專利名稱：紅色奴卡氏放線菌細胞壁骨架用于治療肝臟疾病的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種紅色奴卡氏放線菌細胞壁骨架的醫(yī)藥新用途，即治療肝臟疾病的新用途。
背景技術(shù)：
紅色奴卡氏放線菌(Nocardia rubra)是自土壤分離的一種放線菌，分類學上屬于細菌域，厚壁菌門，放線菌綱，奴卡氏菌屬。
目前國內(nèi)已有研究者從該菌中分離制備得到一種天然混合產(chǎn)物——紅色奴卡氏菌細胞壁骨架(Nocardia rubra cell wall skeleton，簡稱N-CWS)，也稱紅色諾卡氏菌細胞壁骨架。主要成分為類脂化合物(枝菌酸17.1％)、多糖(阿拉伯半乳聚糖46.3％)和粘肽(主要為丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、葡萄糖胺和胞壁酸)等(Zhang ZL，Lin S，Tang WL，et al.Studies on thephysico-chemical properties，composition and content determination of Nocardia rubra cell wallskeleton[J].J China Antibiotic，2002，27(9)532-534)。臨床上已用于治療體外炎癥、婦科疾病、皰疹病毒引起的感染的臨床治療藥物。目前，國內(nèi)外學者已通過荷瘤小鼠整體動物模型，驗證了N-CWS具有顯著預(yù)防和抑制腫瘤增生，并治療癌性并發(fā)癥(癌性胸水、癌性腹水)的作用，包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌，輔助治療惡性黑色素瘤、惡性淋巴瘤、晚期胃癌和食道癌等。除此之外，目前未見有關(guān)于N-CWS其它藥效作用的報導(dǎo)。
近年來，各種慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎以及因肥胖導(dǎo)致的脂肪肝呈明顯上升趨勢，肝臟疾病已成為嚴重危害人類身體健康的重大疾病之一，但是，市場上尚未見有特效低毒的各類抗肝炎藥物，發(fā)現(xiàn)更多肝臟類疾病的治療新藥已成為藥物研究領(lǐng)域的重點之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了紅色奴卡氏放線菌細胞壁骨架(以下簡稱N-CWS)的治療新用途，即其可以用于治療肝臟疾病，所述肝臟疾病包括慢性肝損傷、肝纖維化、急性肝損傷、化學性肝損傷、肝炎等，也可用于護肝。
本發(fā)明的N-CWS在治療肝臟疾病時可以將其制備成藥劑學上常規(guī)的劑型，通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的給藥方式來進行給藥，例如口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥。優(yōu)選的給藥方式是口服。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實際治療所需的量可以由醫(yī)師根據(jù)實際情況(如，病人的病情、體重等)而方便地確定。對于一般的成人，每日需要給藥5-600mg的量。
本發(fā)明的N-CWS可以由固體發(fā)酵制備得到，具體制備方法已有文獻報道，一般的方法如下1、菌種保存斜面保存法配制固體培養(yǎng)基(0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，0.5％氯化鈉，0.03％Na2HPO4.12H2O，1％甘油，1.6％瓊脂；以10％碳酸鈉調(diào)pH值至7.2)，121℃滅菌后制成斜面培養(yǎng)基。以接種環(huán)從平板中挑取活化單菌落，斜面劃線接種，31℃培養(yǎng)120h后，4℃保藏。
2、發(fā)酵固體培養(yǎng)基牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、氯化鈉0.5％、0.03％Na2HPO4.12H2O、甘油1％、蒸餾水配制；10％碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.5；121℃滅菌后，鋪平板備用。
接種與發(fā)酵用無菌蒸餾水或液體培養(yǎng)基洗脫斜面菌種保藏管中的菌體，吹打均勻后制成一定濃度的菌懸液，按照一定的量涂布法涂布于直徑15cm的平板上，31℃倒置培養(yǎng)120h。
菌體收集將長出的菌苔用接種鏟輕輕刮下，然后用一定體積的PBS緩沖液制成菌懸液，4℃下5000rpm離心5min，收集菌體后稱重備用。
3、N-CWS的制備與理化性質(zhì)分析將發(fā)酵獲得的菌體重懸于10倍體積PBS溶液，冰浴條件下間歇法超聲破碎菌體，調(diào)節(jié)頻率和功率，避免發(fā)生泡沫，使裂解盡快完成。
裂解產(chǎn)物于4℃，10000g離心15min，取上清，適量DNase和RNase處理1h以消化菌體中的核酸，然后加入終濃度為1％TritonX-100處理24h，再用適量的胰蛋白酶和鏈蛋白酶處理12h，最后以正丙醇、無水乙醇/冰乙酸(1∶1)分別處理2h，蒸餾水洗滌三次后即得到白色的N-CWS，60℃烘干后稱重。
將收集獲得的N-CWS配置成一定濃度混懸液，0.07Mpa下滅菌15min，4℃保存。

N-CWS無嗅無味，呈白色粉末狀，不溶于水、乙醇、二甲亞砜、醚等試劑。


圖1.N-CWS處理對ALT的動態(tài)變化影響圖2.N-CWS處理對AST的動態(tài)變化影響圖3小鼠肝組織的病理學變化(HE染色，×20)，A為正常小鼠肝組織，B為100mg/kg聯(lián)苯雙酯處理組，C為模型組，D、E、F分別為150、15和1.5mg/kg N-CWS處理組(n＝10)圖4.N-CWS對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維大鼠血清AST的影響圖5.N-CWS對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維大鼠血清ALT的影響圖6不同處理組大鼠肝組織的病理變化(HE染色，×400)A為正常組，B為模型組，C為陽性對照組，D為40mg/kgN-CWS高劑量組)，E為8mg/kgN-CWS中劑量組，F(xiàn)為1.6mg/kgN-CWS低劑量組為了便于理解，以下將通過具體的實施例和附圖對本發(fā)明進行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
具體實施例方式
實施例1N-CWS對CCl4所致急性肝損傷小鼠的保護作用1、藥物劑量高劑量組的劑量為150mg/kg，配制濃度7.5mg/ml，灌胃0.2ml/10g；中劑量組為15mg/kg，配制濃度0.75mg/ml，灌胃0.2ml/10g；低劑量組為1.5mg/kg，配制濃度0.075mg/ml，灌胃0.2ml/10g。
試驗對照空白對照用生理鹽水，按與給藥組等體積灌胃口服。
陽性對照藥為聯(lián)苯雙酯滴丸劑(1.5mg/粒)，北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)。臨用時根據(jù)需要加入蒸餾水溶解混懸均勻，4℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)臨床用量和動物耐受容量，設(shè)計動物實驗劑量小鼠劑量100mg/kg，配制濃度5mg/ml，灌胃0.2ml/10g。
2、實驗動物健康昆明種小鼠，全雄，體重20±2g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。
3、其他實驗材料四氯化碳，分析純，南京化學試劑一廠生產(chǎn)。甲醛溶液，分析純，南京化學試劑一廠生產(chǎn)。魯花牌純正花生油，萊陽魯花濃香花生油有限公司。氯化鈉注射液，金陵藥業(yè)浙江天峰制藥廠生產(chǎn)。轉(zhuǎn)氨酶活性測定試劑盒為南京建成生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號為20040518。
4、實驗方法
4.1 N-CWS對四氯化碳所致急性肝損傷模型小鼠的保護作用將90只昆明種小鼠按體重隨機分為六組，每組15只，即正常對照組(Control)、模型組(Model)、陽性藥對照組(Bifendate，p.o 100mg/kg)和N-CWS高、中、低劑量組(p.o，劑量分別為150、15和1.5mg/kg)。給藥體積為0.2ml/10g，正常組和模型組分別給予等體積生理鹽水。
造模前24h開始灌胃給藥，每日早晚各給藥一次，連續(xù)給藥4日，第2d給藥后1h，除正常對照組外，其余各組用0.2％的CCl4花生油溶液0.2ml/10g腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型。48h后小鼠眼眶取血，3000rpm離心10min分離血清以改良賴氏法測定血清轉(zhuǎn)氨酶；斷頭處死動物，取肝臟左葉以10％甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后進行病理學觀察。
4.2 血清轉(zhuǎn)氨酶動態(tài)變化實驗取130只昆明種小鼠按體重隨機分為四組，即正常對照組(Control，n＝10)、模型組(Model，n＝40)、聯(lián)苯雙酯陽性對照組(Bifendate，p.o 100mg/kg，n＝40)和N-CWS高劑量組(p.o 150mg/kg，n＝40)。給藥體積為0.2ml/10g，正常組和模型組給予等體積生理鹽水。
除正常對照組外，其余各組用0.2％的CCl4花生油溶液0.2ml/10g腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型。造模后1h開始灌胃給藥，每隔12h給藥一次，分別在造模后第8h、24h、48h、72h從模型組、陽性對照組、給藥組各取10只小鼠，眼眶取血，3,000rpm離心10min，取血清測定轉(zhuǎn)氨酶水平。正常組小鼠只設(shè)一個時間點(Oh)如上操作。
5、結(jié)果5.1 N-CWS對CCl4致急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響N-CWS可明顯抑制CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的異常升高，并呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系(見表1)。與陽性藥物聯(lián)苯雙酯相比，15mg/kg的N-CWS對轉(zhuǎn)氨酶活性的抑制作用與100mg/kg的藥效相當，但劑量僅為前者的15％。
表1.N-CWS對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with Model group，ΔΔP＜0.01 compared with Normal group.
鑒于由CCl4誘導(dǎo)的血清轉(zhuǎn)氨酶活性在后期恢復(fù)，觀察了造模后不同時間中小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的動態(tài)變化(見圖1和圖2)，結(jié)果顯示模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性在72h內(nèi)恢復(fù)正常，150mg/kg的N-CWS與陽性藥物對照組對血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響趨勢是相近的，它們均可降低整個過程中(0～72h)轉(zhuǎn)氨酶的活性，前者的效果尤為顯著。
5.2 N-CWS對小鼠肝臟組織學變化的影響通過石蠟切片觀察了肝臟組織的病理變化(圖3)，結(jié)果顯示與正常對照組相比，模型組小鼠肝小葉的中央靜脈周圍肝細胞明顯腫脹，胞漿疏松化，匯管區(qū)可見大量中性粒細胞浸潤；肝竇擴張充血，部分病例可見肝細胞點狀壞死，肝細胞脂肪變性。而150mg/kg和15mg/kg的N-CWS處理后，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細胞雖有輕度水腫，但無壞死現(xiàn)象；在肝臟的匯管區(qū)僅見少量中性粒細胞浸潤，病變程度遠較模型組為輕，并能阻止由于CCl4引起的肝細胞腫脹，胞漿疏松化，脂肪變性，最終至點狀壞死的病變過程，保護肝臟組織結(jié)構(gòu)受損；結(jié)果同時顯示，150mg/kg的N-CWS處理后，肝細胞發(fā)生有絲分裂，肝細胞分化與增殖較瀕繁，肝再生旺盛。
實施例2N-CWS對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的保護作用1、受試藥物藥物劑量高劑量組為40mg/kg，配制濃度2mg/ml，p.o 0.2ml/10g；中劑量組為8mg/kg，配制濃度0.4mg/ml，p.o 0.2ml/10g；低劑量組為1.6mg/kg，配制濃度0.08mg/ml，p.o 0.2ml/10g。
實驗對照空白對照用生理鹽水，按與給藥組等體積灌胃口服。
陽性對照馬洛替酯為山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司產(chǎn)品。臨用時根據(jù)需要加入蒸餾水溶解混懸均勻，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、實驗動物SD大鼠，全雄，體重150-180g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。
3、其他實驗材料四氯化碳，分析純，南京化學試劑一廠生產(chǎn)。甲醛溶液，分析純，南京化學試劑一廠生產(chǎn)。魯花牌純正花生油，萊陽魯花濃香花生油有限公司。氯化鈉注射液，金陵藥業(yè)浙江天峰制藥廠生產(chǎn)。轉(zhuǎn)氨酶活性、肝臟羥脯氨酸、血清A/G比檢測試劑盒為南京建成生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號為20050318。
4.實驗方法將120只SD大鼠按體重隨機分為六組，每組20只，即正常對照組(Control)、模型組(Model)、陽性對照組(Bifendate，p.o 50mg/kg)和N-CWS高、中、低劑量組(p.o，劑量分別為40、8和1.6mg/kg)。
每周一、四上午除正常對照組外，其余各組以20％CCl4花生油溶液2.5ml/kg腹腔注射，建立大鼠肝纖維化模型；每周一至周六下午灌胃給藥，給藥體積2.5ml/kg，每日給藥一次，正常組和模型組給予等體積生理鹽水，實驗總周期為10周。
末次給藥12h后大鼠眼眶取血，血清采用改良法賴氏法測定ALT和AST活性。斷頭處死動物，肝臟左葉以10％甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后進行病理學檢測；中葉于液氮中速凍后置于-80℃保存，進行肝臟羥脯氨酸，血清白蛋白與球蛋白比值(A/G)等相關(guān)生化指標的檢測。
5、結(jié)果5.1 血清轉(zhuǎn)氨酶活性變化利用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化損傷動物模型評價了N-CWS對抗肝纖維化的藥效作用，結(jié)果表明高、中、低不同劑量(40mg/kg、8mg/kg和1.6mg/kg)的N-CWS均表現(xiàn)出顯著降低CCl4所致血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST病態(tài)升高的活性，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系(圖4和圖5)，其中1.6mg/kg劑量組的N-CWS對肝損傷保護作用的藥效與陽性藥物馬洛替酯的作用相當，但給藥劑量僅為后者的3.2％。
5.2 肝組織的病理變化對不同處理組的大鼠肝組織病理變化情況進行分析(圖6)與正常對照組相比，模型組大鼠肝細胞發(fā)生較明顯的脂肪變性，細胞腫脹嚴重，匯管區(qū)可見明顯的炎細胞浸潤，纖維結(jié)締組織中度生成，肝纖維化形成。而40mg/kg的N-CWS處理后，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚；在肝臟的匯管區(qū)僅見少量中性粒細胞浸潤，僅有一例標本可見肝細胞腫脹，脂肪變性，病變程度遠較模型組為輕。8mg/kg和1.6mg/kg的N-CWS處理后，大鼠肝臟內(nèi)炎癥細胞浸潤和肝細胞脂肪變性均較嚴重，但未見較明顯的纖維結(jié)締組織增生，肝纖維化并未形成。
5.3 血清中白蛋白與球蛋白的比值利用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化損傷動物模型評價N-CWS對抗肝纖維化的藥效作用，結(jié)果表明各劑量組N-CWS均可較顯著逆轉(zhuǎn)CCl4引起血清A/G比值的降低，且藥效呈現(xiàn)較明顯的量效關(guān)系(表2)。
表2 N-CWS對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中A/G比值的影響


*P＜0.05 compared with Model group，**P＜0.05compared with Normal group.
5.4 肝臟組織中羥脯氨酸含量(HYP)的變化利用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化損傷動物模型評價了N-CWS對抗肝纖維化的藥效作用，結(jié)果表明40mg/kg、8mg/kg和1.6mg/kg劑量組的N-CWS可較顯著逆轉(zhuǎn)CCl4引起的肝臟羥脯氨酸含量的增高，三個劑量組N-CWS的藥效呈現(xiàn)較明顯的量效關(guān)系(表3)。
表3 N-CWS對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中羥脯氨酸含量的影響

*P＜0.05 compared with Model group，**P＜0.05compared with Normal group.
6、討論血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)被認為是反映肝損傷的敏感指標，并被作為肝功能的評價指標廣泛應(yīng)用于肝病的臨床診斷過程。ALT位于肝細胞胞漿內(nèi)，AST則主要分布于肝細胞線粒體內(nèi)，少部分位于胞漿。肝受損較輕時，細胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)ALT和AST釋放進入血液，而線粒體內(nèi)的AST則不釋放，當肝細胞受損嚴重時AST才釋放進入血液，故血清轉(zhuǎn)氨酶的水平可在一定程度上反映肝細胞膜的受損程度。
羥脯氨酸是合成細胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分之一膠原蛋白的基礎(chǔ)物質(zhì)，因而肝臟中羥脯氨酸的含量可直接反映肝臟纖維化的程度。N-CWS可顯著降低CCl4誘導(dǎo)所致的肝臟中羥脯氨酸的異常增高，說明N-CWS能對抗肝纖維化，該結(jié)果也與組織病理學檢測結(jié)果一致。
白蛋白主要由肝細胞合成和分泌，可維持血液滲透壓，且能結(jié)合陽離子、陰離子等多種物質(zhì)，產(chǎn)生廣泛可逆構(gòu)形的改變，故能輸送許多營養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪酸、激素、微量金屬離子、酶、維生素和藥物等。此外，白蛋白還能與微溶的代謝物及有毒物質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物后運送至代謝器官和解毒器官，然后排出體外；球蛋白是機體免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的免疫蛋白。白蛋白與球蛋白量的比值是慢性肝損傷治療的一項重要的預(yù)后指標。而N-CWS能在一定程度上恢復(fù)CCl4誘導(dǎo)的A/G比值的降低而達到趨于正常的水平，表明N-CWS對肝纖維化治療的預(yù)后效果較好。
綜上所述，N-CWS可以抑制血清轉(zhuǎn)氨酶的活性和炎癥反應(yīng)，并促進肝細胞的分裂增生，對化學性肝損傷和慢性肝損傷具有良好保護作用。同時，N-CWS可顯著降低肝臟中羥脯氨酸水平和ECM的蓄積，具有顯著的抗肝纖維化作用，且預(yù)后效果較好。
權(quán)利要求
1.紅色奴卡氏放線菌細胞壁骨架用于制備治療肝臟疾病藥物的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中肝臟疾病是慢性肝損傷。
3.權(quán)利要求1所述的用途，其中肝臟疾病是肝纖維化。
4.權(quán)利要求1所述的用途，其中肝臟疾病是肝炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種紅色奴卡氏放線菌細胞壁骨架的醫(yī)藥新用途，即治療肝臟疾病的新用途。
文檔編號A61P1/00GK1724071SQ20051004094
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月8日
發(fā)明者葉波平, 王穎, 金國虔, 陶俊, 余江河, 吳梧桐, 劉煜, 王鑫, 劉慧 申請人:中國藥科大學