專(zhuān)利名稱(chēng)：防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜禽藥，尤其是一種防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
禽類(lèi)的呼吸道感染性疾病在整個(gè)禽病中占有十分重要的地位，其中病毒和細(xì)菌性疾病占80％以上。目前發(fā)病的禽種和病種都在不斷增加，不僅嚴(yán)重影響著禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而且禽類(lèi)病毒感染人體和人禽共患病癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康已引起國(guó)際社會(huì)的高度重視。由于免疫程序復(fù)雜、弱毒疫苗的潛在危險(xiǎn)性、滅活苗抗原性弱、一些疫苗的保護(hù)率降低以及缺少有效的預(yù)防用疫苗等因素，尤其在病毒性疾病的防治方面還存在很多缺陷。用中藥防治病毒和細(xì)菌引起的感染性疾病在我國(guó)具有悠久歷史，在臨床應(yīng)用中顯示出了獨(dú)特的療效。由于中草藥保持了各種物質(zhì)的自然形態(tài)和生物活性，極少有毒副作用，近年來(lái)許多國(guó)家都非常重視從中草藥或植物藥中研究新藥。國(guó)內(nèi)的動(dòng)物用藥也正向療效高、耐藥性低、效果持久、低毒、低殘留等方向發(fā)展，中草藥在某些領(lǐng)域有逐漸取代抗生素類(lèi)藥物的趨勢(shì)。但由于中藥在動(dòng)物體內(nèi)作用機(jī)理的復(fù)雜性和復(fù)方成分難以定量化，研制和篩選一種非常有效的并能夠在臨床大規(guī)模應(yīng)用的有效藥物仍十分困難，目前市場(chǎng)上仍以中西結(jié)合藥物為主，而且功能單一。

發(fā)明內(nèi)容
基于現(xiàn)有技術(shù)的不足和國(guó)內(nèi)外對(duì)抗病毒、抗菌中藥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的需求，本發(fā)明以祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo)，研制了新組方純中藥防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物——“菌毒康”，將其制成口服制劑型，用于治療和預(yù)防禽類(lèi)頑固性呼吸道感染類(lèi)疾病。
本發(fā)明的另一目的是提供防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物——“菌毒康”的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物，以1500ml藥液計(jì)算，含各味中藥以生藥材計(jì)算的量以及敷料量配比為板蘭根350～450g，黃連150～250g，金銀花225～275g，黃芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，95％乙醇225-250ml，亞硫酸氫鈉3g，其余為蒸餾水。
本發(fā)明的制備方法是①水提按照配方組成，分別稱(chēng)取板蘭根350～450g，黃連150～250g，金銀花225～275g，黃芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，第一次加4倍蒸餾水，加熱至沸騰，提取0.5小時(shí)；過(guò)濾取濾液；第二次加入7倍水量，加熱至沸騰提取1小時(shí)，過(guò)濾收集濾液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加熱濃縮至1200ml；②醇沉加入乙醇，使藥液的乙醇濃度含量為50％，搖勻后在低溫下靜置過(guò)夜，離心驅(qū)除沉淀物，回收上清夜，回收乙醇使藥液體積至1200ml，以上述方法分別經(jīng)過(guò)65％、80％的乙醇提取2次，最后濃縮藥液1200ml；③藥液配制藥液中加入3g亞硫酸氫鈉攪拌溶解。然后加入乙醇225～250ml充分?jǐn)嚢琛Ｗ詈蠹尤胝麴s水并定容至1500ml。
劑型口服液理化參數(shù)pH值5.0±1.0；比重1.02±0.15；性狀棕紅色液體，久置可有微量沉淀，味微苦。
鑒別取藥液作為供試品溶液另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加水配成0.5mg/ml試驗(yàn)，吸取上述兩溶液各1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇(6∶3∶1.5∶1.5)為展開(kāi)劑展開(kāi)，置于蒸氣飽和的層析缸內(nèi)展開(kāi)，取出晾干后置紫外檢測(cè)儀(365nm)下檢視。供試品與對(duì)照品在色譜板相應(yīng)的位置上顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)。
含量測(cè)定取藥液1ml，加入2M的NaOH溶液4滴，使其pH值調(diào)整為9.0-10.0。以2ml的乙酸乙酯提取5次，合并乙酸乙酯并揮干，殘?jiān)?.05M的硫酸溶解并定容至25ml，搖勻，按分光光度法，在345nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度，按C20H18ClNO4的吸收系數(shù)(El％，1cm)為728計(jì)算，即得。“菌毒康”含鹽酸小檗堿(C20H18ClNO4)計(jì)，其值應(yīng)為0.45μg/ml以上。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果是本發(fā)明屬于清熱解毒類(lèi)藥物，與活血化淤藥、補(bǔ)益藥配伍，并且通過(guò)大量的臨床使用，證明該藥物對(duì)多種病毒和細(xì)菌引起的禽類(lèi)呼吸道感染甚至十分頑固、久治不愈的病癥具有十分良好的治療效果，其應(yīng)用對(duì)于推動(dòng)我國(guó)家禽業(yè)的發(fā)展將產(chǎn)生積極作用；本產(chǎn)品主要治療和預(yù)防禽類(lèi)頑固性呼吸道感染類(lèi)疾病，可取代現(xiàn)有的抗生素類(lèi)藥物，臨床使用具有高效、安全、低毒、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。
下面，結(jié)合病毒試驗(yàn)、藥理藥效試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)、治療雞呼吸道綜合癥療效試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明再作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1①按照配方組成，分別稱(chēng)取板蘭根400g，黃連200g，金銀花250g，黃芩300g，山豆根200g，甘草150g，第一次加4倍蒸餾水，加熱至沸騰，提取0.5小時(shí)，過(guò)濾取濾液；第二次加入7倍水量，加熱至沸騰提取1小時(shí)，過(guò)濾收集濾液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加熱濃縮至1200ml。
②加入乙醇，使藥液的乙醇濃度含量為50％，搖勻后在低溫下靜置過(guò)夜，離心驅(qū)除沉淀物，回收上清夜，減壓加熱回收乙醇，使藥液體積至1200ml。以上述方法分別經(jīng)過(guò)65％、80％的乙醇醇沉2次，最后濃縮藥液至1200ml。
③藥液中加入3g亞硫酸氫鈉攪拌溶解。然后加入乙醇225ml充分?jǐn)嚢?。最后加入蒸餾水并定容至1500ml。
實(shí)施例2①按照配方組成，分別稱(chēng)取板蘭根400g，黃連200g，金銀花250g，黃芩300g，山豆根200g，甘草150g，第一次加4倍蒸餾水，加熱至沸騰，提取1小時(shí)，過(guò)濾取濾液；第二次加入6倍水量，加熱至沸騰提取1小時(shí)，過(guò)濾收集濾液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加熱濃縮至1200ml。
②加入乙醇，使藥液的乙醇濃度含量為50％，搖勻后在低溫下靜置過(guò)夜，離心驅(qū)除沉淀物，回收上清夜，減壓加熱回收乙醇，使藥液體積至1200ml，以上述方法分別經(jīng)過(guò)65％、80％的乙醇醇沉2次，最后濃縮藥液至1200ml。
③藥液中加入3g亞硫酸氫鈉攪拌溶解。然后加入乙醇225ml充分?jǐn)嚢瑁詈蠹尤胝麴s水并定容至1500ml。
試驗(yàn)例1藥理藥效試驗(yàn)“菌毒康”對(duì)雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)感染細(xì)胞能力的影響取9日齡SPF雞胚，去頭、爪和內(nèi)臟，用D-Hanks液沖洗3次后置于小燒杯中，剪成1mm3左右大小的碎塊，再用D-Hanks液沖洗3次，然后加入4倍量的0.25％胰蛋白酶液，輕輕搖勻后置于37℃水浴中消化至組織塊變得疏松、表面發(fā)毛棄上層胰液，用D-Hanks液沖洗，吹散，紗布過(guò)濾，以MEM細(xì)胞生長(zhǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至×106個(gè)/ml，分裝100ml細(xì)胞瓶(10ml/瓶)，置5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層，再用0.025％的胰酶消化，洗去胰酶，每瓶用細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋成10ml，轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞板，每孔0.2ml，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成完整單層時(shí)，小心吸去細(xì)胞生長(zhǎng)液，按以下三種順序加入中藥和病毒①先加中藥后加病毒取各稀釋度中藥分別加入到CEF單層中，每個(gè)濃度重復(fù)4孔，每孔0.1ml，置于5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，各孔再加入0.1ml的病毒液，每個(gè)稀釋度同時(shí)設(shè)設(shè)中藥對(duì)照(只加中藥0.2ml)、病毒對(duì)照(只加0.2ml病毒)和細(xì)胞對(duì)照(只加0.2ml細(xì)胞維持液)繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h在倒置顯微鏡下觀察，直至病毒對(duì)照組完全死亡時(shí)。
②先加病毒后加中藥先將病毒液加入CEF單層中，每孔0.1ml，培養(yǎng)24h，加入各稀釋度中藥，每孔0.1ml，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔；同時(shí)設(shè)中藥對(duì)照、病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。觀察同①。
③病毒和中藥同時(shí)加入將各稀釋度中藥加入CEF單層中，每個(gè)濃度重復(fù)6孔，每孔0.1ml；同時(shí)加入病毒液，每孔0.1ml。并設(shè)中藥對(duì)照、病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。觀察同①。
按以下標(biāo)準(zhǔn)判定和列表記錄從表1可以看出“菌毒康”先于病毒加入時(shí)，在0.0488mg/ml濃度出抑制高峰(強(qiáng)抑制)，0.0977mg/ml呈中抑制，0.1953～0.7813mg/ml和0.0244mg/ml以下濃度呈弱抑制，后加時(shí)未出現(xiàn)抑制效應(yīng)，與病毒同時(shí)加入時(shí)，在0.0122mg/ml以上呈強(qiáng)抑制，0.0061mg/ml以下呈中抑制。本結(jié)果表明，”菌毒康”的抗病毒機(jī)理應(yīng)是通過(guò)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)而抑制病毒的，并且存在量效關(guān)系。
表1菌毒清對(duì)IBDV感染細(xì)胞能力的影響(濃度mg·ml1)

*注中藥對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照細(xì)胞組成層好，無(wú)游離細(xì)胞、死細(xì)胞，細(xì)胞折光好，病毒對(duì)照細(xì)胞全部死亡。
-細(xì)胞全部死亡或僅有少數(shù)活細(xì)胞，表示中藥不能抑制病毒；+活細(xì)胞較多，細(xì)胞單層出現(xiàn)嚴(yán)重拉網(wǎng)狀，表示弱抑制；
++細(xì)胞單層完好，折光性差，表示中抑制；+++細(xì)胞單層完好，折光性好，表示強(qiáng)抑制。
試驗(yàn)例2對(duì)小鼠的口服急性毒性試驗(yàn)對(duì)體重18～22g的昆明系小白鼠50只，分5組灌服”菌毒康”，各組劑量依次為6451、7021、8295和8930mg/kg，觀察小鼠的死亡情況并進(jìn)行記錄，實(shí)驗(yàn)期限為7天，試驗(yàn)中死亡小鼠及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活小鼠進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。
表2小鼠口服急性中毒試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié)果計(jì)算表明，”菌毒康”對(duì)小鼠的口服LD50為7624mg/kg，LD50的95％的可信限為6917～9793mg/kg，根據(jù)毒理學(xué)毒物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)為低毒。與臨床推薦使用量相比，換算的單位體重用量非常小，由此可見(jiàn)，菌毒清安全范圍大，毒性小很，臨床使用安全可靠。
試驗(yàn)例3臨床藥效試驗(yàn)1、“菌毒康”防治雞傳染性支氣管炎(IBV)的試驗(yàn)結(jié)果1日齡京白939雛雞，經(jīng)臨床檢查均為健康，IBV-T株原液接種于9日齡雞胚尿囊腔，每胚0.2ml，共接種8只雞胚并做2只空白對(duì)照，接種后恒溫箱37℃下培養(yǎng)24h，拋棄死胚，72h后，無(wú)菌收獲尿囊液加入青霉素后放4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?20只1日齡京白939雛雞隨機(jī)分成四組，每組30只。各組具體飼養(yǎng)與管理見(jiàn)表3。病料組織采集于攻毒后1天，3天，5天，分別采集氣管、肺、腎等組織，石蠟切片，普通H·E染色。
表3飼養(yǎng)管理情況 從表4可以看出，攻毒后第III組癥狀明顯嚴(yán)重，人工感染IB-T株前后用”菌毒康”預(yù)防及治療的第I、II組癥狀幾乎沒(méi)有或只有輕微臨床癥狀，攻毒后未給予治療的第III組臨床癥狀明顯嚴(yán)重。說(shuō)明”菌毒康”能拮抗或輕微減輕IBV-T株侵害后的癥狀。證明了該藥對(duì)IBV-T株有預(yù)防和治療的作用。
表4攻毒后臨床癥狀
表5攻毒后的肉眼病變

表6光鏡下病理組織變化

以上結(jié)果表明各用藥組病雞在藥物的作用下，大部分得到保護(hù)，少數(shù)發(fā)病的雛雞病變比較輕微，器官受損輕而易恢復(fù)，而攻毒致病的第III組組織嚴(yán)重，病變明顯。
從表6可見(jiàn)IBV-T株侵害的主要組織是氣管和腎，致病的第III組組織病變最嚴(yán)重最明顯。而第I組預(yù)防和第二組治療組組織幾乎沒(méi)有病變或輕微。說(shuō)明”菌毒康”能抑制IBV-T株侵害組織，對(duì)組織有保護(hù)作用。
試驗(yàn)例4治療雞呼吸道綜合癥療效試驗(yàn)2500只伊沙褐蛋雞(90日齡-183日齡)，均為臨床病例，三個(gè)月病程，雞產(chǎn)蛋率只有30％。臨床癥狀為雞冠及肉髯深紅，嗜飲水；營(yíng)養(yǎng)不良羽毛凌亂無(wú)光澤，削度；咳嗽甩頭流鼻液，大便稀或水樣、色灰白；頭、頸腫脹。診斷結(jié)果為雞傳染性喉氣管炎，及大腸桿菌、葡萄球菌等細(xì)菌混合感染。治療試驗(yàn)，2000只病雞采用”菌毒康”飲水治療，方法為按1∶100稀釋”菌毒康”給病雞自由飲用，連續(xù)用藥5天；每天觀察記錄雞的癥狀變化。500只雞采用對(duì)照藥物病毒唑治療，飲水藥物濃度為0.1％給藥方法同上。
試驗(yàn)結(jié)果用藥前后雞產(chǎn)蛋率變化“菌毒康”治療組用藥后95％雞只臨床治愈，至第七天平均產(chǎn)蛋率達(dá)最高峰80％，接近正常產(chǎn)蛋的水平。臨床治愈雞實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，玻片凝集試驗(yàn)雞喉氣管炎呈陰性，鏡檢埃希氏大腸桿菌和葡萄球菌感染率在正常范圍之內(nèi)。臨床治愈病雞飲食正常，甩頭、咳嗽、拉稀、頭頸腫等癥狀消失。
對(duì)照藥物病毒唑治療組用藥后10％雞只臨床治愈，用藥后第七天產(chǎn)蛋率為40％。病雞實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，玻片凝集試驗(yàn)檢查雞喉氣管炎病毒呈陽(yáng)性，鏡檢埃希氏大腸桿菌和葡萄球菌感染率高于正常范圍。所有病雞甩頭、咳嗽、拉稀、頭頸腫等癥狀未消失。
使用方法說(shuō)明功能抗病毒，抗菌，清熱解毒，消炎，增強(qiáng)免疫力。
主治禽呼吸道病毒與細(xì)菌感染性疾病。
用量方法禽飲水，按1％稀釋于水中，每日1-2次，連續(xù)使用3-5天。預(yù)防量減半。
規(guī)格100ml/瓶，32瓶/箱。
貯藏密閉，避光，置陰涼處。
有效期二年。
權(quán)利要求
1.一種防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物，其特征是以1500ml藥液計(jì)算，含各味中藥以生藥材計(jì)算的量以及敷料量配比為板蘭根350～450g，黃連150～250g，金銀花225～275g，黃芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，95％乙醇225-250ml，亞硫酸氫鈉3g，其余為蒸餾水。
2.如權(quán)利要求1所述的一種防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物的制備方法是①水提按照配方組成，分別稱(chēng)取板蘭根350～450g，黃連150～250g，金銀花225～275g，黃芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，第一次加4倍蒸餾水，加熱至沸騰，提取0.5小時(shí)；過(guò)濾取濾液；第二次加入7倍水量，加熱至沸騰提取1小時(shí)，過(guò)濾收集濾液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加熱濃縮至1200ml；②醇沉加入乙醇，使藥液的乙醇濃度含量為50％，搖勻后在低溫下靜置過(guò)夜，離心驅(qū)除沉淀物，回收上清夜，回收乙醇使藥液體積至1200ml，以上述方法分別經(jīng)過(guò)65％、80％的乙醇提取2次，最后濃縮藥液1200ml；③藥液配制 藥液中加入3g亞硫酸氫鈉攪拌溶解。然后加入乙醇225～250ml充分?jǐn)嚢?。最后加入蒸餾水并定容至1500ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種防治禽類(lèi)呼吸道病毒與細(xì)菌感染藥物組合物及其制備方法，以1500ml藥液計(jì)算，含各味中藥以生藥材計(jì)算的量以及敷料量配比為板蘭根350～450g，黃連150～250g，金銀花225～275g，黃芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，95％乙醇225－250ml，亞硫酸氫鈉3g，其余為蒸餾水。并采用水提、醇沉、藥液配制三步驟制成口服劑。本發(fā)明通過(guò)大量的臨床使用，證明該藥物具有抗病毒，抗菌，清熱解毒，消炎，增強(qiáng)免疫力功能，對(duì)多種病毒和細(xì)菌引起的禽類(lèi)呼吸道感染，甚至頑固性、久治不愈的病癥治療效果十分明顯，其應(yīng)用對(duì)于推動(dòng)我國(guó)家禽業(yè)的發(fā)展將起到積極作用。
文檔編號(hào)A61K33/04GK1813956SQ20051004170
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者張繼瑜, 李劍勇, 周緒正, 李金善, 李宏勝, 蒲小霞, 魏小娟, 徐忠贊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所