專利名稱：一種注射型骨修復(fù)材料及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法制備人工器官技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種注射型骨修復(fù)材料及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，骨修復(fù)材料大多為支架材料負(fù)載細(xì)胞生長因子模式。支架材料和生長因子的選擇是組織工程學(xué)研究的重點內(nèi)容。支架材料作為種子細(xì)胞載體，有負(fù)載細(xì)胞和緩釋生長因子的作用，目前常用的支架材料多為固體類材料，其在骨修復(fù)材料的制備中已取得了令人矚目的效果。但是，也不同程度地存在難以塑形、負(fù)載生長因子和種子細(xì)胞操作復(fù)雜、負(fù)載率不高、細(xì)胞易流失等缺陷。因此，注射型或水凝膠類材料是目前骨修復(fù)材料研究的熱點。常用于骨修復(fù)材料領(lǐng)域的細(xì)胞生長因子有BMP、TGF-β、bFGF、VEGF等，均為外源性蛋白(異種或異體蛋白因子)。從這些生長因子的制備方法分析，包括異體骨提取和基因重組兩種，其制備復(fù)雜、價格昂貴。例如，申請?zhí)枮?2114509.1的中國專利申請“以動物纖維蛋白為載體的注射型多種生物因子復(fù)合骨修復(fù)材料”公開了一種以動物纖維蛋白為載體的注射型多種生物因子復(fù)合骨修復(fù)材料，其采用的就是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子和β轉(zhuǎn)化生長因子。從免疫學(xué)角度看，目前常用的各類生長因子均為外源性(非自體)蛋白或多肽類，不同程度存在免疫排斥反應(yīng)。研究開發(fā)制備簡單、價格低廉、無免疫排斥的自體生長因子用于骨修復(fù)材料的制備，是骨修復(fù)材料進(jìn)一步臨床應(yīng)用亟待解決的重要問題。
富血小板血漿(Plate Rich Plasma，PRP)是從全血中分離出來的含高濃度血小板的血漿。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，從自體靜脈血中提取的富血小板血漿(PRP)中含有多種高濃度的有利于促進(jìn)骨再生的生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)等。當(dāng)PRP與氯化鈣及凝血酶混合后，可促使其中血小板α顆粒釋放出這些生長因子。這些生長因子對骨缺損的愈合有明顯的促進(jìn)作用。PRP中各種生長因子濃度比例與體內(nèi)正常濃度比例相似，生長因子之間有最佳協(xié)同作用。但單純應(yīng)用PRP于局部，這些生長因子易因血循環(huán)而流失，只能在較短時間內(nèi)起作用。目前，已有將PRP與固體材料如TCP或同種異體骨等復(fù)合用于口腔頜面外科修復(fù)骨缺損的報導(dǎo)。但將PRP與注射型材料復(fù)合用于骨修復(fù)方面則未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，為了克服現(xiàn)有的骨修復(fù)材料難以塑形及操作復(fù)雜及昂貴的外源性細(xì)胞因子等不足，本發(fā)明提供一種注射型骨修復(fù)材料，該骨修復(fù)材料為可注射形材料負(fù)載自體PRP再復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細(xì)胞簡便，且使用自體細(xì)胞生長因子，不存在免疫排斥問題。
本發(fā)明所述的一種注射型骨修復(fù)材料，由溶液一與溶液二組成，其中，溶液一是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80-100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合；溶液二是氯化鈣和凝血酶的混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml；使用時，以雙聯(lián)注射器分別抽取溶液一和溶液二，以體積比為9∶1～1∶1的比例混合注射，形成凝膠狀骨修復(fù)材料，其中PRP所占的體積比為10～30％。
所述溶液一中的纖維蛋白原溶液是以濃度為2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纖維蛋白原而得到的。
所述的纖維蛋白原為商品化產(chǎn)品，可購自廣州倍繡生物技術(shù)有限公司或同類公司。
本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料的各組分的濃度及比例都是經(jīng)過實驗摸索得到的最佳結(jié)果，因此在注入體內(nèi)后會在20-30秒內(nèi)迅速形成具有生物活性的凝膠狀骨修復(fù)材料。
所述的PRP優(yōu)選是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
所述提取自體RPR的二次離心法包括以下步驟將抗凝血于20℃以3000r/min第一次離心10分鐘，吸取上清及白膜層下3mm成分；同樣溫度下以3600r/min第二次離心15分鐘，棄上層3/4上清，剩余部分即為PRP。
混合注射前在溶液一中加入一定細(xì)胞密度的種子細(xì)胞，即獲得相應(yīng)的由注射型骨修復(fù)材料復(fù)合種子細(xì)胞的注射型組織工程骨。
本發(fā)明的另一目的是提供一種注射型骨修復(fù)材料的制備方法。
本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟A.材料準(zhǔn)備
(1)自體RPR取自體靜脈血，以二次離心法提取富血小板血漿即PRP，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?；以抑肽酶溶液溶解纖維蛋白原，使成溶液態(tài)，配制氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000I U/ml；所述提取自體RPR的二次離心法包括以下步驟將抗凝血于20℃以3000r/min第一次離心10分鐘，吸取上清及自膜層下3mm成分；同樣溫度下以3600r/min第二次離心15分鐘，棄上層3/4上清，剩余部分即為PRP。
(2)纖維蛋白原溶液以抑肽酶溶解纖維蛋白原，使其成溶液態(tài)；(3)氯化鈣-凝血酶混合溶液配置氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400IU/ml；B.將自體RPR與纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，超聲振蕩使混合均勻，得到含PRP的纖維蛋白原溶液；C.以雙聯(lián)注射器分別抽取步驟B獲得的含PRP的纖維蛋白原溶液以及氯化鈣-凝血酶混合溶液，通過混合針頭注射，注射時含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶溶液比例為9∶1～1∶1，形成粘著力較強(qiáng)的凝膠，其中PRP所占的體積比為10～30％，即獲得所述的注射型骨修復(fù)材料。
在步驟B獲得的含PRP的纖維蛋白原溶液中加入一定量的種子細(xì)胞，再按照步驟C混合注射入體內(nèi)，獲得由注射型骨修復(fù)材料復(fù)合種子細(xì)胞的注射型組織工程骨。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述注射型骨修復(fù)材料的用途。
本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料，可用于制備治療骨缺損和骨不連以及促進(jìn)骨折愈合的移植物，包括直接注入患處，以及復(fù)合種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨。
本發(fā)明利用纖維蛋白原溶液遇氯化鈣-凝血酶混合溶液后形成纖維蛋白凝膠(fibringlue，F(xiàn)G)的原理，將PRP與高濃度纖維蛋白原溶液混勻后再加入氯化鈣-凝血酶混合溶液，形成的纖維蛋白凝膠不僅具有封閉創(chuàng)面、止血、促進(jìn)愈合、生物粘合等多種功能，還因其特有的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使其可作為藥物或生長因子緩釋載體。這樣，在纖維蛋白凝膠形成的過程中，PRP也釋放出各種生長因子。這些生長因子存在于纖維網(wǎng)格狀凝膠中，隨著纖維蛋白的降解而逐漸釋放出來，可在局部維持較長期的有效生長因子濃度。溶液態(tài)的纖維蛋白原也使組織工程骨的構(gòu)建更為簡單，且其形成的凝膠有較強(qiáng)的粘著能力，使種子細(xì)胞不易流失，纖維蛋白膠可注射使用，可用于微創(chuàng)手術(shù)或非手術(shù)治療骨缺損和骨不連以及促進(jìn)骨折愈合。
本發(fā)明所設(shè)計的技術(shù)方案是將纖維蛋白原與催化劑(氯化鈣、凝血酶)等材料分開包裝，術(shù)前先將PRP或MSCs與纖維蛋白原溶液混合，該過程操作簡單，當(dāng)構(gòu)建組織工程骨時，種子細(xì)胞與PRP液態(tài)材料易于復(fù)合，且分布均勻；術(shù)中使用時再將這種混合液與催化劑用二聯(lián)注射器注入體內(nèi)；在體內(nèi)形成凝膠狀FG，其粘著性強(qiáng)，使種子細(xì)胞與PRP不易流失。
本發(fā)明所設(shè)計的技術(shù)方案中，在纖維蛋白原溶液中加入一定量的抑肽酶，其主要作用為調(diào)控FG的降解以增強(qiáng)FG的穩(wěn)定性。研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)中FG注入體內(nèi)后約20秒形成果凍狀凝膠，術(shù)后4周時尚有少部分FG殘留，術(shù)后8周時FG已完全降解。術(shù)后動物無發(fā)熱、傷口潰爛等全身表現(xiàn)，植入部位組織亦未發(fā)現(xiàn)明顯水腫和炎性。這表明該復(fù)合材料無毒、無明顯抗原性。
綜上所述，從自體全血中提取PRP，其制備簡便，價格低廉。自體PRP中富含多種有利于骨修復(fù)的生長因子如PDGF、TGF-β、VEGF等，均為自體來源，不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和疾病傳播，所制備的注射型骨修復(fù)材料兼有靈活應(yīng)用的注射型材料和自體生長因子二者的優(yōu)點，操作簡單，使用方便，粘著力較強(qiáng)，可塑性好，可在體內(nèi)任意塑型成損傷部位的形狀，使新骨形狀完全恢復(fù)成原有的生理狀態(tài)，成骨效果明確，可適用于各種不規(guī)則骨缺損、骨不連治療，且可在局部注射應(yīng)用，也可用于非手術(shù)方法治療骨折，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料的掃描電鏡圖。
圖2為術(shù)后4周時的橈骨正位X片，自左至右分別為A、B、C組。
圖3為術(shù)后8周時的橈骨正位X片，自左至右分別為A、B、C組。
圖4為術(shù)后12周時的橈骨正位X片，自左至右分別為A、B、C組。
圖5為術(shù)后16周時的D組橈骨正位X片。
圖6為術(shù)后12周時的A組(實驗組)橈骨組織學(xué)切片；圖7為術(shù)后12周時的C組(對照組)橈骨組織學(xué)切片。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料，可用于制備治療骨缺損和骨不連以及促進(jìn)骨折愈合的移植物，包括直接注入患處，以及復(fù)合種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨。下面以本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料為基礎(chǔ)負(fù)載種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的實施例，來對本發(fā)明的技術(shù)方案和實施效果作進(jìn)一步說明。
實施例一種子細(xì)胞——骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。
本實驗采用的種子細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，與本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料共同構(gòu)建組織工程骨。
新西蘭大白兔，由南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))南方醫(yī)院動物所提供，采用速眠新、氯胺酮和阿托品復(fù)合液肌肉注射麻醉。雙側(cè)髂骨處抽取紅骨髓3ml，肝素溶液抗凝，混入DMEM培養(yǎng)基，混勻后1000r/min離心10min，吸棄懸浮脂肪細(xì)胞及部分上清，過100目濾網(wǎng)，加DMEM完全培養(yǎng)基(含15％胎牛血清)接種。37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)，3天后全量換液，以后2～3天半量換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底80％后以0.25％胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)以DMEM條件培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，50ug/ml抗壞血酸，10-8mol/L地塞米松，10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉)誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化，常規(guī)3天換液1次。取傳4代內(nèi)細(xì)胞(細(xì)胞密度達(dá)到108數(shù)量級)備用。所述的完全培養(yǎng)基含15％胎牛血清，條件培養(yǎng)基含10％胎牛血清，50ug/ml抗壞血酸，10-8mol/L地塞米松，10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉。
實施例二PRP的提取。
無菌條件下抽取兔耳背中央動脈血5ml，以10％枸椽酸鈉0.5ml抗凝。20℃溫度下以第一次以3000r/min離心10分鐘，吸取上清及白膜層下3mm成分。同樣溫度下第二次離心3600r/min離心15分鐘，棄上層3/4上清，剩余部分即為PRP。旋渦震蕩器輕震使混勻。高倍顯微鏡下計數(shù)其血小板含量并與全血比較。本法制備的PRP中血小板數(shù)量較全血提高了4倍多。每5ml全血約制成PRP0.6ml，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 實施例三注射型骨修復(fù)材料的制備。
注射型骨修復(fù)材料由溶液A與溶液B組成。溶液A是以抑肽酶溶液溶解纖維蛋白原并與PRP以3～6∶1比例混合。抑肽酶濃度為2000～6000U/ml。溶液B為氯化鈣和凝血酶溶液，其氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400U/ml。使用時以雙聯(lián)注射器分別抽取溶液A和溶液B。以溶液A、B比例9∶1～1∶1混合注射。注入體內(nèi)時在20-30秒內(nèi)形成果凍狀凝膠，在體外也成形成凝膠。
當(dāng)用于構(gòu)建組織工程骨時，在溶液A、B混合注射前，在溶液A中加入按實施例一所述方法經(jīng)體外誘導(dǎo)分化增殖的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，其細(xì)胞密度為5×106～10×107/ml。
如圖1所示，掃描電鏡觀察凝膠為纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)可見較多骨髓基質(zhì)細(xì)胞和血小板。血小板來自PRP(富血小板血漿)。
實施例四制備橈骨骨缺損模型取健康新西蘭大白兔，6個月齡，體重2-3kg，采用速眠新、氯胺酮和阿托品復(fù)合液肌注麻醉。無菌條件下，手術(shù)顯露右側(cè)橈骨中段，連同骨膜切除橈骨1.5cm，造成節(jié)段性骨缺損模型。
實施例五動物植入實驗實驗設(shè)計36只健康新西蘭大白兔，由南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))南方醫(yī)院動物所提供，按實施例四制備橈骨骨缺損模型，隨機(jī)分為A、B、C三組，每組12只。所有動物術(shù)前一周按實施例二所述方法抽取耳背中央動脈血提取自體富血小板血漿(Plate Rich Plasma，PRP)。A組于術(shù)前1～2月按實施例一所述方法制備骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，術(shù)前30分鐘將消化計數(shù)后的MSCs加入實施例三所述方法制備成注射型骨修復(fù)材料，植入自體橈骨1.5cm節(jié)段性骨缺損，為實驗組。B、C兩組分別植入PRP+FG、FG于同樣骨缺損處為對照組。纖維蛋白膠(fibrin glue，F(xiàn)G)是將纖維蛋白原與氯化鈣、凝血酶混合后形成的一種凝膠狀物。A、B、C三組逐層縫合切口，術(shù)后三天肌注青霉素40萬u/日。另取4只橈骨同樣部位和大小骨缺損曠置作為空白組，即D組。
術(shù)后4、8、12周時拍攝橈骨正位X線片。用放射影像學(xué)評分和圖像分析X線阻射影比較骨缺損的修復(fù)情況。
檢測方法(1)大體觀察嚴(yán)密觀察新西蘭大白兔術(shù)后的一般情況。術(shù)后4、8、12周每組各處死2只動物取材，觀察骨修復(fù)材料的表面變化、骨痂形成、骨缺損修復(fù)情況及周圍組織反應(yīng)。
(2)放射學(xué)檢查A、B、C三組動物于術(shù)后4、8、12周均攝右橈骨正位x光片(投照距離1m，投照條件46KV，50mA，曝光時間0.14s)，D組于術(shù)后12、16周攝片，觀察骨缺損愈合情況。所有照片依據(jù)Yang等(Yang CY，Simmons DJ，Lozano R.The healing of graftscombining freeze-dried and demineralized allogeneic bone in rabbits.Clin Orthop.1994，298289)的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行放射學(xué)評分。骨缺損部位x線阻射密度測定參照文獻(xiàn)(陽富春，楊志明等，獼猴組織工程化骨制備及其修復(fù)異體骨缺損的放射學(xué)評估，中國臨床康復(fù)2004；8(2)223-225)。
結(jié)果(1)大體觀察術(shù)后所有兔切口未見紅腫、滲血及濃性分泌物，切口均一期愈合。術(shù)后4周，A組、B組骨缺損處為大量淡紅色質(zhì)硬纖維組織充填，切開纖維組織見其內(nèi)仍有少量膠狀物，橈骨遠(yuǎn)近斷端見大量纖維骨痂，A組骨痂多于B組，C組缺損處稍凹陷，為質(zhì)軟纖維組織生長，缺損區(qū)中心部仍有部分FG殘留，未見明顯骨痂。各組骨缺損周圍肌肉均未見水腫。術(shù)后8周，A、B組骨缺損區(qū)均見大量連續(xù)性骨痂，呈膨脹性生長，其直徑超過正常橈骨；兩者無明顯區(qū)別，材料已完全吸收；C組缺損仍為纖維組織充填，見少量散在骨痂生長。各組周圍組織未見異常反應(yīng)。術(shù)后12周，A組兩只兔骨缺損處均完全愈合，局部為正常有骨膜骨組織，塑形良好，難以區(qū)分?jǐn)喽恕組一只兔缺損完全愈合，塑形好，另一只兔缺損處為新生骨痂充填，斷端模糊。C組見遠(yuǎn)近兩斷端各有部分骨痂生長，骨缺損中間部仍為纖維組織。周圍組織正常。D組術(shù)后16周處死時觀察骨缺損大小基本同前，兩骨端硬化，骨髓腔封閉，纖維組織充填髓腔，無明顯骨痂生長。
(2)X片觀測如圖2至圖4所示，A組術(shù)后4周骨缺損處呈斑片狀阻射影，斷端仍清晰，兩斷端部密度稍高。術(shù)后8周時兩斷端模糊，骨缺損處為連續(xù)性高密度阻射影，橈骨外部骨痂清晰，缺損處內(nèi)側(cè)尺骨皮質(zhì)密度增高。12周時骨缺損處呈均勻一致高密度影，有7只兔橈骨雙側(cè)骨皮質(zhì)連續(xù)，髓腔貫通，說明術(shù)后12周時骨缺損完全愈合。B組術(shù)后4周骨缺損處為連續(xù)性絮狀阻射影，斷端清晰。術(shù)后8周骨缺損區(qū)模糊，為連續(xù)性高密度阻射影，骨痂量增多。12周時骨缺損消失，5只骨皮質(zhì)連續(xù)，塑形好，髓腔復(fù)通。C組術(shù)后4周缺損區(qū)大部呈透光影，僅斷端周圍見絮狀阻射影。8周時見斷端清晰，缺損區(qū)有小片狀阻射影。術(shù)后12周見缺損區(qū)仍清晰，僅見兩端有少量骨痂生長。如圖5所示，D組術(shù)后16周骨缺損區(qū)仍呈透亮影，骨斷端硬化、模糊，說明空白組術(shù)后16周骨缺損均無愈合。
(3)X線片影像學(xué)評分結(jié)果A、B、C組正位照片骨缺損修復(fù)評分從表1可看出，A組和B組在4、8、12周均較C組的放射影像學(xué)評分為優(yōu)(P＜0.05)，但A組和B組相比較無明顯差異(P均＞0.05)。正位片骨缺損部位阻射密度測量值從表2可看出，A、B、C組在4、8、12周的骨缺損阻射密度測量值有顯著性差異(P＜0.05)，在新生骨痂形成的多少和密度方面，A＞B＞C。
表1 關(guān)于骨缺損修復(fù)的正位照片評分(X±s，n＝8)

表2 關(guān)于骨缺損部位阻射密度測量值(X±s，n＝8)

實驗結(jié)果表明A、B組在Yang氏放射學(xué)評分及缺損區(qū)骨痂阻射密度測量方面均優(yōu)于單純FG組，而A、B兩組間雖在放射學(xué)評分上無明顯差別，但在骨痂形成質(zhì)量上，A組優(yōu)于B組。從該結(jié)果分析，PRP有明顯的促進(jìn)骨缺損修復(fù)作用，而種子細(xì)胞的添加對增進(jìn)骨痂形成起重要作用。
如圖6和圖7所示，組織學(xué)切片觀察見實驗組為正常骨組織結(jié)構(gòu)，并有髓腔形成，對照組為纖維組織結(jié)構(gòu)，無明顯成骨。
結(jié)論P(yáng)RP對骨缺損愈合有明顯促進(jìn)作用，復(fù)合PRP的注射型材料與MSCs制備骨修復(fù)材料可修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損。
在骨折的自然愈合過程中，嵌入骨折斷端部位的血凝塊起著重要作用，其中血凝塊中的纖維蛋白和血小板聚集過程中釋放的各種生長因子起主導(dǎo)作用。本發(fā)明中的PRP，是在術(shù)前一周抽取自體全血，經(jīng)二次離心法制備出來的，其血小板濃度較全血提高了4倍余。隨著FG的降解，這些生長因子逐漸釋放出來并可在局部維持較長期有效濃度。Obarrio等人的研究(Obarrio J J，Arauz-Dutari J I，Chamberlain T M，etal.The use ofautologous growth factors in periodontal surgical l therapyPlateletgelbiotechnology-casereports.IntJPeriodontics Restorative Dent，2000；20(5)486)以及Soory等人的研究(Soory M，Virdi H.Implications of minocycline，platelet-derivedgrowth factor，and transforming growthfactor-bet on infiamma-tory repair potentialin the periodontium.J Periodontol，1999；70(10)1136)發(fā)現(xiàn)，在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和骨祖細(xì)胞膜上存在PDGF、TGF-β1和TGF-β2受體。PRP中的PDGF和TGF-β可能通過與靶細(xì)胞(MSCs和骨祖細(xì)胞)膜上的受體結(jié)合發(fā)揮作用，促進(jìn)MSCs和骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而增強(qiáng)新骨再生，加速骨缺損的修復(fù)。而PRP中的VEGF有促進(jìn)新生血管形成作用，骨修復(fù)材料的血管化是促進(jìn)新骨再生的基礎(chǔ)，大量新生血管的形成為種子細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)，亦可促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。
基于上述分析，本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料可用于制備治療骨缺損和骨不連以及促進(jìn)骨折愈合的移植物。
權(quán)利要求
1.一種注射型骨修復(fù)材料，其特征在于由溶液一與溶液二組成，其中溶液一是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80-100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合；溶液二是氯化鈣和凝血酶的混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml；使用時，以雙聯(lián)注射器分別抽取溶液一和溶液二，以體積比為9∶1～1∶1的比例混合注射，形成凝膠狀骨修復(fù)材料，其中PRP所占的體積比為10～30％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射型骨修復(fù)材料，其特征在于所述溶液一中的纖維蛋白原溶液是以濃度為2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纖維蛋白原而得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨修復(fù)材料，其特征在于所述的PRP是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程骨，其特征在于所述提取自體RPR的二次離心法包括以下步驟將抗凝血于20℃以3000r/min第一次離心10分鐘，吸取上清及白膜層下3mm成分；同樣溫度下以3600r/min第二次離心15分鐘，棄上層3/4上清，剩余部分即為PRP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的注射型骨修復(fù)材料，其特征在于混合注射前在溶液一中加入一定細(xì)胞密度的種子細(xì)胞，即獲得相應(yīng)的由注射型骨修復(fù)材料復(fù)合種子細(xì)胞的注射型組織工程骨。
6.如權(quán)利要求1所述的注射型骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A.材料準(zhǔn)備(1)自體RPR取自體靜脈血，以二次離心法提取富血小板血漿即PRP，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?；以抑肽酶溶液溶解纖維蛋白原，使成溶液態(tài)，配制氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000IU/ml；(2)纖維蛋白原溶液以抑肽酶溶解纖維蛋白原，使其成溶液態(tài)；(3)氯化鈣-凝血酶混合溶液配置氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400IU/ml；B.將自體RPR與纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，超聲振蕩使混合均勻，得到含PRP的纖維蛋白原溶液；C.以雙聯(lián)注射器分別抽取步驟B獲得的含PRP的纖維蛋白原溶液以及氯化鈣-凝血酶混合溶液，通過混合針頭注射，注射時含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶溶液比例為9∶1～1∶1，形成粘著力較強(qiáng)的凝膠，其中PRP所占的體積比為10～30％，即獲得所述的注射型骨修復(fù)材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的注射型骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于在步驟B獲得的含PRP的纖維蛋白原溶液中加入一定量的種子細(xì)胞，再按照步驟C混合注射入體內(nèi)，獲得由注射型骨修復(fù)材料復(fù)合種子細(xì)胞的注射型組織工程骨。
8.如權(quán)利要求1或2或3所述的注射型骨修復(fù)材料用于制備治療骨缺損和骨不連以及促進(jìn)骨折愈合的移植物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種注射型骨修復(fù)材料及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料，由溶液一與溶液二組成，其中，溶液一是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80－100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合；溶液二是氯化鈣和凝血酶的混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml；使用時以雙聯(lián)注射器分別抽取溶液一和溶液二，以體積比為9∶1～1∶1的比例混合注射入體內(nèi)，形成粘著力較強(qiáng)的凝膠，其中PRP所占的體積比為10～30％。本發(fā)明所述的注射型骨修復(fù)材料可制備治療骨缺損和骨不連以及促進(jìn)骨折愈合的移植物。
文檔編號A61P19/08GK1846789SQ200510034119
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日
發(fā)明者裴國獻(xiàn), 黃愛文, 金丹, 曾憲利, 胡稷杰, 陳書軍, 張元平 申請人:南方醫(yī)院