專利名稱：一種腺癌標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種癌標志物及其應用，尤其涉及一種腺癌標志物及其應用。
背景技術：
長期以來許多研究都發(fā)現(xiàn)類風濕關節(jié)炎與腫瘤在組織學上有很多相似性，包括大量細胞外纖維蛋白沉淀(fibrin deposit)、異常組織細胞增殖(abnormal cell proliferation)和分化(cell differentiation)、過高毛細血管增生(angiogenesis)和高凝血活性(coagulation activity)。一些臨床醫(yī)生也經(jīng)常用治療腫瘤的藥物治療類風濕關節(jié)炎。但是這兩種疾病在分子水平上的內(nèi)在聯(lián)系還不清楚。
肽基精氨酸脫亞胺酶(Peptidylarginine deiminase，PAD)是在人體組織中一種酶，目前，共發(fā)現(xiàn)了五種PAD酶(即PAD1、2、3、4和6)。這些酶由坐落在人類染色體1p36區(qū)域上的一簇基因所編碼，并具有不同的組織分布。它可以在鈣離子存在的情況下對其它一些組織蛋白進行后翻譯修飾(post-translational modification)。這個酶可將多肽鏈中的精氨酸(arginine)的氨基催化成羰基，從而使精氨酸轉化成瓜氨酸(citrulline)。瓜氨酸是一個非自然氨基酸。這個由PAD催化的多肽中精氨酸轉化成瓜氨酸的過程被稱做瓜氨酸化(citrullination)。(見圖1)。
近年來，通過免疫學、細胞生物化學和分子遺傳學的研究，肽基精氨酸脫亞胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)(一些文章中也稱為PADI4或PAD5)被證明在人類類風濕關節(jié)炎發(fā)病過程中起著非常重要的作用。2004年，常曉天發(fā)現(xiàn)PAD4酶在類風濕關節(jié)炎關節(jié)滑膜組織中有著廣泛的表達，并且使滑膜組織中的纖維連接蛋白被瓜氨酸化；在對類風濕關節(jié)炎病人，全身性紅斑性狼瘡病人，正常人的血漿進行的進一步的檢測后發(fā)現(xiàn)，類風濕關節(jié)炎病人血漿中的纖維連接蛋白(fibronectin)也呈現(xiàn)明顯瓜氨酸化。那么，肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)除在類風濕關節(jié)炎關節(jié)滑膜組織中有著廣泛的表達并對類風濕關節(jié)炎發(fā)病過程有影響外，結合類風濕關節(jié)炎與腫瘤在組織學上的諸多相似性，是不是肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)也在癌細胞中有著同樣明顯的表達？它對細胞的分化和癌變的影響和作用是什么？經(jīng)檢索，還未見相關的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明要解決的問題是在研究肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4酶)對類風濕性關節(jié)炎病理作用的基礎上，進一步研究該酶在各種各樣的腫瘤組織中的表達調(diào)控。提出一種腺癌標志物及其在制備腫瘤臨床診斷試劑和其治療藥物中的應用。
本發(fā)明所述的腺癌標志物，由肽基精氨酸脫亞胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)組成。即為肽基精氨酸脫亞胺酶4。
上述肽基精氨酸脫亞胺酶4特異表達在所有的腺癌組織或細胞中。
上述肽基精氨酸脫亞胺酶4起始于CD34胚胎性干細胞并在癌細胞分化過程中持續(xù)表達。
確定和支持上述腺癌標志物是肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4酶)的實驗證據(jù)用免疫組織化學法對48種癌組織進行的實驗檢測表明PAD4酶在許多種癌組織特別是幾乎所有的腺癌(adenocarcinoma)癌細胞中有著非常明顯的表達(見圖2)。用Western blotting法對許多腫瘤組織進行了檢測分析，其結果也證實了上述結論(見圖3)。更令人信服的是，利用免疫組織化學法實驗發(fā)現(xiàn)PAD4酶與高分化腺癌中的細胞角蛋白(cytokeratin)有著基本一致的表達圖案(expressional profile)(見圖4)?？梢宰C明PAD4酶在幾乎所有的腺癌和一些非腺癌組織中與細胞角質(zhì)蛋白共表達。細胞角蛋白是已知的癌細胞標志物。它主要出現(xiàn)在上皮細胞來源的癌細胞中。細胞角質(zhì)蛋白與PAD4酶的共表達(co-expression)強有力地證實PAD4酶在癌組織的存在。
本發(fā)明所述的腺癌標志物PAD4酶在癌細胞中有特異性高表達的發(fā)現(xiàn)，對癌發(fā)病機制的研究有著重要的意義。
第一，這項發(fā)現(xiàn)解釋了為什么許多癌癥病人的血液中存在高凝血酶活性(thrombinactivity)。常曉天在研究類風濕關節(jié)炎時發(fā)現(xiàn)PAD4酶可以體內(nèi)和體外通過瓜氨酸化抑制抗凝血酶(antithrombin)活性，從而導致病變組織中凝血酶活性失控、增高。
第二，這項發(fā)現(xiàn)解釋了為什么類風濕關節(jié)炎與腫瘤在組織學上有很多相似性。正因為兩種病變組織都含有大量的PAD4酶和因此失活的抗凝血酶，增高的凝血酶活性被證明能夠刺激組織的外細胞纖維蛋白沉淀生成、細胞異常增殖、細胞轉移，毛細血管異常增生和抑止細胞凋亡。
第三，這項發(fā)現(xiàn)解釋了病人血清中的高濃度30,000道爾頓(Da.)細胞角質(zhì)蛋白片段的存在。實驗結果表明瓜氨酸化后的細胞角質(zhì)蛋白易斷裂為此3萬Da.的片段。而血液中這一片段的存在是臨床診斷腫瘤的一個標準。
第四，這項發(fā)現(xiàn)解釋了為什么癌細胞失去了正常的細胞凋亡機制。實驗結果表明被PAD4酶瓜氨酸化后的細胞角質(zhì)蛋白可以抵抗細胞各種caspase的消化。而細胞角質(zhì)蛋白的正常消化降解是細胞凋亡一個關鍵步驟之一。
第五，這項發(fā)現(xiàn)印證了一百多年來關于癌細胞起源于胚胎性細胞的假說，也證實了腺癌可能起源于CD34干細胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PAD4酶最初特異地存在于骨髓來源的CD34造血前體干細胞，并持續(xù)地在CD34的衍生細胞中表達。許多癌細胞(特別是腺癌)特異地表達PAD4酶，建議這些癌組織可能是CD34+細胞在各種因素的誘導下進行了不正常的增殖所產(chǎn)生的。
本發(fā)明所述的腺癌標志物PAD4酶在癌細胞中有特異性高表達的發(fā)現(xiàn)，對腫瘤臨床診斷試劑以及抗癌藥物的制備也有著非常重要的意義。
A本發(fā)明所述腺癌標志物PAD4酶在制備腫瘤臨床診斷試劑特別是腺癌臨床診斷試劑中的應用。
PAD4酶可以作為一個新的癌細胞標志物用于臨床腫瘤病理切片的檢查和判定。盡管科學家已發(fā)現(xiàn)許多癌細胞標志物，但到目前為止還未有一個標志物能廣泛并特異地標記出所有的腺癌組織。細胞角質(zhì)蛋白作為標志物只存在于高分化的癌細胞中，它不能用于跟蹤細胞的分化和癌化過程；CD34只存在于干細胞和一些未分化的癌細胞中，它不在已分化的癌細胞中表達。PAD4酶起始于CD34胚胎性干細胞并在癌細胞分化過程中持續(xù)表達。因此，PAD4酶是一個非常好的癌細胞標志物。在臨床上和實驗室中，可按常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶4抗體，建立檢測肽基精氨酸脫亞胺酶4的定性或定量方法及配套試劑盒。以用于判斷癌的類型和進行發(fā)病機制的研究。到目前為止，經(jīng)查詢，尚無一個腫瘤標志物能標記出如此多的癌細胞，并能示蹤癌細胞的分化和癌化過程。
B本發(fā)明所述腺癌標志物PAD4酶在制備治療腫瘤藥物中的應用。
研究證明PAD4酶通過對凝血酶和細胞角蛋白的瓜氨酸化刺激細胞外纖維蛋白沉淀、細胞異常增生、毛細血管異常增生，細胞游走和抑止細胞凋亡，從而導致組織腫瘤化。因此，人們可以設計一種像單克隆抗體或降低鈣離子濃度的藥物，去阻止PAD4酶活性，從而達到癌抑制或癌治療的目的。
例如以常規(guī)方法篩選對肽基精氨酸脫亞胺酶4有抑制作用的藥物，制備抗腫瘤藥物。
以常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶4單克隆抗體，加載抗腫瘤藥物，制備成抗腫瘤“生物導彈”藥物。
針對PAD4酶設計、制備藥物去阻止該酶對凝血酶，細胞角蛋白和其他細胞蛋白的催化。


圖1.PAD酶能催化肽鏈中的精氨酸殘基成瓜氨酸.
圖2.免疫組織化學法證明PAD4酶在幾乎所有的腺癌和一些非腺癌腫瘤的癌細胞都有很強的高表達.
其中A排是各種各樣的癌組織(物鏡10X)，B排是A排的局部放大(物鏡40X)，C排是相對應的健康組織(物鏡10X).1A-1B十二指腸腺癌，2A-2B食管腺癌，3A-3B前列腺腺癌，4A-4B腮腺腺癌，5A-5B胃腺癌，6A-6B肝膽管癌.
圖3.Western blot法證明許多腺癌組織都表達PAD4酶。
從結腸癌(1)，肺腺癌(2)，腮腺腺癌(3)，前列腺腺癌(4)和胸腺癌(5)組織中提取的組織總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后被轉印到PVDF膜上。經(jīng)與抗PAD4抗體雜交后，所有腺癌組織都呈現(xiàn)67kDa.的PAD4表達信號。
圖4.免疫組織化學法證明PAD4酶在幾乎所有的腺癌和一些非腺癌組織中與細胞角質(zhì)蛋白共表達.
其中A排和B排是各種各樣的癌組織，C排和D排是相對應的健康組織.A排和C排表示PAD4酶在各種各樣癌和健康組織中的表達，B排和D排表示細胞角質(zhì)蛋自酶在相對應的組織中的表達.結果表明PAD4酶與細胞角質(zhì)蛋白在幾乎所有的腺癌和一些非腺癌組織中表達在同一區(qū)域.1，大腸腺癌.2，十二指腸腺癌.3，膽囊腺癌.4，肺腺癌.5，直腸腺癌.6，胃腺癌.7，子宮腺癌.8，乳腺纖維腺瘤。(物鏡10X).
圖5.各種各樣的caspase對細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)CK8，18和19的降解。
體外重組的細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)CK8，18和19分別和caspase 1(4，15，26)，caspase 2(5，16，27)，caspase 3(6，17，28)，caspase 6(7，18，29)，caspase7(8，19，30)，caspase 8(9，20，31)，caspase 9(10，21，32)and caspase 10(11，22，33)在37℃下反應孵育。其中A代表caspase對細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)的處理，B代表caspase對瓜氨酸化后的細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)的處理。C代表在caspase抑制劑存在時caspase對瓜氨酸化后細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)的處理。對照組包括未瓜氨酸化和未caspase降解的細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)(1，12，23)；瓜氨酸化處理但未被caspase降解的細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)(2，13，24)；瓜氨酸化和caspase抑制劑處理的細胞角質(zhì)蛋白質(zhì)(3，14，25)。結果表明，經(jīng)PAD4酶瓜氨酸化處理的細胞角質(zhì)蛋白能有效地抵抗caspase的降解。箭頭代表信號的分子量。
具體實施例方式
下面結合實施例中的驗證實驗對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的闡述實施例1用免疫組織化學方法證明PAD4酶在癌組織中的表達(1)將0.5立方厘米左右新鮮腫瘤組織置于10％福爾馬林緩沖液中固定十二個小時。固定后的組織塊按著標準程序進行脫水，包埋并制成10微米厚的石蠟切片。
(2)將載有石蠟切片的載玻片按著標準程序在二甲苯和酒精中脫蠟，復水，并暫停于蒸餾水中。
(3)將組織切片置于95℃度的檸檬酸緩沖液(CM buffer)處理品十五分鐘.然后將載有切片的檸檬酸緩沖液轉移到常溫下再冷卻十五分鐘.檸檬酸緩沖液可以大大增強PAD4蛋白的組織抗原性。
(4)將組織切片重新置于蒸餾水中水浸泡兩次，每次三分鐘。
(5)將組織切片置于PBS緩沖液(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，NaHPO41.15g/L和KH2PO40.2g/L，pH7.4-7.6)中浸泡三次，每次三分鐘。
(6)用S上述PBS緩沖液配制的3％脫脂奶粉稀釋PAD4酶抗體。將實驗濃度的抗體滴加在組織切片上。在4℃度下進行抗原抗體反應十二小時。
(7)將組織切片置于PBS緩沖液中浸泡三次，每次五分鐘。
(8)用PBS緩沖液配制的3％脫脂奶粉稀釋磷酸化酶標記的抗兔IgG第二抗體。將實驗濃度的抗體滴在加組織切片上。在室溫下讓反應進行一小時。
(9)將組織切片置于PBS緩沖液中浸泡三次，每次五分鐘。
(10)用適當?shù)陌l(fā)色劑(例如New Fuchsin)處理組織切片，顯示PAD4酶的位置。
(11)用蘇木精對組織切片進行對比染色。
(12)脫水，封片。
(13)鏡檢。
結果表明PAD4酶在許多種癌組織特別是幾乎所有的腺癌癌細胞中有著非常明顯的表達(見圖2)。
實施例2Western blot法證明PAD4蛋白在各種腺癌組織中表達(1)將手術中獲得的各種癌組織按常規(guī)步驟勻漿提取組織總蛋白。
(2)按常規(guī)步驟將提取的組織總蛋白SDS-PAGE電泳，然后轉印在PVDF膜上.
(3)按常規(guī)步驟用抗PAD4抗體雜交PVDF膜，探測PAD4酶在癌組織總蛋白中的表達。
結果表明PAD4酶存在于各類腺癌組織的總蛋白中(圖3)。此結果印證了以上免疫組織化學的發(fā)現(xiàn)。
實施例3用免疫組織化學方法證明PAD4在許多癌組織中與細胞角質(zhì)蛋白共表達按實施例1描述的免疫組織化學方法，將各種各樣癌組織的連續(xù)石蠟切片分別與抗PAD4抗體和抗細胞角質(zhì)蛋白雜交。對連續(xù)切片上兩種靶蛋白表達的圖案進行比較，發(fā)現(xiàn)PAD4酶在幾乎所有的腺癌和一些非腺癌組織中與細胞角質(zhì)蛋白的表達是一致的(圖4)。此結果表明PAD4酶與細胞角質(zhì)蛋白在許多癌細胞中共表達。
實施例4用體外酶切反應和Western blot證明PAD4對細胞角質(zhì)蛋白的作用用基因工程的方法構建的含PAD4基因人工質(zhì)粒，按常規(guī)步驟體外生產(chǎn)PAD4酶蛋白。經(jīng)活性鑒定后，將該酶與細胞角質(zhì)蛋白分別與各種各樣caspase(caspase 1-10)在37℃下反應兩小時，然后用Western blot檢查酶切結果。結果表明，經(jīng)PAD4酶瓜氨酸化后的細胞角質(zhì)蛋白能有效地抵抗caspase的降解(見圖5)。
實施例5制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶4抗體，制作抗PAD4蛋白預包被酶標板(條)試劑盒(1)人工合成短肽(氨基酸序列PAKKKSTGSSTWPC)。然后按常規(guī)多克隆抗體制備程序多次注射此短肽于兔子皮下，獲取抗PAD4蛋白抗血清。
(2)按常規(guī)程序純化抗PAD4抗體。
(3)用PH9.6碳酸鹽緩沖液按1∶3000-5000的比例稀釋該抗體。
(4)將酶標板每孔中滴加100ul抗體稀釋液，置室溫4小時。
(5)用含0.05％Tween-20PBS洗滌酶標板孔3遍，然后每孔加200ul2％BSA。置酶標板與37℃2小時，吹干后放入錫鉑袋中真空封上，4℃保存。
*抗PAD4抗體，用辣根過氧化物酶常規(guī)標記。
品稀釋液含2％BSA、PBS。
滌液含0.05％Tween-20PBS。
顯色劑0.4％TMB。
終止液2％H2SO4。
實施例6檢測應用腫瘤組織抗肽基精氨酸脫亞胺酶(1)工合成短肽(氨基酸序列PAKKKSTGSSTWPC)。然后按常規(guī)多克隆抗體制備程序多次注射此短肽于兔子皮下，獲取抗PAD4蛋白抗血清。
(2)按常規(guī)程序純化抗PAD4抗體。
(3)按常規(guī)勻漿腫瘤組織，提取腫瘤組織總蛋白。
(4)將待檢組織總蛋白用樣品稀釋液4000稀釋后，加100ul于ELISA板樣品孔中。37℃下放置1小時。
(5)洗滌液洗5遍。
(6)加用辣根過氧化物酶標記的抗PAD4抗體100ul，37℃下反應1小時。
(7)用洗滌液洗5遍。
(8)每孔加顯色劑100ul，37℃15分鐘。
(9)每孔加終止液50ul，于酶標儀405nm處測各孔的吸光度值。
(10)根據(jù)各孔吸光度值大小，與對照孔吸光度值比較，計算結果。
實施例7篩選對肽基精氨酸脫亞胺酶4有抑制作用的藥物，制備抗腫瘤藥物HL60培養(yǎng)細胞來源于造血系統(tǒng)干細胞。實驗證明該培養(yǎng)細胞用phorbol 12，13-dibutyrate(PMA)刺激后能表達PAD4蛋白。以此細胞為模型可建立體外實驗系統(tǒng)篩選各種抗PAD4酶的抗癌藥物。具體內(nèi)容如下(1)按常規(guī)無血清培養(yǎng)HL60細胞。(2)加PMA和各待選抗癌藥物培養(yǎng)細胞中。(3)用western blot，Northernhybridizationhel ELISA等方法檢測PAD4蛋白和mRNA是否被抑制，從而選出潛在的抗癌藥物。
實施例8制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶4單克隆抗體，加載抗腫瘤藥物，制備成抗腫瘤生物導彈”藥物生物導彈是將抗癌藥物與單克隆抗體化學偶聯(lián)，然后注入病人體內(nèi)，利用抗原抗體結合的原理，將抗癌藥物帶給癌細胞，進而發(fā)揮特異性殺死癌細胞的作用。具體步驟如下(1)制備抗PAD4單克隆抗體。(2)將抗癌藥物如阿霉素，碘131或其它抗癌藥物與該單克隆抗體化學偶聯(lián)。同時也可將多種藥物混合制成“多彈頭”。(3)靜脈或直接顯微注射方式，將藥物導入腫瘤，達到治療目的。(4)也可用同樣方式將放射性標記物結合抗PAD4單克隆抗體上，然后將結合物注入病人體內(nèi)，進行顯像診斷。此法準確率可達90％以上。
權利要求
1.一種腺癌標志物，由肽基精氨酸脫亞胺酶4組成。
2.如權利要求1所述的腺癌標志物，其特征是，所述肽基精氨酸脫亞胺酶4特異表達在所有的腺癌組織或細胞中。
3.如權利要求1或2所述的腺癌標志物，其特征是，所述肽基精氨酸脫亞胺酶4起始于CD34胚胎性干細胞并在癌細胞分化過程中持續(xù)表達。
4.權利要求1所述腺癌標志物在制備腫瘤臨床診斷試劑中的應用。
5.權利要求1所述腺癌標志物在制備腺癌臨床診斷試劑中的應用。
6.權利要求5所述腺癌標志物在制備腺癌臨床診斷試劑中的應用，其特征是，以常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶4抗體，建立檢測肽基精氨酸脫亞胺酶4的定性或定量方法及配套試劑盒。
7.權利要求1所述腺癌標志物在制備治療腫瘤藥物中的應用。
8.權利要求7所述腺癌標志物在制備治療腫瘤藥物中的應用，其特征是，以常規(guī)方法篩選對肽基精氨酸脫亞胺酶4有抑制作用的藥物，制備抗腫瘤藥物。
9.權利要求7所述腺癌標志物在制備治療腫瘤藥物中的應用，其特征是，以常規(guī)方法制備抗肽基精氨酸脫亞胺酶4單克隆抗體，加載抗腫瘤藥物，制備成抗腫瘤“生物導彈”藥物。
10.權利要求7所述腺癌標志物在制備治療腫瘤藥物中的應用，其特征是，針對PAD4酶設計、制備藥物去阻止該酶對凝血酶，細胞角蛋白和其他細胞蛋白的催化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腺癌標志物——肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4酶)，所述PAD4酶特異表達在所有的腺癌組織或細胞中，并在癌細胞分化過程中持續(xù)表達。本發(fā)明還公開了所述標志物在制備腫瘤臨床診斷試劑，特別是腺癌臨床診斷試劑及其治療藥物中的應用。本發(fā)明所述腺癌標志物的發(fā)現(xiàn)，對癌發(fā)病機制的研究有著重要的意義；同時對腫瘤臨床診斷試劑以及抗癌藥物的研究開發(fā)也有著非常重要的意義。
文檔編號A61K47/46GK1733932SQ20051004404
公開日2006年2月15日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權日2005年7月18日
發(fā)明者常曉天, 朱有名, 韓金祥 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術研究中心