無(wú)法承擔(dān)。
眼球作為相對(duì)暴露器官，局部用藥簡(jiǎn)易可行并可以避開血眼屏障對(duì)眼部藥物吸收限制，大大減少用藥量。因此，眼的局部用藥相對(duì)于其它器官具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但結(jié)膜囊容積有限；淚液的反射性分泌、稀釋和引流作用；鼻粘膜、結(jié)膜血管的藥物吸收；角膜、鞏膜的屏障作用以及藥物本身的理化性質(zhì)(分子量、溶解性、PH值及與淚液中蛋白的結(jié)合等)使滴眼劑的生物利用度極低，一般僅為1％-5％。眼膏存在糊視、油膩、賦形劑過(guò)敏問(wèn)題。結(jié)膜下和眼內(nèi)注射或者難以在病變部位達(dá)到有效治療濃度或瞬間藥濃過(guò)高，有效藥濃維持時(shí)間過(guò)短，對(duì)安全治療范圍窄的藥物可能導(dǎo)致中毒或達(dá)不到治療作用。
FK506為疏水性大分子物質(zhì)，不易透過(guò)角膜產(chǎn)生有效的藥物濃度。因此，研發(fā)增加、延長(zhǎng)藥物吸收、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間的藥物釋放系統(tǒng)，在保證藥物作用的前提下減少給藥劑量、減少全身吸收和毒副作用將更有助于角膜移植排斥反應(yīng)或其他免疫相關(guān)眼病的治療。
近年來(lái)，納米技術(shù)和材料科學(xué)迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了納米藥物控釋系統(tǒng)?？缮锝到獠牧暇酆衔镂⒘p小到納米量級(jí)后，高分子材料的特性發(fā)生了很大的變化，粒子上的官能團(tuán)密度和選擇性吸附能力變大，粒子的膠體穩(wěn)定性大大提高。其超微小體積可通過(guò)人體最小的毛細(xì)血管，能穿透組織間隙并被細(xì)胞吸收。研究表明，載藥的納米微粒對(duì)角膜及結(jié)膜有一定的粘附性，可減少淚液對(duì)藥物的消除，使其在眼部的滯留時(shí)間延長(zhǎng)。使房水和角膜組織的藥物濃度增加，有利于藥物對(duì)眼部病灶的治療。載藥納米微粒還具有增加角膜通透性、增加藥物經(jīng)角膜和非角膜途徑的眼內(nèi)吸收、緩釋增效、降低藥物毒性的特點(diǎn)；能使藥物保持最低有效治療濃度，避免常規(guī)給藥時(shí)藥物濃度過(guò)高和過(guò)低，明顯改善原有藥物的治療效果，提高生物利用度。具有極大的臨床開發(fā)和應(yīng)用前景，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Losa[Losa C，Calvo P，Castro E，et al.Improvement of ocular penetration ofamikacin sulphate by association to poly(butylcyanoacrylate)nanoparticles.JPharm Pharmacol，1991；43(8)548-552.]等制備的丁胺卡那霉素-聚氰基丙烯酸異丁酯(polyisobutylcyanoacrylate)納米微粒子在角膜和前房的藥濃比普通溶液高2.5-3倍。粒徑210～270mn的CsA-聚ε己內(nèi)酯(polyε-caprolactone，PECL)納米囊使CsA在角膜濃度比CsA-油劑增加5倍[Calvo P，Sanchez A，Martinez J，et al.Polyester nanocapsules as new topical ocular delivery systems forcyclosporine A.Pharm Res，1996；13(2)311-315.Calvo P，Vila-Jato JL，Alonso MJ，et al.Comparative in vitro evaluation of several colloidal systems，nanoparticles and nanocapsules and nanoemulsions as ocular drug carriers.JPharm Sci，1996；85(5)530-536]。消炎痛的聚ε己內(nèi)酯納米微粒子能增加藥物通過(guò)角膜的吸收。Campos[Campos AM，Sanchex A，Alonso MJ.Chitosannanoparticlesa new vehicle for the improvement for the delivery of drugs tothe ocular surface.Application to cyclosporine A.Int J Pharm，2001；224159-168]等以等離子成膠技術(shù)制備的CsA-脫乙酰殼聚糖納米微粒滴眼劑使藥物在角膜濃度提高。Dcscai[Desai SD，Blanchard J.Pluronic F127-basedocular delivery system containing biodegradable polysobutylcyanoacryltenanocapsules of pilocarpine.Drug Deliv，2000；7(4)201-207]等用界面聚合法制備了匹羅卡品-聚氰基丙烯酸丁酯納米囊，與含有5％甲基纖維素的匹羅卡品凝膠相比，延長(zhǎng)了匹羅卡品與角膜接觸時(shí)間，作用時(shí)間和強(qiáng)度均高于后者。Zimmer[Zimmer A，Mutschler E，Lambrecht G，et al.Pharmacokinetic andpharmacodynamic aspects of an ophthalmic pilocarpine nanoparticle-delivery-system.Pharm Res，1994；111435-1442]等用乳液聚合法制備了直徑100-300nm的匹羅卡品-聚氰基丙烯酸異丁酯納米微粒，兔眼房水中藥物濃度增加，消除半衰期延長(zhǎng)。在低濃度也能顯著延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間且無(wú)刺激性。美替洛爾(metipranolol)-聚己內(nèi)酯納米微粒子與普通滴眼劑相比，在滴用后4-8小時(shí)顯著降低兔眼壓，而心血管方面的副作用減少。美替洛爾-聚氰基丙烯酸異丁酯納米囊與普通滴眼劑藥效相當(dāng)，但可降低藥物的體內(nèi)吸收，心臟毒性減少5倍[LosaC，Alonso MJ，Vila JL，et al.Reduction of cardiovascular side effectsassociated with ocular administration of metipranolol by inclusion in polymericnanocapsules.J Ocular Pharmacol，1992；8191-198]。倍他洛爾(Betaxelol)、卡替洛爾(Carteolol)的聚氰基丙烯酸異丁酯、PLGA和聚ε-己酸內(nèi)酯納米混懸液均能顯著降低眼壓[Marchal-Heussler L，Maincent P，Hoffman M，et al.Antiglaucomatous activity of betaxolol chlorhydrate sorbed onto differentisobutylcyanoacrylate nanoparticle preparations.Int J Pharm，1990；58115-122]。
Pleyer[Pleyer U，Lutz S，Jusko WJ，et al.Ocular absorption of topicallyapplied FK506 from liposomal and oil formulations in the rabbit eye.InvestOphthalmol Vis Sci，1993；34(9)2737-2742]曾報(bào)道FK506-脂質(zhì)體滴眼后，在120分鐘內(nèi)，眼內(nèi)各組織藥濃均明顯升高，尤其前房和玻璃體內(nèi)藥物濃度分別為5-28ng/g和12-22ng/g，達(dá)到或超過(guò)有效治療濃度，高于FK506-油劑眼內(nèi)藥物濃度的10倍。另外，脂質(zhì)體控釋給藥系統(tǒng)本身較不穩(wěn)定，制備工藝復(fù)雜，存在包裹藥物滲漏且消毒滅菌時(shí)容易氧化產(chǎn)生毒性。微球粒徑過(guò)大時(shí)(≥10μm)，滴眼會(huì)產(chǎn)生不適感。采用PLGA和EVA作為載體的FK506玻璃體腔植入物顯然可以大幅提高眼內(nèi)濃度并具有緩釋作用，但畢竟是一種侵入性操作和裝置，眼內(nèi)毒性，炎癥損傷和各種并發(fā)癥必然會(huì)大大增加。
目前國(guó)內(nèi)外尚未見FK506納米微粒用于制備治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物的相關(guān)報(bào)道。制備FK506-PLGA納米藥物控釋系統(tǒng)將使眼用制劑的高吸收度、生物利用度和更好的舒適度成為可能。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供FK506納米微粒用于制備治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物的用途。
本發(fā)明的發(fā)明人將免疫抑制劑FK506載入可生物降解材料中，制備成納米微粒，再將FK506納米微粒以適當(dāng)?shù)姆绞街苽涑捎糜谥委熃悄ひ浦菜鸬拿庖呦嚓P(guān)性疾病的藥物。
本發(fā)明也提供了一種用于治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物組合物。
所述的藥物組合物包括有效治療劑量的作為活性成分的FK506納米微粒，以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑或添加劑。
所述的FK506納米微粒是FK506載入生物可降解性材料所得到的載藥納米微粒。
所述的生物可降解性材料選自聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、聚乳酸乙醇酸的聚乙二醇衍生物(PEG-PLGA)中的一種或一種以上的混合物。
FK506納米微粒凍干粉的載藥量與制備過(guò)程有關(guān)。不同F(xiàn)K506投藥量、PVA的含量、PLGA的含量及所形成的FK506納米微粒粒徑均可影響FK506納米微粒凍干粉的載藥量。
所述的藥物組合物配制成滴眼液。
所述的滴眼液的成分包括 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.01～0.2克 氯化物0～1.5克 增粘劑至黏度為40～50厘泊 加水至100毫升。
所述的藥物組合物制備成可植入眼內(nèi)緩釋的注射劑。
所述的注射劑的成分包括 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.01～0.2克 氯化物0～1.5克 抑菌劑適量 增粘劑至黏度為40～50厘泊 加水至100毫升。
所述的抑菌劑選自 (1)三氯叔丁醇，濃度為0.3～0.6％； (2)尼泊金類，濃度為0.03～0.06％； (3)苯甲醇，濃度為2～4％。
本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了FK506納米微粒滴眼液體內(nèi)緩釋效果及眼內(nèi)藥物濃度分布情況及房水藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，研究表明FK506納米微粒中FK506的釋放較普通FK506滴眼液有更高的生物利用度。即與不含納米微粒的FK506滴眼劑比較，F(xiàn)K506納米微粒滴眼液在藥物劑量減少1倍和2倍的情況下，房水中有效藥物濃度維持時(shí)間仍增加約3倍以上。
本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了FK506納米微粒注射劑體內(nèi)緩釋效果，研究表明FK506納米微粒中FK506的釋放有明顯的緩釋特征，較普通FK506滴眼液有更高的生物利用度。FK506納米微粒注射劑與FK506滴眼劑相比(相同劑量10ug)，注射劑的藥物平均滯留時(shí)間延長(zhǎng)了7倍，藥時(shí)濃度曲線下面積增加了約4倍。
上述實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述的用FK506納米微粒制備的藥物可以用來(lái)治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病，對(duì)這類疾病將有比同類藥物更好的治療效果。



圖1為FK506納米微粒透射電鏡的示意圖(標(biāo)尺100nm)； 圖2為FK506納米微粒掃描電鏡的示意圖(標(biāo)尺1um)； 圖3為用藥4小時(shí)，角膜上皮表面成團(tuán)聚集顆粒的示意圖(SEM，x20K)； 圖4為用藥16小時(shí)，角膜上皮表面吸附異質(zhì)顆粒的示意圖(SEM，x20K)； 圖5為透射電鏡圖，角膜上皮各層未見異質(zhì)顆粒(TEM，x2K)。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一用生物可降解性高分子材料PLGA制備FK506納米微粒。
1材料和儀器 FK506(日本，F(xiàn)ujisawa)；PLGA(乳酸/乙醇酸＝75/25，平均分子量10000)；PVA(美國(guó)，Acros)；MgCl2.6H2O(AR)；微孔濾膜及過(guò)濾器(德國(guó)，Millipore)；T18-basic高速剪切攪拌機(jī)(德國(guó)，IKA)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)，Beckman)；超低溫冰箱(美國(guó)，Harris)；Alpha1-4冷凍干燥機(jī)(德國(guó)，Barun Medical)；JEM-2010透射電子顯微鏡(日本，JEOL)；JSM-6330F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本，JEOL)。
Waters 4487型高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters)；泵系統(tǒng)Waters 600Controller；檢測(cè)器Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；色譜工作站W(wǎng)aters Millennium32。FK506標(biāo)準(zhǔn)品(日本，F(xiàn)ujisawa，批號(hào)055020L)；乙腈色譜純(美國(guó)，TEDIA)。
2實(shí)驗(yàn)方法 2.1 FK506-PLGA納米微粒制備 采用鹽析法制備納米微粒稱取MgCl2·6H2O，加入經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾的雙蒸水，超聲震蕩、溶解，加入適量PVA，手動(dòng)振蕩，使其充分浸潤(rùn)，配制成含10％PVA、60％MgCl2·6H2O(W/W)的溶液作為無(wú)機(jī)相(水相)。丙酮液中加入PLGA粉末，配制5％PLGA溶液，加入FK506，形成有機(jī)相。有機(jī)相與無(wú)機(jī)相以1∶4混合，玻璃棒攪拌使兩相間充分浸潤(rùn)。6000rpm剪切攪拌機(jī)攪拌8min。加入蒸餾水，手動(dòng)震蕩5～10min，直到膠體溶液混合均勻。18000rpm冷凍離心15min，棄上清液，沉淀物以雙蒸水80ml分散，同樣條件下重復(fù)冷凍離心2次。將最后所得沉淀以雙蒸水4ml分散，加入適量甘露醇作為保護(hù)劑，冷凍干燥。凍干的FK506-PLGA呈白色絮狀干粉。
2.2納米微粒的形態(tài)和粒徑 冷凍干燥樣品以蒸餾水稀釋，超聲分散，磷鎢酸負(fù)染8分鐘。透射和掃描電鏡記錄其形態(tài)。隨機(jī)選取掃描電鏡下的納米微粒子500個(gè)，計(jì)算平均粒徑。
2.3 FK506納米微粒載藥量 采用高效液相色譜法。配制FK506標(biāo)準(zhǔn)品溶液。色譜柱Hanmilton C18反相液相色譜柱，粒徑5μm，，規(guī)格150mm×4.1mm；柱溫50℃；流動(dòng)相乙腈∶水(55∶45，V/V)；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。進(jìn)樣20μl，外標(biāo)法檢測(cè)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A＝975729C+2000000(r＝0.9999)，F(xiàn)K506在6.55～131μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。稱取FK506納米微粒凍干粉，乙腈溶解后超聲破乳、定容、進(jìn)樣，記錄色譜峰，測(cè)定峰高，代入回歸方程。
3結(jié)果 3.1 FK506納米微粒的形態(tài)和大小 FK506納米微粒膠體及PLGA納米膠體溶液透明，電鏡下可見兩種納米微粒形態(tài)類似，均為圓囊狀球狀體，外形圓整，呈規(guī)則球狀。FK506-PLGA納米微粒的透射電鏡和掃描電鏡見圖1、圖2。FK506-PLGA納米微粒的平均粒徑為166.56±53.96nm。
3.2 FK506納米微粒載藥量 FK506納米微粒凍干粉載藥量為0.8526％。
實(shí)施例二其他生物可降解性高分子材料制備FK506納米微粒 聚乳酸、聚乳酸乙醇酸的聚乙二醇衍生物均為乳酸或乙醇酸的共聚物，與聚乳酸乙醇酸具有類似的理化性質(zhì)，均可使用上述實(shí)驗(yàn)方法獲得FK506納米微粒。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。 表1不同生物可降解性高分子材料制備FK506納米微粒結(jié)果 高分子材料 PLAPEG-PLGA PLGA∶PLA(50∶50) PEG-PLGA∶PLGA(50∶50)平均粒徑(nm) 186±58160±45195±55157±41載藥量(％) 0.880.810.930.82 考慮到制備FK506納米微粒所用的可生物降解性高分子材料均為乳酸或乙醇酸的共聚物，為聚酯類高分子化合物，理化性質(zhì)類似。而FK506納米微粒中藥物的釋放主要依賴于聚酯的水解，故本發(fā)明中選取的不同高分子材料所獲得的FK506納米微粒中藥物的釋放具有類似釋放特征。故下列實(shí)施例中僅選取FK506的PLGA納米微粒配制滴眼劑及注射劑為代表進(jìn)行研究。
實(shí)施例三FK506納米微粒滴眼液 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.01克 氯化鈉0.5克(可不加) 羥丙基甲基纖維素 加入至黏度為40厘泊 加水至100毫升。
其配制方法為精密稱量FK506納米微粒凍干粉適量(含F(xiàn)K506 0.01克)，70ml注射用水分散，加入羥丙基甲基纖維素的水溶液(注射用水)至黏度為40厘泊，加入氯化鈉0.5克(可不加)，混合均勻，補(bǔ)充注射用水至100毫升。0.65微米微孔濾膜過(guò)濾，將濾液分裝，Co60輻射滅菌。
實(shí)施例四FK506納米微粒滴眼液 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.2克 氯化鉀 1.5克(可不加) 透明質(zhì)酸鈉 加入至黏度為50厘泊 加水至100毫升。
其配制方法同實(shí)施例三。
實(shí)施例五FK506納米微粒滴眼液 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.1克 氯化鈉 1.0克(可不加) 羧甲基纖維素鈉 加入至黏度為45厘泊 加水至100毫升。
其配制方法同實(shí)施例三。
實(shí)施例三至五中，氯化鈉也可用氯化鉀等其他氯化物替代。
所述的增稠劑還可采用甲基纖維素、聚乙烯吡咯酮等，加入至黏度為40～50厘泊。
實(shí)施例六通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究FK506納米微粒滴眼液的眼內(nèi)緩釋效果及藥物濃度分布情況 1材料和儀器 FK506納米微粒滴眼液；微量移液器(芬蘭，Labsystems)；PRO-TracTMII Tacrolimus ELISA Kit(美國(guó)，DiaSorin)；BIOCELL-2酶標(biāo)儀(鄭州博賽生物有限公司)；GS6R臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)，Beckman)；Stat Fax-2200恒溫振蕩儀(Awareness technology Inc)；JEM-2010透射電子顯微鏡(日本，JEOL)；Hitachi-600掃描電子顯微鏡(日本，HITACHI)。
2實(shí)驗(yàn)方法 2.1動(dòng)物 3～3.5kg新西蘭大白兔(中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通級(jí)，粵檢證字2003A034)16只，雌雄不限。注射用水稀釋凍干FK506納米微粒，每眼結(jié)膜囊滴入30ul FK506(10ug)。0.5、1、2、4、8、16、24、36h后耳緣靜脈采血1ml。生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，角膜緣處穿刺抽取房水。剪除球結(jié)膜、角膜和前部鞏膜。生理鹽水沖洗、濾紙拭干后稱重，加入甲醇2ml，充分剪碎眼組織后，勻漿40s，10000rpm離心10min，取上清液，56℃氮?dú)獯蹈?、封口。全部樣品?20℃保存?zhèn)錂z。
2.2檢測(cè)方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法。樣本取樣方法固體樣本加入0.5ml甲醇及3.5ml磷酸緩沖液，稀釋振蕩后取樣50ul；液體樣本直接取樣50ul。樣本經(jīng)消化、溫育、振蕩、離心后，將含有游離FK506的上清液加到酶標(biāo)板微孔中。加入鼠抗FK506抗體，室溫孵育后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的FK506。洗滌液洗去沒有結(jié)合的FK506、酶標(biāo)FK506、抗FK506抗體，加入四甲基聯(lián)苯胺作為底物，最后加硫酸終止液終止反應(yīng)。450/620nm雙波長(zhǎng)比色測(cè)定吸光度，使用4PL軟件作四參數(shù)擬合，作吸光度對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算樣品FK506含量，最低檢出濃度為0.3ng/ml。樣品每次檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行2個(gè)質(zhì)控標(biāo)本檢測(cè)。
2.3電子顯微鏡樣本制備 用藥4h、16h和24小時(shí)取材時(shí)剪除的部分球結(jié)膜、角膜4℃下固定于2.5％戊二醛。1h后取出切成1mm×3mm的組織條并繼續(xù)固定。1周內(nèi)處理樣本，包括PBS漂洗，鋨酸后固定、酒精和丙酮梯度脫水。透射電鏡標(biāo)本經(jīng)環(huán)氧樹脂浸透、包埋修塊后超薄切片、染色。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)醋酸異戊酯置換、臨界點(diǎn)干燥后金屬噴鍍。
3結(jié)果 3.1體內(nèi)釋放試驗(yàn) 4PL軟件作四參數(shù)擬合，作吸光度對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。各時(shí)間點(diǎn)全血FK506濃度均低于0.3ng/ml。角膜和結(jié)膜中含大量FK506，鞏膜中含量次之。點(diǎn)眼16小時(shí)內(nèi)房水中FK506濃度為15.50～2.59ng/ml。結(jié)果詳見表2。
與不含納米微粒的FK506滴眼劑比較，F(xiàn)K506納米微粒在藥物劑量減少1倍和2倍的情況下，房水中有效藥物濃度維持時(shí)間仍增加約3+倍；兩種劑型FK506滴眼劑的房水藥物濃度和維持時(shí)間見表3。表2兔眼組織中FK506的平均濃度 時(shí)間(h) 房水(ng/ml) 角膜(ng/g)結(jié)膜(ng/g) 前部鞏膜(ng/g) 0.5 11.42±1.50 3157.05±906.16 2715.68±889.29 753.80±103.98 1 15.50±3.39 2673.17±783.17 2795.43±403.58 1668.33±1041.58 2 13.55±1.10 2121.00±220.63 2139.17±401.17 882.77±108.52 4 10.68±1.96 1867.7±357.31 1950.50±551.22 590.09±229.71 8 9.71±2.34 1667.85±611.87 749.35±244.94 349.00±39.53 16 2.59±0.83 1274.75±254.65 264.83±100.48 280.13±69.03 24 1.27±0.34 779.78±372.40 177.53±62.66 139.13±52.04 36 0.50±0.18 282.50±126.72 60.57±31.72 70.47±34.18 表3.兩種劑型FK506滴眼劑的房水藥物濃度(ng/ml)和維持時(shí)間(h)FK506 FK506納米微粒 投藥量20ug40ug10ug 1h18.93±6.9515.50±3.39 2h28.33±1.3613.55±1.10 2.5h8.35±0.9622.30±5.09 4h＜0.183.95±0.5510.68±1.96 8h9.71±2.34 16h2.59±0.83 3.2電子顯微鏡檢查 掃描電鏡用藥4小時(shí)后角膜上皮表面有較多的小圓顆粒，個(gè)別可以成團(tuán)聚集，如圖3所示。16小時(shí)和24小時(shí)后角膜上皮表面仍可見圓形顆粒附著，如圖4所示。16小時(shí)后結(jié)膜上皮表面也可發(fā)現(xiàn)散在圓形顆粒的附著。
透射電鏡角膜上皮細(xì)胞間細(xì)胞連接、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器均基本正常。未見異質(zhì)顆粒，如圖5所示。
4.討論 目前，F(xiàn)K506的眼部治療濃度尚未建立，一般以2～10ng/ml作為控制免疫相關(guān)眼病最小有效濃度。Pleyer曾報(bào)道FK506脂質(zhì)體作為滴眼劑觀察眼內(nèi)藥物濃度，觀察時(shí)間僅為2h。在30min、60min、120min時(shí)所有眼組織濃度均高于FK506橄欖油組，角膜和房水中藥物濃度較對(duì)照組濃度增高約為10倍，房水中藥物濃度為18～6ng/ml。采用納米技術(shù)制備的FK506納米微粒，用量?jī)H為FK506脂質(zhì)體微粒的1/10。36h的眼部觀察顯示，16h內(nèi)房水中的藥物濃度為15.5～2.59ng/ml，在有效治療范圍內(nèi)。角膜、結(jié)膜和鞏膜組織均可測(cè)到有效治療濃度的KF506，在角膜組織含量最高，結(jié)膜中藥物濃度次之。與以往所作的不含納米微粒的FK506滴眼劑比較，F(xiàn)K506納米微粒在藥物劑量減少1～2倍的情況下，房水中有效藥物濃度維持時(shí)間仍增加約3倍，具有更高的用藥效率。
藥物在眼內(nèi)濃度增加可能原因是藥物有在下穹隆凝聚和聚集傾向，藥物釋放位置臨近結(jié)膜和鞏膜，通過(guò)鞏膜途徑釋放藥物。角膜前滯留時(shí)間延長(zhǎng)也可能是納米微粒子與粘蛋白層結(jié)合所致。電鏡下可見結(jié)膜和角膜上皮有豐富的微絨毛，這一解剖結(jié)構(gòu)為納米顆粒的附著提供了良好的條件。電鏡下角結(jié)膜上皮表面所見的圓形高密度異質(zhì)顆粒，為眼內(nèi)藥物濃度長(zhǎng)時(shí)間的有效維持提供了佐證。角膜全層未見細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間異質(zhì)顆粒，提示藥物不是通過(guò)整個(gè)納米顆粒吞噬和穿透進(jìn)入眼內(nèi)，而是通過(guò)延長(zhǎng)藥物在眼表的吸附時(shí)間，逐漸釋放藥物并進(jìn)入眼內(nèi)。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與不含納米微粒的FK506滴眼劑比較，F(xiàn)K506納米微粒滴眼劑在藥物劑量減少1～2倍的情況下，房水中有效藥物濃度維持時(shí)間仍增加約3倍，具有更高的用藥效率。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們確定FK506納米微粒滴眼劑中藥物的含量范圍為每100ml滴眼液含F(xiàn)K506為0.01～0.2克。
實(shí)施例七FK506納米微粒緩釋注射劑 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.01克 氯化鈉0.5克(可不加) 三氯叔丁醇0.3 羥丙基甲基纖維素 加入至黏度為40厘泊 加水至100毫升。
其制備方法為精密稱量FK506納米微粒凍干粉適量(含F(xiàn)K506 0.01克)，70ml注射用水分散，加入羥丙基甲基纖維素的水(注射用水)溶液至黏度為40厘泊，加入氯化鈉0.5克(可不加)，三氯叔丁醇0.3克混合均勻，補(bǔ)充注射用水至100毫升。0.65微米微孔濾膜過(guò)濾，將濾液分裝，Co60輻射滅菌。
實(shí)施例八FK506納米微粒緩釋注射劑 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.2克 氯化鈉1.5克(可不加) 三氯叔丁醇0.6克 透明質(zhì)酸鈉加入至黏度為50厘泊 加水至100毫升。
其制備方法同實(shí)施例七。
實(shí)施例九FK506納米微粒緩釋注射劑 FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.1克 氯化鈉1.0克(可不加) 三氯叔丁醇0.5克 羧甲基纖維素鈉 加入至黏度為45厘泊 加水至100毫升。
其制備方法同實(shí)施例七。
實(shí)施例七至九中，氯化鈉也可用氯化鉀等其他氯化物替代。
所述的抑菌劑除了采用三氯叔丁醇外，還可用以下劑量的抑菌劑 尼泊金類，濃度為0.03～0.06％； 苯甲醇，濃度為2～4％。
所述的增稠劑還可采用甲基纖維素、聚乙烯吡咯酮等，加入至黏度為40～50厘泊。
實(shí)施例十通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究FK506納米微粒注射劑的眼內(nèi)緩釋效果 1材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試藥 FK506(日本，F(xiàn)ujisawa)；FK506-PLGA納米微粒注射劑；PRO-TracTM IITacrolimus ELISA Kit(美國(guó)，DiaSorin)；電熱三用水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；GS6R臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)，Beckman)Stat Fax-2200恒溫振蕩儀(Awarenesstechnology Inc)；BIOCELL-2酶標(biāo)儀(鄭州博賽生物有限公司)；微量移液器(芬蘭，Labsystems)。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～3.5kg新西蘭大白兔(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)共34只，分為滴眼組和結(jié)膜下注射組，滴眼組18只；注射組16只。將FK506-PLGA凍干納米微粒用注射用水稀釋。滴眼組每眼結(jié)膜囊滴入30ul的FK506(10ug)膠體溶液；注射組每眼結(jié)膜下注射0.1ml濃度為100ug/ml的FK506膠體溶液。滴眼組于給藥后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h抽取房水；注射組于2h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h抽取房水。取材前以生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，標(biāo)本于-20℃保存?zhèn)錂z。
1.3檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附法。最低檢出濃度為0.3ng/ml。藥物濃度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)的處理達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和達(dá)峰濃度(Cmax)采用實(shí)測(cè)值；曲線下面積(AUC0→t)采用梯形法計(jì)算；吸收速率常數(shù)(Ka)以3p87藥代動(dòng)力學(xué)程序擬合；統(tǒng)計(jì)矩方法求得平均滯留時(shí)間(MRT)。
SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件作兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)，差異具有顯著性。
2結(jié)果 2.2房水中FK506濃度及其藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 滴眼和結(jié)膜下注射后房水中FK506時(shí)藥曲線見圖6和圖7。
滴眼組16小時(shí)內(nèi)房水中FK506為15.50±3.39ng/ml～2.59±0.83ng/ml。達(dá)峰濃度Cmax為15.52ng/ml、達(dá)峰時(shí)間Tmax為1h。
注射組在2h的房水平均濃度為1.15±0.25ng/ml，6～96h房水濃度為9.62±2.19ng/ml～2.60±0.21ng/ml。Cmax為10.16±1.37ng/ml、Tmax為64.00±13.86h。
3p87軟件擬合，局部用藥的FK506符合一室模型一級(jí)吸收，其它動(dòng)力學(xué)參見表4。 表4.兩種用藥方式的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 點(diǎn)眼組注射組 P Ka3.79±0.73 0.04±0.004＜0.001 Kt0.09±0.03 0.05±0.010.056 T1/2(h)9.63±3.39 13.69±1.340.093 MRT(h)8.20±1.28 58.53±5.420.003 AUC0→t(ng/ml·h)152.44±16.74 612.48±54.59＜0.001 AUC0→∞(ng/ml·h)160.15±14.45 629.1±49.58＜0.001 Tmax(h)1.25±0.50 64.00±13.860.016 Cmax(ng/ml)15.52±2.38 10.16±1.370.028 3討論 由于FK506脂溶性和大分子量，局部用藥效果不夠理想。Kobayashi給體重3kg的大白兔結(jié)膜下注射劑量為0.1mg/kg的FK506。2h房水濃度為0.8ng/ml，8h達(dá)峰值，為1.07ng/ml；24h僅為0.39ng/ml。Pleyer報(bào)道含96ug FK506的橄欖油滴眼劑在房水中濃度1.5ng/ml，滴眼2h后房水中FK506低于0.5ng/ml。我們采用可生物降解的高分子材料PLGA包裹FK506形成170nm粒徑的載藥納米微粒，載藥10ug的納米微粒滴眼時(shí)在16h內(nèi)房水中藥濃為15.50～2.59ng/ml；結(jié)膜下注射后6～96h房水濃度為2.6～9.62ng/ml。證實(shí)FK506納米微粒可以延長(zhǎng)眼內(nèi)藥物存留時(shí)間并大大提高藥物的生物利用度。注射組的吸收速率常數(shù)Ka明顯低于滴眼組，說(shuō)明藥物的吸收明顯減緩。兩者的藥物平均滯留時(shí)間、藥時(shí)濃度曲線下面積兩者有顯著性差異。與滴眼劑相比，結(jié)膜下注射FK506納米微粒注射劑在眼內(nèi)房水的藥物濃度更為平緩，滯留時(shí)間更為延長(zhǎng)。采用較低的有效濃度治療不僅可以減少浪費(fèi)，而且可以減少藥物的毒副作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們確定FK506納米微粒中藥物的含量范圍為每100ml注射液含F(xiàn)K506為0.01～0.2克。
實(shí)施例十一考察FK506納米微粒在同一劑量、不同局部用藥方式下，F(xiàn)K506納米微粒的房水藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn) 1材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試藥 FK506(日本，F(xiàn)ujisawa)；FK506-PLGA納米微粒(鹽析法制備)；PRO-TracTM II Tacrolimus ELISA Kit(美國(guó)，DiaSorin)；電熱三用水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；GS6R臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)，Beckman)；Stat Fax-2200恒溫振蕩儀(Awareness technology Inc)；BIOCELL-2酶標(biāo)儀(鄭州博賽生物有限公司)；微量移液器(芬蘭，Labsystems)。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～3.5kg新西蘭大白兔(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)共34只，分為滴眼組和結(jié)膜下注射組，滴眼組18只；注射組16只。將FK506-PLGA凍干納米微粒用注射用水稀釋。滴眼組每眼結(jié)膜囊滴入30ul的FK506(10ug)膠體溶液；注射組每眼結(jié)膜下注射0.1ml濃度為100ug/ml的FK506膠體溶液。滴眼組于給藥后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h抽取房水；注射組于2h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h抽取房水。取材前以生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，標(biāo)本于-20℃保存?zhèn)錂z。
1.3檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附法。最低檢出濃度為0.3ng/ml。藥物濃度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)的處理達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和達(dá)峰濃度(Cmax)采用實(shí)測(cè)值；曲線下面積(AUC0→t)采用梯形法計(jì)算；吸收速率常數(shù)(Ka)以3p87藥代動(dòng)力學(xué)程序擬合；統(tǒng)計(jì)矩方法求得平均滯留時(shí)間(MRT)。
SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件作兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)，差異具有顯著性。
2結(jié)果 2.2房水中FK506濃度及其藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 滴眼和結(jié)膜下注射后房水中FK506時(shí)藥曲線見圖6和圖7。
滴眼組16小時(shí)內(nèi)房水中FK506為15.50±3.39ng/ml～2.59±0.83ng/ml。達(dá)峰濃度Cmax為15.52ng/ml、達(dá)峰時(shí)間Tmax為1h。
注射組在2h的房水平均濃度為1.15±0.25ng/ml，6～96h房水濃度為9.62±2.19ng/ml～2.60±0.21ng/ml。Cmax為10.16±1.37ng/ml、Tmax為64.00±13.86h。
3p87軟件擬合，局部用藥的FK506符合一室模型一級(jí)吸收，其它動(dòng)力學(xué)參見表3。
表3兩種用藥方式的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 點(diǎn)眼組注射組P Ka3.79±0.73 0.04±0.004 ＜0.001 Kt0.09±0.03 0.05±0.01 0.056 T1/2(h)9.63±3.39 13.69±1.34 0.093 MRT(h)8.20±1.28 58.53±5.42 0.003 AUC0→t(ng/ml·h)152.44±16.74 612.48±54.59 ＜0.001 AUC0→∞(ng/ml·h)160.15±14.45 629.1±49.58 ＜0.001 Tmax(h)1.25±0.50 64.00±13.86 0.016 Cmax(ng/ml)15.52±2.38 10.16±1.37 0.028 3討論 由于FK506脂溶性和大分子量，局部用藥效果不夠理想。Kobayashi給體重3kg的大白兔結(jié)膜下注射劑量為0.1mg/kg的FK506。2h房水濃度為0.8ng/ml，8h達(dá)峰值，為1.07ng/ml；24h僅為0.39ng/ml。Pleyer報(bào)道含96ug FK506的橄欖油滴眼劑在房水中濃度1.5ng/ml，滴眼2h后房水中FK506低于0.5ng/ml。我們采用可生物降解的高分子材料PLGA包裹FK506形成170nm粒徑的載藥納米微粒，載藥10ug的納米微粒滴眼時(shí)在16h內(nèi)房水中藥濃為15.50～2.59ng/ml；結(jié)膜下注射后6～96h房水濃度為2.6～9.62ng/ml。證實(shí)FK506載藥納米微?？梢匝娱L(zhǎng)眼內(nèi)藥物存留時(shí)間并大大提高藥物的生物利用度。注射組的吸收速率常數(shù)Ka明顯低于滴眼組，說(shuō)明藥物的吸收明顯減緩。兩者的藥物平均滯留時(shí)間、藥時(shí)濃度曲線下面積兩者有顯著性差異。與滴眼劑相比，結(jié)膜下注射在眼內(nèi)房水的藥物濃度更為平緩，滯留時(shí)間更為延長(zhǎng)。采用較低的有效濃度治療不僅可以減少浪費(fèi)，而且可以減少藥物的毒副作用。
實(shí)施例十二建立大鼠角膜排斥反應(yīng)模型，比較觀察FK506納米微粒對(duì)角膜排斥反應(yīng)的作用 1材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重180-220g清潔級(jí)雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠84只、Wistar大鼠35只，分別購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)和中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(廣東省科委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所合格證，第2003A010、2002A058)。Wistar大鼠作為供體，SD大鼠作為受體。將SD大鼠分為6組，每組14只。受體右眼接受角膜移植手術(shù)，供體雙眼取材后處死。
1.2材料、器械和試劑 術(shù)后用藥0.05％FK506滴眼液和0.05％地塞米松滴眼液(中山眼科中心藥劑科配制)；0.01％FK506-PLGA及PLGA滴眼液(凍干粉加注射用水)。
1.3動(dòng)物模型制備 氯胺酮及氯丙嗪各0.1ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，術(shù)眼滴5％新福林散瞳。常規(guī)消毒后手術(shù)顯微鏡(德國(guó)，Zeiss)下行穿透性角膜移植。在供體角膜偏心位置鉆取直徑為3.25mm植片，受體用直徑3.0mm環(huán)鉆制作植床，自體移植的大鼠作3.25mm的植床和植片。10/0尼龍線(美國(guó)，Alcon)間斷縫合8針，線結(jié)不埋藏，自然形成前房。
1.4分組及治療方案 術(shù)畢各組立即按各自方案觀察、治療共28天。其中I～V組為Wistar-SD大鼠異體移植，I組術(shù)后不用藥；II組PLGA滴眼液每日2次III組0.05％地塞米松滴眼液每日2次；IV組0.05％FK506滴眼液每日2次；V組0.01％FK506納米微粒滴眼每日2次。VI組SD大鼠自體移植，術(shù)后不用藥。
1.5角膜排斥反應(yīng)的觀察和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后第2天開始每日或隔日乙醚麻醉，裂隙燈觀察術(shù)眼并記錄直到取材時(shí)。角膜植片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)略，當(dāng)角膜排斥指數(shù)≥6時(shí)，診斷角膜排斥反應(yīng)，植片存活時(shí)間為此前一天。
1.6數(shù)據(jù)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，One-WayANOVA行方差分析。
2結(jié)果 2.1局部用藥觀察 II組及V組用藥時(shí)，部分有結(jié)膜輕微充血，未見局部皮膚脫毛、感染、潰瘍。角膜水腫較輕微。
2.2角膜植片的臨床觀察 各組手術(shù)成功的角膜移植，3天開始植床出現(xiàn)新生血管，植片和植床交接處輕度水腫，角膜植片透明。7天時(shí)全部大鼠的植片和植床交界處均可見新生血管。I組最早于術(shù)后7天、最晚術(shù)后11天出現(xiàn)角膜植片混濁、水腫，出現(xiàn)排斥反應(yīng)。術(shù)后9天新生血管即可進(jìn)入植片中央，排斥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間不等，一般維持1～2周后植片水腫混濁開始減輕、新生血管部分消退。III、IV、V組植片存活時(shí)間均較I組明顯延長(zhǎng)。各組角膜植片存活時(shí)間見表4。
表4大鼠角膜植片存活時(shí)間(天) 組別 例數(shù) 存活時(shí)間平均時(shí)間(x±s) P1* P2*I10 6，7，7，7，8，8，8，9，9，10 7.90±1.20＜0.001 0.004II9 7，8，8，8，8，9，9，9，10 8.44±0.88＜0.001 0.015III9 9，9，9，10，10，11，11，12，13 10.44±1.42＜0.001 0.36IV10 8，9，10，10，11，12，12，13，15，16 11.60±2.550.005V11 10，11，11，14，15，15，15，15，15，17，28 15.09±4.81VI9 ＞28 ＞28 *P1為V組植片存活時(shí)間與其它各組比較值；P2為IV組植片存活時(shí)間與其它組比較值。
3討論 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)K506局部滴眼和全身用藥均可以延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間。Okada比較了FK506肌肉注射和局部用藥治療效果，認(rèn)為局部用藥對(duì)預(yù)防角膜移植排斥反應(yīng)更為有效。提高FK506局部生物利用度的新劑型更有利于排斥反應(yīng)等免疫相關(guān)性眼病的治療。
FK506作用于免疫反應(yīng)早期及T細(xì)胞激活和增殖過(guò)程，通過(guò)抑制Th細(xì)胞釋放IL-2、IL-3、IL-4、IFN-γ等活性因子及IL-2R表達(dá)，抑制Tc細(xì)胞產(chǎn)生。FK506對(duì)B細(xì)胞增殖分化和抗體產(chǎn)生也有抑制作用，從而抑制機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫過(guò)程。IV、V組存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于I組，證實(shí)了FK506抑制免疫排斥反應(yīng)的作用。
FK506分子量較大且為脂溶性，在眼表的局部穿透能力較差，生物利用度受到影響。納米材料和技術(shù)手段的出現(xiàn)使藥物能以較低的濃度實(shí)現(xiàn)較高和長(zhǎng)時(shí)間的眼內(nèi)吸收提供了可能。FK506-PLGA納米微粒的滴眼液濃度僅為FK506滴眼劑和地塞米松滴眼劑濃度的1/5，每天僅用2次，即能明顯延長(zhǎng)植片的存活時(shí)間。V、IV組之間存活時(shí)間有顯著性差別提示納米釋藥系統(tǒng)可以延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高藥效。I、II組之間無(wú)顯著性差別提示PLGA本身不能延長(zhǎng)植片存活時(shí)間。II組植片混濁和水腫程度低于I組，可能與載體中含有高滲劑甘露醇有關(guān)。PLGA作為可降解生物材料，其生物相容性好，已被FDA批準(zhǔn)使用于臨床。從大鼠角膜移植模型用藥的臨床觀察來(lái)看，滴眼時(shí)部分結(jié)膜有短時(shí)間的充血，未見其它明顯的副作用。
FK506納米微粒能延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，對(duì)其它免疫相關(guān)眼病以及器官移植術(shù)后的局部用藥也具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。因而，具有極大的臨床開發(fā)和應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1、FK506納米微粒用于制備治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物的用途。
2、一種用于治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物組合物，其特征在于包括有效治療劑量的作為活性成分的FK506納米微粒，以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑或添加劑。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于所述的FK506納米微粒是FK506載入生物可降解性材料所得到的載藥納米微粒。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的生物可降解性材料選自聚乳酸、聚乳酸乙醇酸、聚乳酸乙醇酸的聚乙二醇衍生物中的一種或一種以上的混合物。
5、根據(jù)權(quán)利要求2至4之一所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物配制成滴眼液。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的滴眼液的成分包括
FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.01～0.2克
氯化物0～1.5克
增粘劑至黏度為40～50厘泊
加水至100毫升。
7、根據(jù)權(quán)利要求2至4之一所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物制備成可植入眼內(nèi)的緩釋注射劑。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述的緩釋注射劑的成分包括
FK506納米微粒，含F(xiàn)K506 0.01～0.2克
氯化物0～1.5克
抑菌劑適量
增粘劑至黏度為40～50厘泊
加水至100毫升。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述的抑菌劑選自
(1)三氯叔丁醇，濃度為0.3～0.6％；
(2)尼泊金類，濃度為0.03～0.06％；
(3)苯甲醇，濃度為2～4％。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫抑制劑FK506納米微粒的用途，提供了FK506納米微粒用于制備治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物的用途。本發(fā)明也提供了一種用于治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病的藥物組合物。所述的藥物組合物包括有效治療劑量的作為活性成分的FK506納米微粒，以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑或添加劑。所述的FK506納米微粒是FK506載入生物可降解性材料所得到的載藥納米微粒。所述的藥物組合物配制成滴眼液，制備成可植入眼內(nèi)緩釋的注射劑。本發(fā)明所述的用FK506納米微粒制備的藥物可以用來(lái)治療眼角膜移植所引起的免疫相關(guān)性疾病，對(duì)這類疾病將有比同類藥物更好的治療效果。
文檔編號(hào)A61P37/06GK1679549SQ200510032949
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者陳家祺, 龐志清, 費(fèi)文雷 申請(qǐng)人:中山大學(xué)中山眼科中心